INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus

Transkript

1 INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus ANAHTAR-KODU: FRI INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus v p 1/8 Türkçe Tarafından üretildi: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belgium Tel BTW BE RPR Gent Tarafından dağıtılan: Fujirebio Europe N.V. Tel Fax customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel Fax germany@fujirebio-europe.com Fujirebio France SARL Tel Fax france@fujirebio-europe.com 0459 Fujirebio Italia S.r.l. Tel Fax italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel Fax spain@fujirebio-europe.com "Vurgulanan Not değişiklikleri" Diğer Dillere bakınız / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: EUROPE GR IS LT RO SK TR LI MT EE non-europe US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

2 80616 INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus / v1 / ANAHTAR KODU: FRI19834 p 2/8 İÇİNDEKİLER Kullanım amacı... 2 Test prensibi... 3 Reaktifler... 3 Açıklama, kullanım için hazırlanması ve önerilen depolama koşulları... 3 Gerekli ama sağlanmayan malzemeler... 4 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 4 Örnek toplama,hazırlama ve saklama... 4 DNA ekstraksiyon... 4 PCR karışım hazırlanması... 4 PCR döngüsü... 4 Uyarılar ve önlemler... 5 Test prosedürü... 5 Sonuçlar... 6 Görüntüleme... 6 Doğrulama... 7 Prosedür sınırlamaları... 7 Test performans... 7 HLA-B Multiplex Primer Çözeltisinin test performansı... 7 Uygulama aralığı... 7 Kesinlik... 8 HLA-Bw4 Primer Çözeltisinin test performansı... 8 Uygulama aralığı... 8 Kesinlik... 8 Ticari markalar... 8 Kullanılan semboller Üretici In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Parti kodu Katalog numarası Tarafından Kullanılan Kullanım amacı Kullanım Talimatlarına başvurun Sıcaklık sınırlaması Amplifikasyon Tampon Birincil Solüsyonu LiPA Taq INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus kit, in vitro kullanım için, insan lökosit antijeni (HLA) B lokusunun 2,3 ve 4.ekzonunun HLA-B multiplex primerler kullanılarak yapılan ve insan lökosit antijeni (HLA) Bw4 allellerinin ikinci ekzonunun HLA-Bw4 primerleri kullanılarak yapılan nükleik asit amplifikasyonuna yöneliktir. Söz konusu reaksiyon, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) vasıtasıyla gerçekleştirilir.

3 80616 INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus / v1 / ANAHTAR KODU: FRI19834 p 3/8 Test prensibi INNO-LiPA HLA-B Multiplex allel grup seviyesinde HLA-B allellerini tiplemek için tasarlanmış INNO-LiPA HLA-B Update stripleri ile beraber kullanılır. Ancak, bazı belirsizlikler devam etmektedir. En sık belirsizlikleri gidermek için, örneğin; Bw4/Bw6 allellerini içeren belirsizlikler, HLA-Bw4 amplifikasyonu eklenmiştir. PCR da amplifiye edilecek DNA örnekleri deoksinükleosit 5'-trifosfatlar (dntp), biyotinile primerler, termostabil DNA polimeraz ile bir tampon içeren bir reaktif karışımı fazlası ile muamele edilir. HLA-B Multiplex primerleri HLA-B lokusunun 2, 3 ve 4. Ekzonları amplifiye eder, spesifik HLA-Bw4 primerleri bütün Bw4 allellerinin ikinci ekzonunu ve ek olarak B*4411, B*4703, ve B*5708 allellerini amplifiye eder. Hedef dizileri primerlere maruz bırakmak için ısıtılmak suretiyle DNA sarmalının iki ipi birbirinden ayrılır ( denatürasyon ). Bu primerler, hedef sekansı kuşatan bölgeleri tamamlar. Bu nedenle, belirli bir sıcaklığa kadar soğutulduktan sonra, primerler, hedef bölgesine (tavlama) bağlanacaktır. Başka bir özgün sıcaklıkta, termostabil DNA polimeraz, fazla dntpleri kullanarak bağlanmış primerleri hedef şablon boyunca uzatır (uzama). Bu şekilde, bir döngüden sonra hedef dizinin iki tam biyotinile kopyası üretilmiş olur. Bir çok döngüden