INFLUENZA A IFA SLIDE

Transkript

1 1 SAKLAMA GEREKLİLİKLERİ: SINFA: insan serumunda indirek immunofloresan testi (IFA) ile influenza A antikorlarının tanısı için slaytlar. GİRİŞ: Yetişkinlerdeki karakteristik enfluenza semptomları: yüksek ateş, başağrısı, fotofobi, boğaz duyarlılığı, öksürük, malaise ve myalgia. Ateş üç gün devam eder, öksürük uzun süre kalır. Bazen çocuklarda crup hastalığına neden olur. Yaşlı hastalar sıklıkla görülen tracheobronchitis ve bronchiolitis gibi kronik bronchopathy yaşarlar. Viral enfeksiyona sekonder bakteriyal pneumonia sendromları çok sıktır, özellikle yaşlı hastalarda önceden varolan patoloji ile görülür. Difüz hemarojik viral pneumonia kardiyovasküler hastalığı olan hastalarda gelişebilir. Myositis ve myoglobinuria influenza ile ilişkili tanımlanmıştır. Infantlar konvulsiyon ve ensefalit ile birlikte çeşitli solunumsal enfeksiyonlar gösterebilir. Genel olmayan komplikasyonlar: otitis media, myocarditis, toksik şok sensromu ve aspirin yenmesi ile ilişkili Reye sendromu. Influenza virusu ile enfeksiyon böbrek ve kemik iliği transplanteli hastalar ile ilişkilidir. Epidemik mevsim dışında izole edilmiş olgular klinik tanı için farklıdır. Epidemik sırasında klinik tanıya erişmek zordur, diğer solunum hastalıkları ile karıştırılabilir. Bu nedenle, laboratuar tanısı yüksek risk gruplarında oldukça yararlıdır. Komplement fiksasyonu, ELISA ve IFA hastalık tanısı için en yararlı tekniklerdir. TEST PRENSİBİ: INFLUENZA A IFA SLIDE IFA metodu slayt yüzeye absorbe edilmiş antijenlerin antikorla reaksiyonuna dayanır.bağlanmayan immunglobulinler yıkama adımı ile uzaklaştırılır. Daha sonraki adımda antijen antikor kompleksi floransan etiketli anti-insan globulin ile reaksiyona girer. Immunforasan mikroskopu kullanılarak test edilir. Visible light UV light FITC Anti-human globulin 2-8ºC de saklayınız. Miadı geçmiş kitleri kullanmayınız. Bu kit 2-8ºC de ağzı kapalı olarak saklanırsa geçerli kalır. AÇILAN REAKTİFLERİN SAKLANMASI: Paketi bir kez açarak kullanınız. STABİLİTE VE REAKTİFLERİN KULLANIMI: Reaktifleri aseptik durumlarda, mikrobiyolojik kontaminasyondan uzak bir şekilde saklayınız. VIRCELL, S.L.yanlış kullanımdan olan hataların sorumluluğunu kabul etmez. TAVSİYELER VE ÖNLEMLER: 1. Sadece in vitro diyagnostik kullanım içindir.sadece profesyonel kullanım içindir. 2. Sadece VIRCELL IFA kitleri ile ilgili olanları kullanın. 3. Her test basamağında pipet uçlarını temizleyiniz.sadece temiz, tercihen tek kullanımlık materyal kullanınız. 1. Hasar görmüş paketleri kullanmayınız. 4. Asla ağız ile pipetlemeyiniz. 5. Kuyucuklar inaktive İnfluenza A antijen ile kaplıdır. Yine de kullanılan tüm malzemeler potansiyel risk faktörü gibi davranılmalıdır. Atıklar konusunda da bölgesel kanunlara göre davranılmalıdır. 6. Sadece kit ekindeki protokolü uygulayın. Inkubasyon zamanı ve sıcaklıklar farklı olursa yanlış sonuçlar verebilir. 7. Slayt üzerinde hasta örneklerinin çapraz kontaminasyonu hatalı sonuçlara neden olur. Önlemleri dikkate alın. 8. Mikroscope optikleri, ışık kaynağı kondisyonu ve tipi floresan kalitesini etkiler. 