DOMATESTE ERKEN YANIKLIK HASTALIĞINA DAYANIKLILIK SAĞLAYAN GENLERİN MOLEKÜLER MARKÖRLER YARDIMIYLA GENETİK HARİTALAMASI ÖN ÇALIŞMALARI

Transkript

1 DOMATESTE ERKEN YANIKLIK HASTALIĞINA DAYANIKLILIK SAĞLAYAN GENLERİN MOLEKÜLER MARKÖRLER YARDIMIYLA GENETİK HARİTALAMASI ÖN ÇALIŞMALARI Şerife TOPKAYA Yüksek Lisans Tezi Bitki Koruma Anabilim Dalı Yrd. Doç.Dr. Özer ÇALIŞ 2008 Her hakkı saklıdır

2 T.C. GAZİOSMANPAŞA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ DOMATESTE ERKEN YANIKLIK HASTALIĞINA DAYANIKLILIK SAĞLAYAN GENLERİN MOLEKÜLER MARKÖRLER YARDIMIYLA GENETİK HARİTALAMASI ÖN ÇALIŞMALARI ŞERİFE TOPKAYA TOKAT 2008 Her hakkı saklıdır

3 Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ danışmanlığında, Şerife TOPKAYA tarafından hazırlanan bu çalışma 26/08/2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Bitki Koruma Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS tezi olarak kabul edilmiştir. Başkan : Doç. Dr. Yusuf YANAR İmza : Üye : Doç. Dr.ahmet YILDIRIM İmza : Üye : Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ İmza : Yukarıdaki sonucu onaylarım (imza) Prof. Dr. Metin YILDIRIM Enstitü Müdürü (tarih)

4 TEZ BEYANI Tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu tezin yazılmasında bilimsel ahlak kurallarına uyulduğunu, başkalarının eserlerinden yararlanılması durumunda bilimsel normlara uygun olarak atıfta bulunulduğunu, tezin içerdiği yenilik ve sonuçların başka bir yerden alınmadığını, kullanılan verilerde herhangi bir tahrifat yapılmadığını, tezin herhangi bir kısmının bu üniversite veya başka bir üniversitedeki başka bir tez çalışması olarak sunulmadığını beyan ederim. Şerife TOPKAYA 2008

5 ÖZET Yüksek. Lisans Tezi DOMATESTE ERKEN YANIKLIK HASTALIĞINA DAYANIKLILIK SAĞLAYAN GENLERİN MOLEKÜLER MARKÖRLER YARDIMIYLA GENETİK HARİTALAMASI ÖN ÇALIŞMALARI Şerife TOPKAYA Gaziosmanpaşa Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Bitki Koruma Anabilim Dalı Danışman : Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ Fungal erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani her yıl Solanacea familyasına ait bitkilerde önemli ürün kayıplarına neden olmaktadır. Domateste erken yanıklıktan dolayı her yıl minumum %10 ürün kaybı oluşmaktadır. Hastalığın kontrolünde kültürel önlemler yetersiz kalmakta, kimyasal mücadele ise kalıntı problemleri, çevre ve insan sağlığına olan olumsuz etkileri nedeniyle tercih edilmemektedir. Etmenin kontrolü dayanıklılık genlerini kullanarak mümkündür. Bu çalışmada yedi domates hattının Alternaria solani ye karşı reaksiyonu belirlenmiştir. Testler sonucunda orta derecede dayanıklı NCEBR2 ( ) hattı ile orta derecede hassas NC84173 ( ) hattı melezlenerek F 1, F 2 ve geriye melez (BC 1 ) bitki populasyonları oluşturulmuştur. Moleküler çalışmalarda ebevynler arasındaki polimorfizmi ortaya koyabilmek için beş adet RGA (Resistance Gene Analogs) markörü, 70 adet Simple Sequence Repeats (SSR) markörü, 23 adet CAPS/SNP (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence/ Single Nucleotide Polymorphism) markörü ve 1 adet INDEL (Insertion/Deletion) markörü kullanılmıştır. Çalışmada toplam 99 adet moleküler markör test edilmiş olup 11 adet moleküler markör ebeveynler arasında polimorfizm vermiştir. Patojenisite testlerinde 150 haritalama populasyonu bitkisinin fenotipleri ortaya konmuştur. Polimorfik markörlerin 150 haritalama populasyonu bitki DNA sıyla olan genotipik reaksiyonları Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile araştırılmıştır. 2008, 57 sayfa Anahtar kelimeler: Solanacea, Alternaria solani, Erken yanıklık hastalığı, SSR, CAPS, INDEL markörleri i

6 ABSTRACT Master of Science Thesis PRELIMINARY STUDIES ON MOLECULAR MARKERS ASSISTED GENETIC RESISTANCE GENES MAPPING TO TOMATO EARLY BLIGHT DISEASE By :Serife TOPKAYA University of Gaziosmanpasa Graduate School Plant Protection Division Supervisor: Asst. Prof. Dr. Özer ÇALIŞ Fungal early blight disease caused by Alternaria solani occurs every year important yield loss on Solanacea family plants. Each year, at least 10% crop loss happens due to early blight disease in tomatoes. Cultural manegement is not enought to control the disease, chemical applications constitutes residue problems, negatives effects on human health and enviroments, therefore, the fungicides does not prefer to control the fungal disease. Early blight disease is able to restrain with resistance genes. In this study, we identified seven tomato lines reactions to early blight disease using pathogenicity tests. According to the pathogenicity test results, intermediate resistant NCEBR2 ( ) line and intemediate susceptible NC84173 ( ) line were crossed F 1, F 2 and back cross (BC 1 ) plant populations were produced. In the pathogenicity tests, 150 mapping population plants phenotypes were determined. In molecular studies, to determine polimorphism between NCEBR2 ( ) and NC84173 ( ) parents 5 resistance gene anologs (RGA) markers, 70 simple sequence repeats (SSR) markers, 23 cleaved amplified polymorphic sequence / single nucleotide polymorphism (CAPS/SNP) markers and 1 INDEL markers used. Among 99 tested molecular markers 11 molecular markers were found polimorphic between the parents. The polimorphic markers analysed with 150 mapping population plants and their genotypic reaction were revealed in polymerase chain reactions. 2008, 57 pages Key Words: Solanacea, Alternaria solani, Early Blight Disease, SSR, CAPS, INDEL markers ii

7 TEŞEKKÜR Tez konumun seçiminde ve çalışmalarımın gerçekleşmesinde değerli katkılarını esirgemeyen ve her zaman yardımlarını gördüğüm danışman hocam Sayın Yrd. Doç. Dr. Özer ÇALIŞ a teşekkürü bir borç bilirim. Çalışmalarımın gerçekleşme aşamasında bilgilerini esirgemeyen hocalarım Doç. Dr. Nejdet KANDEMİR, Doç. Dr. Ahmet YILDIRIM, Yrd. Doç. Dr. Çetin ÇEKİÇ e, Arş. Gör. Özlem SÖNMEZOĞLU na, manevi desteğini esirgemeyen sevgili arkadaşlarım, Arş. Gör. Tuğba ESERKAYA, Zir. Müh. Erkan KESAT, Arş. Gör. Sabriye YAZICI, Zir. Müh. Sevilay SAYGI, Zir. Müh. Rahime GÜNDÜZ, Arş. Gör. Mustafa ALKAN a, bana çalışma imkanı sağlayan Moleküler Biyoteknoloji Laboratuvarı çalışanlarına teşekkürler ediyorum. Ayrıca çalışmada kullandığım hastalık etmeni fungusu tanımlayan Doç. Dr. Yusuf YANAR a teşekkürlerimi sunuyorum. Bütün eğitimim boyunca maddi ve manevi desteğini hiçbir zaman esirgemeyen aileme teşekkür ederim. Şerife TOPKAYA 08/2008 iii

8 İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... i ABSTRACT... ii ÖNSÖZ... iii İÇİNDEKİLER. iv ŞEKİLLER DİZİNİ... v ÇİZELGELER DİZİNİ... vi 1. GİRİŞ LİTERATÜR ÖZETLERİ MATERYAL VE YÖNTEM Hastalık Etmeninin İzolasyonu Domates Agarının Hazırlanışı Hastalık Etmeninin Agar Ortamında Yetiştirilmesi Bitkilerin Elde Edilmesi Bitkilerin Yetiştirilmesi Patojenisite testi Melez Bitkilerin Oluşturulması F2 Melez Bitkilerinin Oluşturulması Geriye Melez Bitkilerinin Oluşturulması Bitkilerden DNA İzolasyonu PCR Analizleri Jel Görüntüleme Moleküler Markörler Restriksiyon Enzimleri Genel Solüsyonlar SONUÇ VE TARTIŞMA Patojenisite Testi Sonuçları Moleküler Analiz Sonuçları KAYNAKLAR EK v