sonra, hedef dizinin büyük miktarda biyotinile kopyası elde edilir. Reaktifler Açıklama, kullanım için hazırlanması ve önerilen depolama koşulları - Reaktifler, özellikle amplifiye edilmiş DNA ürünleri, herhangi kontamine DNA kaynağından izole edilmiş şekilde saklanmalıdır /-25 C de tutulursa, açılmış veya açılmamış, orjinal şişelerde saklanan, reaktifler kitin son kullanma tarihine kadar stabildir. Ancak, ilk kullanımdan sonra reaktiflerin (LiPA-Taq hariç) porsiyonlanması ve sonra -15/-25 C de saklanması tavsiye edilir. - Kit reaktiflerin fiziksel görünümündeki değişiklikler istikrarsızlık veya bozulma belirtisine neden olabilir. Verilen Reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Amplifikasyon Tampon HLA-B Multiplex Primer Solüsyonu HLA-Bw4 Primer Solüsyonu 1x 0,3 ml Tüm dntpler ve koruyucu olarak %0.05 NaN 3 içerir. Kullanmadan önce tamamen çözün, C ye getirin. 1x 0,3 ml Biotinlenmiş primerler, MgCl 2,Tris ve koruyucu olarak %0.05 NaN 3 içerir. Kullanımdan önce MgCl 2 tamamen çözülmesi için tam ısınmaya izin verin ve C ye getirin. 1x 0,07 ml Biotinlenmiş primerler, MgCl 2, koruyucu olarak % 0.05 NaN 3 içerir. Kullanımdan önce MgCl 2 tam çözünmesi için tam ısınmaya izin verin ve C ye getirin. LiPA Taq 1x 0,035 ml Taq DNA polimeraz (2 U/µL) ve koruyucu olarak 0.05% NaN 3 içerir. Kullanmaya başlamadan önce - 15/-25 C saklayın.

4 80616 INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus / v1 / ANAHTAR KODU: FRI19834 p 4/8 Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - DNA ekstraksiyonu için materyaller. - Tek kullanımlık eldiven. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Steril mikrotüpler. - Mikrotüp rakları. - Microtüp santrifüjü. - DNA termal döngü ve ekipmanları. - Dağıtım için ayarlanabilir pipetler 1-20 µl, µl ve µl. - Otoklavlanmış distile su. Güvenlik ve Çevre Koşulları Lütfen Material Safety Data Sheet (SDS) ve potansiyel tehlikeli komponentler içeren işaretli ürün bilgilerini inceleyiniz. En son SDS versiyonu website da mevcuttur. - Sadece yeterince eğitimli personel test prosedürünü yapmak için izinli olmalıdır. - Amplifikasyon Tamponu, Primer Çözeltisi HLA-Bw4, Primer Çözeltisi HLA-B ve LiPA Taq koruyucu olarak sodyum azid içerir. Toksik gaz oluşumunu engellemek için sodyum asitli asitler ile temasından kaçının. Tesisatın içerisinde patlayıcı kurşun veya bakır azid oluşumunu önlemek için, sodyum azid içeren çözeltilerin dökülmesinin ardından kalıntıları gidermek için üzerinden su akıtın. - Numuneler her zaman potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. - Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: Tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar işlenirken eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atık, kurumun atık bertaraf kurallarına göre ele alınmalıdır. Tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnek toplama,hazırlama ve saklama DNA ekstraksiyon Genel olarak kullanılan salting-out DNA ekstraksiyon yöntemi veya spin kolonları temelli yöntemler asit sitrat dekstroz (ACD) veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile antikoagüle edilmiş tam kan örneğinden genomik DNA hazırlamak için kullanılabilir. DNA örneklerini -15/-25 C de saklayın. Ekstrakte edilmiş DNA 0.02 µg/µl ve 1.5 µg/µl arasında konsantrasyona sahip olmalıdır. Saflığı (A260nm/A280nm) 1.5 Yüksek saflıkta DNA elde edildiği durumlarda PCR karışımına alt sınırına yakın DNA Konsantrasyonu kullanın. NOT: Sağlanmayan reaktifler. PCR karışım hazırlanması Her bir bileşen eklenmiş ve doğru miktarda sağlanmalıdır. Çok fazla veya çok az örnek veya reaktif kullanımı özgün olmayan amplifikasyona hatta hiç amplifikasyon olmamasına neden olabilir. PCR döngüsü INNO-LiPA HLA-B Multiplex için doğru sıcaklık profili seçilmelidir.

