PULPA KÖK HÜCRELERİ. T.C. Ege Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Endodonti Anabilim Dalı BİTİRME TEZİ. Stj. Dişhekimi Rouzbeh FAZELİ

Transkript

1 T.C. Ege Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Endodonti Anabilim Dalı PULPA KÖK HÜCRELERİ BİTİRME TEZİ Stj. Dişhekimi Rouzbeh FAZELİ Danışman Öğretim Üyesi: Yrd. Doç. Dr. Tuğba TÜRK İZMİR

2 T.C. Ege Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Endodonti Anabilim Dalı PULPA KÖK HÜCRELERİ BİTİRME TEZİ Stj. Diş Hekimi Rouzbeh FAZELİ Danışman Öğretim Üyesi: Yrd. Doç. Dr. Tuğba TÜRK İZMİR

3 ÖNSÖZ Tezimin hazırlanmasında benden yardımlarını esirgemeyen değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Tuğba TÜRK e ve her zaman yanımda olan aileme ilgilerinden dolayı teşekkür ederim. İzmir-2015 Stj. Diş Hekimi Rouzbeh FAZELİ 3

4 İÇİNDEKİLER 1. GİRİŞ PULPA KÖK HÜCRE Kök Hücre Nedir? Dental Kök Hücrelerin İşlevleri Diş Pulpası Kök Hücreler Dişin Gelişim Süreci Diş Folikülünden Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücreleri Diş Epitel Hücreleri Diş Mezenkimal Kök Hücreler Diş Pulpa Kök Hücreleri (DPSCS) Periodontal Ligament Kök Hücreleri Periodontal Ligament (PDLSCS) Kökenli Mezenkimal Kök Hücreler Apikal Papilla Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler Eksfoliye Süt Dişlerinin Dental Pulpalarından Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler Dental Pulpa Kök Hücre Farklılaşması ve Sinyal Moleküllerin Durumu Dental Pulpa Hücrelerinin İzolasyonunun Sağlanması

5 2.12. Kriyoprezervasyon Uygulanması Diş Doku Mühendisliğinde Epitelial ve Mezenkimal Kök Hücrelerin Yeri ve Önemi İnsanda Otolog Dental Doku Mühendisliğinin Klinik Olarak Denenmesi Periodontal Rejenerasyon Uygulanması Diş Pulpası Rejenerasyonu Uygulanması Bütün Diş Rejenerasyonu Diş Dokusu ve Kan Damarlarının Rejenerasyonu Uygulanması Kemik Doku Rejenerasyonu Uygulanması Dental Doku Onarımı Odontojen Duyarlı Epitel Hücreleri Odontojenik İndüktif Mezenkimal Hücreler Hücre Reagregasyonu ile Diş Rejenerasyonu SONUÇ ÖZET KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ

6 1. GİRİŞ Kök hücre (stem cells) konusu, birçok hastalığın tedavisinde umut ışığı olan ve günümüzde oldukça popülerlik kazanmış bir konudur. Farklı kaynaklardan (kemik iliği, kordon kanı, beyin, saç folikülü, deri epiteli, retina, böbrek ve diş dokuları) elde edilmiş kök hücrelerinin, hasarlı dokuların tamiri için alternatif bir kaynak olduğu bilinmektedir. Diş kaybı veya eksikliği, farklı patolojik durumdan kaynaklanabilen yaygın bir durumdur. Kayıp dişin yerine fonksiyonel ve estetik bir çözüm önerisi, medikal açidan önem taşımaktadır. Son zamanlarda bilim adamları, diş doku mühendisliğine, mevcut protetik yöntemlerin ötesinde potansiyel bir tedavi olarak odaklanmaktadır. Doku mühendisliği, kayıp dişi biyonik dişle değiştirmeyi ya da hasara uğramış diş dokularını restore etmeyi başarması yönünden umut verici bir yaklaşımdır. Bu amaçla kullanılan yöntem, yapı iskelelerinin yüzeyine ekilmiş kök hücrelerle bir biyokompleks yaratmaktır. Mezenkimal kök hücrelerin değişik popülâsyonları dişte bulunmuştur. Bu değişik hücre tipleri, dişteki lokalizasyonuna göre sınıflandırılır ve bu hücreler çok az miktarda farklı özellik gösterirler. Dental pulpa ve periodontal ligamentten izole edilmiş dental kök hücrelerin, diş mühendisliği için en uygun hücreler olduğu düşünülmektedir. Minenin rejenerasyonu için uygun kaynak olacak epitelyal kök hücre bulunması ise hala bir araştırma konusudur. 1

7 2. PULPA KÖK HÜCRE 2.1. Kök Hücre Nedir? Kök hücreler sınırsız bölünebilme, kendini yenileme, organ vedokulara dönüşebilme yeteneğine sahip farklılaşmamış hücrelerdir. Kök hücreler, farklı özelleşmiş hücre tiplerine bölünebilen ve diferansiye olabilen bütün çok hücreli organizmalarda bulunan bir biyolojik hücre tipidir. Hücre üretimini sağlamak üzere kendini yenileyebilir. Bu nedenle doku tedavisi için umut verici bir kaynaktır. (1) Kök hücrelerin iki tipi vardır; embriyonik kök hücreler ve yetişkin kök hücreler. Embriyonik kök hücreler; embriyonun ortaya çıktığı yerde, erken embriyonik gelişimde, ince duvarlı, içi boş yapı şeklindeki blastositin iç hücre kitlesinden meydana gelir. İç hücre kitlesindeki hücreler vücut dokularını meydana getirirken; hücrelerin dış tabakası, plasenta ve uterus içinde fetal gelişim için gerekli olan diğer destekleyici dokuları doğurur. (2) Bu hücreler, üç germ yaprağını oluşturacak kapasiteye sahiptir ve birçok diğer hücre tipini geliştirmek üzere de yetkinlerdir. Yetişkin kök hücreler, göbek kordon kanı (ki burada bulunan pluripotent kök hücre sayısı görece daha az sayıdadır) kemik iliği ve kanda bulunur. Bu yetişkin kök hücreler, lösemi ve kemik iliği transplantasyonu ile kemik-kan kanserlerini ve bazı hematopoetik hastalıkları tedavi etmek için uzun yıllardır tercih edilmektedir. (3) 2.2. Dental Kök Hücrelerin İşlevleri Kök hücreler dişin farklı bölgelerinden, farklı popülâsyonlarda izole edilebilmektedir. Bunlar; hem eksfoliye dişler (süt dişleri) hem de yetişkin dişlerinin 2

8 pulpasından, diş kökünün kemiğe bağlı periodontal ligamentten, sürmemiş dişi çevreleyen dokudan ve gelişmekte olan köklerin uçlarından kaynaklı hücreler içerir. Bu hücreler, nöral krest hücrelerinden farklılaşmıştır ve hepsi belirleyici genlerinin sentezlenmesini ve mezenkimal hücre dizilerine (osteoblast, kondrosit, adipositler) diferansiyasyonunu sağlayan genel mezenkimal kök hücre benzeri özelliklere sahiptir. Farklı hücre popülâsyonları; kaynak doku, fonksiyon ya da kültür koşullarının belirsizliğinin sürmesine bağlanabilen farklılıklara rağmen; kültürdeki büyüme oranları, marker gen ifadeleri ve hücre farklılaşmaları farklılık gösterir Diş Pulpası Kök Hücreler Pulpanın mezenkimal kök hücreler içerdiği hipotezi; mine, dentin ve pulpa hasarlarında odontoblastlara dönüşebilen mezenkim hücrelerin varlığından kaynak almaktadır (4,5) ve günümüzde pulpa gibi diş çeşitli diş dokularından kök hücreler üretilebileceği, artık bilinen bir gerçektir. (2, 6) Dental pulpa kök hücreleri (DPSCs) olarak adlandırılan kök hücreler, yetişkin insan dental pulpalarından izole edilirler. Bu hücreler, sporadik ama genellikle kalsifiye nodüller üreten yüksek sayıda koloni oluşumu ve yüksek proliferasyon oranına sahiplerdir. (2) Buna ek olarak, in vivo immunsuprese farelerde transplantasyon, DPSCs nin dentin-pulpa benzeri karışık formda fonksiyon gösterebilen dental doku oluşturma yeteneğine sahiplerdir. (7) Daha ileri araştırmalarda ise, DPSCs nin in vitro adipositler, odontoblastlar, kondrositler, osteoblastlar gibi diğer mezenkimal hücreler türevlerine diferansiye olma yeteneklerinin olduğunu ortaya çıkarmıştır. (8, 9) DPSCs fonksiyonel olarak aktif nöronlara dönüşür ve implante DPSCs potansiyellerini, nöral bozukluklar için hücresel terapi olarak düşünülen, endojen akson rehberliğini indükler. (10, 11) 3

