Liste Numarası in Vitro Diagnostik Kullanım için. Son Kullanma Tarihi

Transkript

1 REF TV12-100FRT HPV 16/18 Real-TM Quant Rotor-Gene 3000/6000 (Corbett Research), iq icycler/ iq5 (Bio-Rad), Mx3005P (Stratagene), SmartCycler (Cepheid) ile kullanılan Real-Time Kit Liste Numarası in Vitro Diagnostik Kullanım için Kullanılan Semboller 2-8 C de saklayın Dikkat! Lot Numarası Son Kullanma Tarihi Negatif Kontrol VER Versiyon Kullanım Bilgileri Pozitif Kontrol Reaktif İçerir Üretici İSİM HPV 16/18 Real-TM Quant KULLANIM AMACI Kit HPV 16/18 Real-TM Quant ürogenital swablar ve biyopsilerde Human Papillomavirus (16, 18) in genotipleme ve kantitatif tespiti için in vitro Real Time amplifikasyon testidir. TEST PRENSİBİ Kit HPV 16/18 Real-TM Quant iki temel aşamaya dayanır: örneklerden DNA izolasyonu ve multipleks Real Time amplifikasyon. HPV 16 DNA amplifikasyon sonuçları Fam/Yeşil kanalında tespit edilir, HPV 18 DNA amplifikasyon sonuçları Rox/Turuncu kanalında tespit edilir ve İç Kontrol olarak kullanılan β-globine gen Joe/ HEX / Sarı kanalında tespit edilir. Eğer swab doğru şekilde hazırlanmamışsa, ( yüksek miktarlarda mukus ya da yetersiz miktarda epitel hücresi (< ) İnternal Kontrol belirlenmez. KİT İÇERİĞİ Part N 1 DNA-Sorb-A : örnek hazırlama; Part N 2 HPV 16/18 Real-TM Quant : Real Time amplifikasyon. Part N 1 DNA-sorb-A : Lizis Solüsyonu, 2 x 15 ml; Sorbent, 2 x 1,0 ml; Yıkama Solüsyonu, 2 x 50 ml;

2 DNA-elüent, 2 x 5 ml; Transport medium, 2 x 15 ml. 100 test için gerekli reaktifler içerir. Part N 2 HPV 16/18 Real-TM Quant : PCR-mix , 3 x 0,28 ml PCR- buffer-frt, 3 x 0,3 ml Hot Start DNA Polimeraz, 3 x 0,02 ml Negatif Kontrol, 1,2 ml; DNA-buffer (C-), 0,5 ml Quantitation Standard HPV (QS1 HPV, QS2 HPV, QS3 HPV), 3 x 0,04 ml; 108 test için gerekli reaktifler içerir. GEREKLİ FAKAT SAĞLANMAYAN MATERYALLER Zone 1: Örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler (5-40 μl; μl; μl) 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldivenler, pudrasız Tüpe racks Zone 2: Real Time amplifikasyonu: Real Time Thermalcycler Tüpler Workstation Aerosol bariyerli pipetörler ( 0,5-10 µl; 5-40 µl kapsiteli) Tüp rackları UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine thiocyanate içerir. Guanidine thiocyanate, solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Bu kitin bazı komponentleri koruyucu olarak Sodyum Azid içerir. Reaktif transferi için metal boru kullanmayın. 3. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysileri ve göz koruyucuları kullanın. 4. Ağızla pipetleme yapmayın. 5. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 6. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 7. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 8. Örnekler potansiyel enfeksiyon ajanı olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyogüvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyogüvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 9. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 10. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun.