9 Şekil ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Şekil 1. Şekil 2. Şekil 3. Şekil 4. Şekil 5. Şekil 6. Şekil 7. Şekil 8. Şekil.9. Şekil 10. Şekil 11. Şekil 12. Çalışmada kullanılan 3 farklı erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani in besi ortamında gelişimi 12 Domates ve yabani akrabalarının 7 no lu saksılara aktarıldıktan sonra Biyoteknoloji serasında gelişmeleri Çalışmada kullanılan 70 adet SSR markörden 6 tanesiyle yapılan PCR amplifikasyonun görünümü. 35 Polimorfik olarak bulunan 7 SSR markörün ebevyn bitki DNA larıyla yapılan PCR sonuçları. 35 SSR 63 markörü ile PCR yapılan F1 DNA larının metafor jelde görünümü.. 36 Polimorfik SSR63 markörünün 150 haritalama populasyonu bitki DNA sıyla yapılan PCR amplifikasyonu. 38 Polimorfik TOM144 markörünün 150 haritalama populasyonu bitki DNA sıyla yapılan PCR amplifikasyonu. 39 Orta derecede dayanıklı NCEBR2 ve orta decede hassas NC84173 bitkileri arasında polimorfizmi ortaya koyan CAPS markörler Polimorfik olan LEOH57 ve CAPS markörünün ebeveyn ve haritalama populasyonuyla yapılan PCR amplifikasyonu 42 Polimorfik olan Rx-3L1 CAPS markörünün ebeveyn ve haritalama populasyonuyla yapılan PCR amplifikasyonu. 43 Dayanıklılık gen analoğu (RGA) markörlerin orta derecede dayanıklı NCEBR2 ve orta derecede hassas NC84173 hatlarıyla yapılan PCR amplifikasyonu sonuçları 44 Polimorfik INDEL CT10737I markörünün ebeveyn ve haritalama populasyonu ile olan PCR amplifikasyonu. 45 vi

10 TABLOLAR DİZİNİ Tablo Sayfa Tablo 1. Erken yanıklık (Alternaria solani) hastalığına karşı Amerikan Ulusal Germplasm Sisteminde ( taranarak laboratuvarımıza getirilen tohumlar Tablo 2. Ebeveynler arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan dayanıklılık gen anoloğu (RGA) markörleri Tablo 3. NCEBR2 ve NC84173 bitkileri arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan SSR markörleri Tablo 4. Dayanıklı NCEBR2 ve hassas NC84173 bitkiler arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan CAPS markörleri. 25 Tablo 5. Dayanıklı NCEBR2 ve hassas NC84173 bitkiler arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan INDEL markörleri Tablo 6. Ebevynler arasındaki polimorfizmi bulmak için çalışmada kullanılan enzimler ve kestiği bölgeler Tablo 7. Çalışmada kullanılan 7 kültür domates hattının 3 Alternaria solani hastalık etmeni izolatı ile yapılan patojenisite test sonuçları Tablo 8. Alternaria solani 2 no lu izolat ile inokule edilen farklı nesillerdeki bitkilerin haftalık olarak ölçümlenen AUDPC değerlerine ait tanımlayıcı istatistikler. 32 Tablo 9. Alternaria solani 2 no lu izolat ile inokule edilen ebeveyn bitkilerde hastalığın gelişiminin istatistiki analiz sonuçlarının tabloda görünümü.. 33 Tablo 10. İnokulasyondan 42 gün sonra hastalığın tüm bitkilerde gelişimi.. 34 Tablo 11. Polimorfik olarak bulunan simple sequence repeat (SSR) markörlerin nükleik asit dizileri ve ebevyn bitkilerde oluşturdukları amplifikasyon büyüklükleri. 37 Tablo 12. Polimorfik olarak bulunan CAPS markörler ve markörlerin nükleik asit sıraları 41 vii

11 1 1.GİRİŞ Domates dünya üzerinde tarımı en fazla yapılan sebze türlerinden bir tanesidir. Taze olarak tüketildiği gibi, işlenmiş ürün olarak da sofralarımızda salça, domates kurusu, domates suyu ve konserve olarak yer almakta olup insan beslenmesinde oldukça önemli bir yere sahiptir. Türkiye FAO nun 2006 yılı verilerine göre 260 bin hektar (ha) alanda 9,8 milyon ton (t) domates üretimi ile dünyada en çok domates üreten ülkeler arasında üçüncü sırada yer almaktadır (Anonim, 2006). Dünyada domates tüketimi 1985 yılından itibaren %10 artarak 2006 yılında 125,5 milyon ton olmuştur. Besin maddesi olarak domates A ve C vitaminleri bakımından zengin olup, içermiş olduğu antioksidan likopen maddesi kanser ve kalp hastalıklarına karşı koruma sağlamaktadır (Barone, 2003). Tokat yöresi yaklaşık 600 bin ton domates üretimiyle Türkiye domates üretiminin %7 sini, Dünya domates üretiminin ise %0,5 ini karşılamaktadır (Anonim, 2006). Tokat iklimsel olarak hem Karadeniz hem de karasal iklimin sıcak ve nemli özelliklerini gösterdiği için bu derece önemli olan üründe hastalıkların salgın halinde görülmesi kaçınılmazdır. Tokat ta domates te en önemli ve iklim şartlarına bağlı olarak her yıl hastalık oluşturan erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani dir. Türkiye nin yaş sebze ihracatı 22 milyon ton olup dünya sebze üretiminin %3.3 ünü ve 12 milyar dolar olan dünya sebze ihracatının %1.2 sini oluşturmaktadır (Anonim 2008a). Bu rakam sebze üreticisi olan Türkiye nin arzu ettiği ihracat rakamının çok altındadır. Üretimde en büyük problem ihraç edilen sebzelerdeki ilaç kalıntıları, uluslararası standartlara ve tüketici tercihlerine uygun üretim yapılamamasıdır (Anonim 2008b). Domateste erken yanıklık hastalığını kontrol etmek için kullanılan koruyucu ve sistemik fungusitler kullanıcıların bilinçli olmaması, uygulandıktan sonra hasada kadar geçmesi gereken süreye riayet edilmemesi nedeniyle çok miktarda fungisit kalıntısı ortaya çıkmaktadır. Gerek iç tüketimde gerekse ihracatta son derece önemli olan fungisit kalıntıları iç piyasada halkımızın sağlığını tehdit etmektedir. Bu nedenle kısa vadede akut ve uzun vadede kronik hastalık oranlarında artış görüldüğü ve toplumun tercihinin organik tarıma kaydığı bildirilmektedir (Anonim 2008c). Hastalık etmeni A. solani domateste büyük ürün kayıplarına neden olmaktadır. En basit ifadeyle hastalık etmeni en az %10 ürün kaybına neden olduğunda, Tokat için yaklaşık

12 2 60 bin ton domates kaybı görülmekte ve bunun ekonomik boyutları hastalığı kontrol altına alabilmek için uygulanan fungusitlerle maddi kayıp kat kat artmaktadır. Domateste erken yanıklık hastalık etmeninin kontrolü için kültürel önlemler, uzun süreli ekim nöbetleri ve kimyasal olarak fungusit uygulaması yapılmaktadır (Fooland ve ark., 2002). Kimyasal mücadelede kullanılan fungusitlerin hava şartlarına bağlı olarak 7-14 günde bir tekrarlanması gerekmekte olduğundan kullanılan bu fungusitler üründe kalıntılara neden olarak ürünün pazar değerini düşürmekte ihracatı da olumsuz etkilemektedir. Bu sebeple erken yanıklık hastalık etmeni A. solani ile mücadelede en etkili çözüm dayanıklı çeşitleri kullanmaktır. Toprakta saprofitik olarak yaşayan nekrotrofik fungal hastalık etmeni A. solani başta domates ve patates gibi solanaceae familyası bitkilerini, sebzeleri (fasulye), süs bitkilerini (karanfil) ve meyve türlerini (elma, portakal) hastalandırmaktadır (Agrios, 1997). Fakat ekonomik olarak en fazla Solanaceae familyasına ait bitkilerde kayba neden olmaktadır. Günümüzde Türkiye de ticari olarak yetiştiriciliği yapılan kültür domates çeşitleri Alternaria solani hastalık etmenine karşı hassastır. Kültür domatesi çeşitlerinde hastalık etmenine karşı dayanıklılık genlerinin olmayışı domatesin doğal olarak yetişen Lycopersicon türlerini dayanıklılık kaynağı olarak kullanmayı teşvik etmiştir. Çünkü doğada hastalık ve zararlılarıyla birlikte yaşayan yabani domates türleri bu etmenlere karşı dayanıklılık genleri taşımaktadır. Bu dayanıklılık genlerinin kültür domateslerine aktarılması ve üstün verim özelliklerinin kazandırılması son yıllarda çok önem kazanmıştır (Pandey ve ark., 2003). Günümüze kadar uygulanan klasik ıslah programları, bitkisel ürünlerde hastalık ve zararlılar başta olmak üzere kültür bitkilerinin diğer birçok tarımsal özelliklerinin iyileştirilmesinde büyük öneme sahiptir. Klasik ıslah yöntemleri bazı durumlarda yetersiz kalabilmekte ya da oldukça uzun süreye ihtiyaç duymaktadır. Bu sebeplerden dolayı son 15 yıl içerisinde gelişen bitki biyoteknolosi yöntemleri önem kazanmaktadır. Tarımsal yönden öneme sahip genler genetik haritalar kullanılarak, kültür çeşitlerine etkin bir şekilde, hızlı ve kolayca aktarılabilmektedir (Yıldırım ve Kandemir, 2001). Erken yanıklık etmeni Alternaria solani uygun hava şartlarıyla birlikte her yıl başta domates ve patates olmak üzere Solanecea familyası bitkilerinde salgın hastalıklar