9 Pedodontist Dr. Sangtao Shi, 2003 yılında 6 yaşındaki kızının süt dişlerini kullanırken, bebek diş kök hücrelerini keşfetmiş ve bunları, insan süt dişlerindeki kök hücreler (SHED) olarak isimlendirmiştir. Dental pulpa kök hücreleri (DPSCs), dental pulpanın hücreden zengin tabakası içinde bulmaktadır. Multipotansiyellerini ise, nöral krestten embriyonik orjinli olmaları açıklar. Bu kök hücreler, belli uyaranlar altında; adipositler, nöronlar, kondrositler ve mezenkimal kök hücreleri içeren birçok hücre tiplerine diferansiye olurlar. (12, 13) Bunlar, geniş terapotik uygulamaları olan en yüksek potansiyelli kök hücrelerdir. (6) Dental pulpa kök hücreleri, yetişkinlerde ve çocuklarda bulunabilir. (14) Diş kökenli kök hücrelerin, izole edilmesi özel bir protokol gerektirir. (15) SHED ve DPSCs, morfolojik ve fonksiyonel karakteristikleri olan, insan diş pulpalarına yakından benzeyen bir dokuyu üretmede yeteneklidir. (3, 16) Doğumda acilen toplanması gereken göbek kordonu kan hücrelerinin aksine, dental kök hücreler, süt ve daimi dişlerinden oluşturulduğundan dolayı kullanım açısından daha geniş bir zaman aralığına olanak sağlar. Kök hücrelerin toplanması için kullanılabilecek 20 canlı süt dişi ve 32 daimi diş vardır. Çekim endikasyonu konulmuş dişlerden elde edilmesi etik olarak kabul edilebilir bir durumdur. Diş çekimden hemen sonra dental kök hücrelerin izole edilmesi diğer yöntemlere göre daha kolaydır. (17) 2.4. Dişin Gelişim Süreci Dişin gelişim sürecinde ilk adım; epitelden, gelişimsel süreci başlatan mezenkime gelen sinyallerle, uyarıyı oluşturmaktır. Dental epitelial hücrelerin lokalize olarak çoğalmaları gerçekleştikten sonra, hücreler, mezenkimal hücrelerin yoğunlaştığı bir tomurcuk oluşturur. Epitelial hücrelerin, tomurcukta diferansiyasyon ve lokalize proliferasyonları, takke aşamasına önderlik eder. Bu durum epitelial sinyalizasyon 4

10 merkezi tarafından kron morfolojisinin başladığı, bir minenin epitelial katlanmalarının düzenlediği aşamadır. Çan aşamasında, özelleşmiş diş hücrelerinin öncüleri; ameloblast, koordine mine hücreleri ve dentin üreten odontoblastlardan oluşur. Diş erüpsiyonu, kemik rezorpsiyonu ve kök gelişiminin koordinasyonunu içerir ve postnatal meydana gelir. Diş gelişimi boyunca, her süreçte oluşan sinyaller, epitelial ve mezenkimal hücreler arasında karşılıklı etkileşir. İlk kilit sinyaller ise, indüksiyon (epitelyum) ve tomurcuk oluşumundan (mezenkim) meydana gelir. Mezenkimal hücreler epitelden sinyalleri aldığında; mezenkim, karşılayıcı sinyalleri, epiteliyuma geri gönderir. Biyolojik olarak replase edilen dişler için kullanılan bu stratejiler, ilk sinyal değişiklikleri sayesinde saf mezenkim indükleyebilen epitel hücrelerini stimüle etmek için, diş gelişimini stimüle etmek için ya da saf epitelyum indükleyebilen mezenkim hücrelerine dönüştürülmesini sağlamak üzere kullanılır. Dişler, özelleşmiş periodontal ligament yoluyla kemiğe entegre bir kompleks oluşturan, iki ayrı özelleşmiş sert doku (mine ve dentin olmak üzere) içeren kompleks organlardır. Embriyolojik olarak dişler, oral epitel hücreleri (ektoderm) ve mezenkimal hücreler kaynaklı kranial nöral krest arasında sıralı karşılıklı etkileşimlerle oluşan ektodermal organlardır. Epitelial hücreler, mineyi oluşturan ameloblastları sağlar. Mezenkimal hücreler ise; diğer tüm farklılaşmış hücreleri; dentini oluşturan odontoblastlar, pulpa, periodontal ligamenti sağlar. Dişler, postnatal gelişmeye devam ederken minenin dış tabakalanması giderek daha zor hale gelir ve diş fonksiyonu için gerekli olan kök formasyonu çocuklarda diş erüpsiyonunu meydana getirmek üzere başlar. Diş kayıpları toplumda yaygın bir durum olduğu için; dişlerin restorasyon, tamir ve replasmanı; klinik tedaviler arasında çok önemlidir. Dişlerden kök hücre elde 5

11 edilmesi çok invazi hastalar açısından çok invaziv bir işlem gerektirmez. Bu olumlu özelliğin yanında, sağlıklı bir pulpaya sahip dişlerdeki yüksek proliferatif kök hücresi popülasyonlarının varlığı da önemli bir pozitif durumdur. Bu kök hücreler; diş tamiri için, restorasyon, rejenerasyon da kullanılabilineceği gibi, dental tedaviler dışındaki bazı hastalıklar için kök hücre kaynağı olabilmektedir Kök hücrelerin kaynağı bu dişlerin önemli ama genellikle göz ardı edilen avantajı ise; postnatal kök formasyonu gelişimsel süreçte olduğundan, kök formasyonunu kapsayan hücrelerin diğer dental kök hücre kaynaklarına kıyasla daha embriyonik benzeri olmasıdır. (2) 2.5. Diş Folikülünden Elde Edilen Mezenkimal Kök Hücreleri Dental folikül, erüpsiyondan önce gelişen diş jerminin, mine organı ve dental papilini saran gevşek ektomezenkim kaynaklı konnektif bir dokudur. (18) Sementoblastların, PDL ve osteoblastların öncüllerini içerdiğine inanılmaktadır. Dental folikül hücreleri (DFC), kollagen sentezleyen ve liflerle komşu kemik ve sement yüzeylerini etkileyen PDL fibroblastların indüklemesi dolayısıyla diferansiye olarak PDL yi oluşturur. DFC, SCID farelerine transplantasyondan sonra sementoblast benzeri hücreler oluşturabilirliği ispatlanmıştır. (19, 20) Diş folikülü, gelişen dişi kuşatarak; sement, periodontal ligament, alveolar kemik gibi bazı yapıların formasyonunda etkin rol oynar. DFSCs, 3. molarların follikülünden izole edilmiş ve hücre kültürlerinde geçit 15 e kadar kalabilecekleri ispatlanmıştır. (9) DFSCs nin in vivo sement oluşturabilmeleri mümkün iken (21); DFSCs ise, in vitro osteoblast, adiposit ve sinir benzeri hücrelere diferansiye olması mümkündür. (22, 23) Bir başka çalışmada ise, farelere DFSCs nin 4 hafta süren post-transplantasyonu uygulanması yeni bir periodontal ligament oluşumuyla neticelenmiştir. (24) Bu hücreler, 6

