DNA nın restriksiyon enzimleriyle (RE) kesilmesi. Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler DNA nın RE leri ile kesilmesi

Transkript

1 DNA nın restriksiyon enzimleriyle (RE) kesilmesi Moleküler Biyolojide Kullanılan Yöntemler-4 Günümüzde 500 den fazla RE ticari olarak üretilmektedir. RE ler genellikle 10 U/ul konsantrasyonda satışa sunulmaktadır. 1 U RE aktivitesi, uygun koşullar altında 1 ug DNA yı 1 saatte kesebilen enzim olarak tanımlanmaktadır. RE lerin büyük çoğunluğu %50 gliserol içeren tamponlarda ve -20 C de saklanır. Enzim kullanılacağı zaman derin dondurucudan buz kabına alınmalı, işlem bitiminde hemen derin dondurucuya konulmalıdır. Enzimlerin aktif olarak çalışacağı koşulları sağlayan özel tamponlar üreticiler tarafından enzimle birlikte verilmektedir. Bu tamponlar genellikle 10x konsantrasyondadır ve kullanım sırasında 1x şeklinde sulandırılır. DNA nın RE leri ile kesilmesi İzole edilen DNA, RE enzimleri ile kesime bırakılmadan önce jel elektroforezi ile analiz edilmelidir. 20 ul reaksiyon karışımı içerisinde ug DNA bulunmalıdır. DNA konsantrasyonu fazla ise reaksiyon karışımının hacmi artırılmalıdır. Kesim reaksiyonunun kullanılması için çeşitli yöntemler kullanılabilir. Yöntemin seçiminde örnekle ilgili olarak bir sonraki aşama göz önüne alınmalıdır. 1

2 Eğer örnek jel elektroforezi ile analiz edilecekse kesim reaksiyonu, sadece yükleme tamponu ile durdurulur. Eğer örnek ligaz etkisinde bırakılacaksa, RE kesinlikle inaktif hale getirilmelidir. RE lerinin çoğu 65 C de dak tutulduğunda inaktif hale geçer. Üretici firmaların aynı enzim için önerdikleri inaktivasyon sıcaklığı ve süresi farklı olabilir. Bu farklılık enzimin içinde bulunduğu tamponun iyon kuvvetinden ileri gelmektedir. Reaksiyon durdurucu olarak EDTA da kullanılabilir. Kesimde kullanılan RE, Mg iyonunu kofaktör olarak kullanır ve herbir EDTA molekülü 2 Mg 2+ iyonu bağlar RE kesimi sonucu elde edilen DNA parçalarının kontrolü, boyutları bilinen standart DNA fragmentleri kullanılarak jel elektroforezi ile yapılmaktadır. Plazmit DNA sının kesimi Reaksiyon karışımı Plazmid DNA sı (0.5-2 ug) 10x reaksiyon tamponu 1 U enzim ( EcoR1 ve/veya Hindlll Yöntem 1) Reaksiyon karışımı 37 C de 1 saat bırakılır. Genellikle fazla miktarda enzim veya uzun süre inkübasyona bırakmak herhangi bir problem yaratmaz. Bu nedenle bu koşullarda 1 saatlik süre kesilme için yeterli olmakla beraber ortamdaki DNA nın tamamının kesilmesini sağlamak için 1 gece de inkübasyona bırakılabilir. 2) enzim aktivitesi, reaksiyon karışımının dak, 65 C de tutulmasıyla veya son konsantrasyon 10 mm olacak şekilde 0.5 M EDTA (ph 7.5) eklenmesiyle durdurulur. 2

