TERMOFİLİK Bacillus licheniformis KG9 da EKSTRASELLÜLER β-galaktozidaz ENZİMİ ÜZERİNE ÇALIŞMALAR

Transkript

1 T.C. DİCLE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TERMOFİLİK Bacillus licheniformis KG9 da EKSTRASELLÜLER β-galaktozidaz ENZİMİ ÜZERİNE ÇALIŞMALAR Alevcan KAPLAN YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI DİYARBAKIR HAZİRAN- 2010

2 T.C. DİCLE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TERMOFİLİK Bacillus licheniformis KG9 da EKSTRASELLÜLER β-galaktozidaz ENZİMİ ÜZERİNE ÇALIŞMALAR Alevcan KAPLAN YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN: Prof. Dr. Kemal GÜVEN BİYOLOJİ ANABİLİM DALI DİYARBAKIR HAZİRAN-2010

3

4 ÖZ Bu çalışmada Batman Taşlıdere sıcak su kaplıcasından izole edilen termofilik Bacillus licheniformis KG9 un biyoteknolojik öneme sahip ekstrasellüler β-galaktozidaz enziminin bazı özelliklerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bacillus licheniformis KG9 NB besiyerinde laktozlu (%1) ve laktozsuz ortamlarda 6-96 saatler arasında kültüre alınarak zamana bağlı enzim üretimi araştırıldı. Laktozlu ortamda enzim aktivitesinin 48.saatten (1.39 U/mg) başlayarak 96. saate ( 3.25 U/mg) kadar artarak devam ettiği görüldü. Laktozsuz ortamda ise enzim aktivitesinin 36.saatten (1.38 U/mg) başlayarak 96.saate (2.45 U/mg) kadar artarak devam ettiği ancak bu artışın laktozlu ortamdakine nazaran düşük olduğu görüldü. ph ve sıcaklığın β-galaktozidaz enzimi üzerine etkisi ph 4-10 ve 30 C ile 90 C aralığında ham enzimde hem de kısmi olarak saflaştırılan enzim solüsyonunda yapıldı. Enzimin optimum ph ve sıcaklık değerleri sırasıyla 8.0 ve 55 o C olarak bulundu. Enzim aktivitesi üzerine faklı substrat konsantrasyonlarının etkisi mm aralığında araştırıldı. En uygun substrat konsantrasyonu 3 mm olarak tespit edildi. Enzim üretimi üzerine farklı besiyerlerinin etkisi içerikleri farklı olan NB, BM1, BM2, BM3 besiyerlerinde araştırıldı. En iyi enzim aktivitesi NB besiyerinde elde edildi. Enzim üretimi üzerine %1 oranındaki farklı azot ve karbon kaynaklarının etkisi araştırıldı. Karbon kaynaklarının enzim üretimi arttırmadığı tespit edildi. Laktozda araştırılan diğer karbon kaynaklarına göre daha yüksek bir aktivite tespit edildi. Galaktoz, glukoz ve çözünebilir nişastanın ekstrasellüler enzim üretimini i

5 büyük oranda inhibe ettiği tespit edildi. Azot kaynaklarından glisin ve amonyum sülfatın enzim üretimini az miktarda arttırdığı tespit edildi. Yeast ekstrakt, beef ekstrakt, pepton ve tripton un enzim üretimini arttırmadığı tespit edildi. Enzim amonyumsülfat çöktürmesi ve diyaliz aşamasından geçirilerek kısmi olarak saflaştırıldı. Ham ekstraktta enzimin spesifik aktivite değeri 1631 U/mg, verim %100, saflaştırma katsayısı 1 iken diyaliz sonrasında sırasıyla spesifik aktivite değerinin U/mg, verimin %15.7 ve saflaştırma katsayısının olarak değiştiği tespit edildi. Kısmi olarak saflaştırılan enzimin aktivitesi üzerine bazı kimyasalların, metallerin, metal şelatörlerin etkisi araştırıldı. MgCl 2 8 mm da %16 oranında β- galaktozidaz aktivitesini arttırdığı, ZnCl 2 ve CuCl 2 ün 1mM da sırasıyla%99.5 ve %93.5 oranında enzim aktivitesini inhibe ettiği, CaCI 2 ün 20 mm da enzim aktivitesini %62 oranında inhibe ettiği, metal şelatörleri olan EDTA ve 1,10- phenanthroline monohydrat ın ise enzim aktivitesi üzerinde etkilerinin olmadığı tespit edildi. DTT ve β-mercaptoethanol un 10 mm da sırasıyla %37 ve %24 oranında enzim aktivitesini arttırdığı, PCMB nin 4 mm da enzim aktivitesini %52 oranında inhibe ettiği, Iodoacetamide in 20 mm da enzim aktivitesini %53 oranında inhibe ettiği, N-ethylenemaleimide ve PMSF nin ise enzim aktivitesi üzerinde etkilerinin olmadığı tespit edildi. Kısmi olarak saflaştırılan enzimde gliserol ve sorbitolün dondurma-çözdürme işleminde koruyucu etkisi %1-5 konsantrasyonlarında araştırıldı. Sorbitol için en iyi koruyucu etki %5 konsantrasyonunda olduğu tespit edildi. Gliserol de ise %1 de %83, %2-5 konsantrasyonlarında yaklaşık %90 oranında dondurma ve çözme işleminde koruduğu tespit edildi. ii

6 Enzimin termal stabilitesi ºC sıcaklık aralıklarında araştırıldı. Enzimin aktivitesini 50 ºC 120dk. sonunda %90 oranında koruduğu, 55 ºC de 120 dk. sonunda aktivitesini tamamı ile koruduğu, 60 ºC de 120dk. sonunda %90 oranında koruduğu tespit edildi. 65 ºC de ise 20 dk. da enzimin aktivitesini tamamen kaybettiği tespit edildi. Glukoz ve galaktozun, enzim üzerinde yaptığı inhibisyon etkisi belirlendi. Glukoz ve galaktozun mm konsantrasyonları test edildi. Glukozun enzim üzerine ihibisyon etkisi gözlenmedi. Galaktoz un ise 128 mm da %97 oranında inhibisyona neden olduğu tespit edildi. Galaktoz un inhibisyon çeşidini belirlemek amacı ile 4 mm, 16 mm, 32 mm konsantrasyonlarında ve belirli enzim konsantrasyonlarında, 1-6 mm aralığındaki ONPG konsantrasyonları kullanıldı. Galaktoz un enzim üzerinde yarışmalı bir inhibisyona neden olduğu tespit edildi. ONPG için K m ve V max değerleri Lineweaver Burk plot a göre sırası ile 3.52 mm ve 1.602µmol/dk. olarak hesaplandı saatler arasında kültüre alınan bakterilerde zamana bağlı enzim üretim oranları non-denatüre poliakrilamid jel elektroforezi ile teyit edilmiştir. Anahtar Kelimeler : Bacillus licheniformis KG9, Biyoteknoloji, β-galaktozidaz, Ekstrasellüler enzim üretimi ve karakterizasyonu. iii

7 ABSTRACT In this study it was aimed to investigate some features of biotechnologically important β-galactosidase enzyme produced by thermophilic Bacillus licheniformis KG9 isolated from hot spring in Batman Taşlıdere. Time related enzyme production was investigated by culturing Bacillus licheniformis KG9 in lactose-containing and lactose free NB medium between 6-96 hours. It was observed that enzyme activity in lactose-containing medium continuously increased, strating at 48 h (1.39 U/mg) up to 96 h ( 3.25 U/mg). It was seen that enzyme activity in lactose-free medium continuously increased, starting at 36 h (1.38 U/mg) up to 96 h ( 2.45 U/mg), but the increasing in this medium was less than the increasing in lactose containing medium. The effect of ph and temperature on β-galactosidase enzyme and partially purified enzyme solution was investigated between the ph values 4-10 and temperatures between 30 C and 90 C. The optimum ph and temperature were found 8.0 and 55 C respectively. The effect of different substrat concentrations on enzyme activity was investigated between mm. The most convenient substrat concentration was determined as 3 mm. The impact of different mediums on enzyme production was invetigated in NB, BM1, BM2, BM3 mediums which had different content. The best enzyme activity was gained from NB medium. The effect of different nitrogen and carbon sources in % 1 ratios on the production of enzyme was investigated. It was determined that carbon sources didn t increase the enzyme production. It was determined that lactose showed higher iv