12 periodontal ligament gelişimi çalışmasında ve rejeneratif terapilerle rekonstrüktif tedavilerin gelişimin aşamasında yeni bir araç olarak kullanılabilmektedir. İnsan 3. molar dişlerinden izole edilen dental folikül projenitör hücreleri; kültürde hızlı bağlantılarıyla, kök hücre markerları varsayılan Nestin ve Notch-1 sentezlenmesi ve in vitro kompakt kalsifiye nodülleri oluşturma yeteneği ile karakterizedir. DFC immün bağışıklığı olan farelere transplante edildiğinde, her nasılsa sement ya da kemik formasyonunun oluşumu arzu edilenden az olmuştur.dfc; SCAP ile ortak olarak gelişen bir dokudan hüreleri temsil eder ve belki de diğer dental kök hücrelerden daha fazla plastisite sergilemesi bu yüzdendir. Ancak, aynı zamanda SCAP a benzeri bazı hücrelerin özellikleri ve potansiyel kullanımları açısından ileri araştırmaların yapılmasına ihtiyaç vardır. (21) 2.6. Diş Epitel Hücreleri Diş dokusu oluşumuna iki ana hücre tipi katılmaktadır; mineyi oluşturan epiteliyal kökenli ameloblastlar ve mezenşimal kökenli, dentin üretiminden sorumlu olan odontoblastlardır. Mine, epiteliyal kök hücrelerden orijinli ameloblastlar tarafından oluşturulur. Bu ameloblastlar diş gelişiminde rol oynayan ektodermal kökenli hücrelerdir. Bu hücreler ve öncülleri, diş erüpsiyonundan hemen sonra yok olur ve bundan dolayı kalıcı dişte bulunmazlar, bu yüzden in vivo koşullarda mine üretmek için ameloblastların stimüle edilmesi söz konusu değildir. Hayvan gruplarında; epitelial kök hücreleri, yenidoğan veya genç (hala büyüyen) hayvanların 3. molar dişlerinden alınarak, epitel izole edilmiş ve in vitro koşullarda hücrelerle enzimatik olarak separe edilerek ve çoğaltılır. Bu hücreler, aynı dişten alınmış ve biomateryallere maruz kalmış mezenkimal kök hücreler ile birleştirilebilir. (16, 25) 7

13 Yukarıdaki yaklaşımlar diş formasyonunun ve rejenerasyonunun gözlenmesi açısından gelecek vaad etmektedir. Ancak klinik uygulamalarda bazı zorluklar yaşanabilmektedir Diş Mezenkimal Kök Hücreler Mezenkimal kök hücreler, farklı dokuları kapsayan bir çeşit hücre tipine prolifere ve diferansiye olabilen, hematopoetik olmayan, multipotent hücrelerdir. Bunlar, ilk defa 48 yıl önce, Dr. Friedenstein ve bilimsel grubu tarafından, kemik iliğinde spesifik hücre popülasyonunu tanımlanması ile karakterize edilmiştir. (26) Bu hücreler şu gibi bazı spesifik özellikler gösterirler: 1- Fibroblast benzeri morfoloji 2- Plastik doku kültürü yüzeylere yapışma yeteneği 3- Osteojenik potansiyel olan Bunlar CD90, CD73, CD105, CD44 gibi açık protein markerlarını hücre membranındaki proteinler bu hücrelerde bulunur. İfade eder ve bunlar CD34, CD31, CD45 için negatiftir. (27) Bunlar multipotenttir ve osteoblast, nöroblast, kıkırdak, endotel, kas ve yağ hücrelerine farklılaşabilirler. (28) Mezenkimal kök hücreleri bunun yanında; yağ dokusu, iskelet kası, amniyon sıvısı, kordon kanı, göbek kordonu ve dişte bulunur. Bu hücrelerinin dişteki varlıkları, özellikleri ve nispeten kolay izolasyon tekniğinden dolayı; dental mezenkimal kök hücreleri, doku mühendisliği ve rejeneratif tıpta; potansiyel, yeni ve önemli araç olarak halen yaygın şekilde çalışılmaktadır. Dişte çeşitli mezenkimal kök hücreleri potansiyeli bulunur. Dişteki konumlarına göre gruplandırılabilirler: Dental pulpa kök hücreleri: DPSCs (29) 8

14 Eksfoliye Süt dişlerindeki kök hücreler: SHEDs (30) Periodontal ligament kök hücreleri: PDLSCs (31) Diş folikül kök hücreleri: DFSCs (32) Diş apikal papilla kökenli kök hücreleri: SCAPs (33) Yukarıdaki gruplar benzer olmasına rağmen, ileri paragraflarda analiz edilecek her bir popülasyona, spesifik karekteristik bir denge göstermektedir Diş Pulpa Kök Hücreleri (DPSCS) Dentin-pulpa kompleksinin rejeneratif özellikleri bilim adamlarını dental pulpanın, dentin restorasyonu ya da tamiri için sorumlu kök hücreleri bulunmalıdır hipotezine yönlendirmiştir. (34) Gronthos ve ark. (2000) ilk defa kök hücrelerinin yetişkin dental pulpalarında olduğunu rapor etmiştir. (29) Bu çalışma yetişkin 3. molarlarındaki (19 29 yaşındaki) DPSCs nin izolasyonunu rapor etmiş ve bunların tipik fibroblast şekli, kemik iliğindeki mezenkimal kök hücreleriyle aynı prorları ifade modeli ve in vitro mezenkimal kök hücrelere göre daha çok çoğalma oranına sahip olduğunu göstermişlerdir. (35) Bu özel özellik 3. molarların büyüme, formasyon ve erüpsiyonlarına bakarak son kalıcı dişler olmalarından dolayı olabilir. (36) Bu sebeple bu hücreler, kemik iliğindeki mezenkimal kök hücrelerine oranla daha basit bir durum olmaktadır. (37) DPSCs daha sonra HA-TCP tozuyla birlikte immun direnci baskılanmış farelere nakledildi. 6 hafta sonra, insan dişindekine aynı yapıda dentin-pulpa yapısı gözlemlemişlerdir. Kollagen matriksi odontoblast benzeri tabaka ile dikey olarak doldurulmuş ve odontoblastlarla eş hücreler sitoplazmik süreci kan damarlarıyla infiltre pulpa benzeri interstisyel doku ile arayüzü doldurulmuş dentin matriksine genişletmiştir. 9

15 Aynı grup, 2002 de DPSCs nin aynı hücrelerin oluşumuna sebep açabilen proliferasyonunu ve sinir ve yağ hücreleri gibi farklı hücre tiplerine diferansiye olabileceğini göstermişlerdir. Üstelik in vivo eklenen pulpa ile dentin oluşturabildiği gözlenmiştir. (35) Bir başka çalışma ile DPSCs nin taşıyıcı olarak seramik HA-TCP kullanarak farelerde deri altı transplantasyonu takiben kemik üretebileceği görülmüştür. (38) Buna ek olarak, DPSCs depolanmış ve 2 yıl sonra çözüldüğünde pro-osteoblastlara diferansiye olma yetenekleri sürmüştür; spesifik antijen yüzeyleri değişmeden kalmıştır ve hücreler diş dokusu üretilmiştir. (39) Odontoblastlar, osteoblastlar, kas, yağ, noronlar ve kondrositlere değişme yeteneği olan bu hücreler, son zamanlarda hepatosit morfolojik özellikleri ve fonksiyonel gelişim yeteneği gösterdikleri in vitro koşullarda onaylanmıştır. (40, 41) 2006 da bir çalışma ise; DPSCs nin üç farklı 3D yapı iskelelerine (süngerimsi kollagen, gözenekli seramik, lifli bir titanium kafes) yerleştirildiğinde ve fareye 6 ya da 12 haftalık sürelerle nakledildiğinde, dental pulpa benzeri doku yerine bağlayıcı dokuya benzer yapıda bir doku meydana geldiğini bildirmiştir. (42) Bütün bu çalışmalar, DPSCs nin dental doku mühendisliğinde kullanılabilecek bir kaynak göstermektedir. En önemli sorun, endodontide yeni pulpanın yeniden oluşturulacağı steril kök kanalı içerisinde yapı iskelesini sağlamaktır. Kök hücreler, eğer pulpa, dental apikal papilla ya da periapikal bölgenin kemiği gibi dişin diğer bölgeleri nekroze olmasaydı canlı pulpanın diğer parçalarında da bulunabilirdi. Dünyanın her yerindeki farklı araştırmacılar, farklılaşmalarını destekleyecek ideal mikroçerçevenin yanı sıra DPSCs yi yerleştirmek amacıyla ideal iskeleti bulmak için uğraşmaktadır. Bu mikroçerçevre içerisinde yapılan araştırmalarda hücrelerin kendini 10