9. Gereğinden daha uzun süre oda ısısını değiştirmeyiniz. 10. Herbir slayt sadece bir kez kullanılmalıdır. Kırmayınız ve kuyucukları tekrar tekrar kullanmayınız. 11. Kit içeriğinde bulunan cam elementler kırıldığında fiziksel hasara neden olabilir. Dikkatli kullanın. 12. örneğer sorbent eklenmesinden sonra görünür bir presipitat var mı kontrol edin. NUMUNE TOPLAMA VE SAKLAMA: KİT ÖZELLİKLERİ: Slaytlar VIRCELL IFA kit ile ilişkili kolay kullanım için numaralara sahiptir. KİT İÇERİKLERİ: 1 VIRCELL INFLUENZA A SLAYT: 10 kuyucuk içn 10 slayt, B virus ile enfekte LLC-MK2 hücreler, A/Victoria/3/75 strain (ATCC VR-822), formaldehid muamele edilmiştir, acetone sabitlenmiş. 2-8ºC saklayınız ve miadını kontrol ediniz. Human anti-influenza A antibody influenza A antigen Gerekli materyaller ama sağlanmayanlar: Uygun mikropipetler. Thermostabil inkübator. Distile su. 24x60 mm yapışkan. Fluoresan mikroskope ve kullanıcının tercihine göre uygun filtreler. Nemli hazne. Uygun özgüllükte VIRCELL IFA kit. Kan mikrobiyolojik kontaminasyon dikkate alınarak eğitimli bir personel tarafından, venipunktür tekniği ile eğitimli bir personel tarafından alınmalıdır. Steril ve aseptik teknik kullanımı numunenin yapısını da koruyacaktır. Serum numuneleri (2-8ºC) buzdolabında ya da 7 gün içinde çalışılmayacaksa (-20ºC) de saklanır.numuneler tekrar tekrar dondurulup çözülmemeli.hiperlipemik, hemolizli ya da kontamine olmuş numune kullanmayınız. Partikül içeren numuneler, santrifüj edilerek berrak hale getirilmelidir. TEST PROSEDÜRÜ: Slaytlar uygun özgüllükte VIRCELL IFA kit reaktifleri kullanır. Test prosedüründeki verilen sayı VIRCELL IFA kit uygun olmalıdır. IgG belirlemesi: 1.- kullanmadan önce tüm reaktifleri oda ısısına getirin. Açmadan önce tüm slaytların oda ısısına çıkarın µl PBS e 10 µl örnek ekleyerek 1/128 ve 1/256 dilusyonda serum örnekleri hazırlayın 2 (1/128 dilusyon). 50 µl PBS ile (1/256 dilusyon) çift dilusyon hazırlayın. Kontrol serum 3 ve 4 seyreltilmez µl 1/128 ve 1/256 dilusyon iki slayt kuyucuğuna uygulayın 1. pozitif 3 ve negatif 4 kontrolleri aynı yapın. 4.-Slaytı nemli haznede 37ºC de 30 dakika bekletin. Manufacturer: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre Santa Fé *GRANADA* SPAIN* Tel * Fax

2 2 5.- PBS ile 2 slaytı yıkayın 1 (kuyucuklarda direk PBS den kaçının) ve PBS de 10 dakika batırın.distile su ile slaytlara derin yıkama yapın. 6.-Slaytların hava ile kurumasını sağlayın Herbir kuyucuğa 20 µl anti-human IgG FITC konjugat solusyonu 5G ekleyin. (Dilusyona gerek yok). 8.-Aşama 4, 5 ve 6 tekrar edin. 9.-Herbir kuyucuğa küçük bir damla mounting medium 6 ekleyin ve dikkatlice yapışkanla kaplayın. 10.-slaytları olabildiği kadar çabuk floresan mikroskopta 400x büyütmede okuyun. Eğer bunu yapamıyorsanız, bakana kadar 24 saatten uzun olmayacak şekilde 2-8ºC de karanlıkta saklayın. 11.-eğer dilusyon test ediyorsanız, 1/2048 dilusyona kadar analiz edin. IgM belirlemesi: 1.