5 80616 INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus / v1 / ANAHTAR KODU: FRI19834 p 5/8 Uyarılar ve önlemler - DNA kontaminasyonundan kaçınmak için, pre-ve post-amplifikasyon adımları arasında maksimum fiziksel ayrım önerilir: ayrı odalarda, ayrı pipetler ve diğer laboratuvar malzemeleri, ayrı laboratuvar önlük ve eldiveni (ve onların stoğu) iyi laboratuar uygulamaları için alınabilecek minimum önlemlerdir. Kit herhangi bir kontamine edici DNA kaynağından özellikle amplifiye DNA ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. Reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçınınız. - Post amplifikasyon odasından pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüşten kaçının. - Amplifikasyon işlemi için otoklavlanmış tüpler ve pipet uçları kullanılmalıdır. Pamuk tıpalı pipet uçları önerilir. Herbir porsiyonlanmış örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. - Amplifikasyon işlemleri için reaktifler amplifiye DNA 'sından arındırılmış bir odada ele alınmalıdır. Otoklavlanmış tüp ve pipet uçları (tercihen pamuk takılı) kullanılmalıdır. - Çözdükten sonra Amplifikasyon tamponu ve Primer Çözeltilerini vorteksleyin ve bütün reaktifleri asağıya doğru döndürün, özellikle LİPA-Taq. Test prosedürü - HLA-B allelerinin 2,3 ve 4. ekzonlarının ve HLA-Bw4 allelerinin 2. ekzonunun amplifikasyon için bu protokol MicroAmp PCR tüpleri (0.2 ml) ve GeneAmp PCR System 9700 termal cyclerlar ve LiPA-Taq kullanarak en iyi amplifikasyon için tasarlanmıştır. Bu protokol çoğu ticari termal cyclerlar için kullanılabilir ama cyclerın üreticisi tarafından yapılacak bazı modifikasyonları gerektirebilir. - Kullanımdan önce, bu protokolün laboratuvarınızda kullanımda olan thermal cycler ile uyumlu olup olmadığını belirleyin. Termal döngünün kullanımdan önce kalibre edildiğinden emin olun. - Sonucu etkileyebilecek durumlarada, Non-spesifik amplifikasyon ve primer dimer oluşumunu önlemek için gerekli önlemleri alın. Buz üzerinde ve gecikmeden pipetleme adımları uygulayın. Örnekleri yerleştirmeden önce termal döngü ısıtma bloğunu (96 C) önceden ısıtın, ve hemen ardından döngü işlemini başlatın. - INNO-LİPA HLA-BW4 amplifikasyonu yalnızca örnek en az bir BW4 alleli içeriyorsa kullanılmalıdır; örnekte sadece Bw4 olmayan alleller varsa, zayıf spesifik olmayan amplifikasyon oluşabilir. 1. Her genomik DNA yı 0.02 ve 1.5 µg/µl konsantrasyonları aralığında TE tampon ile seyreltin. (N) olarak hazırlanacak şişelerin sayısını belirleyin: N = DNA örneği sayısı + 1 (Negatif kontrol; DNA sız) + 1. Pamuk-filtreli pipet uçları kullanarak otoklavlanmış 1.5 ml lik tüpte bir master mix hazırlayın: HLA-B Multiplex amplifikasyonu için: (N x µl) otoklavlanmış distile su + (N x 10 µl) Amplifikasyon Tamponu (sarı kapaklı) + (N x 10 µl) HLA-B multiplex Birincil Çözeltisi (yeşil kapaklı) + (N x 1.25 µl) LiPA-Taq (N x 2.5 U) (lila kapaklı)