13 3 oluşturur. Hastalığın oluşturduğu kaybı ortadan kaldırmak, en azından azaltmak için, kültürel ve kimyasal uygulamalar yapılmaktadır. Kültürel uygulamaların hastalığın kontrolünde yetersiz oluşu, kullanılan fungusitlerin domateslerde kalıntı bırakması, tekrar uygulama gerekliliği ve çevreye olan olumsuz etkilerinden dolayı son yıllarda bitki dayanıklılık genlerinin önemi artmıştır (Agrios, 1997). Türkiye de kullanılan ticari domates çeşitlerinde erken yanıklık hastalık etmenine karşı dayanıklılık genlerinin bulunmayışı, ıslahçıları hastalığa karşı dayanıklı kültür çeşitleri oluşturmaya yöneltmiştir. Özellikle biyoteknolojik yöntemlerin yardımıyla domatesin yabani çeşitlerinden kültür çeşitlerine dayanıklılık genlerinin aktarılması sağlanmıştır. Domates bitkilerine yabani akrabalarından aktarılan genler erken yanıklık etmenini kontrol altına alırken bu genlerin hangi kromozomlar üzerinde olduğu, genlerin yapısal özellikleri, genlerin dayanıklılığı sağlarken aktive ettikleri savunma mekanizmaları ve patojenle olan ilişkileri konusundaki sorular henüz açıklanamamıştır. Bu soruları cevaplayabilmek, domateste dayanıklılık genlerini kromozomlar üzerinde haritalayabilmek için ebeveyn olarak farklı genetik materyal içeren anne ve baba domates bitkilerinin moleküler olarak farklılığının (polimorfizm) ortaya konması gerekmektedir. Genetik çeşitliliğe sahip istenen özellikleri taşıyan domates çeşitlerinin oluşturulması biyoteknoloji ile günümüzde mümkündür. Özellikle dayanıklılık genlerinin önce kromozomlar üzerinde yerinin haritalanması sonrasında bu haritalanan yeri fiziksel olarak haritalamak ve istenen özelliklere sahip transgenik bitkilerin oluşturulması mümkündür. Çalışmamıza konu olan dayanıklı ve hassas domates bitkilerinde bu özellikleri kontrol eden genlerin haritalanması ve bu genlerin yapılarının anlaşılmasıyla domateste erken yanıklık hastalığının genetik kontrolü sağlanacaktır. Genetik olarak hastalığı kontrol eden genlerin haritalanması ancak ebeveyn bitkilerin genetik olarak polimorfik (farklı) olmasıyla mümkündür. Bu genlerin haritalanması da fenotipte bulunan özelliklerin bir veya daha fazla belirteçle genotipte dayanıklılık genine çok yakın olacak şekilde eşleştirilmesiyle yapılmaktadır. Bu nedenle ebeveynlerdeki polimorfizmin ortaya konması daha önce bahsedilen aşamalar için vazgeçilmez bir adımdır.

14 4 Domateste görülen hastalıkların kontrolü için alternatif teknolojiler üretmek, dayanıklılık lokuslarını kullanarak hastalık etmenlerini kontrol altına almak günümüzde sürdürülebilir tarımın vazgeçilmezlerindendir. Bu nedenle projemizde domates üretiminde önemli olan erken yanıklık hastalık etmeninin dayanıklı domates bitkilerinin genomunda bulunan dayanıklılık lokuslarını haritalamak için alt yapıyı oluşturmak amaçlanmaktadır.

15 5 2. LİTERATÜR ÖZETLERİ Domates (Lycopersicon esculentum mill.) dünyada yaygın olarak yetişen sebze ürünlerinden biri olarak bilinmektedir. Taze sebze olarak aynı zamanda işlenmiş ve kutulanmış olarak tüketilmektedir. Domates tüketimi 1985 den beri dünyada yaklaşık %10 artmıştır. Bunun nedeni domatesin besin değerinden gelmektedir. Domates A ve C vitaminlerinin önemli bir kaynağıdır. Dahası son çalışmalar, kırmızı domatesin önemli bir bileşeni olan likopenin önemini göstermiştir. Antioxidant özelliğe sahip olan likopen kanser ve kalp hastalıklarına karşı koruyucu olarak bulunmuştur (Durant, 2008) Erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani nemli havada yaprak üzerindeki lekelerde koyu füme veya koyu yeşil renkli kadifemsi görünüşte olan miseller oluşturur. Bunlar fungusun konidioforları ve konidilerinden ibarettir. Konidiler çok hücreli, uzun, koyu renkli, enine ve boyuna bölmeli olup uzun bazen çatallı uzantıları vardır. Enfeksiyon genellikle topraktan olur. Fungus hayatını topraktaki bitki artıkları üzerinde devam ettirir. Tohumla da bulaşabilir. Fide devresinde kotiledon yapraklarda nekrotik lekeler meydana getirerek fidelerin ölmesine sebep olur. Ölü fideler üzerinde meydana gelen yoğun popülasyon hastalığın yayılmasını sağlar (Agrios, 1997; Anonim 2008d). Erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani Sorauer domates bitkilerinde iki farklı hastalık semptomuna neden olabilir. Yapraklarda erken yanıklık ve gövdede yaka gibi çürüme (collar rot) oluşturabilir. Hastalık etmeni 6-30 C sıcaklık arasında gelişir. Optimum gelişme sıcaklığı ise C dir. Erken yanıklık hastalığına bitkilerin her devresinde rastlanır. Fidelerde kök çürüklüğü veya kök boğazı yanıklığı yapar. Hastalık yapraklarda, saplarda ve meyvelerde lekeler halinde görülür. Lekeler önce küçük gayri muntazam ve esmerdir. Lekeler sonra 1-2 cm ye kadar büyürler. Koyu gri bir renk alırlar ve genellikle merkezi daireler şeklinde sınırlanma gösterirler. Hastalık şiddetli olursa bütün yapraklar kurur ve dökülürler. Aynı lekeler bazen saplarda da meydana gelir. Bu lekeler yüzünden bazen sap tamamen ölür. Çiçek ve meyve sapları hastalığa yakalanırsa dökülürler. Meyvelerde genellikle sapın tutunduğu kısımda koyu renkli çökük, çoğunlukla sınırlanmış lekeler meydana gelir. Hastalık kısa zamanda bitkiyi öldürür ve çok fazla miktarda ürün kaybına neden olur. Sebze ekilişi yapılan alanlarda hastalığın zararını her zaman görmek mümkündür. Ancak bazı yıllar fungal hastalık