- kullanmadan önce tüm reaktifleri oda ısısına getirin. Açmadan önce tüm slaytların oda ısısına çıkarın µl PBSe 25 µl örnek ekleyerek 1/2 dilusyon serum örnekleri hazırlayın2. Kontrol serum 3 ve 4 seyreltilmez. 3.-Seyreltilmiş serumları anti-human IgG sorbent ile muamele edin 7, 25 µl sorbente 5 µl serum ekleyip karıştırarak. Kontrol serum 3 ve 4 seyreltilmez ve sorbent eklenmez. uygulanan serum direk kullanılır ya da presipitatlar uzaklaşsın diye santrifüj edilir. 4.- Herbir slayt kuyucuğuna 20 µl sorbent-uygulanmış serum eklenir. 1. pozitif 3 ve negatif 4 kontrolleri aynı yapın. 5.- Slaytı nemli haznede 37ºC de 90 dakika bekletin. 6.- PBS ile 2 slaytı yıkayın 1 (kuyucuklarda direk PBS den kaçının) ve PBS de 10 dakika batırın.distile su ile slaytlara derin yıkama yapın. 7.- Slaytların hava ile kurumasını sağlayın Herbir kuyucuğa 20 µl anti-human IgM FITC konjugat solusyonu 5M ekleyin. (Dilusyona gerek yok). 9.- Slaytı nemli haznede 37ºC de 30 dakika bekletin. 10.-Aşama 6 ve 7 yi tekrar edin Herbir kuyucuğa küçük bir damla mounting medium 6 ekleyin ve dikkatlice yapışkanla kaplayın slaytları olabildiği kadar çabuk floresan mikroskopta 400x büyütmede okuyun. Eğer bunu yapamıyorsanız, bakana kadar 24 saatten uzun olmayacak şekilde 2-8ºC de karanlıkta saklayın. İNTERNAL KALİTE KONTROL: Her üretim lotu pazara sürülmeden önce internal (Q.C.) testi yapılır.bu validasyon prosedüründen daha önemlidir. KULLANICILAR İÇİN VALİDASYON PROTOKOLÜ: VIRCELL IFA kite uygun kullanıcılar için validasyon protokolü verilmiştir: Pozitif, negatif ve cut off kontroller her teste çalışılmalıdır.bu kitin ve testin validasyonunu sağlar. Görülen floresan pattern aşağıdaki gibi olmalıdır: Pozitif kontrol: Yeşil elma fluoresan nukleus ve sitoplazmada. Negatif kontrol: Kırmızı hücresel pattern. prevalansı sonuçların uygun gelişimi içindir. Genellikle 256 ya eşit ya da büyük titreler klinik belirtiler ile birlikte viral hastalığı gösterir. LİMİTLER: 1.- Bu kit sadece insan serumunda kullanmak içindir. Slaytlar uygun özgüllükteki VIRCELL IFA kiti ile kullanılır. diğer orjine sahip reaktifler kullanılarak yapılan test sonuçlarından VIRCELL sorumlu değildir. 2.- Kitin kullanıcısına, kitin içeriğini iyice okuyarak, anlayıp çalışması önerilir. Güvenilir sonuç elde etmek için, protokole tamamen uymak gerekir. Özellikle, doğru numune ve doğru reaktif pipetleme ve inkübasyon zamanı adımlarına tamamen uymak gereklidir. 3.- Numunelerin sonuçları klinik değerlendirme ve diğer teşhislerle birlikte yorumlanmalıdır. Kesin teşhis ayırma tekniği ile konulmalıdır. 4.- Bu test enfeksiyonun yerini belirtmeyecektir. Ayırım yapma amacı ile kullanılmaz. 5.-Antikor seviyesinin eksikliğinin tespiti enfeksiyon olasılığını içermemesi söz konusu değildir. 6.-Samples collected very early in the course of an infection may not have detectable levels of IgG. In such cases, it is recommended an IgM assay be performed, or a second serum sample be obtained 14 to 21 days later to be tested in parallel with the original sample to determine seroconversion. 