Deneysel olarak oluþturulan akciðer fibrozisinde E vitamini ve kafeik asit fenetil esterin akciðer dokusundaki bazý metabolik enzimlere etkisi

Transkript

1 Týp Araþtýrmalarý Dergisi 2006: 4 (3): ARAÞTIRMA Deneysel olarak oluþturulan akciðer fibrozisinde E vitamini ve kafeik asit fenetil esterin akciðer dokusundaki bazý metabolik enzimlere etkisi Birsen Özyurt 1, Hüseyin Özyurt 2, Ömer Atýþ 2, Ali Akbaþ 2, H. Ramazan Yýlmaz 3, Sadýk Söðüt 4 1 Gaziosmanpaþa Üniversitesi, Týp Fakültesi Anatomi AD Tokat, 2 Gaziosmanpaþa Üniversitesi, Týp Fakültesi Biyokimya AD Tokat, 3 Süleyman Demirel Üniversitesi, Týp Fakültesi, Týbbi Biyoloji ve Genetik AD., Isparta, 4 Mustafa Kemal Üniversitesi, Týp Fakültesi, Biyokimya AD., Hatay Özet Amaç: Antikanserojen etkili bleomisine (BLM) baðlý pulmoner fibrosis (PF), kanser tedavisinde en sýk rastlanan yan etkilerden biridir. Son yýllarda, organizmada normal metabolik þartlarda da üretilebilen serbest oksijen radikalleri (SOR) PF'den sorumlu ajan olarak ileri sürülmektedir. Bu çalýþmanýn amacý, BLM'e baðlý akciðer fibrozisi üzerine, Hekzokinaz (HK), Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD), laktat dehidrogenaz (LDH) ve malat dehidrogenaz (MDH) enzimlerini ölçerek CAPE'nin etkisini araþtýrmaktýr. Gereç ve Yöntem: 36 adet Spraque-Dawley tipi erkek sýçan rastgele olarak, kontrol, Blm, Blm+E-vit ve Blm+CAPE þeklinde dört gruba ayrýldý. BLM (7.5 mg/kg, tek doz) intratrakeal olarak, E-vit ve CAPE intraperitoneal olarak çalýþma gruplarýna verildi. Çalýþmanýn sonunda, akciðer dokularý çýkarýldý ve HK, G6PD, LDH ve MDH enzim aktiviteleri akciðer dokusunda çalýþýldý.. Bulgular: BLM grubu kontrol grubu ile karþýlaþtýrýldýðýnda HK, LDH ve MDH enzim Yazýþma Adresi: Dr.Birsen Özyurt Gaziosmanpaþa Üniversitesi Týp Fakültesi Anatomi AD. Tokat Tlf: /1232 Faks mdbirsen@hotmail.com aktivitelerinde artýþ gözlendi. Tedavi gruplarýnýn (BLM+vit E ve BLM+CAPE) her ikisinde de, bu enzim aktiviteleri kontrol grubunun deðerlerine yaklaþmýþtý. G6PD düzeyi ise kontrol grubuna göre BLM grubunda düþme göstermiþ, CAPE ise kontrol grubu seviyesine yükseltmiþtir. Sonuç: BLM ana metabolik yollarýn enzim aktivitelerini olumsuz yönde etkilemektedir (özellikle akciðer dokusunda). PF da, E vit ve CAPE'nin çalýþýlan enzim aktiviteleri üzerine daha çok koruyucu yönde etki gösterdiði söylenebilir. Bununda muhtemel sebebinin, Blm'nin akciðer dokusu hasarý oluþtururken serbest oksijen radikallerini oluþturmasý, buna karþýlýk uyguladýðýmýz antioksidan karakterli E vit ve CAPE maddelerinin serbest radikal süpürücü etkileri ile kýsmen hücre ve doku bütünlüðünü koruyarak stabilizasyon saðlamasý olduðu söylenebilir. Anahtar Kelimeler: Bleomisin, akciðer fibrosizi, metabolik enzimler, sýçanlar The effects of vitamin E and CAPE on some metabolic enzymes in experimental lung fibrosis in lung tissues of rats Objective: Pulmonary fibrosis (PF) induced by anticancerogenic belomycin (BLM) is one of the more common side effect encountered during cancer treatment. It has been suggested in the last years