16 6 etmeni epidemiler yapabilmektedir (Anonim 2008d; Agrios, 1997, Lawrence ve ark., 2000). Hastalıklı dokularda bitki fotosentez faaliyetini yapamadığı için bitkide ürün oluşmamakta, oluşsa bile miktarının düşmesine ve meyve kalitesinin yok olmasına neden olmaktadır. Hastalık etmenin kontrolü için kimyasal uygulamalar yapılmaktadır Bu uygulamalar ürünün maaliyetini artırmaktadır (Agrios, 1997; Zhang ve ark. 2003). Hastalık etmeni solanaceae bitkilerinden başka sebzeleri (fasulye), süs bitkilerini (karanfil) ve meyve türlerini (elma, portakal) hastalandırmaktadır. Fakat ekonomik olarak en fazla solanaceae bitkilerinde ürün kaybına neden olmaktadır (Agrios, 1997) Günümüzde Türkiye de ticari olarak yetiştiriciliği yapılan tüm kültür domates çeşitleri Alternaria solani hastalık etmenine karşı hassastır. Hastalık etmeni kültürel önlemler, uzun süreli ekim nöbetleri ve rutin fungisit uygulamaları ile kontrol altında tutulmaktadır (Fooland ve ark., 2002). Erken yanıklık hastalığının kimyasal mücadelesi her zaman ekonomik değildir ve sık sık kimyasal uygulamaları gerekmektedir. Bu yüzden bitki dayanıklılığı hastalıkla mücadelede en uygun yöntemdir (Barone, 2003; Fooland ve ark., 2002; Tirthamallappa ve Lohithaswa, 1999). Gerek klasik gerekse moleküler ıslah yöntemleriyle erken yanık hastalığına karşı dayanıklı çeşitler geliştirilmeye çalışılmaktadır. Hastalık etmeninin kompleks yapısı ve dayanıklı bitkilerdeki karmaşık genetik yapıdan dolayı istenen dayanıklı kültür domates çeşitleri henüz ortaya çıkarılamamıştır (Zhang ve ark., 2003). Kültür domateslerinde hastalık etmenine karşı dayanıklılık genlerinin bulunamayışı domatesin doğal olarak yetişen Solanum türlerini dayanıklılık kaynağı olarak kullanmayı teşvik etmektedir. Çünkü doğada hastalık ve zararlılarıyla birlikte yaşayan yabani domates türleri bu etmenlere karşı dayanıklılık genleri taşımaktadır. Bu dayanıklılık genlerinin kültür domateslerine aktarılması ve üstün verim özelliklerinin kazandırılması son yıllarda çok önem kazanmıştır (Pandey ve ark., 2003). Kültür domatesleri Solanum lycopersicum (syn. Lycopersicon esculentum) içinde erken yanıklığa tam dayanıklı çeşitler bilinmemektedir (Peralta ve ark. 2005). Tüm ıslah hatları ve akraba çeşitler orta derecede dayanıklı olup diğer kültür domates çeşitleri erken yanıklık hastalığına hassastırlar ( Gardner ve Shoemaker 1999). Bazı yabani

17 7 domates türleri, S. habrochaites (syn. L. hirsutum), S. pimpinellifolium (syn. L. pimpinellifolium), S. peruvianum (syn. L. peruvianum) ve S. chilense (syn. L. chilense), potansiyel dayanıklılık kaynağı olarak tanımlanmıştır (Nash ve Gardner 1988; Fooland ve ark. 2000; Thirthamalappa ve Lohithaswa 2000). Bu yabani türlerden bazıları özellikle S. habrochaites PI aksesyonu erken yanıklık hastalığına orta derecede dayanıklı hatlar geliştirmek için kullanılmıştır (Gardner ve Shoemaker 1999). Yapılan çalışmalar domateste erken yanıklık hastalığına dayanıklılık sağlayan genlerin kantitatif olarak etkileşimleri sonucunda her birinin dayanıklılıkta küçükten orta dereceye kadar katkıda bulunduklarını göstermiştir. Klasik ıslah çalışmaları dayanıklı materyallerin ortaya konmasını sağlamış, fakat her bir genin dayanıklılığa nasıl etki ettiğini ve domates genomu üzerindeki yerini açıklayamamıştır. Örneğin Amerika Birleşik Devletlerinde piyasaya sunulan erken yanıklığa dayanıklı NCEBR-4 tohumları hastalığın kontrolünde kullanılmakta fakat genetik yapıları hakkında bilgi bulunmamaktadır (Gardner ve Shoemaker, 1999; Fooland ve Lin, 2001). Biyoteknolojinin üstünlüğü moleküler markörleri, moleküler haritaları ve markör destekli seleksiyon (MAS) teknolojilerini kullanarak klasik bitki ıslah yöntemlerini destekleyen bir yaklaşım olarak karşımıza çıkmasıdır. Özellikle moleküler markör teknolojisi kompleks özellikleri kontrol eden çok sayıda genlerin (Quantitatif trait loci: QTL) sayılarını, bireysel ve interaktif etkilerini ve kromozom üzerindeki yerini belirlemeyi kolaylaştırmaktadır (Tanskley ve ark.1989). Moleküler markörler 1980 lerden beri domates ve diğer bitkilerin genomlarında bulunmuş en önemli genetik yapılar olarak bilinmektedir (Barone, 2003). Dayanıklılık genlerine bağlı olan moleküler markörlerin tanımlanması iki nedenden önemlidir: birincisi bu markörler dayanıklılık fenotipinden ziyade markör genotipine bağlı olarak seleksiyona izin vermektedirler, ikincisi moleküler markörler istenmeyen bağlantı sürüklenmesini azaltabilmektedirler. Hastalıklara dayanıklılık genlerine bağlı moleküler markörleri bulmak için büyük projeler gerçekleştirilmektedir. Bu projelerden birisi domates genomunu ortaya koymaya çalışan Solanacea Genome Project (SGN) olup domates genomunun yaklaşık %40 ı tamamlanmıştır ( Erken yanıklık hastalığına dayanıklı domates haritası oluşturmak amacıyla Fooland ve

18 8 arkadaşları tarafından geriye melez (BC 1 ) populasyonları kullanılarak genetik kaynak S. habrochaites (syn. L. hirsutum) da kantitatif karakter lokus (QTLs) etkilerinin büyüklüğü ortaya konulmuştur (Fooland ve ark. 2002b; Zhang ve ark. 2003). Domates bitkilerinde erken yanıklık hastalığına karşı bitkilerin genetik yapısını ortaya koymak için çimlenme ve yetişkin bitki döneminde bulunan bitkiler melezlenerek patojenisite testelerinden geçirilmişlerdir. Çalışmada kullanılan Arka Saurabh (hassas) x IHR1939 (dayanıklı) melezininin 6 jenerasyon boyunca analizi yapılarak hem çimlenme döneminde hem de yetişkin bitki döneminde erken yanıklılığa dayanıklılığın çekinik genler tarafından kontrol edildiği gösterilmiştir. Erken yanıklığa karşı poligenik dayanıklılık görülmektedir. Eklemeli dayanıklılık olarak bilinen bu dayanıklılık mekanizmalarında birden fazla gen dayanıklılığı kontrol etmektedir (Tirthamallappa ve Lohithaswa 1999). Yukarıdaki domates hatlarıyla yapılan çalışmalarda, eklemeli x eklemeli gen etkilerinin çimlenme döneminde ve dominant x dominant gen etkilerinin yetişkin bitki döneminde önemli olduğu bulunmuştur (Tirthamallappa ve Lohithaswa 1999). Domatesin tüm yabani türleri erken yanıklık hastalığına karşı dayanıklılık kaynağı olarak günümüzde yoğun olarak kullanılmaktadır (Fooland ve ark. 2000). İzole edilen Alternaria solani hastalık etmeninin ırklarının yabani türlere karşı dayanıklılık reaksiyonlarının bulunması, lokal patojenik populasyonların virülensliğine ve patojenitesine bağlı olabileceğinden dolayı özel çevreler için doğrulanmaya ihtiyaç bulunmaktadır. Çok sayıda araştırmacı dünyanın çeşitli yerlerinden erken yanıklığa dayanıklı domates genotiplerini tanımlamışlardır. Yapılan bu çalışmalar ve onların daha sonraki genetik analizleri, dayanıklılığın çoklu genler tarafından kontrol edildiğini tasdiklemişlerdir (Tirthamallappa ve Lohithaswa 1999). Farklı üç domates türünü temsil eden 29 domates genotipinde Alternaria solani hastalık etmeninin dayanıklılığı incelenmiştir. Tarla, sera ve büyüme kabininde yapılan deneylerde Alternaria solani enfeksiyonuna karşı genotipler arasında önemli farklılıklar bulunmuştur. Tarla ve sera deneylerinde hastalıkla inokulasyondan sonra Lycopersicon hirsitum yabani domates türlerinin bazı hatları (PI ve LA2099) hastalık etmenine