8 activity than the other investigated carbon sources. It was determined that galactose, glucose and soluble starch substantially inhibited extracellular enzyme production. It was observed tahat the nitrogen sources glycine and ammonium sulphate slightly increased enzyme production. Yeast extract, beef extract, pepton and tripton didn t increase enzyme production. Enzyme was partially purified by using ammonium sulphate precipitation and dialysis. In crude extract specific activity value was 1631 U/mg, efficiency %100, purification coefficient was 1, after dialysis the specific activity value was U/mg, efficiency %15.7 and purification coefficient was change respectively. The effects of some chemicals, metals and metal chelating agent on partially purified enzyme was studied. It was determined that MgCl 2 increased β- galactosidase activity at the rate of %16 at 8 mm, ZnCl 2 and CuCl 2 at 1 mm inhibited enzyne activity at the percentage of %99.5 and % 93.5 respectively, CaCI 2 at 20 mm inhibited enzyme activity at the percentage of %62, while metal chelating agent EDTA and 1,10-phenanthroline monohydrate didn t effect on the enzyme activity. DTT and β-mercaptoethanol at 10 mm increased enzyme activity at the rate of %37 and %24 respectively, PCMB at 4 mm inhibited at the rate of %52, Iodoacetamide at 20 mm inhibited at the percentage of %53, while PMSF and N- ethylenemaleimide didn t effect on the enzyme activity. Glycerol and sorbitol s protective effect to freeze-solve process on partially purified enzyme was investigated in %1-5 concentrations. The best protective effect for sorbitol was %5 concentration while it has been determined that glycerol protected, %83 percent at %1, and %90 percent in %2-5 concentrations. v

9 Thermal stability of the enzyme was investigated in 50 ºC -65 ºC temperature intervals. Enzyme had %90 activity at 50 ºC for 120 min. Enzyme protected its all activity at 55 ºC for 120 min. Enzyme had %90 activity at 60 ºC for 120 min Enzyme lost all activity at 65 ºC in 20 min. The effect of glucose and galactose on enzyme activity was determined mM concentratinos were invetigated. No inhibition effect of glucose on enzyme activity was observed. Galactose at 128 mm caused inhibition at the rate of %97. In order to detect the type of inhibition, 4mM, 16 mm and 32 mm at concentrations and determined enzyme concetration were used with 1-6mM ONPG concentrations. It has been determined that the Galactose had a racial inhibition effect on enzyme. For ONPG K m ve V max values of ONPG acording to Lineweaver Burk plot was estimated as 3.52 mm and 1.602nµmol/dk. The rate of time related enzyme production in bacteria cultured between hours was confirmed with non-denature polyacrylamid gel electrophorese. Key Words : Bacillus licheniformis KG9, Biotechnology, β-galactosidase, Extracellular enzyme production and characterization. vi

10 TEŞEKKÜR Çalışmalarım boyunca, daima yol gösteren, bilimsel emeklerinin yanı sıra bir büyük olarak yardım ve yakın ilgisini esirgemeyen değerli hocam sayın Prof. Dr. Kemal GÜVEN e teşekkürü bir borç bilirim. Çalışmalarım sırasında beni her konuda destekleyip, yardımlarını esirgemeyen ve benim için her türlü fedakârlığı yapan değerli eşim Mahmut KAPLAN a ve aileme sonsuz sevgi ve saygılarımı sunarım. Deneysel aşamada bilgi ve deneyimlerini paylaşan sayın hocam Dr. Reyhan Gül GÜVEN e teşekkürlerimi sunarım. Deneysel aşamada ve tez yazım aşamasında bilgisini ve yardımını esirgemeyen sayın hocam Arş. Gör. Fatma MATPAN BEKLER e teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım esnasında Hidrobiyoloji laboratuarının imkânlarından faydalanmamı sağlayan ve her daim manevi desteğini gördüğüm sayın hocam Doç. Dr. Elif İpek CENGİZ e ve Prof. Dr. Erhan ÜNLÜ ye teşekkürü bir borç bilirim. Deneylerimin spektroskopik okunmasına yardımcı olan ve Biyokimya laboratuarı nın imkânlarından faydalanmamı sağlayan sayın Prof. Dr. Çetin AYTEKİN e, Doç. Dr. Zübeyde BAYSAL a, Dr. M.Hüseyin ALKAN a teşekkürü bir borç bilirim. Çalışmalarım esnasında yardım ve desteğini gördüğüm değerli arkadaşım Ömer ACER e teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım esnasında manevi desteğini benden esirgemeyen arkadaşlarım Pelin UĞURLU ve Besi SERİN e teşekkürlerimi sunarım. vii

11 Aynı laboratuarı paylaştığımız yüksek lisans ve doktora arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım. Dicle Üniversitesi Bilimsel Araştırma Komisyonunun 08-FF 19 numaralı projemize vermiş olduğu destekten dolayı teşekkür ederim. viii

12 İÇİNDEKİLER ÖZ... i ABSTRACT... iv TEŞEKKÜR...Hata! Yer işareti tanımlanmamış. İÇİNDEKİLER... ix ÇİZELGELERİN DİZİNİ...xiii ŞEKİLLERİN DİZİNİ... xiv SİMGELER VE KISALTMALAR... xv 1. GİRİŞ Enzimler...2 BÖLÜM KAYNAKLARI KAYNAK ARAŞTIRMASI Biyoteknoloji Ekstrem Mikroorganizmalar Termofilik Mikroorganizmalar Bacillus Cinsi Termofilik Basiller Bacillus licheniformis Termostabil Enzimler ve Biyoteknolojide Kullanımı β-galaktozidaz Reaksiyon Mekanizması β-galaktozidaz'ın Fizikokimyasal Özellikleri β-Galaktozidaz ın Biyoteknolojik Kullanım Alanları Peyniraltı suyundaki laktozun uzaklaştırılması için kullanımı ix

13 Süt ve süt ürünlerindeki laktozun uzaklaştırılması için kullanımı Oligosakkaritlerin sentezlenmesinde kullanımı Önceki Çalışmalar...27 BÖLÜM KAYNAKLARI MATERYAL VE METOD Biyolojik Materyal Kimyasal Maddeler Besiyeri Maddeleri Karbon Kaynakları Azot Kaynakları Kimyasal Maddeler, Metaller ve Şelatörler Elektroforetik Maddeler Besiyerleri Sıvı Besiyerleri Katı Besiyeri Tamponlar Kullanılan Aletler Bakterinin Kültüre Alınması β-galaktozidaz Aktivite Tayini Protein Miktar Tayini Değişik Zaman Peryotlarında %1 Laktozlu ve Laktozsuz Ortamlarda Enzim üretiminin Araştırılması Optimum Sıcaklık Tayini Optimum ph Tayini...52 x

14 3.12. Enzim Aktivitesi Üzerine Farklı Substrat Konsantrasyonlarının...52 Etkisinin Araştırılması Farklı Besiyerlerinin Enzim Üretimi Üzerine Etkisinin Araştırılması Enzim Üretimi Üzerine Farklı Karbon Kaynaklarının Etkisinin Araştırılması Enzim Üretimi Üzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisinin Araştırılması Enzimin Kısmi Saflaştırılması: Çöktürme ve Diyaliz Enzim Aktivitesi Üzerine Bazı Kimyasalların Etkilerinin Araştırılması Enzim Aktivitesi Üzerine Bazı Metallerin ve Şelatörlerin Etkilerinin Araştırılması Gliserol ve Sorbitol ün Enzim Aktivitesi Üzerine Koruyucu Etkisinin Araştırılması Termal Stabilite nin Belirlenmesi Elektroforez Nondenatüre Poliakrilamid Jel Elektroforezi ( Laemmli, 1977) BÖLÜM KAYNAKLARI BULGULAR VE TARTIŞMA BULGULAR Laktozlu ve Laktozsuz Ortamlarda Zamana Bağlı Enzim Aktivitesindeki Artışın Belirlenmesi ph nın β-galaktozidaz Aktivitesi Üzerine Etkisi Sıcaklığın β-galaktozidaz Aktivitesi Üzerine Etkisi...62 xi

