8. Hafta. Yeni Teknoloji Aşıları

Transkript

1 8. Hafta Yeni Teknoloji Aşıları

2 Modern Aşı Teknolojisi Modifiye canlı aşılar ve inaktif (ölü) aşılar bugüne kadar birçok infeksiyöz hastalığın kontrolünde başarılı olmuşlardır. Ancak, her zaman için daha etkin, daha ucuz ve daha güvenli aşı üretimine ihtiyaç duyulmaktadır. Modern aşılar: Gen Klonlaması ile Hazırlanan Aşılar (antijenler), Genetik Olarak Attenue Edilmiş Organizma Aşıları Canlı Rekombinant Organizma Aşıları olarak sınıflandırılmaktadır (USDA).

3 Gen Klonlaması ile Hazırlanan Aşılar (an3jenler) (I. Kategori Aşılar) Gen klonlaması yüksek miktarda saflaştırılmış antijen üretimi amacıyla kullanılmaktadır. Gen klonlamasının ilk aşaması ilgili antijeni kodlayan DNA nın izolasyonudur. Bu DNA daha sonra bir bakteri, maya veya başka bir hücreye aktarılarak bu hücrelerde rekombinant antijenin ekspresyonu (üretilerek sergilenmesi) sağlanır. Bu şekilde geliştirilen ilk aşı Şap Hastalığı Virusu ndan hazırlanmıştır. Bu virusun yapısı çok iyi bilinmektedir. Mevcut antijenleri arasında VP1 antijenini (koruyucu antijen) kodlayan genlerin haritaları çıkartılmıştır.

4 İlk olarak şap virusunun RNA genomu izole edilir ve reverz transkriptaz enzimi kullanılarak DNA ya transkripte edilir (RNA nın komplementeri sentezlenerek cdna elde edilir). Daha sonra bu DNA restriksiyon endonüklez enzimleri ile sadece VP1 antijenini kodlayan geni kapsayacak fragment elde edilecek şekilde kesilir. VP1 i kodlayan DNA sonra bir plazmide aktarılır. Bu plazmid ise Escherichia coli bakterisine (rekombinant bakteri) aktarılarak bakteri suşu üretilir. Bu rekombinant bakteri üredikçe fazla miktarda VP1 üretir. Üretilen antijen toplanır, saflaştırılır, ve bundan bir aşı geliştirilir.

5 Bu işlem etkili bir işlemdir, çünkü mililitresinde mikroorganizma yoğunluğu sağlanacak şekilde üretilen 10 lt hacmindeki E. coli den 4x10 7 doz şap aşısı hazırlanabilmektedir. Bununla birlikte bu aşı ile oluşturulan bağışıklığın düzeyi aynı virusun inaktif aşısıyla elde edileninden daha düşüktür ve benzer bir koruma sağlanması için 1000 kat yüksek dozda uygulanmasına gerek duyulmaktadır.

6 İlk ticari kategori I rekombinant veteriner aşısı kedi lösemi virusuna (FeLV, feline leukemia virus) karşı geliştirilmiştir. Aşıda kedilerde koruyucu immun yanıttan sorumlu antijen FeLV nin temel zarf proteini olan gp70 (70kDa lık protein) tir. Bu proteini kodlayan gene ilaveten buna bağlı p15e (zarfta bulunan 15kDa lık bir protein) olarak adlandırılan başka bir proteinin küçük bir porsiyonu izole edilerek E. coli ye inserte edilmiş (plazmid ile aktarılmış) ve bu da yüksek miktarda gp70 üretimini sağlamıştır. Oluşturulan bu gp70 protein glikozile edilmemekte ve 50kDa dan büyük bir moleküler ağırlığa sahiptir. Klonlandıktan sonra rekombinant protein toplanır, saflaştırılır ve bir saponin adjuvantı ile karıştırılarak aşı olarak kullanılır.

7 Rekombinant aşılara başka bir örnek de Borrelia burgdorferi nin neden olduğu Lyme Hastalığı na karşı geliştirilen aşıdır. Bu etkenin immunodominant (immun sistemi daha baskın uyaran) dış yüzey lipoproteinini kodlayan OspA geni E. coli ye klonlanır (plazmid ile aktarılır). E. coli tarafından eksprese edilen rekombinant protein saflaştırılarak buna adjuvant ilave edilir ve aşı olarak kullanılır. Bu aşının farkı, aşılı hayvanlara tutunan ve kanlarını emen kenenin antikorları almasıdır. Bu antikorlar kenenin sindirim kanalında bulunan bakterileri (B. burgdorferi) öldürerek bunların kenenin ağız salgısıyla bulaştırılmasını engeller. Böylelikle kenelerle (vektör) etken bulaşması engellenmiş olur.