6 80616 INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus / v1 / ANAHTAR KODU: FRI19834 p 6/8 HLA-Bw4 amplifikasyonu için: (N x µl) otoklavlanmış distile su + (N x 10 µl) Amplifikasyon Tamponu (sarı kapaklı) + (N x 10 µl) HLA-Bw4 Primer Çözeltisi (kırmızı kapaklı) + (N x µl) LiPA-Taq (N x 1.25 U) (lila kapaklı) Bu amplifikasyon karışımının toplam hacmi şimdi (N x 45 µl) dir. Hafifçe vorteksleyin ve 45 µl olmak üzere master karışımını (N-1) otoklavlanmış amplifikasyon tüplerine porsiyonlayın μl ( μg) genomik DNA hazırlığı pipetleyin. Negatif kontrol tüpüne 5 µl distile su ( DNA sız ) koyun. NOT: Vortekslemeyin veya karıştırmayın. Amplifikasyon karışımının tüpün tabanında olduğunu kontrol edin. 3. Örnekleri önceden ısıtılmış ve kalibrasyonu yapılmış termal bloğa yerleştirin (termal döngü üreticisi tarafından sağlanan talimatlara bakın). HLA-B Multiplex veya HLA-Bw4 amplifikasyonu için tasarlanmış amplifikasyon programını başlatın. 4. HLA-B Multiplex Plus amplifikasyon profili: Adım Sıcaklık Zaman ± 0.75 C 1 denatüre 96 C 5 dk 2 denatüre 96 C 30 sn. Döngüyü tekrarla 3 Birincil sertleşme 64 C 50 sn. 2-4 adımları 4 Birincil uzama 72 C 50 sn. 5 kez 5 denatüre 96 C 30 sn. Döngüyü tekrarla 6 Birincil sertleşme 62 C 50 sn. 5-7 adımları 7 Birincil uzama 72 C 50 sn. 5 kez 8 denatüre 96 C 30 sn. Döngüyü tekrarla 9 Birincil sertleşme 60 C 50 sn adımları 10 Birincil uzama 72 C 50 sn. 10 kez 11 denatüre 96 C 30 sn. Döngüyü tekrarla adımları 15 kez 12 Birincil sertleşme 55 C 50 sn. 13 Birincil uzama 72 C 50 sn. 14 uzatma 72 C 10 dak. NOT: Aynı amplifikasyon profili bütün INNO-LiPA HLA sınıf I ürünleri ve INNO-LiPA HLA-DRB1 Plus için kullanılır. 5. INNO-LiPA HLA-B Multiplex primerleri ile amplifikasyon sonrası, INNO-LiPA HLA-B Update Plus strips 1 ve 2 ile hemen örnekleri kullanın veya -15/-25 C de saklayın. INNO-LiPA HLA-Bw4 primerleri ile amplifikasyon sonrası, INNO-LiPA HLA-B Update Plus strip 1 ile hemen örnekleri kullanın veya -15/-25 C de saklayın. NOT: Amplifiye edilmiş DNA ları kullanılmamış amplifikasyon reaktifleri ile beraber saklamayın. Sonuçlar Görüntüleme - Amplikonların varlığı %2 agaroz jel üzerinde kontrol edilebilir. - Oluk başına amplifiye edilen üründen 10 µl yükleyin. HLA-B Multiplex amplifikasyonu 555 bp (ekzon 2), 436 bp (ekzon 3) and 323 bp (ekzon 4) olmak üzere üç ayrı boyda amplikon üretir. HLA-Bw4 amplifikasyonu bir amplikon üretir; 354 bp (ekzon 2).

