Histoloji Çalışma Metotları

Transkript

1 1 Histoloji Çalışma Metotları PROF. İ.Ü. CERRAHPAŞA TIP FAKÜLTESİ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

2 Histoloji 2 Yunanca Logos Histo Ağ veya Doku Çalışma Dokuların Çalışılması Hücreler Hücreler dışı Ortam MATRİKS

3 Neleri İçerir? 3 Eğer Gözün Görme Sınırı İçinde İse Anatomi Sınır = 0.1 mm (100 μm)

4 Neleri İçerir? 4 Eğer Bir Büyüteç Aracılığı ile İse Mikroskopik Anatomi

5 Yapı ve Fonksiyon 5 Yapının İncelenmesi Fonksiyonun Anlaşılmasında Fonksiyonun Bilinmesi Yapının Tahmin Edilebilmesinde

6 Anormali Anlamak 6 Normalin Bilinmesi Gerekir Yapı Fonksiyon Böylece Patoloji Anlaşılabilir Anormal: Yapı Fonksiyon

7 7 İki Mühim Metodik Düşünce Limitler Uygun Seçim Hangi Mikroskop? Hangi Mikro-teknik?

8 Histolojinin Gelişebilmesi 8 Şu Gelişimlere Bağlıdır: Mikroskoplar Kimya Fizyoloji İmmünoloji Patoloji

9 Bilim Sahalarının Etkileşimi 9 Histo-kimya Histo-fizlyoloji İmmüno-sito-kimya Histo-patoloji

10 Araçlar ve Metodlar 10 Ölçü Üniteleri Doku Hazırlıkları Mikroskopi Histokimya Doku Kesitlerinin Yorumu

11 Araçlar ve Metodlar 11 Radioautografi Canlı Doku ve Hücrelerin İncelenmesi In Vitro Saf Hücre Kültürleri Hücre Fonksiyonu

12 Ölçü Üniteleri 12 Micrometre μm mm m ( 10-6 m ) Nanometre nm μm m ( 10-9 m )

13 Dokunun Hazırlanması 13 İnce Doku Örnekleri Işık Geçirgenliği İnce Saydam Kesit

14 Dokunun Hazırlanması 14 Çok İnce Örnek Kesit Alma Yok Doku Tabakaları Saydam Membranlar Işığı Geçiren Mezanterler Kurbağa Larva Kuyruğu Hamster in Yanak Poşu Duvarı

15 Dokunun Hazırlanması 15 Çok İnce Örnek İncelenebilinir Uzun Sürede Değişen Ortamlarda Fizyolojik Deneysel

16 Dokunun Hazırlanması 16 Kalıcı Örnekler Doku Örnekleri

17 Dokunun Tespiti 17 Otolizi Önlemek Doku Sindirimi Enzimler Bakteri

18 Tespit 18 Dokuyu Koruyabilmek İçin Kullanılan Kimyasal Maddeler Kimyasal Yöntem? (Henüz Çok İyi Anlaşılamamıştır) Komplike

19 Rutin IM İçin En İyi Tespit Eriyiği 19 İzotonik Solüsyon da Tamponlanmış 4% Formol aldehit

20 De-kalsifiye Edilmemiş 20 Kemik ve Diş İçin En İyi Tespit Eriyiği 70% ALKOL

21 Popüler Fiksatifler 21 Formol aldehit Glutar aldehit Proteinlerle Reaksiyona Girer (Amine Grupları ile (Nh 2 )) Proteinler Arasıda Çapraz Bağlar Kurabilir

22 Fiksatifler ve Yüksek Rözülüsyon 22 Çift Fiksasyon Yöntemi (EM) Ultrasütrüktürü Koruyabilmek İçin Tamponlanmış Glutaraldehit Tamponlanmış Osmium Tetroxit Lipid ve Proteinleri Korur Lipid ve Proteinleri Boyar

23 Dehidratasyon (Suyun Giderilmesi) 23 Gömmek İçin Gerekli Suyun Giderilmesi Yükselen Serilerde Etanol ve Su 70% 100%

24 Impregnasyon (Şeffaflaştırma) 24 Etanol ün Yerini Alma Gömme Ortamı İle Karışabilme Xylene, Parafine Gömme Doku, Işığı Geçirir Hale Gelir (Şeffaflaşır)

25 Gömme 25 Kesit Alma İçin Gerekli İnce Kesitlerin Alınabilmesi Yumuşak Dokunun Sert Hale Getirilmesi Gömme Ortamları Parafin (IM Rutin) Plastik Rezinler (IM & EM) Büzüşmeyi Engeller Boşlukları Doldurur