16 yenileme, farklılaşma ve hücre ve dokuların çoğalması üzerindeki rolü, rejeneratif tıbbın geleceği üzerinde hayati önem taşıdığını göstermektedir (43) Periodontal Ligament Kök Hücreleri Periodontal Ligament (PDLSCS) Kökenli Mezenkimal Kök Hücreler Periodontal ligament, dişle alveolar kemik arasında bulunan ve dişi çeneye bağlı tutan liflerden meydana gelen bir yapıdır. Periodontal ligament, çekilmiş dişin kökünden izole edilebilen ve kendini rejenere eden ve sement, alveolar kemik gibi diğer dokulara dönüşebilen kök hücrelerine sahiptir. PDLSCs in vitro adipositler, osteoblastlar, kondrositlere dönüşebilir. (8, 44) Periodontal ligament (PDL); çiğneme boyunca şok absorbsiyonu görevi gören alveolar kemik soketinin iç duvarı ile kemiğe benzer sement arasında lokalize olmuş, özelleşmiş hücreler içeren fibröz konnektif bir dokudur. Periodontal ligamentin; uzun zamandır, bir projenitör hücre popülâsyonu içerdiği bilinmektedir(45) ve son zamanlarda çeşitli çalışmalarda (46), insan periodontal ligamentinden in vivo-in vitro sementoblast benzeri hücreler, adiposit, kollagenden zengin konnektif doku üretmek için mezenkimal hücre soylarını diferansiye etmeye yetenekli bir kök hücre popülasyonu tanımlanmıştır. (47) Periodontal ligament, çiğneme kuvvetlerinden devamlı bir baskı altındadır, bu yüzden PDLSC nin, PDL hücre sayılarının korunmasında endojen rol oynaması muhtemel görünmektedir. Bu durum PDL benzeri yapıları oluşturmada diğer dental kök hücre popülâsyonlarından neden daha iyi olduklarını açıklayabilir. (48) Farelerde transplantasyon sonrasında bu hücreler kemik, sement, kıkırdak ve periodontal ligament benzeri yapıları oluşturmuştur. Oysaki domuzlarda yapılan çalışmada PDLSCs periodontal lezyonları iyileştirmek amacıyla kullanılmıştır. (31) 11

17 Başka bir çalışmada ise; PDLSCs, 3. molarlardan izole edilen dental apikal papilladaki kök hücrelerle kombine edildiğinde, yapı iskelesine ekilip genç domuzlardaki alveolar kemiğe transplante edildiğinde, kök ve periodontal yapı oluşumu gözlenmiş ve yapay bir seramik kronu destekleyecek oluşumun ortaya çıkması sağlanmıştır ve dişin normal fonksiyonunun sağlanmasına olanak verecek bir yapı elde edilmiştir. (16) Orcioni ve ark.nın daha yeni çalışmasında, insan PDLSSCs in yüksek Ca 2 ve nitrik oksit üretimi yapan osteoblastlara dönüşebildiğini göstermiştir. Bu gözleme dayanarak, çoğalan PDLSCs nin nitrik oksitle birlikte lokal transplantasyonunun, periodontal lezyonların tedavisi için yeni, gelecek vaad eden bir metot olabileceğini öne sürülmüştür.(49) Üstelik farelerde transplantasyon yapıldığında, APTG-CM (apikal diş jermi hücreleri) ile önceden kültürlenmiş PDLSCs, sement-periodontal ligamentin yapılarını üretebilmiştir. (50) Lezyonları restore etmek için kullanılan hücresel terapilerde, periodontal ligamentin, kök hücrelerin alternatif kaynağı olarak kullanılabileceği görülebilir Apikal Papilla Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler Dental pulpanın öncül dokusu olan SCAPs, üst dental papilladan izole edilen kök hücrelerdir. SCAPs nin önemli kaynakları; 3. molarlar ve açık apikalli dişlerdir. (51) SCAPs nin in-vitro koşullarda osteoblast, odontoblast ve antipositlere diferansiye olabilme yeteneği mevcutken, in-vivo koşullarda ise; osteoblast ve odontoblastlara diferansiye olabileceği kanıtlanmıştır. (52) İnsan SCAPs nın diş formasyonu için, DPSCs ye kıyasla daha yüksek diferansiyasyon oranına ve daha fazla etkiye sahip oldukları gözlemlenmiştir. Ayrıca, fareler üzerinde taşıyıcı olarak SCAPs ve PDLSCs ın yanı sıra HA-TGT (hidroksilapatit, trikalsiyum fosfat) transplantasyonu, dentin ve sement-sharpey lifleri formasyonu ile sonuçlanmıştır. Bunlara göre, dental mezenkimal 12

18 kök hücrelerinin kombinasyonunun kök-periodontal ligament kompleksini canlandırabileceği önerilmiştir. (8) Bu çalışmaların sonucunda SCAPs, rejeneratif endodontik terapiye (revaskülarizasyon) katılan hücrelerin bir kategorisi olarak kabul edilmiştir. Kök apikal papilladaki (SCAP) kök hücreler dental kök hücrelerin eşsiz popülasyonu büyüyen diş köklerinin uçlarında lokalizedir. Apikal papilla dokusu sadece oral kaviteye diş erüpsiyonundan önce, diş gelişimi boyunca mevcuttur. (51) SCAPs odontoblast ve adipositlere diferansiye olma kapasitesine sahiptir. Bu hücreler CD24+ tür; ama ifade, alkalin fosfataz yukarı regülâsyonuyla beraber tesadüfen, in vitro olarak odontojenik farklılaşma üzerine aşağı yönde regüle edilir. SCAP hücreleri, DPSC den daha yüksek proliferasyon oranları sergiler. (22) Bazı domuzların diş soketlerine, SCAP hücreleri (kök oluşturmak için) ve PDLSC nin (periodontal ligament oluşturmak için) ko-nakliyle dentin ve periodontal ligament oluşturulmuştur. Bu bulgular, bu hücre popülâsyonlarının PDLSC ile birlikte, yapay diş kronuyla kaplaması ile yapılan metal implanta benzer şekilde kullanılabilen biyolojik kök üretmek için kullanılabileceğini öne sürer. Çoğu insan dokularının gelişimlerinin erken zamanlarında, kök hücre izolasyonu klinik olarak mevcut değildi çünkü kökler postnatal gelişirek dental klinik pratiğinde; kök apikal papilla, çekilen yirmilik dişlerden elde edilebilirdi. Bu nedenle, embriyonik benzeri özelliklerle (örneğin kök gelişiminde) birlikte kök hücrelerin çok aktif bir kaynağı kolayca elde edilebildi Eksfoliye Süt Dişlerinin Dental Pulpalarından Kaynaklı Mezenkimal Kök Hücreler İn vitro; kemik oluşumunu indükleme, dentin oluşturma ve diğer dental olmayan mezenkimal hücre türevlerine dönüştürme yetenekleri olan kök hücreler, insanda 13