7 80616 INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus / v1 / ANAHTAR KODU: FRI19834 p 7/8 - In-house gözlemler göstermiştir ki; 10 μl amplifiye edilmiş ürün % 2'lik agaroz jel üzerinde denetlendikten sonra bantlar görünür ise, LIPA testi ile yorumlanabilir sonuç elde edilebilir. Doğrulama - Her amplifikasyon reaksiyonuna en az bir pozitif ve bir negatif kontrol dahil edin. Herhangi bir yeni laboratuvar prosedüründe test prosedürünün doğru bir şekilde uygulanabileceğine dair yüksek derecede güven gelişene kadar pozitif ve negatif kontrolün varlığı dikkate alınmalıdır. Ek bir pozitif kontrolün varlığına ihtiyaç duyuluyorsa, bilinen bir pozitif örnek kullanın. - Jelde negatif bir kontrol için pozitif bir bant elde edilirse çalışma dışlanmalı ve bütün test prosedürü tekrar edilmelidir. Prosedür sınırlamaları - Bu ürünün kullanımı amplifikasyon tekniklerinde iyi eğitimli personelle sınırlandırılmalıdır. - Polimeraz inhibisyonu (ör. heparin,hemoglobin) testin tamamen başarısız olması için sebep olabilir. - Tek kullanımlık eldivenden gelebilecek pudra veya sodyum hipokloritin amplifikasyon üzerinde inhibe edici etkisi vardır. - DNA örneklerinin tekrarlanan dondurulup/çözülme işlemi daha az etkili bir amplifikasyona sebep olabilir. - Primer bağlanma bölgesindeki dizilim bütün alleller için bilinmemektedir. Primer bölgesinde yanlış eşleşme riski çok düşük bir ihtimaldir. Primer başarısızlığı hiç gözlenmemiştir ve tüm grupları kapsayan alleller yüksek miktarda test edilmiştir. Buna rağmen, homozigot sonuçlarda allelik dropout durumu göz önüne alınmalıdır. - İyi laboratuvar uygulamaları ve önceden belirtilen prosedürlerin dikkatli uygulanması spesifik amplifikasyona olanak sağlar. Test performans HLA-B Multiplex Primer Çözeltisinin test performansı INNO-LiPA HLA-B Multiplex testinin performansı 4 Avrupa doku tipleme bankasının rutin tipleme örnekleri ile değerlendirilmiştir. Toplamda 347 örnek analiz edilmiştir. DNA, taze veya dondurulmuş EDTA antikoagülanlı veya sitrat lı kandan ekstrakte edilmiştir. DNA ekstraksiyon yöntemleri salting out, QIAamp 96 DNA blood kit (Qiagen),Genomic DNA Purification kit (Promega) vepuregene (Gentra Systems) dahilinde. Taze veya dondurulmuş GeneAmp PCR System PE-9600 veya PE-9700 thermal cycler kullanılarak amplifiye edilmiştir. Amplikonlar striplere eklenmeden önce 2-8 C veya -15/-25 C de saklanmıştır. Uygulama aralığı 0.01 μg/μl - 2 μg/μl arasında değişen 3 DNA örneğinin dilüsyon serilerinin iç değerlendirmesi esnasında elde edilen sonuçlar, minumum 0.1 µg/µl konsantrasyona sahip DNA kullanımını önerdi. Harici performans değerlendirmesi 20 ng/µl ve 1500 ng/µl arasında bir konsantrasyona ve bir saflığa sahip 347 DNA örneği içerdi (A260nm/A280nm) Bu DNA amplifikasyon öncesi 20 ng/μl ve 250 ng/μl arasında bir konsantrasyona dilüe edilmiştir. Bir merkezden iki örnek için yeniden test etme gerekse de amplifikasyonda başarısızlık yaşanmamıştır.