26 Parafine Gömme 26 Etüvde Erimiş Parafin Isı o C Şeffaflaştıran Maddeyi Buharlaştırır İnfiltrasyon Kalıplara gömme

27 Mikrotomlar 27 Kesit Alma Bıçaklar Çelik Elmas Cam Kesit Kalınlığı (1-10 μm)

28 Dondurma Mikrotomları 28 Lipidlerin Kaybolması Xylene Lipid Kaybını Engelleme Doku Düşük Isılarda Sertlaştirilir Gerekli Sertlik Elde Edilir Kesit Alınır

29 Dondurma Mikrotomları 29 Kısa Sürede Kesit Alınabilir Gömme İşlemi Yoktur Parçaların Süratle İncelenebilmesi Sağlanır Cerrrahi Müdahaleler Sırasında Teşhise Gitme

30 Dondurma Mikrotomları 30 Histokimyasal Çalışmalarda Çok Hassas Enzimler Küçük Moleküller Pek Çok Enzim Dondurma İle Etkisiz Hale Gelmez

31 Dokunun Hazırlanması 31 Kalıcı Hazırlık Mikroskop Altında İnceleme

32 Boyalar 32 Seçici Olarak Doku Kısımlarını Boyarlar Asid Bileşenler Bazik Bileşenler Doku Bileşenleri Boyanır Bazik Boyalar İle (Bazofilik) Asid Boyolar İle (Asidofilik)

33 Basik Boyalara Örnekler: 33 Toluidine Blue Methylene Blue Hematoxylin Dokunun Basokilik Kısımlarını Boyar Nucleoproteinleri Glycosaminoglykanları Asid Glikoproteinleri

34 Asid Boyalara Örnekler: 34 Orange G Eosin Asid Fuksin Dokunun Asidofilik Kısımlarını Boyar Mitokondrileri Sekretuar Granülleri Kollajen

35 35 Hematoxylin ve Eosin (H&E) En sık Kullanılan Boyalar Hematoxylin Maviye Boyar Nüveyi Sitoplazmanın RNA - zengin Kısımlarını Eosin Pembe - Kırmızı Sitoplazma Kırmızı Kollajen Pembe

36 Metaller ile Impregnasyon 36 Gümüş Altın

37 İdeal Doku Hazırlığı 37 Uygun Kimyasal Maddeler Lam Üzerindeki ince Kesitler Orjinal Hallerini Korumalı: Morfolojisini Moleküler İçeriğini

38 Artefakt lar 38 Orijinali Koruma: Morfoloji Moleküler Muhteviyat

39 Dokunun Çok Şüratli Tespiti 39 Morfolojinin Korunması Perfüzyon

40 40 Surfaktant ın Morfolojik Demonstrasyonu Fiksasyon Vaskülar Perfüzyon Skop Elektron Mikroskop

41 IM 41 Doku Yapıtaşları İle Fotonların Etkileşeme Im Faz Kontrast Mikroskobi Polorize Mikroskobi Konfokal Mikroskobi Floresans Mikroskobi

42 Işik Mikroskobu Kısımları 42 Mekanik Optik

43 IM Optik Kısımları 43 Kondansatör Işığı Toplar Ve Odaklar Koni Şeklinde Bir Işık Kaynağını Meydana Getirir İncelenecek Parçayı Aydınlatır

44 IM Optik Kısımları 44 Objektif Büyütür Işığın İzini Odaklar

45 IM Optik Kısımları 45 Oküler İmajı Dahada Büyütür İmajı Odaklar İzleyicinin Retinasına Fotoğraf Plakasına

46 Rezülüsyon 46 Birbirinden ayrı olarak algılanabilen İki Partikül Arasıdaki En Küçük Mesafe

47 47 Mikroskobun Çözüm Gücü Elde Edilebilen Kritik Faktörler Temiz Detaylı Mikroskop Tan Elde Edilebilen

48 48 IM Maksimum Çözüm Gücü ~0.1 μm Büyütmelerde İyi Görünüm Verir X Rözülüsyon =< 0.1 μm

49 Büyütme ve Rözülüsyon 49 CözümGücüSınırlıdır Işığın Dalgaboyu ile

50 50 Lütfen Hangi! Biliniz Mikroskobu Kullanacağınızı Hangi Mikrotekniği

51 Observasyon ve Enterperatasyon 51 Gross Anatomi 3 Boyutlu Yapılar Histoloji Parçadan Alınan Kesitler 2 Boyutlu Seri Kesitlerden Nihayi Sonuca Gidilebilme