8 Belirli bir mikroorganizmaya belirli bir geni klonlamak yerine farklı bir strateji ile antijenleri kodlayan genler bitkilere klonlanarak da aşılar geliştirilebilir. Bu formdaki aşılar özellikle de bulaşıcı gastroenterit virusu veya Newcastle Hastalığı virusu gibi viral etkenlere karşı geliştirilmiştir. Bu amaçla kullanılan bitkiler arasında tütün, patates ve mısır bulunmaktadır. Yüksek konsantrasyonlarda antijen içeren bitkiler hayvanlara yedirilmek suretiyle aşılar uygulanmış olur. Bunlar içerisinde tütün bitkisine klonlanmış Newcastle virus antijenlerinden oluşan aşı ABD de lisans almıştır.

9 Gene3k Olarak A<enue Edilmiş Organizmalar (II. Kategori Aşılar) Uzun süreli ve tekrarlayan doku kültürü pasajları genetik mühendisliğinin basit (primitif) bir formu olarak değerlendirilebilir. Bu uygulamanın beklenilen ve istenilen sonucu hastalığa neden olmayan bir organizmanın üretilmesidir. Bunu sağlamak her zaman mümkün olmamakta ve bu şekilde oluşturulan bir mikroorganizmanın virulent hale geçmesi (reversiyon) her zaman için bir risk taşımaktadır. Ancak, moleküler genetik tekniklerini kullanmak suretiyle bir organizmanın genleri modifiye edilip o organizmanın geriye dönüşümsüz (irreverzibl) bir şekilde attenue edilmesi sağlanabilir. Bu şekilde hazırlanan aşılar II. Kategori Aşılar olarak tanımlanmaktadır.

10 Domuzlarda herpesvirus tarafından oluşturulan yalancı kuduza (pseudorabies) karşı bu strateji ile geliştirilmiş aşılar mevcuttur. Herpesvirusların nöronlar gibi bölünmeyen hücrelerde çoğalabilmesi için timidin kinaz (TK) enzimine ihtiyacı vardır. Dolayısıyla, TK geni uzaklaştırılmış viruslar sinir hücrelerini infekte edebilmekte ancak çoğalamamakta ve hastalık oluşturamamaktadır. Sonuç olarak, bu aşılar sadece etkili koruma sağlamakla kalmaz, aynı zamanda sahada bulunabilecek virulent pseudorabies viruslarının hücrelere invaze olmasını (reseptörlere bağlanıp yeni virusları bloke ederek) ve hayvanların sürekli taşıyıcı durumda olmasını da engeller.

11 Genetik tekniklerden marker aşılar ın üretilmesinde de faydalanılmaktadır. Örn. pseudorabies virusu gx ve gi olarak adlandırılan iki farklı glikoprotein antijeni sentezlemektedir. Bunlar etkili antijenler olup (immunojen, immun sistemi aktif uyarabilen) ancak viral üreme veya virulenste rol oynayan antijenler değildir. Bu antijenler bu virusun tüm saha suşları tarafından üretilmektedir. Dolayısıyla saha virusu ile infekte hayvanlar gx ve gi ya karşı antikor oluşturacaktır. Genetik olarak gx ya da gi antijenini üretmeyen viruslar oluşturmak (genetik attenue) mümkündür ve bu viruslar aşı suşu olarak kullanılabilir. Bu aşılarla aşılanan domuzlar gx veya gi ya karşı antikor oluşturmayacak, ancak sahada diğer viruslarla infekte hayvanlarda bu antijenlere karşı şekillenmiş antikorlar saptanabilecektir.

12 Bu şekilde hazırlanmış bir aşı gx veya gi antijenine karşı ELISA testleriyle saptanabilen bir antikor oluşturmayacaktır. Dolayısıyla domuzlardan toplanan kan serumlarında ELISA testlerinde gx ve gi ya karşı antikor saptanması bu hayvanın saha pseudorabies virus suşlarına maruz kaldığını ortaya koyacaktır. Bu aşı stratejisi DIVA (Differentiate İnfected from Vaccinated Animals) olarak bilinmekte, bu strateji ile geliştirilen marker aşılara da DIVA aşısı denilmektedir. Bu strateji bir ülkede spesifik infeksiyöz hastalıkların eradikasyonunda konvansiyonel korunma yöntemlerine göre daha ekonomik ve hızlı bir alternatif sunmaktadır.

13 Canlı Rekombinant Organizmalar (III. Kategori Aşılar / Vektör Aşılar) Protein antijenlerini kodlayan genler çeşitli organizmalara direkt olarak klonlanabilmektedir (rekombinasyon). Proteinlerin saflaştırılarak kullanılması yerine, oluşturulan bu rekombinant organizmalar da aşı olarak uygulanabilmektedir. Bu aşılar III. Kategori aşılar olarak tanımlanmaktadır. Deneysel olarak hazırlanmış rekombinant aşılarda bu amaçla adenoviruslar, herpesviruslar, BCG veya Salmonella gibi bakteriler kullanılırken, bu amaçla en yaygın kullanım alanı bulmuş aşılarda ise sığır çiçek virusu (vaccinia virus), tavuk çiçek virusu (fowlpox) ve kanarya çiçek virusu (canarypox) gibi çiçek viruslarından faydalanmaktadır.