2 Deneysel olarak oluþturulan akciðer fibrozisinde E vitamini ve kafeik asit fenetil esterin bazý metabolik enzimlere etkisi 15 that main responsible agent in PF is reactive oxygen species (ROS) which were generated also in normal metabolic condition in the organisms. The aim of this experimental study was to investigate the effects of CAPE, an antioxidant agent, on BLM-induced PF through hexokinase (HK), glucos-6-phosphate dehidrogenase (G6PD), lactat dehidrogenase (LDH) and malat dehidrogenase (MDH) enzymes in lung tissue of rats. Methods: Thirty-six Spraque-Dawley male rats were divided randomly into four groups as control, BLM, BLM+Vitamin E (vit E) and BLM+CAPE groups. BLM (7.5 mg/kg, single dose) was applied intratracheally, and CAPE and vit E intraperitoneally in the appropriate groups. At the end of the fibrosis processes, lung tissue were removed and the activities of HK, G6PD, LDH and MDH were measured in lung tissues. Results: There was increased in enzyme activities (HK, LDH and MDH) in BLM groups compared to controls. These enzyme activities decreased nearly to levels of controls in both of the treatment groups (BLM+vit E and BLM+CAPE). This enzyme activity was increased in CAPE groups. CAPE also was increased to levels of the control groups. Conclusion: BLM alters the enzyme activities of main metabolic patway (especially on lung tissue). It may be suggested that there were preventive effect of vit E and CAPE on activities of HK, G6PD, LDH and MDH in PF. These results indicate that CAPE may be a promising drug for protection against BLM-induced PF. Key words: Bleomycin, lung fibrosis, metabolic enzymez, rats Akciðer fibrozisi birçok enfeksiyon hastalýklarý, tümör, otoimmün hastalýklar ve ilaç kullanýmýna baðlý iyatrojenik olarak geliþebilen, akciðerin interstisyel dokusunun diffüz tutulumu ile seyreden ve klinik açýdan oldukça önemli bir akciðer patolojisidir. Bleomisin (BLM), lenfoma, germ hücreli tümörler, baþ-boyun kanserleri gibi birçok malignenside kemoterapötik olarak yaygýn bir þekilde kullanýlan sitotoksik bir antibiyotiktir (1). Anti-neoplastik etkisinin mekanizmasý tam olarak bilinmemesine raðmen DNA sentezini azaltarak ve daha zayýf olarak RNA, protein sentezini inhibe ederek gösterdiði iddia edilmektedir. Uygulandýktan sonra oluþan bleomisin-demir kompleksinin moleküler oksijeni, süperoksit ve hidroksil radikallerine dönüþtürerek DNA üzerine etki ettiði ve iplikçik kýrýlmalarýna sebep olduðu, etki mekanizmasý için ileri sürülen görüþlerdir (2). Tedavi amacýyla BLM kullanýldýðýnda BLM'nin en çok deri ve akciðerde konsantre olduðu görülmüþtür. Yan etkisinin en sýk olarak görüldüðü yerler de bu organlardýr. Akciðer fibrozisi geliþtirme oraný oldukça yüksek olduðundan akciðer fibrozisi modellerinde sýklýkla kullanýlmaktadýr. Özellikle akciðerde fibrozis oluþturmasýnýn nedeni hidrolaz enziminin akciðer dokusunda diðer dokulara oranla çok düþük düzeyde bulunmasýdýr (3). Kafeik Asit Fenetil Esteri (CAPE), propolis maddesinin aktif bir bileþeni olup antimikrobik, antienflamatuar, immunomodülator, antioksidan, antimitojenik olduðu gösterilmiþtir. Yapýca flavonoidlere benzer ve iki halkasal yapý içerir (4). Bu halkasal yapýlardan bir tanesinde iki adet hidroksil grubu taþýmaktadýr. Bu OH grubu sayesinde redoks reaksiyonlarýnda aktif rol oynayarak, E vitamini ve C vitamininde olduðu gibi antioksidan özellik göstermektedir. E-vitamini'nin de antioksidan özelliði uzun yýllardýr bilinmektedir. Bu çalýþmada, BLM ile fibrosiz oluþturulan sýçan akciðer dokularýnda karbonhidrat metabolizmasýnýn önemli enzimleri olan Hekzokinaz (HK), Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz (G6PD), laktat dehidrogenaz (LDH) ve malat dehidrogenaz (MDH) enzim aktiviteleri