3 11. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 12. Bu kit DNA-Sorb ekstraksiyon kit ile kullanılmak için tasarlanmıştır. Eğer DNA-Sorb dan başka bir kit ile DNA ekstraksiyonu yapılıyorsa, bu kullanıcı sorumludur. 13. Bu kiti ancak amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 14. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alandan başlayıp Amplifikasyon ve Tespit alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI HPV 16/18 Real-TM Quant -20 C de saklanabilir. DNA-Sorb-A +2-8 C de saklanabilir. KARARLILIK HPV 16/18 Real-TM Quant etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Aşağıdaki numunelerden HPV 16/18 Real-TM Quant DNA-Sorb-A (REF K-1-1/A) ile ekstre edilmiş DNA analiz edebilir: Servikal swablar: Bir pamuk veya polyester swab kullanarak servikal ağzından ve ektoserviksin çevresinden fazla mukusu alın. Bu swabı atın. En büyük kıl ektoservikse dokunana kadar servikal ağız içine cm Örnekleme Servikal Fırça yerleştirin. Servikal kanal içine tamamen fırça takmayın. Kanaldan uzaklaştırarak saat yönünün tersi yönünde, 3 kere tam çevirerek fırçayı döndürün. 0,5 ml Transport ortamı (Sacace) ile nükleaz-free 2,0 ml tüp içine fırçayı yerleştirin saniye boyunca ortamda fırçayı şiddetlice sallayın. Tüp içinde fırçayı sonda bırakarak skorlanmış çizgide sapını koparın. doku mekanik homojenizör ile homojenize edilmiş ve PBS sterilde çözülmüş (önerilen DNA-Sorb-C REF K-1-6/50 bu kitte dahil değildir, ama ayrı ayrı sipariş edilebilir) Sıvı-bazlı sitoloji numuneler (Cytoscreen, PreservCyt) (bu kitte önerilen DNA-Sorb-D REF K-1-8/100 dahil değildir ama ayrı ayrı sipariş edilebilir) Toplamadan hemen sonra örneklerin çalışılması önerilir. 24 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri 2 8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik faktörlerin transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır. ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solusyonu ve Yıkama Solusyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar C ye kadar ısıtılır. Bir tüpte Ekstraksiyonun Negatif Kontrolü olacak şekilde gerekli miktarda 1,5 ml polipropilen tüpler hazırlayın. 2. Herbir tüpe 300 μl Lizis Solusyonu ekleyin. 3. Uygun tüplere 100 μl Örneklerden ekleyin. 4. Aşağıdaki gibi Kontrolleri ekleyin: Cneg işaretli tüpe 100 μl C (Negatif Kontrol amplifikasyon kiti ile sağlanır) ekleyin. 5. Tüpleri vorteksleyin ve 65 C de 5 dakika inkübe edin. 5-7 saniye santrifüj edin. Eğer numune tamamen çözülmemişse, maksimum hızda ( ) 5 dakika yenicen santrifüj etmenizi ve supernatantı DNA ekstraksiyonu için yeni bir tüpe aktarmanızı öneririz. 6. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 20 μl ekleyin saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 3 dakika inkübe edin. Bu aşamayı tekrar edin.

4 8. Tüm tüpleri 5000g de 30 saniye santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 9. Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solusyonu ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 30 saniye vorteksleyin. Her bir tüpten supernatantı atın. 10. Aşama 9 u tekrar edin ve tüm tüpleri kapakları açık şekilde 65 C de 5-10 dakika inkübe edin. 11. Pelleti 100 μl DNA-eluent içinde yeniden süspense edin. 65 C de 5 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 12. Tüpleri 12000g de 1 dakika santrifüj edin. 13. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. Eğer amplifikasyon, ekstraksiyon ile aynı günde yapılmayacaksa hazırlanan örnekler maksimum 5 gün için 2-8 C de saklanabilir ya da 20 /-80 C de dondurulabilir. PROTOKOL: Reaksiyon hacmi:25µl 1.Yeterli miktarda reaksiyon tüpü hazırlayın (N + 4 kontrol (3 standart ve 1 negatif kontrol) örnek için Miks hazırlayın: PCR- buffer-frt içeren tüpe 20 μl Hot Start DNA Polymerase ekleyin. Dikkatlice tüpü vorteksleyin. Bu miks +4 C de 3 ay saklanabilir. 3. Reaksiyon karışımı hazırlayın (Tablo 2 bakın). Her bir örnek için yeni bir steril tüpe 7*(N+1) µl PCRmix ve 8*(N+1) µl Mix (PCR- buffer-frt + Hot Start DNA Polymerase) ekleyin. 4. Örnek ve kontrol içeren her tüpe 15 μl Reaksiyon Miks ekleyin. 6. Uygun tüplere 10 μl ekstrakte DNA örneği ekleyin. 7. Herbir panel için 2 kontrol hazırlayın: 3 işaretli tüplere 10 µl Quantitation Standards HPV (QS1 HPV, QS2 HPV, QS3 HPV) ekleyin; işaretli Negatif Kontrol tüpüne 10 µl DNA-buffer ekleyin; Tablo 2. X numune karışımları hazırlama (kontroller için reaktiflerin hesaplanması ile) Örnek PCR-mix Mix (PCR- buffer- FRT + Hot Start DNA Polymerase) Örnek PCR-mix Mix (PCRbuffer-FRT + Hot Start DNA Polymerase) Real Time Amplifikasyonu 1. Tüpleri kapatın ve Real Time ThermalCycler içine yerleştirin. 2. Aşağıdaki gibi cihazları programlayın: RotorGene 3000/6000 (Corbett Research) Adım t, C Zaman Floresan tespit Döngü Bekleme dk sn. Döngü FAM, JOE, ROX (Green, sn. Yellow, Orange) Fam, Joe, Rox (impost 3FI 5FI) kanallarındaki ilk tüp için kalibrasyona başlayın ve Perform Calibration Before 1-st Acquisition seçin.