19 dökülen süt dişlerinin pulpalarından izole edilmiştir. (25, 53) DPSCs nin aksine, SHED in vivo daha yüksek proliferasyon oranları, (54) osteoindüktif kapasiteye sahip ve küre benzeri kümeleri oluşturma yeteneği sergiler. (55) SHED diş kesitleri ve yapı iskeleleri üzerine ekilmiş sonucunda ise immun bağışıklığı yetersiz farelere subkutanöz implante edilmesi sonucu, tübüler dentin ve anjiyogenik endotel hücrelerini üretme yeteneği olan fonksiyonel odontoblastlara dönüştürülmüşlerdir. (56) İn vivo koşullarda SHED i dental pulpa doku mühendisliğinde araç olarak kullanarak yapılan çalışmalarda; pulpanın enfeksiyona bağlı uzaklaştırıldığı durumlarda, kök hücrelerle değiştirilmiş ve çalışmalarda diş vitalitesi için önemli olanın, oluşturulan bu dokunun, diş pulpasına benzer mimari ve hücreselliğe sahip olduğunu ortaya koymuştur. Bir başka klinik uygulamada ise; SHED in Parkinson hastalığını (PD) hafifletmedeki terapotik etkinliği olduğu öne sürülmüştür. (56) SHED kürelerinin, parkinson olan farelerin striatumlarına transplantasyonu; davranış bozukluklarının, apomorfininle anımsatılan dönüşünü, kısmen iyileştirmiştir. Tüm bu çalışmaların sonuçları; SHED in, PD tedavisi için kullanılan postnatal kök hücrelerin yararlı kaynağı olabileceğini gösterir. SHED, çocukların dökülen süt dişlerinden izole edilir. Ama PD gibi bir hastalığın, otolog kök hücre terapisi; bu hücrelerin, çocukluk çağından depolanmasını gerektirir. Yetişkin diş pulpasından elde edilen DPSCs, benzer özelliklere sahip olabilir ve bu otolog hücrelerin toplanması ve genişlemesi, hastadan bir diş çekilmesini gerektirmektedir. SHED ve diğer kök hücreler, kranial nöral krest ektomezenşiminden türetilmiştir ve bu yüzden gelişimsel ve fonksiyonel olarak aynı görüneceklerdir. Ancak bazı çalışmalarda, farklı davrandıklarını ve farklı gen ifade profillerinin olduğunu göstermiştir. SHED, DPSC ve mezenkimal kök hücrelerden türeyen kemik iliğine 14

20 kıyasla önemli ölçüde daha yüksek çoğalma oranlarına sahiptir. (57) Gen ifade profillerinin karşılaştırılmasıyla, 4386 genin DPSC ve SHED arasında iki kat veya daha fazla oranda farklılık izlendiği gösterilmiştir. Fibroblast büyüme faktörü ile transforme edici faktör (TGF-β) gibi bazı büyüme faktörleri içeren, hücre proliferasyonu ve ekstraselüler matriks formasyonu ile ilgili yollara katılan genler için SHED in daha yüksek izlenimi gözlenmiştir. (57) TGF-β özellikle önemlidir; çünkü dentin hasarından sonra salınarak pulpa kök hücrelerini odontoblastlara diferansiye etmek için harekete geçirebilir. (4, 58) DPSC, yüksek çoğalma oranına sahip olup uzun süreli kültür ortamına konulduktan sonra kök hücre özelliklerini koruyabilmektedir. (59) Bu yüzden, mezenkimal kök hücrelerin genel allojenik kaynağı kullanılabilir. Otolog kök hücrelerin, henüz tüm süt dişlerini kaybetmemiş çocuklarda kullanımı günümüzde sınırlıdır. Bu hücrelerin ticari bankacılığı fikri, böylece de çocuklar yetişkin hale geldiğinde kullanımlarına izin vermek üzere yaygın hale getirilmesini savunmaktadır. Sınırlı sayıdaki çalışmalarda ise; dondurulan SHED hücrelerinin özelliklerini kriyoprezervasyonundan sonraki 2 yıl boyunca sürdürebildiği gösterilmiştir; ancak uzun süreli depolanmasının (10 yıl ve üzeri) etkilerinin henüz değerlendirilmemiş olması bir sorundur. Çocuklar doğal olarak 20 süt dişini kaybettiğinde, kordon kanının aksine bu hücreleri depolamanın birden fazla yolu bulunmaktadır. (60) Dental Pulpa Kök Hücre Farklılaşması ve Sinyal Moleküllerin Durumu Büyüme faktörleri ve morfogenetik faktörler, spesifik membran reseptörlerine bağlanır ve bir dizi sinyal yolunu tetiklerler. (53) Gelişim boyunca, bu sinyal moleküller hücresel fonksiyonlarda ana rol oynar ve dentin ile pulpada sinyal tamir sürecinde önemli bir role sahiptirler. (3, 15) Bunlar dentinden salındığında biyoaktif halde 15

21 bulunurlar ve hücresel cevapları indüklemek için yetenekli durumda olurlar; tersiyer dentin ve dental pulpa tamirinin üretimi gibi. Dentinin düzenlenmesi; karies, asidik diş bağlanma ajanları ya da pulpa örtücü materyallerle demineralize edilen dentin matriksinden salınan büyüme faktörlerinin hareketini kolaylaştırır. Kalsiyum hidroksitin; dentini çözündürmek ve dentini rejenere edebilen biyoaktif moleküllerin salınımına izin vermek için kullanılabileceği gösterilmiştir 26. Bu durum, DPSCs lerin takviyesini, odontoblastlara diferansiyasyonlarını ve mineralize edilebilir matrislerin salgılanmasını içerebilir. (16, 53, 61) Dental Pulpa Hücrelerinin İzolasyonunun Sağlanması Kök hücreler; akım sitometrisi, floresans aktif hücre sınıflandırması, manyetik aktif hücre sınıflandırması gibi çeşitli teknikler ve biyomarkerların (yüzey markerları ve yan popülâsyonlar) kullanımıyla belirlenmiştir. Manyetik aktif hücre sınıflandırması (MACS), çeşitli hücre popülâsyonlarının seperasyonu için kullanılan, bu hücre popülâsyonlarının yüzey antijenlerine bağlı bir metottur. Bu yöntem sayesinde, belirli bir yüzey antijenine karşı antikorlarla kaplanan manyetik nanopartiküllerle inkübasyonlarına izin verilmesi aracılığıyla, hücrelerin ayrılmasına izin verilir. Bu yöntemle, manyetik nanopartiküllere katılmak için antijen ifade eden hücreler meydana gelir. Daha sonra, güçlü bir manyetik alana yerleştirilirler. Bu süreçte, diğer hücrelerin akışı sırasında, hücreler, kolonda kalan nanopartiküllere bağlanmıştır. Bu yöntemle, hücreler, belirli antijenlere saygı duyularak separe edilebilir. Floresan aktif hücre sınıflandırması (FACS), akış sitometrisinin spesifik bir tipidir. İki ya da daha fazla petri içine, her seferinde bir hücre olmak üzere, hücrelerin heterojen bir karışımını ayırmanın bir yolunu sağlar. Spesifik ışık saçılımı ve her bir hücrenin floresan karakteristikleri üzerine dayanan bu yöntemde, özellikle ilgi çekici olan hücrelerin fiziksel 16

22 separasyonlarının yanı sıra; özel hücrelerden floresan sinyallerinin hızlı, objektif ve kantitatif kaydının sağlanabilmesidir. Hücre yüzey markerları, kök hücreleri sınıflandırma ile izolasyon ve farklılaşma durumlarını izlemek için kullanışlıdır. Çünkü bu yüzey markerları, bozulmamış hücrelerle direkt görselleştirilebilirler. (17) Kriyoprezervasyon Uygulanması Hematopoetik kök hücreler, kriyoprezervasyon uygulanmış ve transplantasyon için başarıyla kullanılabilmiştir. Diş pulpası, uzun periyotlar içinde (39) kolaylıkla dondurularak depolanabilir ve yetişkin doku rejenerasyonu için (58) bir kryobank üretmek için kullanılabilir. Diş pulpa kök hücreleri, kriyoprezervasyon uygulanmasından sonraki süreçte dahi potansiyellerini korurlar. (34) Bütün dental pulpanın kriyoprezervasyonu sonucu, güvenli kurtarışa yol açar. Bütün pulpa için, değişik kriyoprezervasyon teknikleri seçilebilmektedir. Bu özelliklere göre, hastanın ihtiyaçlarına göre depolama ve iyileşme potansiyeline sahip ve terapotik açıdan üç boyutlu doku rekonstriksiyonu yapımına elverişli olabilecek şekilde seçim yapılmalıdır. Yirmi süt ve 32 kalıcı dişe sahip olduğumuzdan dental pulpa kök hücreleri aynı zamanda hastaların vital pulpalarından da elde edilebilir. Kök hücrelerin tanımlanmasına yardımcı olacak kök hücre markerları da diğer bazı yardımcı araçlar olarak kullanılabilir. (17) Diş Doku Mühendisliğinde Epitelial ve Mezenkimal Kök Hücrelerin Yeri ve Önemi Dişin iki farklı dokudan oluştuğu göz önüne alındığında, yapımı dental mezenkimal ve epitelial hücrelerin kooperasyonunu gerektirir. Birçok çalışma, diş rekonstrüksiyonu için ümit verici sonuçlarla, in-vitro ve in-vivo koşullarda kök hücrelerin yukardaki kombinasyonlarının kullanımı girişiminde bulunulmuştur. (62) 17