üzerine CAPE ve E-vitamininin etkileri araþtýrýldý. Gereç ve Yöntem Çalýþmada 36 adet Sprague Dawley tipi erkek sýçan ( g) kullanýldý. Sýçanlar düzenli olarak ad libitum tipi pellet yem ve musluk suyu ile beslendiler, 12/12 saat gece/gündüz güneþ ýþýðýna maruz býrakýldýlar. Çalýþmada kullanýlan sýçanlar; I-Kontrol (n=8), II-Blm (n=9), III-Blm+E-vit (n=9) ve IV- Blm+CAPE (n=10) þeklinde dört gruba ayrýldý. Sýçanlara, çalýþmanýn baþlanðýcýndan iki gün önce E-vit [10mg/kg 1x1 intraperitoneal (ip)], CAPE (10µmol/kg 1x1 ip) ve kontrol grubuna %10 etil alkol (CAPE için çözücü olarak etil alkolde kullanýldýðý için) (250µl 1x1 ip) baþlandý. Çalýþmanýn baþladýðý gün ise, intratrakeal (it) olarak 250µl fosfat tamponu (BPS) uygulandý. BLM ise 7.5 U/kg (250µl BPS içinde) tek doz þeklinde deneyin baþladýðý gün it olarak verildi. Bütün ilaç uygulamalarý her sabah saat 08:00-09:00 arasýnda yapýldý. Deneylerin son gününe kadar sýçanlarýn tedavisi yapýlýrken kesi bölgesini enfeksiyon riskine karþý korumak amacýyla günlük yara bakýmý (Batticon solüsyonu ile) yapýldý. Deney boyunca sýçanlarda enfeksiyon gözlenmedi. Çalýþmada, BLM uygulanmasýný takiben deney süresinin sonunda beklenen þekilde fibrozis tablosunun oluþtuðu gözlendi. Sadece BLM'nin uygulandýðý sýçan grubunda, göðüs duvarý açýldýðýnda çýplak gözle görülebilecek þekilde akciðerlerde diffüz tipte fibrotik deðiþiklikler izlendi. Blm uygulanmasýndan sonraki 14. gün sýçanlarýn akciðer dokularý i.p. ketamin anestezisi altýnda göðüs kafesi orta hat boyunca kesilerek doku bütünlüðünün korunmasýna dikkat edilerek çýkarýldý. Çýkarýlan dokular sývý azot tanký içinde donduruldu ve -85 o C'ye ayarlý

3 16 Özyurt ve ark derin dondurucuda (Nuaire -85 o C Ultralow Freezer, Japan) biyokimyasal testlerin yapýlacaðý güne kadar muhafaza edildi. Biyokimyasal analiz için derin dondurucudan alýnan dokular, soðuk % 0.9'luk NaCl ile yýkandý, aðýrlýklarý tartýldý. Soðukluðu muhafaza edilip bistürü yardýmýyla küçük parçalara ayrýlarak 2 ml soðuk Tris-HCl [0.2 mm ve Tris solüsyonu HCl solüsyonu 50/39.9 (v/v)] içinde devir/dakika'ya ayarlý homojenizatörle (Ultra-Turrax T 25 Basic, IKA Labortechnic Germany) 2 dakika rpm de homojenize edildi. Homojenatlar daha sonra 4 oc'de 5000xg'de 1 saat santrifüj edildi. Santrifüj edilen tüplerin üst kýsýmlarý alýnarak süpernatantlar elde edildi. Ölçümlerin hepsi bu süpernatanda yapýldý. Enzim aktivitelerinin saptanmasý; HK, G6PD, MDH ve LDH enzimlerinin aktivitesi NADH'ýn oksidasyonu (MDH ve LDH için) ya da NADP'ýn redüksiyonu (HK ve G6PD için) yöntemiyle 25 o C'de 340nm'ye ayarlý spektrofotometre (Shimadzu marka UV/visible-160 A Spektrofotometre (Japonya)) ile ölçüldü (5). Protein ölçümü, doku protein seviyeleri standart olarak sýðýr serum albumini kullanýlarak oluþturulan standart eðrisinden Lowry prosedürü ile saptandý (6). Ýstatistiksel analizler: Ýstatistikler Windows uyumlu statistical package for social sciences SPSS programý ile non-parametrik testlerden Mann Whitney- U testi kullanýlarak yapýldý. Ýstatistiksel anlamlýlýk için p<0.05 kabul edildi, deðerler ortalama ± standart sapma (Sd) olarak verildi. Bulgular Çalýþmada 14 gün süren izleme döneminde BLM uygulanan sýçanlarýn klinik tablolarý da akciðerde ciddi patolojik deðiþiklikler olduðunu göstermekte idi. Özellikle BLM grubundaki sýçanlar 7. günden itibaren 14. güne doðru her gün artacak þekilde zayýflamaya ve hýrýltýlý