8 80616 INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus / v1 / ANAHTAR KODU: FRI19834 p 8/8 Kesinlik İç veri: 2 örnek 4 er kere olmak üzere 2 farklı çalışmada 2 farklı kullanıcı tarafından amplifiye edilmiştir. Bütün örnekler agaroz jel üzerinde görünürdür. Prob reaktivitesi bütün durumlarda karşılaştırılabilirdir. Sonuçların yorumlanması bütün vakalarda aynıdır. HLA-Bw4 Primer Çözeltisinin test performansı INNO-LiPA HLA-B Multiplex Plus ın HLA-Bw4 Primer Çözeltisinin test performansı üreticide ve iki Belçika doku tipleme laboratuvarında değerlendirilmiştir. Toplamda 82 anonim örnek analiz edilmiştir (50 örnek harici olarak; 32 in-house). DNA önceden taze (30 örnekte antikoagülan EDTA, 4 örnek bilinmiyor) veya dondurulmuş tam kandan (20 örnekte antikoagülan ACD, 25 örnekte EDTA;1 örnek bilinmiyor) ekstrakte edilmiştir. İki örnek için ne antikoagülan ne de saklama koşulları bilinmemektedir. Kullanılan ekstraksiyon yöntemleri Puregene Blood Kit (Gentra Systems), QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) veya in-house salting out metoduydu. DNA -20 C de saklanmıştır. DNA nın saflığı (A260/A280) 1 ile 2.9 arasında ayaralanmıştır (76 örnek). 6 numune için saflık bilinmiyordu; diğer örneklerde iyi kalitede sonuçlar veren yöntem ile ekstrakte edildiklerinden analize kabul edilmişlerdir. Ekstraksiyondan sonraki konsantrasyon μg/μl aralığındadır. 25 DNA örneği amplifikasyondan önce 0.05 μg/μl konsantrasyonuna dilüe edilmiştir. 57 örnek için DNA amplifikasyondan önce dilüe edilmemiştir (konsantrasyon aralığı µg/µl). GeneAmp PCR System PE veya PE-9700 termal cyclerları kullanılmıştır. 78 Örneğin amplifikasyonu ilk denemede başarılı olmuştur. Bir merkezde test edilen 4 örnekten bir örnek için jel üzerindeki negatif (3 örnek) veya bulaşmış (1 örnek) sonuçların olması sebebiyle tekrar gerekmiştir. 3 örnek ilk denemede başarılı sonuç vermiş ama birinin amplifikasyonu tekrar başarısızlık ile sonuçlanmıştır. Bu örneğin üreticideki ilk denemede üçlü olarak başarı ile sonuçlanmıştır. Uygulama aralığı 81/82 numuneler için ,037 mg / ml aralığında - İç ve dış değerlendirme çıkarılan DNA 5 ul kullanarak başarılı amplifikasyon gösterdi. Kesinlik Testler arası, test içi ve kullanıcılar arası tekrarlanabilirlik üretici tarafıdan değerlendirilmiştir. Bir örnek, ikişer kere olmak üzere, 3 farklı döngüler ve proses kullanarak, her cycler için 2 çalışmada amplifiye edilmiştir. Bu protokol iki farklı kullanıcı tarafından ikişer kere tekrar edilmiştir. Kayde değer bir çeşitlilik gözlenmemiştir. Lotlar arası varyasyonlar üretici tarafından bir örneği üçer kere olmak üzere üç farklı primer grubu kullanılarak değerlendirilmiştir. Bütün PCR ürünleri %2 lik agaroz jel üzerinde kıyaslanabilir bir yoğunluk göstermişlerdir. Ticari markalar - LiPA Benelux da tescili ticari markadır ve dünyanın geri kalanında bir ticari markadır (ABD dahil). - INNO-LiPA, dünya çapında bir ticari markadır örneğin ABD de. - GeneAmp ve MicroAmp Applied Biosystems, LLC tescili ticari markalarıdır.