23 Sıçanlar, domuzlar ve farelerden kökenli dental mezenkimal ve epiteliyal kök hücreler laboratuarda kültür ortamına konularak ve farelerde transplantasyon öncesinde farklı biyomateryallerin yüzeyine ekildi. Bütün bu yayınlanan raporlar, dental kök hücrelerin kombinasyonunun; reorganizasyonlarına, ayrı tabakaların formasyonuna ve odontoblast ile ameloblastlara diferansiyasyonlarına öncülük edebilmeleri sonucunda dentin ve mine formasyonunu gösterilmiştir. (1, 22, 63, 64) Biyomühendise edilmiş dişler, ektopik yerde oluşturulmuş ve alveolar kemik yüzeyine doğru implantasyona izin veren tam kök ve periodontal dokular gibi önemli ögelerin eksikliği ile karakterize edilmiştir. Ancak, Nakao ve ark. (2007) 2 fare mandibulası üzerinde diş formasyonu üzerine bir çalışma yayınlamıştır. Özellikle, dental epitelial ve mezenkimal kök hücreleri, kollajen jel damla üzerine tohumlanmış ve faredişi kavitesine implante edilmiştir. Rejeneratif amaçla kullanılan diş jermi; odontoblastlar, ameloblastlar, dental pulpa, kan damarları, kron, periodontal ligament, kök ve alveolar kemikle birlikte yapısal olarak gerekli dişin oluşumuna öncülük eder. Mandibula içine implantasyon dişin gelişimi, maturasyonu ve dişin çıkışına izin vermesiyle sonuçlanmıştır. (22) Bu sonuçlar ışığında, dental kök hücrelerin insanda kayıp diş yerine kullanılabilmesi yönünden önemlidir yılında yapılan başka bir çalışmada, alveolar kemik üzerindeki kayıp diş alanına biyomühendise edilen dişin transplantasyonu ile farelerde başarılı fonksiyonel diş replasmanı gösterilmiştir. (65) Diş epitelial ve mezenkimal molar diş jerminden türetilen kök hücreler kültür ortamına konularak farelerdeki kayıp dişler alanında alveolar kemiğe transplantasyon öncesinde biyomateryalle kombine edildi. Özellikle, üst 1. molar çekilmiş ve dental kavite ile oral kavite epitelinin fiziksel rehabilitasyonuna izin vermesi için transplantasyon 3 hafta sonra gerçekleştirilmiştir. Son olarak, oral bölgede 18

24 çıkan biyomühendise edilen dişin uygun yapıda olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, deneysel ortodontik tedaviye ve çeşitli termal ve elektriksel, mekanik stress ve ağrı mücadelesi gibi zararlı uyaranlara yanıt vermiştir. Kron genişliğini ayarlamak gibi dişi oluşturan parametrelerin konfigürasyonunun güncel tekniklerle sağlanabileceğinden dolayı boyutu normale göre daha küçük olmuştur İnsanda Otolog Dental Doku Mühendisliğinin Klinik Olarak Denenmesi d Aquiono ve ark. (2009) insanda yetişkin dental pulpa mezenkimal kök hücreleri (DPSCs) ve kollagen süngerinden oluşan biyokompleksin implantasyonuyla, mandibular kemik kaybının restorasyonunun sonuçlarını göstermiştir. (66) Başlangıçta bu klinik çalışmaya, mandibuladaki gömük 3. molarları görüntülemek için çekilen panoramik filmleri alınan 17 hasta katılmıştır. Hastalardan, alt çenede bilateral olarak 3. molarların çekilmesiyle, kortikal alveolar laminalarının en azından 1,5 cm yüksekliğinde etkileneceği, ikincil olarak 2. moların distalinin etkileneceği düşünülmüştür. Bu durum, 3. molar çekiminden sonra yavaş kemik tamirine neden olur ve komşu 2. moların kaybına yol açabilir. Bu çalışmada, hastaların kaydı için önemli olan parametre iki benzer alt molara sahip olmak idi; böylece biyokompleksin implantasyonu için bir tanesini test (T) grubu, diğerini de kontrol (C) grubu olarak değerlendirebilir. Ayrıca DPSCs nin izolasyonu için gereken çekim için, hastaların sağlıklı 3. molarlara sahip olması gerekmekteydi. Maksiller 3. moların çekimi üzerine DPSCs izole edilip 21 gün boyunca kültür ortamına konulmuş, akış sitometrisi, protein markerlarını genellikle DPSCs nin hücresel yüzeyinde belirlemek için uygulanıp, kollagen sünger üzerine yerleştirilmiştir. Aynı günde, hastada madibular 3. molarlarının çekimi gerçekleştirilmiştir. Kontrol grubunda (C) DPSCs siz kollagen sünger yerleştirilmiş, diğer yandan test grubunda (T) DPSCs ile 19

25 doldurulmuş kollagen süngerli biyokompleks yerleştirilmiştir. Hastalar ameliyattan sonra 1 hafta boyunca takip edilmiş ve ilk trimester için gözlemler devam etmiştir. Ameliyattan üç ay sonra iki grubun radyografilerinde önemli ölçüde farklılık görülmüş; t grubu daha yüksek oranda mineralizasyon ve kontrol grubuna kıyasla daha yüksek kortikal seviye gösterdiği bildirilmiştir. T grupları tamamen rejenere edilip, enfeksiyon ya da enflamasyon olmadığı ve fonksiyonların normal olduğu gözlenmiştir. Ayrıca histolojik ve immunfloresans analiz için T ve C gruplarından birer örnek alındığında, T grubunda havers kanallarını çevreleyen lameller bir mimariyle vaskülarize ve iyi organize kemik gözlenmiş. Oysaki C grubunda, kemik reabsorbsiyonu gösteren geniş havers kanallarıyla birlikte olgunlaşmamış kemik izlenmiştir. İmmunfloresan analiz, her iki grupta da farklı miktarda osteonektin, osteokalsin, kemik alkalin fosfataz olduğunu göstermiş; T grubunda farklı seviyede kemik maturasyonu olduğunu onaylayan daha yüksek seviyede kemik morfogenetik protein 2 ve vasküler endotelial büyüme faktörü izlenmiştir. Genellikle insanlarda otolog kemik rejenerasyonunun ilk bulgusu, mandibuladaki DPSCs nin kollagen süngerde kullanımıyla kemik defektlerinin optimal tamirini ve 2. molar boyunca periodontal dokuların restorasyonunu gösterir. (5) Maksilla ve mandibuladaki kemikler genellikle periodontal hastalıklar, mandibulanın nekrozu gibi dejeneratif hastalıkları takiben reabsorbsiyona uğrar. Yazarlar, DPSCs nin tahrip olmuş dokuların restorasyonu/rejenerasyonu için basit ve doğal alternatif olabileceğini öne sürer ve bunlar kemik mühendisliğinde yeni araç olarak isimlendirilmektedir. Dental tedavilerde otolog kök hücrelerin kullanılması tekniğinin onaylanmasından önce daha fazla klinik çalışmaya ihtiyaç vardır. Steril bir pulpal kavitenin revaskülarizasyonu için periodontal kemik dokusu, dental papilla ya da 20