solumaya baþladýlar. BLM grubunda bulunan sýçanlarýn hepsinde kilo kaybý çok fazla idi. Zamanla solunum sýrasýnda sýçanlarýn burun kanatlarý solunuma katýlmaya baþladý ve interkostal çekilmeleri mevcuttu. Ýþtahlarý gün geçtikçe azaldý. Deneyin baþladýðý günlere göre daha az yem yemeye ve daha az su içmeye baþladýlar. Son günlere doðru özellikle BLM grubunda daha fazla olmak üzere bazýlarýnýn burunlarýnda muhtemelen hemoptiziye baðlý kanamalar görüldü. Bu bulgular E-vit grubunda daha hafif seyirli idi. CAPE grubunda ise kontrol grubu ile hemen hemen ayný tablo mevcuttu, yani yukarýdaki bulgularýn hiç biri görülmedi. Sonuçlar toplu olarak Tablo-1 de gösterilmiþtir. HK aktivitesi BLM grubunda, kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlý þekilde artmýþ olarak bulundu (p=0.035). E vitamini daha fazla etki göstermek üzere, BLM+E vit'i (grup III) ve BLM+CAPE (grup IV) gruplarýnda HK seviyesi hemen hemen kontrol grubu seviyesine çekilmiþtir. LDH ve MDH enzim aktiviteleri çalýþma gruplarýnda kontrol grubuna göre artmýþ olup Blm+Evit grubundaki artýþ istatistiksel olarak anlamlý

4 Deneysel olarak oluþturulan akciðer fibrozisinde E vitamini ve kafeik asit fenetil esterin bazý metabolik enzimlere etkisi 17 idi (sýrasýyla p<0.026; p<0.031). G6Pd enzim aktivitesi BLM grubunda ve BLM+E vit grubunda kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlý olmasa da kýsmen bir azalma göstermiþtir. BLM+CAPE grubunda ise, G6PD enzim aktivitesi düzelme göstermiþ ve hemen hemen kontrol grubunun seviyesine yaklaþtýrmýþtýr. Tartýþma Serbest oksijen radikallerinin BLM kaynaklý olarak sentez edilip DNA kýrýlmalarýna sebep olduðu iddialarý bir antioksidan olan SOD'un ilave edildiði ortamlarda DNA kýrýlmalarýnýn ve DNA hasarýnýn in vitro koþullarda azaldýðýnýn bulunmasý ile desteklenmiþtir (7). Pulmoner fibrozis gibi anormal koþullarda antioksidan savunma sisteminin durumu büyük önem taþýmaktadýr. Özellikle oksidan stresi artýran faktörler ve antioksidan sistemin kesintiye uðramasý doku hasarýný hýzlandýrmaktadýr. Bu bakýmdan her iki sisteme yönelik tedavi stratejileri geliþtirilmeye çalýþýlmaktadýr (8,9). BLM ile pulmoner fibrozisin oluþturulduðu bazý çalýþmalarda antioksidan enzim aktivitelerine bakýlmýþ ve BLM'nin antioksidan enzimleri (süperoksit dismutaz, katalaz ve glutatyon peroksidaz) düþürdüðü bulunmuþtur. Ayný çalýþmalarda antioksidan ajan olarak erdostein ve CAPE uygulanmýþ ve her iki ajanýn da antioksidan enzim aktivitelerini kontrol grubu seviyelerine yükselttikleri bulunmuþtur (10,11). Bizim çalýþmamýzda, yalnýz BLM verilen grupta HK enzim aktivitesindeki artýþýn anlamý; BLM ile oluþan SOR'nin ATP azalmasýna ve glikoliz aktivasyonuna yol açmasý, oksidatif fosforilasyon'daki inhibisyonun da ATP seviyesini düþürüp SOR üretimine katkýda bulunarak bir kýsýr döngü oluþturmasý þeklinde düþünülebilir. G6PD enzim aktivitesi kontrol grubuna göre yalnýz BLM ve BLM+E vit.'i verilen gruplarda düþerken CAPE verilen grupta anlamlý olarak artmýþtýr. Ýndirgeyici ekivalanlarýn üretildiði önemli bir yol olan pentoz fosfat yolunun birinci enzimi olan G6PD aktivitesinde CAPE verildikten sonra görülen artýþ, antioksidan sistemin kuvvetlenmesi olarak deðerlendirilebilir. Azalmýþ olan G6PD aktivitesi, NADPH oluþumunu bozar (12). Yalnýz BLM verilen grupta G6DH aktivitesindeki düþüþün, NADPH oranýný azaltarak serbest radikal hasarýný artýrmýþ olabileceði