15 4.1.4.Enzim Aktivitesi Üzerine Farklı Substrat Konsantrasyonlarının Etkisi Farklı Besiyerlerinin Enzim Üretimi Üzerine Etkisi Enzim Üretimi Üzerine Farklı Karbon Kaynaklarının Etkisi Enzim Üretimi Üzerine Farklı Azot Kaynaklarının Etkisi Enzimin Kısmi Olarak Saflaştırılması Ünite Tanımı İçin o-nitrophenol e ait Extinction Sabitesi nin Bulunması Enzim Aktivitesi Üzerine Bazı Kimyasal Maddelerin Etkileri Enzim Aktivitesi Üzerine Bazı Metallerin ve Şelatörlerin Etkileri Enzim Aktivitesi Üzerine Gliserol ve Sorbitol ün Koruyucu Etkisi Termal Stabilite Enzimin Kinetik Parametrelerinin Tespiti Non-denatüre Poliakrilamid Jel Elektroforezi TARTIŞMA ŞEKİLLER...86 Kimyasallar Metaller ve Şelatörler BÖLÜM KAYNAKLARI SONUÇ VE ÖNERİLER: BÖLÜM KAYNAKLARI ÖZGEÇMİŞ xii

16 ÇİZELGELERİN DİZİNİ Çizelge 2.1. Bazı Ekstremozimler ve Uygulama Alanları Çizelge 2.2. Bacillus licheniformis in taksonomik yeri Çizelge 2.3. Mikrobiyal β-d Galaktozidaz Kaynakları Çizelge 2.4. Dünyadaki Yaygın β-galaktozidaz Eksikliği Çizelge 2.5. Laktoz Hidrolizi Boyunca Oluşan Oligosakkaritlerin Yapıları Çizelge 4.1. Kısmi Saflaştırma Tablosu Çizelge 4.2. β-galaktozidaz Aktivitesi Üzerine Bazı Kimyasal Maddelerin Etkisi Çizelge 4.3. β-galaktozidaz Aktivitesi Üzerine Bazı Metal ve Şelatörlerin Etkisi xiii

17 ŞEKİLLERİN DİZİNİ Şekil 2.1. β-galaktozidaz tarafından glikozidik bağın kırılma reaksiyonu Şekil 2.2. β-galaktozidaz tarafından laktozun hidrolizi Şekil 2.3. β-galaktozidaz tarafından katalizlenen galaktozil transfer reaksiyonu. Şekil4.1. Laktozlu ve laktozsuz ortamlarda zamana bağlı β-galaktozidaz aktivitesindeki artış. Şekil 4.2. ph nın β-galaktozidaz aktivitesi üzerine etkisi. Şekil 4.3. Sıcaklığın β-galaktozidaz aktivitesi üzerine etkisi. Şekil 4.4. β-galaktozidaz aktivitesi üzerine farklı substrat konsantrasyonlarının etkisi. Şekil 4.5. Farklı besiyerlerinin β-galaktozidaz üretimi üzerine etkisi. Şekil 4.6. β-galaktozidaz üretimi üzerine farklı karbon kaynaklarının etkisi. Şekil.4.7. β-galaktozidaz üretimi üzerine farklı azot kaynaklarının etkisi. Şekil 4.8. ONP ye ait Milimolar extiction coefficent(me) sabitesi. Şekil 4.9. β-galaktozidaz aktivitesi üzerine gliserol ve sorbitol ün koruyucu etkisi. Şekil Zamana bağlı β-galaktozidaz termal stabilite tayini. Şekil Lineweaver Burk Plot a göre β-galaktozidaz ın kinetik parametreleri. Şekil4.12. Non- denatüre poliakrilamid jel elektroforezi. xiv

18 SİMGELER VE KISALTMALAR ONPG NB PCMB PMSF DTT NEM EDTA OECD GOS PAS mm Rpm ; O-Nitro-fenil-β-D-galactopyranoside ; Nutrienth Broth ; p-chloromercuribenzoate ; Phenylmethylsulfonylfluoride ; Dithiothreitol ; N-Ethylenemaleimide ; Ethylenediamintetraeceticacide ; Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü ; Galaktooligosakkarit ; Peynir altı suyu ; Milimolar ; Devir/dakika K m V max ; Michaelis-Menten hız sabiti (mm) ; Maksimum hız (µmol/ dk) U/mg OD SDS FCR TEMED APS BNG BFB ; Ünite/miligram ; Optik density ; Sodyum dodesil sülfat ; Folin reaktifi ; N-N-N`-N`-Tetrametiletilen daimin ; Amonyum persülfat ; 6-Bromo-2 napthly- β-d-galactopyranoside ; Brom Fenol Blue xv

19 1. GİRİŞ Tüm dünya ülkelerinde endüstriyel alandaki yatırımlar giderek artmaktadır. Ülkemizde ise 20. yüzyılın ortalarında başlayan ve giderek hızlanan endüstrileşme sürecinde, özellikle gıda, tekstil, kimya gibi sektörler öne çıkmaktadır 1. Bununla birlikte bu endüstriyel alanların, üretimlerinde ve üretim sonrası oluşan atık maddelerinin uzaklaştırılması ve/veya onlardan yeni ürünlerin elde edilmesi teknolojisinin geliştirilmesi yolunda yapılan çalışmalar hız kazanmaktadır 2. Bu çalışmalardan özellikle endüstriyel enzimlerle ilgili alan oldukça dikkat çekmektedir. Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle endüstriyel enzimlerle ilgili yapılan çeşitli araştırmalar, daha da önem kazanmaktadır 3. Endüstriyel yolla enzim üretiminde mikrobiyal kaynaklı enzim kullanılmasında fermentasyon metodlarının gelişmesi, çevre koşullarının kontrol altında tutulması, doğru suşların seçimi ile üretim potansiyeli artmakta ve miktar sınıflandırması faktörü de ortadan kalkmaktadır 4. Mikrobiyal enzimlerin dünya genelinde yıllık kullanım değerlerine bakıldığı zaman alkalin proteaz %25, diğer proteazlar %21, amilaz %18, rennin %10, tripsin %3, lipaz %3, diğer karbonhidratı parçalayan enzimler %10 şeklinde bir dağılımla karşılaşılmaktadır. Parasal olarak yüz milyonlarca dolar şeklinde tanımlanan ekonomik değeri vardır yılında yapılan bir değerlendirmede, dünyadaki enzim satışının 450 milyon doları bulduğu belirtilmektedir. Bugün dünyadaki enzim satışında 2-3 kat artış olduğu bilinmektedir 5. Enzim kullanımı açısından gıda endüstrisi, tek başına %50 lik bir paya sahiptir 6. 1

