Doç.Dr. Yıldız AKA KAÇAR

Transkript

1 Doç.Dr. Yıldız AKA KAÇAR

2 Selülozik yapıdaki hücre çeperleri, mekanik ya da enzimatik yollarla çıkarılmış olan hücrelere protoplast denilmektedir. Protoplast kültürü ise, izole edilen Protoplast kültürü ise, izole edilen protoplastların, hücre modifikasyonu ve somatik hibridizasyon yöntemleriyle, bitki tür ve çesitlerinin geliştirilmesi amacına yönelik olarak, uygun besin ortamlarında kültüre alınmasıdır.

3 Protoplastların canlılığı üzerine etki eden faktörler; Enzimin saflığı Kültür ortamının ozmotik basıncı

4 Bir bitkinin hücre, doku, organ, meristem veya embriyo gibi çeşitli parçalarından yeni bitki veya bitkiler elde edilmesine bitki rejenerasyonu denir. In vitro şartlarda tek hücreden yeni bitki elde edilmesine totipotansi, böyle bir hücreye de totipotent hücre denir.

5 Bitkilerde hücre duvarı hücre için mekanik bir sınır ve destek olarak görev yapmakta, ozmotik değişiklikler sonucu hücrenin patlamasını ve mikroorganizmaların hücreyi enfekte etmesini engellemektedir.

6 Hücre duvarı hücrenin büyüklüğünü, şeklini ve dengesini belirler.

7 Selüloz Hemiselüloz Pektik maddeler

8 Eksplant kaynakları Donör bitki materyalinin ön muamelesi ve yetiştirme şartları Protoplast izolasyonunda kullanılan yıkama solüsyonları, enzimler ve enzim karışımları Ozmotik şartlar ve plazmolizasyon Enzim inkübasyonu Protoplastların yıkanması ve saflaştırılması İzolasyon sonrası uygulanan testler

9 Protoplast kültürü yapılışı

10 Yaprak mezofil hücreleri (klorofil içerdiklerinden somatik melezlemede yapılan renksel ayrımda avantajlıdır) Embriyonik hücreler (daha hızlı gelişme ve bölünme gösterirler) Genç bitki dokuları Henüz olgunlaşmamış bitki doku ve organları (embriyo, kotiledon, meyve kabuğu) Meristematik hücreleri içeren dokular (gövde apikal meristemi, yan ve kök ucu meristemleri) Özel protoplast kaynakları (polen tanesi, skutellum, stoma hücreleri vb.)

11 Eksplantın alındığı bitkinin gelişme devresi ve şartları Kültür ortamı komponentleri Sıcaklık Işık

12 Yıkama solüsyonları; CaCl 2, manitol, CPW Enzimler; Selülaz, hemiselülaz, pektinaz

13 Ozmotik basıncı ayarlamak için; Manitol Sorbitol Glikoz Sakkaroz KCl CaCl 2 kullanılır.

14 İnkübasyon süresi kısa tutulmalıdır. Sıcaklık arttıkça inkübasyon süresi kısalır.

15 En çok kullanılan saflaştırma metodları; Filtrasyon Santrifüj Karışık metod Daha yoğun bir çözelti içinde yüzdürme

16 Filtrasyon metodunda, ortalama protoplast çapına göre değişen ve azalan porozitede bir seri filtreden protoplastlar geçirilir ve az sayıda santrifüj işlemi uygulanır.

17 En çok kullanılan teknik filtrasyon ve santrifüj işleminin birlikte uygulanmasıdır. İlk önce protoplast karışımı bir filtreden geçirilir, daha sonra 5-10 dk santrifüj edilir.

18 Bazı durumlarda protoplastlar sakkaroz çözeltisinde düşük devirde santrifüj edilir. Sakkaroz çözeltisi protoplastlardan daha fazla yoğun olduğu için protoplastlar çözelti üzerinde toplanırlar ve pipetle çekilerek uzaklaştırılırlar. Buna yüzdürme metodu denir.