þeklinde deðerlendirilebilir. LDH ve MDH enzim aktivitesinde ise kontrol grubuna göre CAPE'li grupta nispeten bir artýþ, diðer iki grupta ise belirgin bir artýþ vardý. Bu durum, SOR'in glikoliz'i indükleyerek glukoz ve glikojen'in hýzla pirüvata çevrilip fazla miktarda laktat oluþturmasýna baðlý olabilir. Yalnýz BLM verilen grupta LDH artýþý bu þekilde açýklanabilir (13). Bleomisin verilen grupta MDH enziminde görülen artýþ ayný gurupta G6PD enzimindeki azalma ile izah edilebilir. Çünkü NADP-baðýmlý MDH enziminin rol aldýðý yol, alternatif NADPH üretim kaynaðý yapabilen bir yoldur (14), dolayýsý ile kompansatuar olarak bir artýþ sözkonusu olmuþ olabilir ancak bu artýþ istatistiksel olarak anlamlý bulunamamýþtýr. Sonuç olarak BLM'nin, diðer doku ve organlarla karþýlaþtýrýldýðýnda çok fazla akümülasyon gösterdiði akciðer dokusunda, glukozun girdiði ana metabolik yollarýn enzimlerini olumsuz yönde etkilediði görüldü. E vit'i ve CAPE, çalýþýlan enzimler üzerine kýsmen koruyucu yönde etki gösterdi. BLM'nin akciðer hasarý oluþturmasýnda rol alan SOR'ni bu antioksidan karakterli maddeler muhtemelen ortamdan uzaklaþtýrarak hücre stabilizasyonunu saðladýklarý söylenebilir. Bu amaçla anti-tümöral tedavi planlanmasýnda, BLM gibi serbest radikalleri arttýrarak etki gösteren kemoterapotiklere ilave olarak antioksidan ajanlarýn tedaviye eklenmesi, bu antikanserojen ajanlarýn yan etkilerinden korunmak için önerilebilir. Kaynaklar 1. Ommaty R. Vademacum modern ilaç rehberi. 25. baský, (Ankara) 2004; Sausville EA, Stein RW, Peisach J, Horwitz SB. Properties and products of the degration of DNA by bleomycin and iron (II). Biochemistry 1978; 17: Zitnik RJ. Drug-induced lung disease: Cancer chemotherapy agents. J Respir Dis 1995,16: Koltuksuz U, Irmak MK, Karaman A et al. Testicular nitric oxide levels after unilateral testicular torsion/detorsion in rats pretreated with caffeic acid phenetylester. Urol Res. 2000; 28: Bohringer and Mannheim Biochemical information handbook (1973) Hexokinase ( ), glucose 6- phophate dehydrogenase ( ), lactate dehydrogenase ( ), Malate dehydrogenase ( ). 6. Lowry O, Rosembrugh NJ, Randhall RL. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem 1951; 193: Cunningham ML, Ringrose PS, Lokesh BR. Inhibition of the genotoxicity of bleomycin by superoxide dismutase. Mutat Res 1984; 135: Robert MS. Mechansms of pulmonary fibrosis. Chest 2001; 120: Nagai A, Aoshiba K, ýshihara YT, et al. Administration of alfa 1-protinase inhibitor ameliorates bleomycin-induced pulmonary fibrosis in hamsters. Am Rev Respir Dis 1992; 145: Sogut S, Ozyurt H, Armutcu F, Kart L, et al. Erdosteine prevents bleomycin-induced pulmonary fibrosis in rats. Eur J Pharmacol 2004; 494(2-3): Ozyurt H, Sogut S, Yildirim Z, et al. Inhibitory effect of caffeic acid phenethyl ester on bleomycineinduced lung fibrosis in rats. Clin Chim Acta. 2004; 339(1-2): Ho HY, Cheng ML, LU FJ,et al. Enhanced oxidative stress and accelerated celluler senescence in glu-

5 18 Özyurt ve ark cose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) deficient human fibroblasts. Free Radical Biology Medicine 2000; 29: Schwartz MK, Bodansky O. Lactic dehydrogenase(clinical aspect). Methods in enzimology(ed Wood WA). Academic pressinc. Orlando, Florida, 1966,9: Chambe PC, Harvey RA. Lippincott's Illustrated rewiews: Biochemstry. 2nd ed. Philadelphia: J.B. Lippincott Company, 1994;