14 Bu viruslar derinin çizilmesi veya ağız yoluyla kolaylıkla uygulanmaktadır. Bu viruslar büyük genoma sahip olup, yeni bir genin genoma eklenmesine (insersiyon) (bu virus genomlarının yaklaşık %10 luk porsiyonuna yabancı DNA eklenebilir) izin vermekte ve bu genlerin kodladığı antijenler yüksek düzeylerde eksprese (üretilip hücre yüzeyinde sergilenebilmekte) edilebilmektedir. Dahası, bu şekilde üretilen rekombinant proteinler çiçek virusu içerisinde glikozilasyon ve membran transportu gibi uygun işlem aşamalarını da geçirmektedir.

15 Bu aşılara güzel bir örnek kuduz virusu zarf glikoproteini olan G glukoproteinini kodlayan gen eklenmiş sığır çiçeği rekombinantıdır. G glikoproteini kuduz viruslarının yüzeylerinde karakteristik spike proteinlerini (hücrelere tutunmadan sorumlu yüzey molekülü, koruyucu antijen) oluşturmaktadır. Bu proteini kuduz virus antijenleri içerisinde virusa karşı nötralizan antikor üretiminden sorumlu tek antijendir ve kuduza karşı korumanın sağlanmasında etkili olmaktadır. Bu kuduz-vaccinia virus rekombinantı G proteinine karşı antikor üretimini ve bağışıklığın şekillenmesini sağlar. Bu aşı yeme karıştırılarak yabani karnivorlarda oral aşı olarak kullanılabilmektedir ve uçaklarla atılmak suretiyle yabani hayvanların bulunduğu bölgelere dağıtılabilir. Benzeri bir aşı Belçika da havadan atılarak uygulanmak suretiyle yayılmakta olan tilki kuduzunu önlemiştir.

16 Sığır vebasına karşı korunmada da benzer kategori III aşılarından faydalanılmıştır. Bu aşılar sığır vebası virusunun hemaglutinin (H) veya füzyon (F) genlerini içeren sığır çiçeği (vaccinia virus) virusu ya da keçi çiçeği (caprifox) viruslarıdır. Rekombinant keçi çiçeği virusu (capripox virus) sığırları hem sığır vebası hem de nodüler ekzantemine (lumpy skin disease) karşı korumaktadır. Sığır çiçek virusu TK ve hemaglutinin genlerini inaktive edilerek daha ileri düzeyde de attenue edilebilir. Bu aşılanan hayvanlarda aşı virusunun (vaksinia virus) deri lezyonları oluşturmasını engeller, ek bir avantaj sağlar. Domuz çiçek virusu domuzlarda görülen yalancı kuduz (Aujeszky s disesase) hastalığının potansiyel bir vektörü olarak test edilmektedir.

17 Kategori III aşılara başka bir örnek de, Batı Nil virusuna karşı korunmada sarı humma (yellow fever) (hastalığın etkeni Flavivirus cinsine ait bir arbovirus olan Sarı Humma Virusu dur, vektör sinekler, bulaşma şekli sinek ısırması) viral kimerası (2 ya da daha çok farklı m.o.nın replikasyondan sorumlu genlerini de içeren nükleik asit fragmentlerinin birleştirilmesi ile oluşturulmuş yeni hibrid mikroorganizma) dır. Bu teknoloji, attenue sarı humma aşı suşu 17D nin kapsid ve yapısal olmayan (nonstructural) protein genlerini kullanarak Batı Nil Virusu gibi diğer flavivirusların zarf protein genlerinin taşınmasını sağlar. Sonuçta ortaya çıkan virus, sarı humma / Batı Nil virus kimerası olup daha az nöro-invazif ve her iki parent virusa göre daha güvenli bir aşı suşudur. Güvenlik sınırı zarf genlerinde hedef nokta mutasyonları ile daha da artırılabilir.

18 Amerika Birleşik Devletleri Tarım Dairesi (USDA) tarafından onaylı başka bir III. Kategori aşısı ise Newcastle Hastalığı na karşı geliştirilmiştir. Taşıyıcı organizma tavuk çiçek virusu olup bu virusa Newcastle Hastalığı virusunun hemaglutinin (HA) ve füzyon (F) genleri aktarılmıştır. Bu aşının tavuk çiçeğine karşı da koruyuculuğu bulunmaktadır. Kanarya çiçek virusu vektörlü aşılar benzeri şekilde kedi ve köpek hastalıklarına karşı başarıyla kullanılmaktadır.