19 9 karşı neredeyse tam dayanıklılık göstermiş, diğer taraftan NC84173 ıslah hattı ve New Yorker domates çeşidi ise tam hassaslık göstermiştir (Fooland ve ark., 2000). Yukarıda belirtilen çalışmaların tersine bir gen tarafından (monogenik) dominant olarak kalıtım gösteren gen Lycopersicon hirsutum PI içerisinde bulunmuştur (Datar and Lonkar, 1985). Bu çalışmada F 2 popülasyonu bitkileri çok dayanıklı, orta dayanıklı ve hassas olarak bulunmuş, dayanıklılık; hassaslık oranı tesadüfen 3:1 olarak ortaya konmuştur (Datar ve Lonkar, 1985). Fakat erken yanıklık hastalığına karşı yabani ve kültür domateslerinde bulunan genlerin kantitatif yapıda olduğu her bir genin dayanıklılığı farklı miktarlarda katkıda bulunduğu Fooland ve Lin tarafından ortaya çıkarılmıştır. Burada F 2 populasyonunda ortaya konan 3:1 dayanıklı:hassas oranın tesadüfen ortaya çıktığına karar verilmiştir (Fooland ve Lin 2001). Domates erken yanıklık ve diğer fungal yaprak hastalıklarını kontrol etmek için rutin olarak fungusitler kullanıldığından dolayı, çevresel endişelerden dolayı fungusitleri azaltmaya karşı artan bir ilgi bulunmaktadır. Erken yanıklığa dayanıklı çeşitlerin geliştirilmesi bu hastalığı kontrol etmede yüksek başarı sağlayacaktır. Son yıllarda ABD de erken yanıklığa orta derecede dayanıklı USDA7162, C1943, NCEBR-1, ve NCEBR-2 ıslah hatları geliştirilmiştir (Gardner, 1988). Bu hatlardan NCEBR-1 ve NCEBR-2 dayanıklılığı asıl olarak eklemeli genetikle belirlenirken, USDA7182 ve C1943 de erken yanıklığa dayanıklılığın resesif genler tarafından kontrol edildiği ortaya konmuştur. (Nash ve Gardner, 1988). Yapılan bir haritalama çalışmasında L. pimpinellifolium LA722 ile domates NC84173 hattı melezlenerek bir haritalama populasyonu oluşturulmuştur. Bu çalışmada oluşturulan 119 BC 1 haritalama populasyonu bitkisi üzerinde 151 RFLP markörü test edilmiştir. Yaklaşık olarak 1192 cm domates genomu içerisine bu markörler ortalama 7,9 cm mesafeyle yerleştirilmiştir. Haritanın uzunluğu ve markörlerin linear sırası domatesin önceden yayınlanan moleküler haritalarıyla iyi bir uyum içindeyken kromozomlar arasında rekombinasyonun dağılımında önemli farklılıklar bulunmuştur. (Chen ve Foolad, 1999).

20 10 Bir diğer çalışmada, domates dayanıklılık genleri ile moleküler markörler arasında bağlantı haritası Lycopersicon esculentum Mill. hattı NC84173 ile Lycopersicon hirsutum Humb PI bitkileri arasında oluşturulan geriye melez populasyonunda çalışılmıştır. NC84173 bitkisi domateste bazı hastalıklara dayanıklı fakat erken yanıklığa ve geç yanıklığa dayanıklı olmayan geliştirilmiş ıslah hattıdır. PI erken yanıklık ve geç yanıklık da dahil birçok domates hastalıklarına dayanıklı, kendine döllenen bir bitkidir. Haritalamada 142 RFLP markörü ve 29 RGA anoluğu test edilmiştir. Kullanılan dayanıklılık gen analogları bilinen dayanıklılık genlerinin Leucine rich repeats (LRR), Nucleotide Binding Site (NBS), Pto kinase (Ptokin) domainlerinden türetilmiştir. Tüm bu RFLP ve RGA markörleri 1469 santi Morgan (cm) olan domates genomu üzerinde ortalama 8,6 cm mesafeyle yerleştirilmiştir. RGA lokusları 12 domates kromozomunun 9 tanesi üzerinde haritalanmış olup bilinen genlerin (Cf2, Cf4, Cf9) konumları ile bazıları çakışmıştır (Zhang ve ark., 2003). Moleküler markörler ve gen haritalarının gelişmesiyle bitki türleri arasındaki sınırlamaların artık üstesinden gelinebilmektedir. Moleküler bağlantı haritaları karmaşık özellikleri etkileyen QTL lerin yada genlerin bireysel etkilerini, kromozomal bölgeleri ve sayılarını tahmini olarak belirlemeyi kolaylaştırabilmektedir. Kromozomal bölgelerdeki QTL lerin tanımlanmasından sonra istenen QTL bölgeleri kültür bitkilerine aktarılabilir ve istenmeyen özellikler MAS yöntemiyle kısmen hızlı şekilde elemine edilebilmektedir (Zhang ve ark.2002).

21 11 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Hastalık Etmeninin İzolasyonu Erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani Tokat-Kazova dan 25 infekteli sırık ve yer domatesi bitkilerinin 2,5 ve 6 numaralı örneklerden 2004 sonbahar döneminde izole edilmiştir. İzole edilen bu 2, 5 ve 6 no lu patojen izolatları domates besi ortamında günde düzenli olarak yeni besi ortamlarına aktarılarak muhafaza edilmiştir. Hazırlanan otoklav edilmiş domates besi ortamı steril kabinde 9 cm çapındaki steril petrilere ~20 ml olacak şekilde dökülmüştür. Hastalık etmeni A. solani in teşhisi, Gaziosmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Anabilim Dalı öğretim üyesi Doç. Dr. Yusuf YANAR tarafından yapılmıştır Domates Agarının Hazırlanışı Ticari olarak üretilen (DİMES, Tokat) %100 domates suyundan 30 ml alınarak 270 ml çeşme suyu ilave edilerek 300 ml besi ortamı hazırlanmıştır. Hazırlanan domates suyunun ph sı ölçülerek olması için seyreltik HCl ilave edilmiştir. Bu domates ortamının katılaşması için %1.5 agar olacak şekilde 4.5 gr agar agarı (Lab M, İngiltere) ilave edilerek C de 1 atmosfer basınçta 20 dakika otoklav edildikten sonra steril besi ortamı hazırlanmıştır Hastalık Etmeninin Agar Ortamında Yetiştirilmesi Besi ortamları petrilere döküldükten sonra üzerine Alternaria solani hastalık etmeninin en güçlü gelişimin olduğu yerden miselyumlar 5 mm çapında kesilerek Petrinin tam ortasına ters olarak bırakılmıştır. İnokule edilen petriler oda sıcaklığında gelişmeye bırakılmıştır. Böylece hastalık etmeni saf olarak üretilip patojenisite testlerinde kullanılmıştır (Şeki l). Çalışma kapsamına alınan 2, 5 ve 6 no lu Alternaria solani izolatları içerisinde 2 no lu izolatın daha çok sayıda spor oluşturması nedeniyle inokulasyon işlemlerinde kullanılmıştır.

22 12 Şekil 1. Çalışmada kullanılan 3 farklı erken yanıklık hastalık etmeni Alternaria solani in besi ortamında gelişimi A) 2 no lu,b) 5 no lu, C) 6 no lu A. solani izolatları 3.4. Bitkilerin elde edilmesi Projemizde kullandığımız domates NCEBR 1-6 hatları Prof. Dr. Randy GARDNER (Horticultural Science, North Carolina University, USA) tarafından çalışmalarımızda kullanmak üzere hediye edilmiştir. Diğer yabani domates tohumları ve kültür domates tohumu NC84173 California Üniversitesi Tomato Genetics Resource Merkezinden (Anonim, 2007) temin edilmiştir. Türkiye domatesin anavatanı olmadığı için domatesin doğal yetiştiği Güney Amerika nın And dağları bilim adamları tarafından taranarak domates genetik kaynakları oluşturulmuştur. Amerika da oluşturulan Tomato Genetics Resources Merkezi en büyük domates ve yabani akrabalarının saklandığı merkezlerden birisidir. Çalışmada kullandığımız tohumların orijinal toplanma yerleri Tablo 1 de verilmiştir. Tablo 1. Erken yanıklık (Alternaria solani) hastalığına karşı Amerikan Ulusal Germplasm Sisteminde ( taranarak laboratuvarımıza getirilen tohumlar. Tohumun adı (Accession No) Orijini Latince adı NC84173 Amerika L. esculentum NC EBR-1 Amerika L. esculentum NC EBR-2 Amerika L. esculentum NC EBR-3 Amerika L. esculentum NC EBR-4 Amerika L. esculentum NC EBR-5 Amerika L. esculentum NC EBR-6 Amerika L. esculentum