20 Gıda sektörünün önemli bir yan kolu olan süt ve süt ürünlerinin üretimi ve işlenmesi de, hem üretim kapasitesi hem de çevreye verdiği kirlilik yükü bakımından ülkemizde önemli bir yer tutmaktadır 1. Süt ve süt ürünleri endüstrisi bünyesinde gerçekleşen biyoteknolojik dönüşümlerde, enzimlerin kullanılması, sağladığı avantajlar bakımından günümüzde oldukça önemli bir yerdedir. 1.1.Enzimler Enzimler canlı hücreler tarafından oluşturulan ve kimyasal reaksiyonları spesifik olarak katalizleme yeteneğinde olan protein yapısındaki maddelerdir. Bazı reaksiyonları gerçekleştiren ve ribonükleik asit yapısında olan ribozimler dışında enzimlerin tamamı protein yapısındadır 7. Canlı organizmalarda gerçekleşen çok sayıda reaksiyon enzimlerle katalizlenir. Enzimlerle katalizlenen reaksiyonlar katalizlenmemiş karşıtlarına göre kez daha hızlı gerçekleşir. Enzimlerin ilgili reaksiyonları ılımlı koşullarda çok hızlı ve spesifik bir biçimde katalizliyor olmaları, enzimlerden doğal ortamlarının dışındaki pek çok alanda yararlanabilme imkanı sağlar. Bu nedenle enzimler tıp alanında, kimya endüstrisinde, gıda proseslerinde, tarım ve ziraat alanlarında oldukça önemli bir yere sahiptirler 8. İnsanlar gerçekte binlerce yıl öncesinden bu yana enzimlerden yararlanmaktadır. Örneğin alkol fermantasyonu, bira ve ekmek yapımı gibi işlemler ilk biyoteknolojik prosesler olarak tanımlanabilirler. Buna karşılık enzimler hakkında bilimsel denebilecek araştırma ve bulgular ancak geçtiğimiz yüzyılda gözlenmeye başlanmıştır yılında Spallanzani nin atmaca mide suyunun eti eritebildiğini bulması, 1811 yılında Kirchoff un buğday nişastasının zamanla dekstrin ve şekerlere dönüştüğünü belirlemesi, 1830 yılında Robiquet, Boutron ve Chalan nın amigdalinin acı badem tarafından hidrolizlendiğini keşfetmesi 2

21 enzimoloji konusundaki ilk çalışmalar olarak gösterilebilir. Payen ve Persoz un 1833 yılında nişastayı şekere dönüştüren termolabil bir maddeyi alkol çöktürmesiyle elde etmeleri enzimoloji alanındaki en önemli kilometre taşlarından biri olmuştur 9. Bugüne kadar 2000 den fazla enzim tanımlanmış ve bunlardan yaklaşık 100 tanesi ticari olarak kullanıma uygun bulunmuştur. Fakat günümüzde bunlardan sadece 18 tanesi endüstriyel amaçla üretilmektedir 3. Enzimler katalizledikleri reaksiyonun tipine bağlı olarak 6 ana gruba ayrılmışlardır. Bunlar oksidoredüktazlar, transferazlar, hidrolazlar, liyazlar, izomerazlar, sentetazlar ve ligazlar olarak sınıflandırılmışlardır 10. Ticari öneme sahip olan enzimlerin çoğu, hidrolazlar şeklinde tanımlanmakta olup, mikrobiyal kökenlidir. Bu enzimlerin çoğu ekstrasellüler olarak bulunur 3. Mikrobiyal kaynaklı ekstrasellüler enzimler ekolojik ve ekonomik olarak mikrobiyal hücrenin ekonomisi ve global karbon döngüsünde önemlidirler 11. Ekstrasellüler enzimler ortamda bulunan yüksek molekül ağırlıklı besin maddelerini hidroliz ederek mikroorganizma tarafından alınabilir forma dönüştürürler. Ekstrasellüler enzimler mikroorganizmanın ürediği/üretildiği ortama salındığı için, ortamın fiziksel ve kimyasal özelliklerine karşı kendisini stabil kılan bazı özelliklere sahip olması gerekir. Ekstrasellüler enzimler mikroorganizma için gerekli ise fazla miktarda üretilebilir, söz konusu enzimin substratı ortamda bulunursa enzim üretimi indüklenebilir. Bu özelliği sayesinde, ektsrasellüler enzimler endüstriyel alanlarda kullanılmak için uygun ve vazgeçilmez moleküller haline gelmiştir. Günümüzde mikrobiyal enzimlerin pek çoğu önemli araştırma konusu haline gelmiş, dünyanın hemen her yerinde üretilmeye, sanayi, endüstri alanında kullanılmaya başlanmıştır 12. 3

22 β-galaktozidaz( lâktaz), proteaz, lipaz, katalaz, transglutaminaz gibi enzimler süt ve ürünlerinin üretiminde veya kalitelerinin arttırılmasında kullanılan başlıca mikrobiyal kaynaklı enzimlerdir 13. Son zamanlarda yapılan araştırmalar mikrobiyal kaynaklı enzimlerden termofilik olan grup üzerine yoğunlaşmıştır. Termofilllerden elde edilen termostabil enzimlerin, mikroorganizmaların gelişme sıcaklıklarından daha yüksek sıcaklıklarda bile stabil oldukları ve termofil enzimlerinin daha sağlam oldukları belirlenmiştir 14. Termostabil enzimlerden bazılarının mezofilik konak hücrede ekspresyonu ile termostabilitelerinin bozulmadığı gözlenmiştir. Bu nedenle termofilik enzimlerin yüksek sıcaklıklara adaptasyon için geliştirdikleri moleküler stratejilerin genetik bir özellik olduğu belirtilmiştir 15,16. β-galaktozidaz (β-d galaktozid galaktohidroliz, E.C ), laktozdaki β- glikozidik bağının enzimatik hidrolizini katalizleyerek, laktozdan daha tatlı ve çözünürlüğü laktoza göre daha fazla olan glukoz ve galaktozun oluşmasını sağlamaktadır 17. Bu çalışmada, hızla gelişen süt ve süt endüstrisinin, üretiminde, üretim sonrası oluşan atık suların prosesinde, süt ürünlerinin insanlar tarafından tüketilmesi ile ortaya çıkan sorunların giderilmesinde, fonksiyonel gıda olarak değerlendirilen ve intestinal mikrobiyal dengenin korunmasında elzem olan prebiyotik besin üretiminde biyoteknolojik olarak önemli bir yere sahip olan β-galaktozidaz enzimi üzerine çalışmalar yapılması amaçlanmıştır. Bu çalışma Bacillus licheniformis türlerinde yapılan ilk ekstrasellüler β-galaktozidaz çalışma olması yönüyle biyoteknolojik uygulamaların geliştirilmesi açısından önem arzetmektedir. 4

23 BÖLÜM KAYNAKLARI 1. Yiğit, N. Peyniraltı suyundan sürekli sistemde biyogaz üretimi için en uygun koşulların belirlenmesi Yüksek Lisans Tezi, Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara, 3 4-5s, Kahyaoğlu, M.; Kıvanç, M. Endüstriyel Atık Maddelerden Mikrobiyal Yolla Beta Karoten Üretimi, Tarım Bilimleri Dergisi (J. Agric. Sci.), 2007, 17(2): Kıran, Ö.E. ; Çömlekçioğlu, U. ; Dostbil, N. Bazı mikrobiyal enzimler ve endüstrideki kullanım alanları, KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi, 2006, 9(1). 4. Topal, Ş. Mikrobiyal Enzimler ve Biyoteknolojik Yolla Rennin Üretimindeki Gelişmeler, Gıda Dergisi, 1988, 13 (3), Kıran E.Ö. ; Çömlekçioğlu U. Zeytin Ilıcası ( Kahramanmaraş) ndan Termofil Alkalifilik Amilolitik Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu ve Amilaz Üretme Yetenekleri Üzerine Azot Kaynaklarının Etkisi; KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi, 2003, 6(2),s Topal, Ş. ; Pembeci, C. ; Borcaklı, M. Türkiye nin Tarımsal Mikoflorasının EndüstriyelÖneme Sahip Bazı Enzimatik Aktivitelerinin Incelenmesi-I: Amilaz, Proteaz, Lipaz, Turk J Biol, 2000, 24, Şener, A. ; Ünal, M.Ü. Enzim Stabilizasyonu, Türkiye 9. Gıda Kongresi Mayıs, 2006, Bolu. 8. Telefoncu, A., Enzimoloji, Yüksek Lisans Yazokulu, 1997, Eylül. Kuşadası, Aydın, Türkiye. 446s. 9. Aehle, W. Enzymes in Industry. Production and Applications. Wıley-VCH Verlag GmbH &Co. KGaA, 2004, Weinheim. 10. Gözükara, M.E. Biyokimya, 1997, Nobel Tıp Kitabevleri, Ankara 5