3 DNA nın jelden geri alınması DNA nın jelden geri kazanılmasına yönelik oldukça farklı yöntemler geliştirilmiştir. Bu yöntemlerle istenilen boyuttaki DNA fragmentlerini saf olarak elde etmek veya DNA yı herhangi bir aşamada saflaştırmak olasıdır. Bununla beraber uygulamada başarılı sonuç alınmasını güçleştiren bazı noktalar vardır. Bunlar: Saf olmayan agaroz kullanımı: DNA nın jelden geri kazanılması sırasında agaroz içindeki yabancı maddelerin DNA solüsyonunda bulunması sonraki aşamalarda kullanılacak olan enzimleri inhibe etmektedir. Fakat günümüzde oldukça saf olarak üretilen agaroz kullanımı ile bu problem ortadan kaldırılmıştır. Büyük fragmentlerin jelden geri kazanılmasındaki güçlük: Genellikle 5 kb dan daha küçük fragmentlerin geri kazanımı başarılı olurken büyük fragmentler aynı başarı ile izole edilemezler. Düşük konsantrasyonda DNA kullanımı: Eğer az miktarda DNA jele yüklenmişse geri kazanım işlemleri sırasında önemli kayıplar olabileceğinden 500 ng dan az miktardaki DNA ile işleme başlamamak yararlı olur. DNA nın jelden geri kazanılmasına yönelik geliştirilmiş yöntemler: 1) Ticari olarak üretilen küçük sefarasil kolonlarla yapılan saflaştırma: Üretici firmanın önerdiği tamponlar kullanılarak istenilen boyuttaki DNA yı içeren jel parçaları kolona yüklenir ve DNA nın kolona bağlanması sağlanır. Daha sonra elüsyon tamponu kullanılarak DNA kolondan geri alınır. 2) Düşük sıcaklıkta eriyebilen agaroz kullanılarak saflaştırma: Agaroza hidroksietil grupları eklenerek yaklaşık 30 C de donması ve 65 C nin altında erimesi sağlanır. Bu özellikte agaroz kullanılarak istenen DNA yı içeren jel parçası kesilip eritildikten sonra fenol/kloroform ekstraksiyonu ve etanol çöktürmesi sonucunda DNA saf olarak elde edilebilir. 3) DNA fragmentlerini içeren agaroz parçası, içinde yürütme tamponu bulunan diyaliz tüpüne konur ve elektriksel alana bırakılır. DNA nın jelden ayrılıp tampona geçmesi için bir süre beklenir. DNA nın tamamının diyaliz tüpündeki tampona geçip geçmediği UV ışık altında zaman zaman kontrol edilir. Daha sonra Etidium bromürün izoamil alkol kullanılarak uzaklaştırılması ile DNA saf olarak elde edilir. 3

4 4) Gene Clean yöntemiyle DNA nın jelden geri kazanılması: Oldukça başarılı bir yöntemdir DNA nın içinde bulunduğu agaroz jel eritilir ve toz halinde cam boncuk solüsyonu örneğe eklenir. DNA cam boncuklara yapışır, diğer maddeler santrifüjleme ile uzaklaştırılır. RNA izolasyonu ve analizi Daha sonra, DNA elüsyon tamponu ve distile su kullanılarak cam boncuklardan ayrılır ve etanol ile çöktürülür. Genler ve genetik kod Gen: DNA nın genetik bilgiyi taşıyan bölümleri. Bütün genler DNA dan oluşur. Genetik bilgi akışının moleküler işlemleri 3 basamağa ayrılır 1 replikasyon Bir gendeki bilgileri A,G,T,C bazlarının sıralanışı belirler. DNA da bulunan bilgiler RNA ya taşınır ve RNA aracılığı ile proteinlere dönüştürülür DNA, RNA ve proteinlerin 3 ü de genetik bilgi içerdiğinden bilgi makromolekülleri olarak isimlendirilirler. Moleküler biyolojinin santral dogması 21 2) Transkripsiyon (kopyalama): DNA bir ara molekül olan RNA aracılığıyla protein sentezinde rol oynar. Bilgilerin RNA ya dönüşümüne transkripsiyon denir. Bir veya birden fazla polipeptiti şifreleyen RNA molekülüne de Elçi (mesajcı) RNA (mrna) denir. Bazı genler Transfer RNA (trna) ve ribozomal RNA (rrna) sentezi için gerekli bilgileri içerirler. Bunlar protein sentezinde rol oynarlar ancak, protein yapacak genetik bilgileri kodlamazlar. 