26 pulpa kavitesindeki canlı hücrelerden orjinli kök hücrelerin kullanımı zaten endodontide kullanılmaktadır. (5) Periodontal Rejenerasyon Uygulanması Periodonsiyum dişi çene içinde korumak için dişleri çevreleyen ve destekleyen dokular kompleksidir. Periodontitis, periodonsiyumu etkileyen bir enflamatuar hastalıktır ve bağ dokusu ataşmanı kaybı ile alveolar kemik desteğinin geri dönüşümsüz kaybıyla sonuçlanır. Fonksiyonel periodonsiyumun hücre bazlı replasmanı için sorun; yeni ligament ve kemik oluşturma ve hem kemik ile diş kökü arasında hem de ligament ve kemik dokuları arası uygun bağlantıları sağlamaktır. Handa ve ark. (2013) çalışmalarında periodontal gelişimde anahtar olayları tekrarlamak için dental kök hücrelerin farklı popülâsyonlarını kullanmayı amaçlamış; böylece periodonsiyumu rejenere etmek için bu iyileştirme sıralı bir şekilde gerçekleşebilmeyi hedeflemiştir. (67) Periodontal rejenerasyon metodlar, insan periodontal ligament hücre transplantasyonunu kolaylaştırmak için düzenlenen hücre tabakalarını içerir. (68) Periodontal ligament hücreleri insan 3. molar dişlerinden izole edilmiş, hücrelerin düşük sıcaklıkta tedavisi boyunca uygun hücre tabakaları olarak spontan ayrılmasını stimüle eden poly (N-isopropilakril-amid) (PIPAAm) grefte edilen kapların üzerine kültürlenmiştir. HPDL hücre tabakaları birinci molarlarından periodonsiyum ve sementleri kaldırılan farelere implante edilmiştir. Hücresel olmayan sement benzeri tabaka ile fibril ankrajına benzeyen doğal periodontal ligament fibrilleriyle uygulanan bu tekniğin periodontal rejenerasyonlar için uygun olabileceği gözlenmiştir. Umut verici olmasına rağmen bu yaklaşımdaki önemli sorunlardan biri gerekli olabilecek herhangi bir kemik değişimini dikkate almamasıdır. Bir diğer sorun ise yeniden canlandırılan periyodonsiyumun bütünlüğü ve fonksiyonunu çiğneme boyunca uzun zaman 21

27 periyotlarında ne derece koruyabileceğidir. Şiddetli periodontitis için mevcut tedaviler yetersizdir; bu yüzden, yeni diş kök hücre bazlı tedavilerin yakın gelecekte yoğun araştırma konusu olması muhtemeldir. (2) Diş Pulpası Rejenerasyonu Uygulanması Dental pulpa enfekte olduğunda kaldırılması gerekir ve bu endodontik tedavi gereken kök pulpası için kısmen problemlidir. Bu yüzden diş pulpasının restorasyonu diş hekimliğinde çok önemli bir yer tutmaktadır; çünkü enfekte pulpa inorganik materyallerle replase edilince diş devitalize olur. Yeni bir çalışmada, boşaltılan kök kanal boşluğunda diş kök hücrelerini kullanarak dental pulpanın de novo rejenerasyonu gösterilmiştir. (69) DPSC ve SCAP, insan 3.molarlarından izole edilmiş, poly-d,llactide/glycolide iskele üzerine ekilmiş ve kök fragmanlarının kanal boşluğuna eklenmiş, SCID farelere subkutanöz transplantasyon ile takip edilmiştir. Diş fragmanlarının, ameliyattan 3 4 ay sonra sonraki histolojik analizinde, kök kanal boşluğuna iyi yerleşmiş olan vaskülarize, pulpa benzeri doku izlenmiştir. Ayrıca, mineralize dokuya benzeyen dentinin devamlı tabakası, kanalın mevcut dentin duvarlarına yerleşmiştir. (70) Farelerde yapılan son çalışmalar, genetik olarak işaretlenmiş hücreleri kullanarak; hücrelerin çoğunluğu damarlar tarafından sağlandığından dolayı boş pulpa kavitesinin rejenere olduğunu; kök hücreleri eklenmesinin, boyutta küçük farklılıklar yaptığını göstermiştir. Bu yüzden; kök hücre pulpa restorasyonunda eksojen kök hücreler sağlanmasında problem olmayabilir; ama pulpa ekstirpasyonundan sonra yeterli kan temininin cerrahi olarak sağlanması gereklidir Bütün Diş Rejenerasyonu 22

28 Biyolojik olarak ayrışabilen iskelelere kök hücrelerin ekilmesiyle, diş benzeri dokular elde edilmiştir. Ikeda ve ark. (2009) yetişkin bir farede, kayıp diş bölgesindeki alveolar kemiğe diş germinin transplantasyonuyla elde edilen tam fonksiyonel bir diş replasmanını bildirmiştir. (66) Xu ve ark. (2008), faredeki bir diş tomurcuğunu, Arg- Gly-Asp bağlanma yeri bağlayıcı peptid ile birlikte üretmek ve tedavi etmek amaçları için kullanılan 2 gözenek büyüklüğünde ipek fibroinden üretilen iskelelere ekmiştir. (71) Dental dokular yeniden canlandırılmış olsa da, doğal bir dişin doğru düzenlenmesinde başarı oranı sadece %15 20 dir. Yani, yapısal olarak sağlam diş hedefine ulaşmak için uzun bir yol vardır ve daha çok çalışmaya gereksinim vardır. Diş replasmanının mevcut durumu, kemikte önceden delinmiş boşluğa vidalanan daha sonra plastik veya seramik kronla kaplanan dental implantlardır. İmplantın mevcut olması için, kullanımında minimum miktarda kemik gerektirir. Çünkü bu implantlar PDL yani şok absorbe edici bir yapılmadan kemiğe direkt bağlanır ve çiğneme kuvvetleri implantların dezavantajı olarak kemiğe direk olarak iletilir. Postmenapozal osteopetroziste meydana gelen, kemik kaybıyla sonuçlanan diş kayıplarında, implantlar için yetersiz kemik olması durumunda, implantlar kemik greftlerince desteklenmelidir. Diş hekimliğinde ana hedef, kayıp dişi biyolojik olarak replase etmek için özünde metal yerine hücre bazlı implantlara sahip olmaktır. Biyolojik replasman için minimum gereksinim fonksiyonel diş, kökler, periodontal ligament ve sinir ile kan malzemeleri için gereken temel bileşenleri oluşturmaktır. Dişin kronu ise protetik olarak iyi fonksiyonlu ve boyutsal, şekilsel ve renk olarak mükemmele yakın derecede restore edilebilir. Bu nedenle biyolojik diş replasmanında biyolojik kök çok önemli bir basamak teşkil etmektedir. (2) Diş Dokusu ve Kan Damarlarının Rejenerasyonu Uygulanması 23