24 11. Dhaked, K.R.. ; Alam, I. S. and Singh, L. Characterization of β- galactosidase from an Antarctic Bacillus sp.,indian Journal of Biotechnology,2005, vol.4,pp Kuzu, S.B. Kitinaz Üreten Bacillus İzolasyonu, Enzimin Kısmi Saflaştırılması ve Karakterizasyonu Yüksek Lisans Tezi, Çukurova Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Adana, 1s, Er, B. ; Sarıahmetoğlu, B. Süt endüstrisinde mikrobiyel enzim kullanımı, Vet Hekim Der Derg. 2009, 80(1): Sabato, D. ; Nucci, R. ; Rossi, M. ; Gorczynski, I. ; Gorczynski, Z. and Lakowicz, J. The β-glycosidase from the hyperthermophilic archaeon Sulfolobus solfataricus: enzyme activity and conformational dynamics at temperatures above 100 C. Biophys. Chem., 1999, 81: Niehaus, F. ; Bertoldo, C. ; Kahler, M. ; Antranikian, G. Extremophiles As a Source of Novel Enzymes For Indusrtial Application. Appl Microbiol Biotechnol, 1999, 51: Jaenicke, R. and Böhm, G. The stability of proteins in extreme environments. Current Opinion in Structural Biology, 1998, 8; Panesar, P. S. ; Panesar, R.; Singh S R..; Kennedy F. J.; Harish K. Microbial production, immobilization and applications of β-d-galactosidase Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2006, 81:

25 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2. 1 Biyoteknoloji Günümüzün en yayılgan, en etkin jenerik teknolojilerinden bir tanesi olan biyoteknoloji; canlı organizmaların veya canlılığın moleküler temellerini oluşturan kavram ve işleyiş kurallarının kullanımı ile geliştirilen teknolojileri ve teknolojik ürünleri kapsamaktadır. İnsanlık tarihiyle eşdeğer bir geçmişe sahip olan geleneksel biyoteknoloji, son elli yılda moleküler biyoloji ve genetik alanlarında gerçekleşen bilimsel ilerlemeler sayesinde, yepyeni bir anlam ve önem kazanmıştır. Genetik bilgi ve malzemeyi önemli bir hammadde olarak kullanan ve son yirmi yıl içinde baş döndürücü bir hızla gelişerek özellikle sağlık, tarım, gıda, çevre ve enerji uygulamalarında geniş kullanım ve büyük kazanımlar elde edilen modern biyoteknoloji, 21. yüzyılda yalnızca ekonominin değil, neredeyse hayatın bütün alanlarını etkileyerek son derece köklü değişikliklere neden olması beklenen teknolojiler arasında en ön sıralarda yer almaktadır 1. Bu gelişmelere paralel olarak 1982 yılında OECD tarafından biyoteknolojinin tarifi yapılmıştır. Buna göre Biyoteknoloji; temel bilimlerin ve mühendislik ilkelerinin, hammaddelerin biyolojik araçlar yardımı ile ürünlere dönüştürüldüğü süreçlere uygulandığı bir teknolojidir 2. Biyoteknolojinin çalışma alanları dünyanın temel problemlerini oluşturur. Örneğin; protein üretimi ve insan beslenmesinin garantiye alınması, hammadde ve enerji stoklarının daha verimli değerlendirilmesi, insan ve hayvan sağlığını koruyucu bileşiklerin üretilmesi, bitkilerin biyoteknolojik korunması, bulaşıcı ve salgın hastalıklar ile savaş, atık su arıtılması, çevre korunması ve atıkların yeniden değerlendirilmesi gibi. Son yirmi yılda, dünyadaki uygulama ve araştırma konularına 7

26 göz atıldığında, biyoteknolojinin özellikle sağlık, tarım, gıda sektörleri ile kimyasalların çevreye verdiği zararın giderilmesi için kullanıldığı görülmektedir Ekstrem Mikroorganizmalar Son yıllarda yapılan çalışmalar mikrobiyal yaşamın spesifik çevrelerle sınırlı olmadığını, mikrobiyal komünitelerin yüksek sıcaklık, yüksek tuz, düşük sıcaklık, asidik ve alkali ph, yüksek basınç gibi ekstrem olarak tabir edilen çevrelerde de bulunabileceğini ortaya koymuştur 4. Bununla birlikte bu olağandışı bölgelerde başta bakteriler ve arkealar olmak üzere çoğu organizmalar kolonize olurlar 5. Ekstremofiller olarak adlandırılan bu organizmalar değişik ekstrem çevrelerde yaşamaya yapısal ve moleküler düzeyde adapte olmuşlardır. Yaşadıkları bu ekstrem koşullar nedeniyle çeşitli endüstriyel uygulamalarda kulanılan eşsiz biyokatalizörler üretirler 6. Bazı ekstremozimler ve uygulama alanları Çizelge2.1. de verilmiştir. Çizelge 2.1. Bazı Ekstremozimler ve Uygulama Alanları 7. Ekstremofil Enzim Enzim Endüstriyel uygulamalar Termofil ( C) Psikrofil (-2-20 C) Amilazlar Ksilanazlar Proteazlar DNA polimerazlar Proteazlar Dehidrogenazlar Amilazlar Tatlandırıcılar için glikoz ve fruktoz Kağıt beyazlatma Fırıncılık, bira, deterjan Genetik mühendisliği Peynir olgunlaştırılması, süt üretimi Biyosensörler Deterjanlarda polimer degradasyonu Asidofil (ph< 3) Sülfür oksidaz Kömür desülfürizasyonu Alkafil (ph> 8) Selülazlar Deterjanlarda polimer degradasyonu Halofil (2 5 M NaCl) - Poli (α-glutamik asit )(PGA) üretimi Poli (β-hidroksi butirik asit)(phb) Barofil (Yüksek basınç) Metalofil (Yüksek metal konsantrasyonu) Tüm mikroorganizma Tüm mikroorganizma üretimi Jellerin ve nişasta granüllerinin oluşturulması Maden cevheri elde edilmesi, biyomineralizasyon 8

27 Ekstrem şartlara dayanıklı olan enzimlerin kullanılmak istenmesinin nedeni endüstriyel açıdan önemli olan birçok kimyasal işlemlerin yüksek sıcaklık ve basınç gibi sert koşullar altında gerçekleşmesidir. Günümüzde endüstride yaygın olarak kullanılan mezofilik mikroorganizmaların avantajlarının fazla olmasına rağmen kimyasal işlemlerdeki ekstrem ph, sıcaklık ve iyon konsantrasyonu gibi uygulamalarda kullanımları sınırlı kalmaktadır. Buna karşılık ekstrem mikroorganizmalardan elde edilen enzimler ( ekstremozimler ) koşullara dayanıklıdır. Bu nedenle ekstremozimler son 20 yılda bahsedilen sert biyoteknolojik uygulamalarda yaygın olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bu enzimler ayrıca protein mühendisliğinde termoaktivite ve termostabilitenin tam olarak anlaşılabilmesi için model enzimler olarak kullanılmaktadır 8,9. Günümüze kadar, ekstremofil ve hipertermofil mikroorganizmalardan polisakkarit parçalayan selülaz, amilaz, pullulanaz, lipaz, esteraz, fitaz gibi enzimlerin karakterizasyon çalışmaları yapılmış ve endüstriyel işlemler için yeni imkanlar sağlanmıştır Termofilik Mikroorganizmalar Ekstrem mikroorganizmalar ile ilgili son yıllarda yapılan birçok çalışmada en çok termofilik mikroorganizmalar grubu dikkat çekmektedir. Termofilik mikroorganizmaların biyokatalitik potansiyelleri ve enzimleri üzerinde birçok araştırmalar yapılmıştır 11. Termofilik mikroorganizmaların mezofilik mikroorganizmalara göre yüksek üreme hızları, son ürünün kolay kazanılması, yüksek işlem stabilitesi ve verimi, nişasta selüloz gibi doğal polimerleri doğrudan 9