3) Translasyon (tercüme): mrna daki bilgiyi kalıp olarak kullanarak protein sentezleme 22 Genetik kod Bir protein zincirindeki amino asitlerin sırası, mrna daki bazların özel dizilişi tarafından tanımlanır. Bir proteinin amino asit sırası ile bir genin baz sırası arasında doğrusal bir ilişki vardır. bir mrna molekülü üzerindeki her 3 baz bir amino asidi kodlar. Amino asitleri kodlayan bu 3 lü bazlara Kodon denir. Translasyon işlemi mrna ile olduğundan, genetik kod DNA olarak değilde mrna olarak yazılır mrna nın muhtemel 64 (4 3 ) kodonu bulunmaktadır. Ancak bunlardan 61 i a.a leri kodlamaktadır. 3 kodon a.a kodlamaz. Bunlar stop kodonudur. Her bir kodon özel bir aminoasidi kodlar Genetik kodun en ilginç özelliği bir amino asidin farklı kodonlar tarafından kodlanmasıdır. Genetik kod protein kodlayan sistemle proteine dönüştürülür. Bu sistem ribozomlar (protein ve rrna dan oluşur), trna ve çeşitli enzimlerden oluşur. 23 Bu nedenle herhangi bir yerdeki aminoasit bilindiğinde bu yerdeki kodonun otomatik olarak bilinmesi sözkonusu değildir. Diğer yandan DNA dizisini ve doğru okuma zincirini bilerek proteindeki aminoasit belirlenebilir 24 4

5 PROTEİN SENTEZİ Bu durum DNA dizisinden aminoasit dizisini belirlemeye müsaade eder ve genetik devrin kalbini oluşturur. Canlı bir hücrede pek çok metabolik olay ve reaksiyon proteinler tarafından yürütülür Proteinler yapısal eleman olarak da önem taşırlar Kan plazma proteinleri Hormonlar Antikorlar Enzimler Kloroplast Mitokondri Hücre duvarında yer alan proteinler vb yapısal ve işlevsel protein gruplarıdır Protein sentezi Protein sentezi çok karmaşık bir olay olmakla birlikte çok hızlı gerçekleşir. Örn E.coli ribozomlarında 100 amino asitlik bir polipeptit zinciri 5 sn de sentezlenir. Genç bir hücre içinde arasında bulunan ribozomlarda aynı anda yüzlerce, binlerce proteinin sentezlenmesi söz konusudur. Hücrede bulunan proteinlerin ne zaman ve hangi miktarda sentezleneceği diğer moleküller tarafından kontrol altında tutulduğundan bu karmaşık olaya temel komponentler yanında yüzlerce molekül ve faktör katılmaktadır Ribozomlar mrna üzerindeki 3 lü baz dizilerinin belli bir düzene göre okunduğu ve aminoasit diline çevrildiği yer ribozomlardır. O nedenle ribozomlar tercüme bürolarına benzetilir. Ribozomların translasyon için seçicilikleri yoktur, hangi genetik bilgi gelirse onun çevirisini yaparlar. Ribozomlara bilgiyi getiren mrna üzerinde bulunan ve herbiri bir aminoasidi belirleyen kodonlar ile doğru aminoasitler arasındaki ilişkiyi kuran adaptör moleküller ise trna lardır. Kısaca kodonlar ile aminoasitlerin