23 Bitkilerin yetiştirilmesi Tomato Genetics Resource Merkezinden elde ettiğimiz bu tohumlar viollere ekilerek 2-3 gerçek yapraklı hale gelince 7 numaralı 20 cm çapındaki saksılara şaşırtılmıştır. Bu bitkiler Ziraat Fakültesi Biyoteknoloji serasında 16 saat gündüz, 8 saat gece, %60 nisbi nemde ve 26±1 C sıcaklıkta gelişmeye bırakılmıştır (Şekil 2). Şekil 2. Domates ve yabani akrabalarının 7 no lu saksılara aktarıldıktan sonra Biyoteknoloji serasında gelişmeleri Patojenisite testi Hastalık etmenine karşı dayanıklı ve hassas bitkileri ortaya koyabilmek için patojenisite testleri yapılmıştır. Bu amaçla besi ortamında steril şartlarda geliştirilen Alternaria solani izolatları distile suda toplanıp hazırlanan 2x10 6 spor ml -1 konsantrasyonunda bitkilere püskürtülmüştür. Hastalık etmeni sporların konsantrasyonu 0.1 mm x 0.1 mm x 0.1 mm (en x genişlik x derinlik) olan Haemocytometer (Thoma lamı) ile sayılarak ayarlanmıştır. Hazırladığımız bu spor konsantrasyonu bitkilere 6 damla yüzey gerilimini düşürücü Tween 20 katıldıktan sonra yaprak yüzeyi tamamen ıslanıncaya kadar püskürtülmüştür. Püskürtme işlemi ilk gün 3 defa tekrarlanmıştır. Daha sonra sera

24 14 şartlarında hastalık etmeninin gelişimi beş hafta (inokulasyondan sonra 35 gün) boyunca gözlemlenmiştir. Bitkilerde hastalık şiddetinin belirlenmesinde 1= %0-3, 2= %3-6, 3= %6-12, 4= %12-25, 5= %25-50, 6= %50-75, 7=%75-87, 8= %87-94, 9= %94-97, 10= %97-100, 11= %100 kullanılmıştır. Bu ölçüm sisteminde 0 semptom göstermeyen sağlıklı yaprağı, 100 hastalıktan dolayı tamamen deforme olmuş yaprağı ifade etmektedir. Hastalığın gelişimi, bitkinin genel görünümüne bakılarak A. solani hastalık etmeninin yapraklarda hastalığın gelişmiş olduğu alan ölçülmüştür. Ebeveynlere ait hatlar (P1ve P2), F1, F2, geriye melez bitkileri (BCI) için hastalık gelişiminin olduğu alan (Area Under the Disease Progress Curve: AUDPC) aşağıdaki gibi hesaplanmıştır. n AUDPC= [ ( R + R ) / 2 ]*[ t t ] i+ 1 i i+ 1 i i= 1 R i : i. Gözlem gününde zarar görmüş dokuların tahmini oranı ti: İlk gözlem zamanı n: Toplam gözlem sayısı (Foolad ve Lin, 2001) Melez Bitkilerin Oluşturulması Hastalık etmeni A. solani ile patojenisite testlerinde kullanılan bitkilerin hastalık gelişimlerine bakarak dayanıklı ve hassas bitkiler belirlenmiştir. Dayanıklı ve hassas domates bitkileri çiçeklenme dönemine geldiğinde birbirleriyle melezlenerek F 1 hibrit melez bitkileri oluşturulmuştur. Melezleme işleminde hassas ebeveyn olan NC84173 den melezlemeden üç gün önce tamamen açılmış olan çiçeklerden polen tozları alınmış ve petri içinde gölge bir ortamda kurutulmaya bırakılmıştır. Melezleme gününde kuruyan polenler hafifçe ezilerek toz haline getirilerek kullanılmaya hazır hale getirilmiştir. Dayanıklı ebeveyn NCEBR2 nin tam açılmamış olan çiçeklerinin bir pens yardımı ile önce taç ve çanak yaprakları açılmıştır. Daha sonra polen ana hücreleri dişicik borusuna zarar vermeden, dişicik borusu yalnız kalacak şekilde uzaklaştırılmıştır. Yalnız bırakılan dişicik borusuna hazırlanmış olan NC84173 polenleri değdirilerek tozlama işlemi gerçekleştirilmiştir. Melezleme yapılan çiçek dışarıdan

25 15 yabancı tozlanmayı engellemek için parşömen kağıttan yapılan ışığı ve havayı geçiren kese kağıtlara konularak kapatılmıştır. Melezleme işleminin başarılı olabilmesi için bu işlem bir gün aralıkla 3 defa tekrarlanmış ve bir bitkide en fazla üç tane çiçeğe melezleme yapılmıştır F 2 Melez Bitkilerinin Oluşturulması Elde edilen bu F 1 hibrit bitkilerinin kendilenmeye bırakılması ile F 2 populasyonu oluşturulmuştur. Kendilemeye bırakma işleminde çiçekler tomurcuk halindeyken tam açılmadan yabancı döllenmeyi engellemek için kese kağıt ile kapatılmıştır. Çiçekler tam açılınca parşömen kağıt açılarak kendi polen tozu dişicik borusuna samur fırça yardımı ile değdirilerek tozlanma sağlanmış ve kese kağıt tekrar kapatılmıştır. Melezlemenin gerçekleşebilmesi için bu işlem üç defa tekrarlanmıştır. Bu F 2 popülasyonu bitkilerinin patojenisite sonuçları erken yanıklık hastalık etmenine karşı dayanıklı bitkilerdeki genetik özelliğin bir yada daha fazla lokus tarafından kontrol edildiğini ortaya koyacaktır Geriye melezleme populasyonunun oluşturulması Hassas ve dayanıklı bitkilerin melezlenmesiyle elde edilen F 1 bitkileri polen donör olan hassas (NC84173) bitkiyle geriye çaprazlanarak geriye melez (Back cross: BC 1 ) populasyonu oluşturulmuştur. Elde edilen bu geriye melez populasyonuna haritalama popülasyonu da denilmektedir. Bu geriye melezleme popülasyonu dayanıklılık gen(ler)inin haritalanmasında kullanılmaktadır. Haritalama işlemi için dayanıklı ve hassas ebeveynlerle birlikte F 1, F 2 ve BC 1 populasyonunda bulunan tüm bitkiler patojenisite testinden geçirilmiştir Bitkilerden DNA izolasyonu Bitkiler 2-3 gerçek yapraklı dönemde iken genç yapraklardan 2 örnek alınmıştır. Hücresel organellerin açığa çıkması ve hücre duvarının parçalanması için, fiziksel olarak dondurup-çözme işlemi ve kimyasal maddeler uygulanmıştır. Bu işlem için yaprak örnekleri sıvı azot içerisinde dondurularak sıcak ekstraksiyon buffer içerisinde öğütülerek yapılmıştır. Hücre membranı ise CTAB ya da SDS gibi deterjanların kullanılmasıyla parçalanmıştır. DNA yı nükleazlardan ayırmak için EDTA gibi

26 16 deterjanlar kullanılmıştır. DNA-protein kompleksinin çözülmesi ve proteinlerin uzaklaştırılması buffer karışımına kloroform ve/ veya fenol karışımı eklenerek yapılmıştır. Bitki DNA izolasyonunda aşağıda belirtilen protokol farklı DNA izolasyonu metotlarının modifiye edilmesi sonucu oluşturulmuştur. 1) 1,5 cm boyunda bir yaprak ependorf tüpte önce 50 µl buffer içinde öğütülür ve daha sonra 450 µl buffer ilave edilir. 100 ml Buffer: 65 ml dh 2 O 10 ml 1 M Tris ph: 7,5 14 ml 5 M NaCl 10 ml 0,5 M EDTA ph: 8,0 ==> 65 o C de ısıtılarak, 1 gr CTAB 1 ml 14 M Beta MerkaptoEtanol (BME) eklenir. 2) Bir ünite Proteinase K eklendikten sonra (1 ünite 5 µl konsantrasyon) vorteksde karıştırılır. 3) 50 µl % 20 SDS (veya 80 µl %10 SDS) eklenerek 65 o C deki su banyosunda 1 saat tutulur ve ara sıra alt üst ederek karıştırılır. 4) Su banyosundan çıkarılan tüplere 2 / 3 hacim (400 µl) kloroform : isoamil alkol (24:1) eklenir dakika alt üst edilerek karıştırılır. 5) g de 15 dakika santrifüj edilir. 6) Süpernatant 2 / 3 hacim yani 400 µl 2-propanol içeren yeni bir tüpe alınır. Alt üst edilerek DNA gözle görülür hale getirilir. 7) 15 dakika g de santrifüj edilir. 8) Sıvı dökülür. Pelet kuruduktan sonra 400 µl 1 x TE eklenir. 9) DNA 60 o C deki su banyosunda 3 saat eritilir. 10) 10 mg / ml RNase çözeltisinden 1 µl eklenir ve su banyosunda 1 saat bekletilir. 11) 400 µl kloroform : isoamil alkol (24:1) eklenir. Tüpler 10 dakika alt üst edilerek karıştırılır. 12) 15 dakika g de santrifüj dilir.