28 fermente edebilmeleri gibi birçok avantajları vardır ºC arasında yüksek sıcaklıklarda gelişebilen termofilik mikroorganizmalar, volkanik ve jeotermal kaynaklarda bulunurlar. Bunlara örnek olarak solfatarik alanlar (yanardağların püskürmesi sırasında başlangıcı gösteren gaz tütme bölgeleri), nötral sıcak su kaynakları ve deniz dibi sıcak su kaynakları ile yüksek sıcaklığa sahip deniz ve karasal ortamları sayılabilir 12. Geniş sıcaklık aralıklarında üreyebilen termofilik mikroorganizmalar, yüksek sıcaklıkta optimum fonksiyon göstermek için biyolojik membranlarında çesitli adaptasyonlara ihtiyaç duyarlar. Genelde bakterilerin fosfolipit kompozisyonu gelişim sıcaklığı ile değişir 13. Termofillerin hücre membranı doymuş yağ asitlerinden yapılmıştır. Bu yağ asitleri hücreye hidrofobik bir çevre sağlar ve yüksek sıcaklıkta yaşaması için hücreyi yeterince stabil tutar 10. Bu mikroorganizmalar diğer geleneksel mikroorganizmalar ile karşılaştırıldığında, doğaları nedeniyle hücresel komponentleri, enzimleri ve proteinleri de oldukça termostabildir. Enzimleri mezofilik homologlarına göre sadece termostabil değildir ayrıca kimyasal ajanlara da dayanıklıdır bu da endüstriyel uygulamalar için oldukça önemlidir 14. Son yıllarda biyoteknolojik kullanımlarda önem kazanan bazı termofilik Bacillus üyelerinin varlığı bilinmektedir. +50 o C ile +70 o C arasında yaşayanlardan bazıları Bacillus stearothermophilus, Bacillus coagulans, Bacillus licheniformis, Lactobacillus thermophilus, Bacillus clostridium dur

29 2.3. Bacillus Cinsi Yaygın olarak hemen her yerde bulunabilen Bacillaceae familyası içinde olan Bacillus cinsi bakteriler aerob veya fakültatif anaerob, gram pozitif ya da değişken gram olan spor formlu çomak yapan bakterilerdir. Vejetatif formları µm eninde µm büyüklüğünde olabilir ve o C arasındaki optimal sıcaklıklarda gelişebilirler. Buna rağmen termofilik ve psikrofilik olan üyeleri 75 ºC nin üstündeki ve 3 ºC nin altındaki sıcaklıklarda çoğalabilirler. Bazı türleri ph 2 ve 10 gibi ekstrem asidite ve alkalinite şartlarında gelişebilirler. Çoğu ırkı katalaz pozitiftir, peritrişli (çevre kirpikler) flagellaya sahiptir 16,17. Bacillus cinsinin koloni morfolojisi çeşitlilik gösterir. Geneli beyaz veya krem renkli kolonilere sahiptir. Bazı türlerinde sarı, pembe, portakal rengi ve siyah renklerde pigmentli kolonilere de rastlanır18. Türlerinin hepsi ısıya dayanıklı spor üretme yeteneğindedirler. Sporları silindirik, elipsoidal, küresel olabilir ve santral, subterminal veya terminal konumda bulunurlar. Bacillus anthracis dışındakilerin hepsi saprofitiktir genellikle patojenik değildirler. Mezofilik cinsler çoğunlukta olsa da zorunlu termofil, psikrofil, asidofil ve halofil cinslerde bulunur 19. Genel olarak güvenli olmaları, sentezledikleri proteinleri dış ortama salgılama kapasiteleri gibi birçok nedenden dolayı cazip endüstriyel organizmalardır. Çünkü, gram negatif bakteriler ürettikleri proteinleri protoplazmalarında ya da periplazmik boşluklarında biriktirirler ve bu da üretilen ürünün izolasyonunu güçleştirerek suştan birden fazla kez yararlanılmasını engeller. Ayrıca sentezlenen ürünlerin organizmaya karşı toksik etki oluşturması söz konusudur. İntrasellüler ortamda sentez ürünlerinin biriktirilmesi çözünmeyen protein oluşumu, yanlış protein katlanmaları ve etkin olmayan disülfit bağ formasyonu gibi sorunları beraberinde 11

30 getirmektedir. Ayrıca gram negatif bakteriler, insanlara toksik olan endotoksin ve intrasellüler protein üretmeleri nedeniyle, proteinlerin izolasyonu ve saflaştırılmasında ekstra maliyet oluşturmaktadırlar 20. Mantarlardaki aflatoksin gibi toksik yada alerjen bileşik üretimi de göz önünde bulundurulduğunda, gram pozitif bakteriler, özellikle Bacillus türleri endüstriyel enzim üretiminde öncelikli olarak tercih edilmektedirler. Bacillus türleri çeşitli kompleks substratlara karşı aktivite gösteren çok sayıda ve çeşitli hidrolitik enzimler üretmekte ve salgılamaktadırlar. Bu nedenle Bacillus cinsindeki organizmalar, endüstriyel alanda α-amilaz, proteaz, glukanaz, glukoz izomeraz ve endonükleaz gibi enzimlerin üretiminde yaygın şekilde kullanılmaktadırlar Termofilik Basiller Termofilik Basiller 1994 yılında iki cins halinde (Bacillus ve Alicyclobacillus) sınıflandırılmaktaydı ve türlerin çoğu Bacillus cinsi içerisinde yer almaktaydı. Son yıllarda, artan Bacillus cinsi bakterilerinin geniş ve çeşitli grupları yeni cinslere bölünmüştür. Bu cinsler; Alicyclobacillus, Paenibacillus, Brevibacillus, Aneurinibacillus, Virgibacillus, Salibacillus, Gracilibacillus, Ureibacillus ve son olarak Geobacillus tur. Bu yeni cinsler 16S rrna gen sekans analizleri baz alınarak ayrı filogenetik gruplara dahil edilmiştir 22,23. Termofilik basiller, sıcaklıkla muamele edilmiş besin ürünlerinin kontaminantları olarak düşünülseler de esas potansiyelleri proteaz, amilaz, lipaz ve DNA restriksiyon enzimleri gibi termostabil enzimlerin kaynağı olarak öneme sahiptirler 22. Bacillus sp. cinsleri endüstriyel önemi olan termoaktif, termostabil, alkalin, ve şelatör dirençlilik özelliğine sahip enzimler üretirler. Bu enzimler 12

31 kaotropik ajanlara (üre, tiyoüre vb.) ve organik çözücüler gibi kimyasal denatürantlara karşı genellikle dirençlidirler Bacillus licheniformis Yeryüzündeki çoğu toprak ve bitki materyallerinden izole edilebilen Bacillus licheniformis gram pozitif, fakültatif anaerob ve endospor formlu saprofitik organizmalardır. B.licheniformis izolatları denitrifikasyon yeteneği göstererek besin döngüsünde önemli bir yer tutmaktadırlar. Organizmanın hayvanlar ve bitkiler için patojen olmadığı rapor edilmiştir 25. Bacillus licheniformis genom sekansları belirlenmiş olan Bacillus cinslerinden Bacillus subtilis in olduğu grupta yer almaktadır. Bunlar Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus thuringiensis ve alkalifilik türlerden olan Bacillus halodurans ve Bacillus subtilis tir 25. Çizelge 2.2. Bacillus licheniformis in taksonomik yeri 26. Soy Hücresel mikroorganzima Bacteria Firmicutes Bacilli Bacillales Bacillaceae Bacillus Bacillus subtilis group Bacillus licheniformis 13