doğru buluşmalarını ribozomlar sağlar Ribozomlar hücre yapıları içinde en karmaşık ve anlaşılması en zor organellerden biridir. Temel olarak RNA ve proteinlerden oluşan ribozomlar oldukça ayrıntılı düzenlenmişlerdir. Ribozomal proteinlerin oranları hem çok yüksektir (%60) hem de çeşitleri çok fazladır. Prokaryotlarda 52, ökaryotlarda ise en az 82 farklı protein bulunmaktadır. Prokaryotik ve ökaryatik ribozomlarının büyüklük ve sayıları farklı olmakla birlikte temel yapıları benzemektedir. Ökaryotlarda 80S, prokaryotlarda ise 70S ribozomlar tanımlanmıştır PROKARYOTLAR (70 S ribozom) Büyük alt birim (50S) 23S rrna (2904 nükleotit) + 31 protein 5S rrna (120 nükleotit) Küçük alt birim (30S) 16S rrna (1541 nükleotit) + 21 protein ÖKARYOTLAR (80S ribozom) Büyük alt birim (60S) 28S rrna (4718 nükleotit) + 49 protein 5.8S rrna (120 nükleotit) Küçük alt birim (40S) 18S rrna (184 nükloetit) + 33 protein Her iki tip te bir büyük bir de küçük alt birim içermektedir. 29 S: Svedberg unitesi (10-13 sn 30 5

6 Transfer RNA Sedimantasyon katsayıları 4 S tir Hücrede bulunan en küçük nükleik asitlerdir (73-93 nükleotit). Molekülün %50-70 lik bölümü bazlar arası hidrojen köprüleri kurarak çift zincirler oluşturmaktadır. Translasyonda doğru aminoasitleri ribozomlara getirmekle görevli trna lar farklı aminoasitleri taşır. Her aminoasit (a.a) için en az bir trna molekülü görev yapar. Bazı a.a ler için iki,üç veya dört trna bulunur. Prokaryotlarda yaklaşık 60, ökaryotik hücrelerde farklı trna bulunmaktadır RNA izolasyonu ve analizi Hücrelerdeki toplam RNA, bakterilerde toplam hücre ağırlığının %6 sını, gelişmiş yapılı canlılarda ise %1 ini kapsamaktadır. Örneğin, tipik bir memeli hücresi yaklaşık g total RNA içerir. Bu miktarın; %80-85 i rrna ya (28S, 18S ve 5S rrna) aittir. Kalan %10-15 lik miktar ise düşük moleküler ağırlıklı RNA türlerini (trna, nükleusa ait küçük RNA lar) içermektedir. mrna ise total RNA nın %1-5 ini kapsayan, boyutları ve dizisi birkaç yüz bazdan birkaç kb a kadar değişen bir heterojenlik göstermektedir. Parçalanmamış ve temiz RNA izolasyonu, klonlama ve gen anlatımı çalışmalarında oldukça önemli aşamalardan biridir. Herhangi bir hücre tipinden izole edilen toplam RNA dan mrna nın izolasyonu ve bu işlemi takiben komplementer DNA (cdna) elde etmek mümkündür. Böylece istenen dokudan cdna kitaplığı oluşturulabilir ve istenen gen klonlanabilir. RNA çalışmalarının tümünde başlıca ön koşul yapısını koruyan parçalanmamış (intact) RNA nın izolasyonudur. İzolasyon sırasında en fazla karşılaşılan problem, aktivitesini uzun süre koruyan, ribonükleaz (RNaz) kontaminasyonudur. Çok az miktarlarda RNaz varlığı bile RNA nın bütün olarak eldesini engelleyebilmektedir. Bu tür sorunlardan kurtulmak için çözeltiler, cam ve plastik eşyalar özel yöntemlerle hazırlanmalı ve steril edilmelidir. 6