29 SHED in, vaskülogenesise benzeyen bir süreç ile fonksiyonel vasküler endotelial hücrelere farklılaşma potansiyeline sahip olduğu görülmüştür. (72, 73) Bu bulgular, dental pulpa kaynaklı kök hücrelerinin; kalp, beyin veya uzuvların bazı iskemik durumlarının tedavisinde yararlı olabileceği yönündeki görüşleri doğrular niteliktedir. Dental pulpa doku mühendisliğinin zorluklarından biri fonksiyonel damar ağının üretimidir. Çünkü pulpanın vaskülarizasyonu kök kanalı boyunca apical foramen yoluyla sağlanır. Bu nedenle, dental pulpa doku mühendisliğinde vaskülogenezisin eşlik ettiği girişimlerinin uyarılması için daha fazla çalışmanın yapılması gereklidir.(15) Kemik Doku Rejenerasyonu Uygulanması DPSCs ler, pre-osteoblastlara farklılaştıklarında, kalsifiye bir kemik dokusu haline gelen bir ekstraselüler matriks oluştururlar.(74) Bunun dışında, bu gibi dokuların, immünolojik olarak bağışıklanmış farelere transplante edildiklerinde remodelasyona uğradıkları ve hapsolmuş osteositlerle bir lameller kemik oluşturdukları gösterilmiştir. (75) Dental Doku Onarımı Doku rejenerasyonunda potansiyellerinden yararlanmak için dental kök hücrelerin şu anda dikkate alındığı birçok araştırma alanı vardır. Bunlar; dentin, periodontal ligament, dental pulpa gibi hasarlı diş dokularının onarımınında dental kök hücrelerin kullanımını ve mine doku mühendisliğini içerir. (44, 76, 77, 78, 79) Dental kök hücreleri, kemik ve sinirler gibi dental olmayan dokuların tamirini kolaylaştırmak için de kaynak olarak kullanılır. (10, 11, 55, 70, 79, 80) Odontojen Duyarlı Epitel Hücreleri Odontogenezisi indükleme yeteneği olan epitelyum hücrelerinin erken evre embriyolarının endojen dental epitelinden başka bir kaynağı bugüne kadar 24

30 tanımlanamamıştır.(2) Kültürde yetiştirilebilen ve mezenkim hücrelerini indüklemesinden sonra dişleri oluşturabilen epitel hücrelerinin, olgunlaşmamış durumlarını korumaları kaynaklarını tanımlamada esas sınırlamadır. Mallasez epitel artıkları, kök oluşumu sırasında kalan; bu yüzden yetişkin dişlerinde bulunmuş, izole edilebilinen ve kültürlenebilinen bir hücre grubudur.(81) ERM (Malasez epitel hücreler) in vitro olarak besleyici tabakalar üzerinde elde edildiğinde, primer dental pulpa hücreleriyle rekombinasyonunu takiben mine benzeri doku oluşturmak üzere stimüle edilirler. (82) Embriyoların ve yetişkin bireylerin oral mukoza epitelial hücreleri rekombinasyon deneylerinde kullanılmış ve embriyonik dental mezenkimle kombine edildiğinde, kompleks dental yapıları doğurduğu gösterilmiştir. (70, 74) Oral epitelial hatları, embriyonik gün E18 de, p53 eksikliği bulunan sıçan embriyolarında belirlendiğinde dişin oluştuğuna dair bazı kanıtlar saptanmıştır; oral epitelial hücreler, fetal E16, 5 molar mezenkimal dokularıyla kombine edilmiş ve 2 3 haftalığına transplante edilmiştir. (83) Postnatal oral mukozal epitelyum aynı zamanda embriyonik dental epitelyum replasmanı için kullanılabilir çünkü genç hayvanlardan izole edilen, hücre tabakaları olarak gelişen ve E12, 5 embriyolarının dental mezenkimleriyle yeniden ilişkili hücreler, diş benzeri yapılar meydana getirebilir. (84) Kültürün ardından diş oluşumuna katkı sağlayabilen, eksojen faktörlerin bu hücrelere eklenmesiyle indüklenebileceğini düşündüren epitelyum hücrelerin kaynakları elde edilmiştir. Bu gibi faktörler; fibroblast büyüme faktörü, kemik morfogenetik protein ve Wnt ailelerinin sinyal proteinlerini içerir, ama bunların geçici, mekansal, kantitatif örneklerinin in vivo çoğaltılması zordur. Daha kolay manipüle edildiklerinden, anahtar 25

31 intraselüler faktörlerin (örn; kinazlar, transkripsiyon faktörlerin) kullanımının daha verimli sonuçlar doğuracağı muhtemeldir. (5) Odontojenik İndüktif Mezenkimal Hücreler İndüktif embriyonik oral epitelle kombine edildiğinde genişletilmiş yetişkin kemik iliği stromal hücrelerinin in vitro olarak diş oluşturacağı gösterildiğinde, bunu takiben dental olmayan mezenkimal hücre kaynaklarının odontojenik epitelial sinyallerine cevap verme yeteneği gösterilmiştir. (85) Bu çalışma, aynı zamanda yetişkin oral kavitesine transplantasyonu takiben, embriyonik diş taslaklarının tam dişlerin içine gelişebileceğini göstermiştir. Bu nakiller, yeterli süre sonunda kökleri oluşturacak ve sürecektir. (12) İn vitro indüktif epitel üretimiyle ilgili sorunları gösteren yukarıdaki bölümler, indüktif kapasite ile beraber mezenkimal hücrelerin belirlenmesi yaklaşımının daha yararlı olabileceğini öne sürmüştür. İndüktif kapasiteye sahip hücreler, in vivo koşullarda dental epitelyumden ilk indüktif sinyalleri alan, erken embriyonik nöral krestten türetilmiş ektomezenşim hücreleridir. Kemik iliği mezenşimal hücreleri, epitel kaynaklı odontojenik sinyallere cevap verebilir ancak sadece bu epitelial sinyalleri aldıktan sonra diş oluşumunu uyarabilir. Kemik iliği mezenşimal hücrelerinin işlenmeye hazır hale gelmesi, uyarıcı faktörler aracılığıyla ya da embriyonik dental epiteliumla mümkündür, ama herhangi bir somut klinik değerinin olması, gerçekte çok zahmetli ve zordur.(2) Ektomezenşim hücreleri, odontojen indükleme kapasitesine sahipse, in vitro olarak korunabilirler mi? Farelerden alınan embriyonik diş jermlerinde, mezenkimal hücreler izole edilip sonrasında in vivo kültürünü takiben, odontojenik sinyallere cevap potansiyellerini korumuşlardır; ama indükleme kapasitesine sahip hücrelerin kültür sonrası bu cevap potansiyellerini korumaları belirsizdir. Benzer şekilde, insan 26

32 embriyolarından eşdeğer hücreler izole edilmiş ve yeniden birleşme deneylerinde dişleri oluşturmaları gösterilmiştir. (2) Embriyonik ektomezenşim replase etmede, yetişkin dental pulpa mezenkimal hücreleri ana kaynaktır; çünkü bu hücreler, kranial nöral krestten üretilir ve dental hücrelerdir. Gerçekten de bu hücreler, nöral krestte ifade edilen birçok geni ve bir dizi kök hücre marker genini ifade eder. Ancak yetişkin dental pulpa mezenşimal kök hücrelerin, herhangi odontojenik indüktif veya duyarlılık kapasitesini koruduğu henüz gösterilmemiştir. Bir ilginç nokta; erişkin dental kök hücrelerinde görülmeyen ama ektomezenşim hücreleri tarafından ifade edilen faktörleri belirlemektir. Bu faktörler hücreleri diş oluşturma yönünden yetenekli kılarlar. Uyarılmış pluripotent kök hücrelerin üretilmesinin amaçlandığı benzer yaklaşımlarda, erişkin dental kök hücreleri, dişleri oluşturabilen ektomezenşim hücrelerine dönüştürmek için kullanılabilir. (2) Hücre Reagregasyonu ile Diş Rejenerasyonu Farelerde, ayrılan diş hücrelerinin yeniden birleşmesiyle deneysel olarak fonksiyonel dişler biyomühendise edilebilir. Aslında bu deneyler, tam dişlerin kullanımından ziyade ayrışmış hücrelerin yeniden birleşme yeteneğini gösterir. Birçoğu diş üretmek için kullanılan hücreler, embriyonik diş tabakalarından elde edilir. Bu tabakalar diş jermini düzenlemek için ayrılır ve yeniden birleşirler. (13, 86) Reagregasyon, kullandığı iskeleye hiçbir benzerlik taşımayan, multipl küçük toothlets üretir. Benzer şekilde, diş jerminin epitelial ve mezenkimal hücre komponentleri fiziksel olarak ayrılabilir, bunun üzerine diş jermini düzenlemek için sınıflanıp ve yeniden birleşirler. (86, 87) Bu durumda, çoklu diş jermlerinden ayrılmış 5x10 4 hücre yeni ve tek bir diş jermi üretmek için gereklidir. (86) 27