32 20-25g/l gibi büyük miktarlarda protein içeren ekzoenzimleri biyoteknolojik olarak antibiyotiklerin, biyokimyasalların imalatında, endüstriyel uygulama alanları bulmaktadır 25,27. Son zamanlarda endüstride kullanılan enzimleri arasında farklı proteazlar, α-amilaz, penisilinaz, pentosanaz, sikloglikoziltransferaz, β-mannanaz ve farklı pektinolik enzimler bulunmaktadır. Spesifik Bacillus licheniformis türleri basitrasin ve protisin gibi peptid antibiyotikleri üretmede kullanılırlar buna ek olarak çoğu türleri de sitrik asit, inozin, inozinik asit ve poli γ-glutamik asit gibi kimyasalların üretilmesinde kullanılırlar Termostabil Enzimler ve Biyoteknolojide Kullanımı Enzimler hayatımıza bizim asla fark edemeyeceğimiz derecede girmişlerdir. Enzimler, yiyeceklerin, içeceklerin üretiminde, hazırlanmasında, giysilerin temizlenmesinde, hastalıkların teşhisinde kullanılır. Enzimler hayatın arkasındaki protein yapısındaki makinelerdir ve biyoteknoloji teknikleri ve enstrümanları ile biyolojik maddelerin hazırlanmasında kullanılmak üzere adaptasyonları yapılmaktadır 28. Enzim teknolojisi, ekonomik, etkili ve ekolojik tekniklere olan büyük ihtiyaç nedeniyle ilerleme kaydetmiştir. Biyoteknoloji sayesinde, yeni tür enzimlerin büyük ölçeklerde ve ekonomik olarak üretilmesi mümkün olmuştur. Üretimi, sabitlenmesi (non-reaktive), paketlenmesi ve belirli ölçeklerde dağıtımının yapılabilmesi sonucu, enzimler, raflarda duran ekzotik bir maddeden ziyade, büyük depolarda muhafaza edilebilen endüstriyel bir madde olmuştur. Enzim endüstrisindeki ulaşılan nokta, onun yeni pazarlara ve yeni uygulama alanlarına girişini teşvik etmektedir

33 Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Bunun nedeni mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel ve hayvansal kaynaklara göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olmaları, daha stabil ve daha ucuz olmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleridir 29. Ekstrem mikroorganizmalardan özellikle termofiller, termostabil biyokatalizörlerinden dolayı çok ilgi çekmektedir. Pek çok canlı grubunun yaşayabilmesinin imkânsız olduğu sıcaklıklarda bile termofil bakterilerin enzimlerini kullanabilmeleri ve yaşamlarını sürdürebilmeleri, araştırmacıları bu konuda çalışmalar yapmaya yöneltmiştir 30. Biyoteknolojik açıdan büyük potansiyellere sahip olan ekstremozimler içerisindeki en önemli enzimler termostabil enzimlerdir ve bu enzimler protein stabilitesinin anlaşılması için model olarak kullanılmaktadır. Diğer önemli bir neden ise bu enzimlerin yüksek sıcaklıklardaki biyoteknolojik işlemlerdeki avantajlarıdır 31 Yüksek sıcaklık bakteriyel ve viral kontaminasyon riskini azaltır. Ayrıca sıcaklığın arttırılması organik bileşiklerin çözünürlüğü ve biyolojik olarak kullanılabilme açısından önemli etkilere sahiptir. Sıcaklığın artması beraberinde viskozitenin düşmesini ve organik bileşiklerin difüzyon katsayısının artmasını da beraberinde getirmektedir. Sonuç olarak küçük alanlarda yüksek reaksiyon hızı gerçekleştirilmektedir 32. Termostabil proteinler değişik denatüre şartlara yüksek tolerans gösterirler. Bu proteinler mezofilik proteinlere nazaran daha yüksek α heliks ve β tabakası içeriğine sahiptirler. Ayrıca bu proteinler çok yavaş katlanma hızı gösterirler. Bu özelliğin değişik denatüre şartlarında doğal yapıyı korumada önemli olduğu 15

34 sanılmaktadır 4,10. Termofillerin ısıya, denatürasyona, proteolizise dayanıklı proteinler içerdikleri rapor edilmiştir. Bu organizmalar tarafından sentezlenen ve şaperonin proteinleri olarak adlandırılan bu proteinler, denatüre proteinlerin katlanmasına yardımcı olarak doğal formlarını almalarına ve fonksiyonlarını yeniden kazanmalarına yardımcı olurlar. Ayrıca termofiller non-termotolerant organizmaların kullandığı elektrostatik disülfit köprüsü ve hidrofobik etkileşimleri kullanarak yüksek sıcaklıklara adapte olurlar 10. Biyoteknolojinin ilerlemesiyle ve enzimlerin saf olarak elde edilmeleriyle uygulamalar birçok alanda artmıştır ve termostabil enzimlerin kullanılabilirliğiyle endüstriyel işlemler için bir çok yeni imkan ortaya çıkmıştır. Termostabil enzimler çoğunlukla termofilik organizmalardan izole edilirler ve doğal yapılarındaki stabiliteden dolayı birtakım ticari uygulama alanları bulurlar 10. Bu güne kadar 2000 den fazla enzim tanımlanmış olup, bunlar arasında yaklaşık 100 tanesi ticari kullanıma uygun bulunmasına rağmen günümüzde sadece 18 tanesi endüstriyel amaçla kullanılmaktadır. Ticari olarak kullanılan enzimlerin %59 unu proteazlar, %28 ini karbohidrazlar, %3 ünü lipazlar ve%10 unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır β-galaktozidaz Glikozidazlar ( EC 3.2.1, EC 3.2.2, EC ) iki veya daha fazla karbonhidrat arasında veya bir karbonhidrat ile karbonhidrat olmayan bir başka bileşik arasındaki glikozidik bağları katalizleyen enzimler olarak bilinirler 33. Biyoteknolojik olarak en çok dikkat çekici olan glikozidazlar β-galaktozidazlardır. β-galaktozidazlar genellikle aminoasit dizilerindeki benzerliklere göre 4 farklı 16

35 familyada sınıflandırılmışlardır: GH 1, GH 2, GH 35, GH Bunlardan GH-2 en iyi çalışılanı olup, Escherichia coli, Aspergillus, Bacillus megaterium ve S.solfactorius β-galaktozidazlarını içine alır, oysa termofilik basiller de dahil olmak üzere termofilik bakteriler, psikrofilik ve halofilik mikroorganizmalar GH -42 ye aittir 35. β-galaktozidaz ( β-d-galaktozid galaktohidroliz, E.C ), laktozdaki β-glikozidik bağının enzimatik hidrolizini katalizleyerek, laktozdan daha tatlı ve çözünürlüğü laktoza göre daha fazla olan glukoz ve galaktozun oluşmasını sağlamaktadır 36. Katalizlediği reaksiyon aşağıdaki gibidir (Şekil 2.1.): Şekil 2.1. β-galaktozidaz tarafından glikozidik bağın kırılma reaksiyonu Reaksiyon Mekanizması Laktozun enzimatik hidrolizi besin endüstrisinin önemli biyoteknolojik uygulamalarından birisidir. β-galaktozidaz tarafından glikozidik bağın kırılma mekanizması İçinde, β-galaktozidaz ın karbonyum iyon galaktozil geçiş bölgesi aracılığıyla bir glikozil enzim ara ürünü oluşturup hidrolize eden bir çift yer değiştirme reaksiyon mekanizması önerilmektedir 37. Literatürlerde, β-galaktozidaz ın aktif mekezinde sistein ve histidin aminoasidinin bulunduğu ve fonksiyonlarının sırasıyla proton vericisi ve proton alıcısı olduğu 17