27 17 13) Süpernatant 100 µl 1.2M NaCl (veya 26 µl 5 M NaCl ) içeren yeni bir tüpe alınır. Hafifçe karıştırılır. 14) 800 µl % 96 soğuk etil alkol ilave edilir. Alt üst edilip karıştırılarak DNA çökeltilir. 15) g de 20 dakika santrifüj edilir ve sıvıyı dökülür. 16) Pelet 900 µl % 70 soğuk etil alkol ile dikkatlice yıkanır. Ters çevrilmiş halde 2 saat kurutulur. 17) Kuruyan pelet 100 µl 1 x TE de çözülür. Toplam 20 µg civarında DNA elde edilebilir. Elde edilen bu DNA lar kullanılıncaya kadar 100 µl TE buffer içerisinde C de saklanmıştır PCR analizleri PCR, DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla suni şartlarda DNA üretilmesini ifade etmektedir. Bu üretim için 6-25 nükleotid uzunluğunda başlatıcı DNA lar (primerler) gerekir. Reaksiyon ortamının ph sını ve tuz konsantrasyonunu optimum hale getiren tampon çözelti, polimeraz enzimin ihtiyaç duyduğu MgSO 4 ve DNA üretiminde kullanılmak üzere A, T, G, C nükleotidlerinin her birinden konulur. Polimeraz enzimi bu başlatıcı DNA nın bir kalıp DNA üzerine bağlanmasından sonra, onu bir uçtan uzatmaya başlar ve kalıp DNA nın aynısını üretir. DNA üretim işlemi birbirini izleyen bir seri çok spesifik sıcaklık devrelerinden yapılmaktadır. Reaksiyonda önce 95 0 C civarında bir sıcaklık kullanımıyla kalıp (hedef) DNA nın çift sarmal yapısı açılarak hedef DNA nın denatürasyonu sağlanıp DNA tek iplik haline getirilmektedir. Yapışma safhasında C arasında bir sıcaklıkta primerlerin kalıp DNA ya bağlanması sağlanmaktadır. Son olarak da 72 0 C de polimerizasyon yani DNA üretimi yapılmaktadır. Bu üç devre duruma bağlı olarak defalarca (normalde döngü) tekrarlanarak milyonlarca hedef DNA elde edilmektedir. (Sambrook ve ark., 1989). Çalışmada dayanıklı (NCEBR2) ve hassas (NC84173) ebeveynleri birbirinden moleküler olarak ayıran (polimorfik) 99 adet moleküler markör kullanılmıştır

28 Jel görüntüleme Çalışmada PCR ürünlerini görüntüleyebilmek için örnekler hazırlanan %1 lik agaroz jellere yüklenmiştir. Agaroz jelde yeterli derecede açılım bulunmadığında elde edilen PCR ürünleri %3 ve %4 lük metafor agaroz jellere yüklenerek elektroforez işlemine tabii tutulmuştur. Hazırlanan agaroz jellere yüklenen DNA ları ayırmak için ortalama Volt (V), metafor agaroz jellere yüklenen örnekleri ayırt etmek için ortalama V elektrik akımı uygulanmıştır Moleküler Markörler Çalışmada belirlediğimiz 5 adet RGA (Resistance Gene Analogs) markörü (Tablo 2), 70 adet SSR (Simple Sequence Repeats) markörü (Tablo 3), 23 adet CAPS/SNP (Cleaved Amplified Polymorphic Sequence/ Single Nucleotide Polymorphism) markörü (Tablo 4) ve 1 adet INDEL (Insertion/Deletion) markörü (Tablo 5) kullanılmıştır. Tablo 2. Ebeveynler arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan dayanıklılık gen anoloğu (RGA) markörleri. Anneling Markörün adı Nükleotid sıralaması sıcaklığı RLRR XLRR CLRR PTOKİN1 5 -CGCAACCACTAGAGTAAC-3 5 -ACACTGGTCCATGAGGTT-3 5 -CCGTTGGACAGGAAGGAG-3 5 -CCCATAGACCGGACTGTT-3 5 -TTTTCGTGTTCAACGACG-3 5 -TAACGTCTATCGACTTCT-3 5 -GCATTGGAACAAGGTGAA-3 50 C 50 C 50 C 50 C PTOKİN2 5 -AGGGGGACCACCACGTAG-3 50 C RGA markörleri ebeveynler arasında dayanıklılık gen anaologlarının bulunup bulunmadığı ortaya koymak açısından kullanılan markörlerdir. Bitkiler RGA markörünü zaman içinde rekombinasyonlar, silinmeler ve mutasyonlarla kaybedebilir.

29 19 Tablo 3. NCEBR2 ve NC84173 bitkileri arasındaki polimorfizmi ortaya koymak için çalışmada kullanılan SSR markörleri. Kromozom yeri Marker İsmi Nükleotid sıralaması Annelin g sıcaklığ ı Position 1 SSR92 1 TOM AAGAAGAAGGATCGATCGAAGA-3 5'-TCATGACCACGATACTACATGTTTC-3' 5 -CCTCCAAATCCCAAAACTCT 3 5 -TGTTTCATCCACTATCACGA 3 50 C 0,00 cm 45 C 1 SSR192 5'-ACAACATGGGAAGCACTTGA-3' 5'-ATTAAATTGGGCCATGGTGA-3' 50 C 31,50 cm 1 SSR308 5'-TTTCCCTGTTTCAGCCTTTG-3' 5'-GGCACGAGAATTTAGCCACT-3' 55 C 121,00 cm 1 SSR222 5'-TCTCATCTGGTGCTGCTGTT-3' 5'-TTCTTGGAGGACCCAGAAAC-3' 55 C 97,50 cm 1 TOM202 1 SSR65 1 SSR TGGTCACCTTCAACTTTTATAC-3 5 -AAATGATAATGAAATGGAGTGA-3 5 -GGCAGGAGATTGGTTGCTTA-3 5 -TTCCTCCTGTTTCATGCATTC-3 5'-AATTCACCTTTCTTCCGTCG-3' 5'-GCCCTCGAATCTGGTAGCTT-3' 50 C 50C 159,00 50 C 138,00 cm

30 20 Tablo 3 devam ediyor Kromozom Marker yeri İsmi 2 SSR96 2 SSR22 2 SSR51 2 SSR32 2 SSR356 2 SSR605 2 SSR349 3 SSR231 3 SSR27 3 SSR22 3 SSR86 3 SSRB SSR22 Nükleotid sıralaması 5'-GGGTTATCAATGATGCAATGG-3' 5'-CCTTTATGTCAGCCGGTGTT-3' 5 -GATCGGCAGTAGGTGCTCTC-3 5 -CAAGAAACACCCATATCCGC-3 5'-CTACCCTGGTCTTGGTGGAA-3' 5'-AAAGGATGCTCTAGCTTCTCCA-3' 5'-TGGAAAGAAGCAGTAGCATTG-3' 5'-CAACGAACATCCTCCGTTCT-3' 5''-ACCATCGAGGCTGCATAAAG-3' 5'-AACCATCCACTGCCTCAATC-3' 5'-TGGCCGGCTTCTAGAAATAA-3' 5'V-TGAAATCACCCGTGACCTTT-3' 5'-GAGTGATCATCCATCCTCTCA-3' 5'-GGAAGAGACTTTGGACTAAGGGA-3' 5'-TGCCAATCCACTCAGACAAA-3' 5'-TGGATTCACCAAGGCTTCTT-3' 5'-CCCAAATCAAGGTTTGTGGT-3' 5'-TCAGATGCCACCACTCTCAG-3' 5 -GATCGGCAGTAGGTGCTCTC-3 5 -CAAGAAACACCCATATCCGC-3 5 -AGGGCAACAAATCCCTCTTT-3 5 -GGAGACGAGGCTGCTTACAC-3 5 TGCAACATCTTAGCTCCAAGCTAGG-3 5 CATGGACCAAGAATATGGAAACTGC 3 5 -GATCGGCAGTAGGTGCTCTC-3 5 -CAAGAAACACCCATATCCGC-3 Anneling sıcaklığı Position 50 C 36,50 cm 60 C 99,00 cm 50 C 39,50 cm 50 C 78,00 cm 55 C 44,00 cm 55 C 48,50 cm 55 C 47,50 cm 50 C 75,40 cm 50 C 169,00 cm 60 C 99,00 cm 50 C 54,00 cm 55 C 72,60 cm 60 C 99,00 cm