7 RNaz özellikle çalışanın ellerinden bulaştığı için RNA izolasyonu sırasında kesinlikle eldiven giyilmelidir. Kirli cam eşya ve yüzeylerle temas edilmişse eldivenler değiştirilmelidir. İzolasyonda kullanılacak çözeltiler RNaz ın aktivitesini yok eden dietil pirokarbonat (DEPC) ile hazırlanmalıdır. Bununla birlikte, Tris,DEPC yi inaktive ettiği için Tris içeren çözeltiler DEPC ile hazırlanmamalıdır. Çözelti hazırlanmasında kullanılan tüm kimyasalları mümkünse sadece RNA çalışmalarına ayırmak en kesin yoldur. Tartımlarda daha önce elle tutulmuş spatül gibi araçların kimyasalların içine sokulması bile RNaz kontaminasyonuna yol açtığından, bunların cam eşyalar gibi fırında steril edilmesi gerekmektedir. Cam eşyalar 180 o C de 8 saat veya 300 o C de 4 saat tutularak, ya da kloroform ile yıkanarak RNaz ın inaktivasyonu sağlanabilir. Bazı cam eşyalar, içinde %0.1 oranında çözünmüş DEPC bulunan su ile doldurularak 2 saat 37 o C de bekletilir. Daha sonra birkaç kez steril distile su ile yıkanır ve 15 dak otoklavlanır. Bu işlem DEPC nin uzaklaştırılması için gereklidir. RNA izolasyon aşamaları 1. RNA izolasyonu protokollerinin tümünde ilk aşama hücre çeperinin ve membranının parçalanmasıdır. 2. Daha sonra hücre lizatının sentrifüjlenmesi ile RNA diğer hücresel moleküllerden ayrılır. 3. RNA nın saflaştırılmasında proteinler ve ribonükleazların denatürasyonunu solvent ekstraksiyonuyla yapılır. Hücre komponentleri, fenol içeren solventlerle ayrılır. Setrifügasyonla 3 faz oluşur: -en altta organik faz (proteinler, lipitler -ortada DNA - en üstte ise RNA bulunur 4. RNA içeren sıvı faz çeşitli RNA lar alkol ve tuz ile çöktürülür: mrna 0.1 M NaCl ve % 70 etanolde; rrna 3M sodyum asetat ve % 70 etanolde; trna ise 1M NaCl ve % 66 lık soğuk etanolde çöktürülür. Yöntem Bakterilerden Total RNA izolasyonu Gram (-) bakterilerden total RNA izolasyonu Organizma : E. coli Gerekli malzemeler Protoplast tamponu, ph 8.0 Tris-HCl 15 mm Sakkaroz 0.45 M EDTA 8 mm Lizozim 50 mg/ml Lizis tamponu, ph 8.0 Tris-HCl 10 mm NaCl 10 mm Sodyum sitrat 1mM SDS % 1.5 DEPC li su DEPC 0.2 ml Distile su NaCl ile doyurulmuş DEPC li su NaCl 40 g ml E.coli kültürü xg de 4 o C de 5 dak santrifüj edilir. 2. Hücre çökeltisi 10 ml protoplast tamponu içinde çözündürülür ve 80 l lizozim (50 mg/ml) eklenerek 15 dak buz içinde tutulur. 3. Protoplastlar 5.900xg de 4 o C de 10 dak sentrifüjlenerek çöktürülür ve 0.5 ml lizis tamponunda çözündürülür l DEPC eklenerek karıştırılır ve mikrosentrifüj tüpüne aktarılır, 5 dak 37 o C de bekletilir ve daha sonra buz içinde soğutulur. 7