5 iq icycler/ iq5 (Bio-Rad) Adım t, C Zaman Floresan tespit Döngü dk sn dk. FAM, HEX, ROX 45 Mx3005P (Stratagene) Adım t, C Zaman Floresan tespit Döngü dk sn dk. FAM, HEX/JOE, ROX 45 SmartCycler (Cepheid) Aşama Sıcaklık Sn. Optik Tekrar Aşama 1. Bekleme 95 C 900 Kapalı 1 Aşama 2 95 C 20 Kapalı 2-Sıcaklık Döngüsü 60 C 60 Açık (FAM, JOE/TET/Cy3, ROX Standart eğriyi oluşturmak için Joe (Human DNA), Fam (HPV 16) ve Rox (HPV 18) kanallarındaki Quantitative Standards (HPV 16/18 Quant Data Kartta rapor edilmiş) konsantrasyonları girin ve tüplerin pozisyonlarını programlayın. SONUÇ ANALİZİ: Sonuçlar, threshold (eşik ) çizgisi ile fluoresan eğrisinin kesiştiği noktada cihazın software ile yorumlanır. Internal Kontrol(İnsan DNA), FAM/Green kanalda HPV 16, ROX/Orange kanalda HPV 18 ve Joe/HEX/Yellow kanallarında belirlenir. Aşağıdaki formül kullanılarak insan hücresinde 18 DNA ve/veya HPV 16'ın konsantrasyonu hesaplanır: lg (HPV DNA kopyası (16 or 18)/ insan DNA kopyası x ) = lg ( hücrede HPV ) Sonuçların yorumlanması: Sonuç lg ( hücrede HPV) Yorum < 3 Klinik olarak önemsiz 3-5 Klinik olarak önemli. Servikal displazin var olan riski > 5 Klinik olarak çok önemli. Servikal displazin yüksek riski. Sorun giderme 1. Amplifikasyonun negatif kontrolü ve negatif kontrol örnekleri için sonuç tablosunda Ct değerlerinin oluşumu reaktifler veya örneklerin kontaminasyonunu göstermektedir. Bu analiz sonuçları tüm testler için geçersiz kabul edilir. Tüm testlerin analizinin tekrarlanması gereklidir ve kontaminasyonun kaynağını elimine etmek ve tespit etmek için ölçümler alınmalıdır. 2. Numunede insan DNA konsantrasyonu 1000 kopyadan daha azdır: swab doğru şekilde hazırlanamaz. Testi tekrar edin. 3. Standard Curve (standart eğri) penceresinde Katsayı korelasyon değeri R < 0,9 dan küçüktür: bütün numunelerin tekrar test edilmesi gerekir.

6 PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü negatif numuneler ile doğrulanmıştır. Bu numuneler spesifik HPV primerler ve probları ile sinyal vermezler. HPV 16/18 Real-TM Quant kitin özgüllüğü 100% dir. Kit HPV 16/18 Real-TM Quant ın potansiyel çapraz-reaktivitesi kontrol grubuna karşı test edilmiştir. Diğer patojenler ile herhangi bir çapraz-reaktivite gözlenmez. Analitik hassasiyet Kit HPV 16/18 Real-TM Quant, 500 kopya/ ml den az olmayan % 100 duyarlılıkla testlerin HPV DNA tespitini sağlar. Tespit, negatif numuneler tarafından kontrol standardını ve dilüsyonlarını gerçekleştirir. Hedef bölge: E7 Sacace Biotechnologies Srl 18 San Carlo str., Caserta, Italy *PCR: The Polymerase Chain Reaction (PCR) process is covered by patents owned by Hoffmann-La Roche and applicable in certain countries. Sacace does not encourage or support the unauthorized or unlicensed use of the PCR process. Use of this kit is recommended for persons that either have a license to perform PCR or are not required to obtain a license