7.- Erken alınan numunlerde IgG seviyesi tespit edilmeyebilir.bu durumlarda IgM testi yapılmalıdır.ikinci serum gün sonra alınmalıdır, serokonversiyonun tespiti için ilk alınan numuneyle paralel çalışılmalıdır. 8.-Tek-örnek antikor belirleme sonuçları güncel enfeksiyon tanısı için kullnılamaz. Çiftli örnekler (akut ve nekahat döneminde) toplanmalı ve serokonversiyona bakmak ya da antikor seviyesindeki artışı belirlemek için çalışılmalıdır. 9.-otoimmun hastalıklı serumlar IFA kullanılarak aşırı hücrelerle nonspesifik reaksiyon verebilir. Bu serumlar bu metod ile değerlendirilemez. PERFORMANS DUYARLILIK VE ÖZGÜLLÜK: 50 serum örneği ticari ELISA kitlerine karşı INFLUENZA A IFA IgG ile test Sonuçlar aşağıdadır: ÖRNEK NO DUYARLILIK ÖZGÜLLÜK IgG % 90.0% 46 serum örneği ELISA kitlerine karşı INFLUENZA A IFA IgM ile test Sonuçlar aşağıdadır: ÖRNEK NO DUYARLILIK ÖZGÜLLÜK IgM % 96.4% Sera with non-specific reactivity were excluded from final calculations. SONUÇLARIN YORUMLANMASI: Serum titresi bir pozitif reaksiyonda görülen en yüksek dilusyondur. Nukleus ve sitoplazmada elma yeşili floresan görüldüğünde reaksiyon pozitiftir. Kırmızı hücresel pattern görüldüğünde reaksiyon negatiftir. Bazen, serum hücrelerin %50 sinde pozitif floresan vererek reaksiyona girebilir. Bu pattern değerlendirilemez spesifik olmayan reaksiyon ile ilişkilidir. Bu kılavuzdan farklı sonuçlar pozitif olarak değerlendirilemez. IgG ve IgM antikorları primoenfeksiyon ve reenfeksiyon sırasında farklı davranır. primoenfeksiyonda IgG ve IgM hemen tüm hücrelerde görülür (IgM, IgGden önce görülür). reenfeksiyonda IgMantikorları tüm olgularda görülmez, bu nedenle IgG Belirlemesi tanı için tek yararlı metoddur. IgG yüksek titresi hastanın hayatı boyunca bir çok hastalıkta görülür, IgM ise enfeksiyondan 2 ya da 3 ay sonra ölçülebilir ve bu nedenle güncel enfeksiyonlar için geçerli markırdır. Yüksek titre sağlıklı kişilerde de bulunabilirken serokonversiyon tanı teyidini sağlar. Serum tek bir örneği ile, mevsimsel varyasyonlarda sayılması için çok önemlidir, hasta yaşı, coğrafik bölgede hastalık

3 3 EN ÇALIŞMA-İÇİ KESİNLİK: 3 serum (2 pozitif ve 1 negatif) 5 grupta aynı koşullarla aynı kişi tarafından test Bir dilusyondan fazla titre değişimi görülmemiştir. ÇALIŞMALAR-ARASI KESİNLİK: 3 serum (2 pozitif ve 1 negatif) 5 grupta aynı koşullarla aynı kişi tarafından test Bir dilusyondan fazla titre değişimi görülmemiştir. ÇAPRAZ REAKSİYONLAR VE ETKİLEŞİMLER: Benzer grupların virusları (respirtory syncytial virus (RSV), influenza A, adenovirus, parainfluenza) için pozitif olduğu bilinen 10 örnek IgG ile test Benzer grupların virusları (respirtory syncytial virus (RSV), influenza A, adenovirus, parainfluenza) için pozitif olduğu bilinen 8 örnek IgM ile test Çapraz bir reaksiyon veya etkileşim görülmedi. DİĞER ETKİLEŞİM ÇALIŞMALARI: IFA testi romatoid faktör için pozitif olduğu bilinen 25 serum ile 2 viral ve 2 bakteriyal antijene karşı IgG ve IgM antikorları belirlemesi için test IFA