8 l NaCl ile doyurulmuş DEPC li su eklenerek 10 dak buz içinde tutulur dak, 4 o C de mikrosentrifüjde yüksek hızda ( dev/dak) sentrifüj edilir. 7. Üst sıvı 2 mikrosentrifüj tüpüne eşit hacimde aktarılır. Her bir tüpe 1 ml soğuk (-20 o C) saf etanol eklenir ve bir gece -20 o C de bekletilir dak yüksek hızda ( dev/dak) 4 o C de sentrifüjleme sonucu elde edilen çökelti 500 l soğuk % 70 lik etanol ile yıkanır ve havada kurutulur. 9. Çökelti 100 l DEPC li suda çözündürülür. Gram (+) bakterilerden Total RNA izolasyonu Organizma: B. subtilus Gerekli Malzemeler: Lizis tamponu, ph 7.4 Tris-HCl ph mm NaCl 100 mm EDTA 5 mm SDS % 1 Proteinaz K 100 g Fenol/kloroform/izoamil alkol 25:24:1 Kloroform/izoamil alkol 24:1 NaCl 5 M Saf etanol Etanol % 70 DNA parçalama tamponu ph 8.0 Tris-HCl ph mm MgCl 2 10 mm 2.5 mg/ml DNaz I (RNaz içermeyen) TE tamponu, ph 8.0 DEPC li su Yöntem 1.10 ml B. subtilus kültürü xg de 4 o C de 5 dak sentrifüj edilir. 2. Çökelti 0.5 ml lizis tamponunda çöktürülür, mikrosentrifüj tüpüne aktarılır ve kuru buz üzerinde dondurulur. 3. Örnek çözündürüldükten sonra 3 kez 10 ar sn mikrotip sonikatör ile 30W da köpürmeye izin vermeden sonikasyon gerçekleştirilir ve 60 dak 37 o C de bekletilir. 4. Eşit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol eklenerek karıştırılır. Daha sonra karışım oda sıcaklığında 5 dak yüksek hızda sentrifüjlenir. Üst faz yeni bir mikrosentrifüj tüpüne aktarılır. 5. Önce eşit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol ile bir kez, daha sonra eşit hacimde kloroform/izoamil alkol eklenerek ekstraksiyon yapılır. 6.Toplam 400 l üst faza 15 l 5 M NaCl eklenir ve tüp soğuk saf etanol ile dondurulup karıştırılır, -20 o C de bir gece bekletilir dak 4 o C de yüksek hızda sentrifüjleme sonrası oluşan çökelti 500 l soğuk % 70 lik etanol ile yıkanır ve havada kurutulur. 8. Çökelti 95 l DNA parçalama tamponunda çözdürüldükten sonra ve 4 l DNaz I eklenir ve 60 dak 37 o C de bekletilir. 9. Eşit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol eklenerek ekstraksiyon yapılır. Üst faz yeni tüpe alınır. Alt faza 100 l TE eklendikten sonra 5 dak oda sıcaklığında sentrifüjleme yapılır. Üst faz bir önceki üst faz ile birleştirilir. 10. Bu sıvı, kloroform/izoamil alkol ile ektrakte edilir. Yeni üst faza 10 l 5M NaCl ve 600 l soğuk saf etanol eklenerek bir gece 20 o C de bekletilir dak 4 o C de yüksek devirde sentrifüjleme sonucu elde edilen çökelti 500 l soğuk % 70 lik etanol ile yıkanarak havada kurutulur. 100 l DEPC li suda çözündürülür. RNA nın analizi Spektral yöntemler RNA nın konsantrasyonunun saptanmasında kullanılan spektrofotometrik yöntemler DNA nın spektral analizi ile tamamen aynıdır Elektroforetik yöntemler RNA nın analizinde formaldehit-agaroz jeli kullanılır. Bu jelde yükleme hacmi arttırılabilir Ayrıca çözünme gücü daha yüksektir. RNA nın doğrusal biçimde kalmasını sağlar RNA, DNA agaroz jellerinde olduğu gibi etidium bromürle boyanır. 8

9 Parçalanmış RNA Parçalanmamış toplam RNA jel üzerinde oldukça belirgin 28S (veya 23S) ve 18S (veya 16S rrna bantlarına sahiptir. 28S rrna bantı 18S rrna bantının yaklaşık 2 katı kadar daha yoğun bir parlaklık oluşturur. Bu 2:1 oranı toplam RNA nın parçalanmadan elde edildiğinin en kesin göstergesidir. Kısmen parçalanmış RNA ise bulutumsu yaygın bir görüntü verir. 9