36 bildirilmektedir. Enzimatik hidroliz prosedürü boyunca sistein aminoasidinde bulunan sülfidril grubu proton vericisi, histidin aminoasidinde bulunan imidazol grupları da nükleofil bölge olarak davranarak glikozidik bağın kırılmasını kolaylaştırırlar 36,38. Şekil 2.2. β-galaktozidaz tarafından laktozun hidrolizi 39. Enzimatik reaksiyon esnasında galaktozil reaksiyonu olarak da adlandırılan ikinci bir reaksiyon daha meydana gelir. Bu reaksiyonda β-galaktozidaz, galaktozil i hidroksil grubu içeren alıcıya transfer eder (Şekil 2.3). Bu alıcı su olduğu zaman, hidroliz sonucu serbest galaktoz meydana gelir. Bununla birlikte, belirli koşullar altında, diğer şekerler alıcı olarak davranabilirler ve oligosakkarit oluşumlarına edenolurlar

37 Şekil 2.3. β-galaktozidaz tarafından katalizlenen galaktozil transfer reaksiyonu Endüstriyel Açıdan Önemli β-galaktozidaz Kaynakları β-galaktozidazlar doğada yaygın bir şekilde dağilım gösterirler 40. Bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalar gibi çok farklı biyolojik sistemlerde bulunmaktadırlar 41. Ticari kullanımlar için, yüksek oranda β-galaktozidaz üreticisi olan çoğu organizmaların varlığı bilinmektedir 42. Buna rağmen genellikle maya (intrasellüler), mantar ya da küfler (ekstrasellüler) enzim üreticisi olarak bilinmektedir. Bakteriyel kaynaklar kolay fermentasyonları, yüksek enzim aktiviteleri ve stabiliteleri ile giderek önem kazanmaya başlamıştır. Ticari olarak kullanılan β-galaktozidaz kaynakları mikrobiyal orjinlidir (Çizelge 2.3.) Bununla birlikte bu mikroorganizmalardan elde edilen β- galaktozidazlar farklı özelliktedirler. Bu nedenle çeşitli uygulama alanlarında kullanılmaktadırlar. Enzimin uygulanabilirliğini operasyonel ph oranı belirlemektedir. Bu karakteristik özelliklere göre enzimler iki grup içermektedirler, bunlardan birincisi mantarlardan elde edilen asidik ph ya sahip enzimlerdir, ikincisi mayalardan ve bakterilerden elde edilen nötral ph ya sahip enzimlerdir 43. Mantarlardan elde edilen enzimlerin optimum ph sı 3 ile 5 arasında iken 19

38 oldukça yüksek olan optimum sıcaklıkları da C arasında değişmektedir. Bilindiği gibi düşük asit ve yüksek sıcaklık mikroorganizmaların büyümesini engellemektedir. Sonuç olarak bu özellikleri ile mantarlara ait β-galaktozidazların kullanımları yüksek asit ürünleri ve farmasötik preparasyonlarla sınırlandırılmıştır. Bununla birlikte mayalardan elde edilen β-galaktozidazlar nötral ph ya sahip olmaları ile karakterize edilirler. Bu nedenle sütteki laktozun hidrolizinde ve tatlı peyniraltı suyu proseslerinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Mayalardan β-galaktozidaz üretilmesi, yüksek oranda ve düşük fiyatta elde edilmeleri ve beslenme için güvenli olmaları açısından avantajlıdır. Bununla birlikte, bu enzimin en önemli karakteristiği düşük sıcaklıkta stabil olmasıdır. Sıcaklık 55 C nin üstüne çıktığında enzim hızlı bir şekilde inaktif olmaktadır 43. Bakteriyel β-galaktozidazlar nötral ph ya sahip olmaları ile karakterize edilmektedirler. Optimum sıcaklıkları türden türe değişiklik göstermektedir 44. Termofilik kaynaklar termostabil β-galaktozidazlar üretirler 45. Termofilik β- galaktozidazlar, mezofilik karakterdeki β-galaktozidazlar kullanıldığında karşılaşılan sorunlara termal stabiliteleri ile çözüm getirirler. Bu özellikleri ile süt ve süt ürünleri endüstrisinde yüksek sıcaklık gerektiren ürünlerin sterilize edilmesinde ve mikrobiyal kontaminasyon riskini azaltmada avantaj sağlamaktadırlar 46. Çizelge2.3. Mikrobiyal β-d galaktozidaz kaynakları 47,35*. Kaynak Mikroorganizma(lar) Mantarlar Alternaria alternata, A. palmi Aspergillus foetidis, A. fonsecaeus, A. niger, A. oryzae, A. carbonarius 20

39 Auerobasidium pullulans Beauveria bassiana Curvularia inaequalis Fusarium moniliforme, F. oxysporum Mucor meihei, M. pusillus Neurospora crassa Paecilomyces varioti Penicillium conescens, P. Chrysogenum Rhizobium meliloti Saccharopolyspora rectivirgula Scopulariopsis sp. Streptomyces violaceus Trichoderma reesei Mayalar Bullera singularis Candida pseudotropicalis Saccharomyces anamensis, S. fragilis Kluyveromyces bulgaricus, K. fragilis, K. lactis, K. marxianus Bakteriler Arthrobacter sp. Bacillus acidocaldarius, B. circulans, Alicyclobacillus acidocaldarius ssp. Rittmannii* B. coagulans, B. subtilis B. megaterium, B. stearothermophilus Bacteroides polypragmatus 21

40 Bifidobacterium bifidum, B. infantis Clostridium acetobutylicum, C. thermosulfurogens Corynebacterium murisepticum Enterobacter agglomerans, E. cloaceae Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. kefiranofaciens, L. Helviticus L. lactis, L. sporogenes, L. thermophilus, L. delbrueckii Leuconostoc citrovorum Pediococcus acidilacti, P. pento Propionibacterium shermanii Pseudomonas fluorescens Pseudoalteromonas haloplanktis Streptococcus cremoris, S. lactis, S. thermophilus Sulfolobus solfataricus Thermoanaerobacter sp. Thermus rubus, T. aquaticus, T. thermophilus Vibrio cholera Xanthomonas campestris 22

41 2.7. β-galaktozidaz'ın Fizikokimyasal Özellikleri Enzim, çeşitli mikrobiyal kaynaklarda, protein zincirinin uzunluğu ve aktif merkez pozisyonunun farklı olması gibi özelliklere sahiptir. Bununla birlikte yapılan son çalışmalarda farklı kaynaklardaki β-galaktozidaz enzimlerinin, katalitik merkezlerinde benzer olarak glutamik asit kalıntıları bulunmuştur. β-galaktozidaz'ın molekül ağırlığı organizmalar arasında farklılık göstermektedir. E.coli' ye ait β-galaktozidaz'ın molekül ağırlığı yaklaşık 116,353 kda dur 36. Bifidobacterium longum CCRC ait β-galaktozidaz'ın molekül ağırlığı 357 kda dur 48. Bir ve iki değerlikli katyonların etkisi birçok çalışmada belirtilmiştir 49,50. Mg +2 ve Mn +2 gibi iki değerlikli katyonlar β-galaktozidaz'ın aktivitesini arttırırken, tek değerlikli katyonlar pozitif ya da negatif etkiye neden olabilmektedirler 45 Ca +2 β-galaktozidazların inhibitörü olarak bilinmektedir. Fakat sütte bulunan Ca +2 iyonlarının tamamı kazeine bağlıdır ve çözelti içerisinde serbest halde bulunmamaktadır. Bu nedenle β-galaktozidaz ın aktivitesini inhibe etmemektedir β-Galaktozidaz ın Biyoteknolojik Kullanım Alanları Peyniraltı suyundaki laktozun uzaklaştırılması için kullanımı Peyniraltı suyu; süt fabrikalarının atık maddesi olup, sütün peynir mayası veya organik asitlerle pıhtılaştırılmasından ve peynirin esasını oluşturan kazeinin çöktürülmesinden sonra geri kalan yeşilimsi sarı renkte bir sıvıdır. Zengin bir içeriğe sahip olan peyniraltı suyu gelişmiş ülkelerde ilaç, yem ve laktoz üretimi gibi alanlarda kullanılmakta fakat ülkemizde hemen hemen hiç değerlendirilmeden toprak veya su ortamına verilmektedir 51,52. β-galaktozidazın peyniraltı suyunda yoğun 23