testinde diğer herbir antijen için belirlenen 2 serum örneği de IgG ve IgM için test IgM testi için serum anti-igg sorbent ile muamele edilir. Sonuçlar romatoid faktör tarafndan IgM testinde etkileşimleri önlemek için sorbentin etkili olduğunu göstermiştir. Önerilen sorbent test edişmiş ve IgG antikor fazlalığına göre yanlış negatif sonuçları önlediği bulunmuştur. ETİKETTE KULANILAN SEMBOLLER: TEST PROSEDÜRÜNÜN ÖZETİ: Slayt kuyucuklarına serum dilusyon ve kontrolleri ekleyin 1 Nemli hazne 30 dakika 37ºC de IgG testi için Nemli hazne 90 dakika 37ºC de IgM testi için PBSile iki kez yıkayın 2 ve bir kez distile su ile yıkayın Nemli Hazne Kuru hava Fluoresan konjugat ekleyin 5G ya da 5M 30 dakika 37ªC de PBSile iki kez yıkayın 2 ve bir kez distile su ile yıkayın Kuru hava Küçük bir damla mounting medium 6 Yapışkan ile kaplayın In vitro diyagnostik medikal alet Miadı kadar kullanın (miadı) Slaytı fluoresan mikroskopta okuyun 400x 2ºC 8ºC 2-8ºC de saklayınız x Yeteri kadar r <X> test içerir. Lot Katalog No Inserte bakınız <X>kuyucuklar

4 4 EN LITERATURE: 1. Arola, M., O. Ruuskanen, T. Ziegler, and T. T. Salmi Respiratory virus infections during anticancer treatment in children. Pediatr Infect Dis J 14: Brown, G. C. and T. P. O'Leary S IgM and IgA influenza fluorescent antibodies in serum. J Immunol 107: Buchner, Y. I., R. B. Heath, J. V. Collins, and J. R. Pattison Detection of antibodies of the IgM class in sera of patients recently infected with influenza viruses. J Clin Pathol 29: Buchner, Y. I., R. B. Heath, J. V. Collins, and J. R. Pattison Serum IgM antibody and influenza A infection. J Clin Pathol 30: De Silva, L. M., M. S. Khan, G. Kampfner, J. O. Tobin, R. Gillett, and C. A. Morris The post-mortem diagnosis of influenzal infection by fluorescent IgG, IgA and IgM antibody studies on necropsy blood. J Hyg (Lond) 71: Doller, G., P. C. Doller, and H. J. Gerth Diagnostic significance of influenza subtype-specific IgG, IgA, and IgM antibodies. J Biol Stand 14: Falsey, A. R., C. K. Cunningham, W. H. Barker, R. W. Kouides, J. B. Yuen, M. Menegus, L. B. Weiner, C. A. Bonville, and R. F. Betts Respiratory syncytial virus and influenza A infections in the hospitalized elderly. J Infect Dis 172: Ljungman, P., J. Andersson, J. Aschan, L. Barkholt, A. Ehrnst, M. Johansson, and O. Weiland Influenza A in immunocompromised patients. Clin Infect Dis 17: Serwint, J. R. and R. M. Miller Why diagnose influenza infections in hospitalized pediatric patients? Pediatr Infect Dis J 12: Urquhart, G. E Serum IgM and IgA responses in influenza A infections. J Clin Pathol 27: Vikerfors, T., G. Lindegren, M. Grandien, and J. van der Logt Diagnosis of influenza A virus infections by detection of specific immunoglobulins M, A, and G in serum. J Clin Microbiol 27: For any question please contact customer service: technicalservice@vircell.com REVISED: October-05

5 5 Manufacturer: VIRCELL, S.L. Pza. Domínguez Ortiz 1. Polígono Industrial Dos de Octubre Santa Fé *GRANADA* SPAIN* Tel * Fax