19 Hücre duvarı kalıntısının tespiti Canlılık testleri Protoplast büyüklüğü ve verim tespiti

20 Somoklonal varyasyon yaratılarak, bunlar arasından amaca uygun fertlerin seçilmesi, Melezlenmeleri mümkün olmayan türlerin protoplast füzyonu ile melezlenebilmeleri, Protoplastlar bünyelerine makro moleküller, organeller ve hatta hücre çekirdekleri de alabildiğinden, istenilen bilgilerin yeni bitkilere aktarılması.

21 Protoplast Kültürü

22 Sıvı damla kültürleri tekniği Sıvı kültür tekniği Agar içinde kültür tekniği Agar üzerinde sıvı kültür tekniği Agaroz ortamı kültürü tekniği Agaroz blokları kültürü tekniği Agaroz damla kültürü Asılı veya oturan damla kültürü Protoplastların tutuklanması Nörs kültürleri ve besleyici hücreler

23 Strese tepki: enzim etkisi sonucu bitki hücresinin kendi savunma mekanizmasını geliştirmesi Tamir mekanizması: hücre zarında ve zar proteinlerinde oluşan zararın giderilmesi, yeni zarın oluşturulması Adaptasyon: organellerin ve sitoplazmanın morfolojik ve fonksiyonel olarak adaptasyonu

24 Hücre bölünmesi: hücre hayat döngüsünün yeniden başlaması, hücre bölünmesi ve kallus oluşumu Morfogenesis: organize hücre gelişmesi, bölünmenin uyarılması ve değişimin başlayarak organize doku ve daha sonra bitkilerin oluşturulması

25 Protoplast füzyonu ve somatik melezleme, pre-zigotik eseysel uyusmazlıklar nedeniyle, klasik melezleme ile elde edilemeye hibritlerin elde edilmesinde kimyasal ve fiziksel yöntemlen kullanılarak uygulanan bir tekniktir. Somatik hibridizasyon

26

27 Somatik melezleme, iki protoplastın çekirdek, sitoplazma veya her ikisinin de birbirleriyle belirli ortam ve şartlarda birleştirilmesidir. Füzyon sonucu oluşan yapılara füzyon ürünleri veya heterokaryonlar denir. M. sativa x M. coerulea somatik hibridine ait çiçekler

28 Füzyonu olacak her iki cins veya türden tekrarlanabilir bir şekilde protoplastlar elde edilir Protoplastlar çeşitli metodlarla birleştirilir (füzyon) Füzyon ürünlerinin seçimi yapılır Heterokaryonların kültürü sonucu önce kallus sonra sürgün rejenerasyonu yoluyla bitkiler elde edilir Somatik melezler seleksiyona tabi tutulur Somatik melez bitkiler ebeveynlerle karşılaştırmalı olarak analiz edilir Verim ve tarla denemeleri yapılır Tohum üretimi ve tescil işlemi yapılır.

29 Protoplast füzyonunda; Polietilen glikol (PEG) ile füzyon ve Elektrofüzyon metodları kullanılmaktadır.

30 RAPD profilleri Kromozom sayımı Southern analizi Flow Sitometri RFLP İn situ genomik melezleme gibi biyokimyasal ve sitolojik metodlar kullanılarak yapılır.

31 Fraksiyon I protein analizi Kromozom sayısı ve karyotipi İzozimler Mitokondriyel DNA miktarının tespiti Kloroplast DNA miktarının tespiti Nüklear DNA miktarının tespiti Genel morfoloji (somaklonal varyasyon)

32 Her bitki türü için tekrarlanabilir bir şekilde protoplasttan bitki elde etme metodu geliştirilmiş değildir. Heterokaryonların etkin bir şekilde ayırımı yapılamamaktadır. Somatik melez bitkiler genellikle steril olmakta, döl vermemekte veya fertil olması durumunda çok geniş bir somaklonal varyasyon göstermektedir.

33