31 21 Tablo 3 Devam ediyor Kromozom Marker İsmi yeri 4 SSR638 4 TOM184 4 SSR214 4 TOM210 5 SSR49 5 SSRB SSR13 6 SSR350 6 SSR47 6 SSR578 7 SSR45 7 SSR285 7 SSR241 8 SSR38 Nükleotid sıralaması 5 TGTTGGTTGGAGAAACTCCC-3 5 -AGGCATTTAAACCAATAGGTAGC-3 5 -CAACCCCTCTCCTATTCT CTGCTTTGTCGAGTTTGAA-3 5 -AAATTCCCAACACTTGCCAC-3 5 -CCCACCACTATCCAAACCC-3 5 -CGTTGGATTACTGAGAGGTTTA ACAAAAATTCACCCACATCG-3 5 -TCTCAAAGTCGTTCCTTCTTGA-3 5 -GGAAGAGAAACGCGGACATA-3 5 AGACTCAGTCCCGAACAAGTTGAAG-3 5 ACATTACACTAAACCCCCAATTGCC-3' 5 -GGGTCACATACACTCATACTAAGGA-3 5 -CAAATCGCGACATGTGTAAGA GGAATAACCTCTAACTGCGGG-3 5 -CGATGCCTTCATTTGGACTT-3 5 -TCCTCAAGAAATGAAGCTCTGA-3 5 -CCTTGGAGATAACAACCACAA-3 5 -ATTCCCAGCACAACCAGACT-3 5 -GTTGGTGGATGAAATTTGTG-3 5 -TGTATCCTGGTGGACCAATG TCCAAGTATCAGGCACACCA AGTGGCTCTCACCTACTGCG-3 5 -CAATTCTCAGGCATGAAACG-3 5 -TCAACAGCATAGTGGAGGAGG-3 5 -TCCTCGGTAATTGATCCACC-3 5 -GTTTCTATAGCTGAAACTCAACCTG GGGTTCATCAAATCTACCATCA-3 Anneling sıcaklığı 50 C 60 C Position 58,00 cm 45 C 25,30 cm 50 C 95,00 cm 45 C 25,30 cm 50 C 106,00 cm 55 C 119,00cM 50 C 27,00cM 55 C 101,00cM 50 C 6,50 cm 55 C 44,00 cm 50 C 60,00 cm 55 C 2,00 cm 55 C 0,00cM 50 C 55,00 cm

32 22 Kromozom yeri Marker İsmi 8 SSR594 8 SSR335 8 SSR63 8 SSRB SSR73 9 SSR69 9 TOM236 9 SSR70 9 SSR599 9 SS383 9 SSR SSR SSR SSR74 Nükleotid sıralaması 5 -TTCGTTGAAGAAGATGATGGTC-3 5 -CAAAGAGAACAAGCATCCAAGA-3 5 -CCTCTCCATTCTGTGGTGGT-3 5 -AACCGTCCTCGATTTCACAC-3 5 -CCACAAACAATTCCATCTCA-3 5 -GCTTCCGCCATACTGATACG-3 5 -AAAGCCAAAGTGGAAGAACTCAAGG-3 5 -CTCGTAAAACGTTCATCAATCTCGC TGGGAAGATCCTGATGATGG 3 5 -TTCCCTTTCCTCTGGACTCA 3 5 -TTGGCTGGATTATTCCTGTTG-3 5 -GCATTTGATAGAAGGCCAGC-3 5 -GTTTTTTCAACATCAAAGAGCT-3 5 -GGATAGGTTTCGTTAGTGAACT-3 5 -TTTAGGGTGTCTGTGGGTCC-3 5 -GGAGTGCGCAGAGGATAGAG-3 5 -GGATTTCTCATGGAGAATCAGTC 3 5 -TCCCTTGATCTTGATGATGTTG 3 5 -ATTGTACAAAGACCCGTGGC-3 5 -GTTGCACACTGGATCAATGC-3 5 -GTTCCCGCTTGAGAAACAAC 3 5 -CCAATGCTGGGACAGAAGAT-3 primer (5'-3') ACAACAAAGGCAGCTGGTTC 3 primer (5'-3') GCTTCCGACAGCCCATATAA 3 5 -GCAGAGGATATTGCATTCGC 3 5 -CAAACCGAACTCATCAAGGG-3 5 ACTCACCATGGCTGCTTCTT-3 5 TTTCTTGAAGGGTCTTTCCC-3 Anneling sıcaklığı Position 55 C 55,00 cm 55 C 49,70 cm 40 C 61,00 cm 53 C 87,00cM 45 C 32,00 cm 50 C 24,90 cm 45 C 50 C 50 C 42,00 cm 55 C 109,00 cm 50 C 57,30 cm 50 C? 50 C 46,00 cm 50 C 31,00 cm 55 C 74,00 cm

33 23 Tablo 3 Devam ediyor. Kromozom Marker yeri İsmi 10 SSR SSR34 10 SSR SSR SSR SSR SSR SSR67 11 TOM SSR SSR44? SSR21? SSR33? SSR424 Nükleotid sıralaması 5 -GCAGAGGATATTGCATTCGC 3 5 CAAACCGAACTCATCAAGGG-3 5 -TTCGGATAAAGCAATCCACC 3 5 -TCGATTGTGTACCAACGTCC 3 5 TTCGGATAAAGCAATCCACC-3 5 -TCGATTGTGTACCAACGTCC 3 5 -GCATTCGCTGTAGCTCGTTT-3 5 -GAGCTTCATCATAGTAACG-3 5 -TGGCTGCCTCTTCTCTGTTT-3 5 -TTTCTTGAAGGGTCTTTCCC-3 5 -TGTAAGAGTGTCTGCCTGCAC 3 5 -ATGGGTTCGGGTTAGCTCTT 3 5 -GAAACCGCCTCTTTCACTTG 3 5 -CAGCAATGATTCCAGCGATA 3 5 -GCACGAGACCAAGCAGATTA 3 5 -GGGCCTTTCCTCCAGTAGAC 3 5 -CTGTTTACTTCAAGAAGGCTG 3 5 -ACTTTAACTTTATTATTGCGACG-3 5 -AAgCCAAgCTCgAACCTgTA-3 5 -ATCCATgCTgTCgCTTTCAT-3 5 -TCATCTGCAATTCATGGCTC 3 5 -AGGTCAAGGATGTGCTTCCC 3 5 -GGGTCTCAAAGAAATGGCAC-3 5 -ACGGATCTCAGCCTCAGAAA-3 5 -GTCTTTACACAATCTCTCACTTGG-3 5 -CTGGTCACTGAACTGCCAGA-3 5 -AAGGACTTGTGCTGGATTGG-3 5 -TAGTACGCCATGGACCTTCC-3 Anneling sıcaklığı Position 55 C 34,50 cm 50 C 45 C 55 C 25,30 cm 25,70 cm 50 C 35,00 cm 50 C 80,40 cm 52 C 86,00 cm 50 C 11,00cM 50 C 24,00cM 45 C 60 C 72,50 cm 45 C 60,00 cm 50 C 55 C 55 C

34 24 Tablo 3 Devam ediyor. Kromozom Marker yeri İsmi? SSR41? SSR100? SSR118? SSR130? SSR133? SSR142? SSR254 Nükleotid sıralaması 5 -TCTCTGAAACGAGACAGAGGAA-3 5 -AGTACGTCTCCCATGGCTGT-3 5 -GCAAGCCTGTGACAATTGAG-3 5 -GTCGTCGTGTTCCGTCATAA-3 5 -AGTGGTTCCACTTGTTTAGACC-3 5 -GAATCCGATCTGGGTCAGTG-3 5 -AAACCCTCAACACCATCACC-3 5 -CATCATTTCTTTCATGGCTCC-3 5 -CCGTTCTTGGTGGATTAGGA-3 5 -AAAGAGTGAAATGTGCACAGAC-3 5 -CGAACAGATGCATAGATGAAGA-3 5 -ACGGTGTGGACTCATGTGAA-3 5 -CCATTGGATAGCGTCTCCC-3 5 -ATTGTGCATGTTGATACCCA-3 Anneling sıcaklığı 55 C 50 C 55 C 50 C 50 C 50 C 57 C Position SSR markörleri PCR amplifikasyonu sonucunda ebeveynler arasındaki polimorfizmi kolayca ortaya koyması, enzimlerle ayrıca kesmeye ihtiyaç duyulmaması nedeniyle hızlı güvenilir sonuçlar vermektedir. SSR markörlerin maliyeti ekstra kesme işlemine ihtiyaç duyulmadığı için daha düşüktür. Çalışmamızda yukarıda saydığımız kolaylıklarından dolayı SSR markörler öncelikle tercih edilmiştir.