Rekombinant DNA Teknolojisi-II

Transkript

1 BYM613 Genetik MühendisliM hendisliği Rekombinant DNA Teknolojisi-II Hacettepe Üniversitesi Biyomühendislik BölümüB Güz G z DönemiD Dr. Eda Çelik-AKDUR edacelik@hacettepe.edu.tr İçerik (2 hafta) Rekombinant DNA teknolojisi Tanımlar ve temel basamakları Restriksiyon ve Ligaz Enzimleri Vektörler Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Klonlanmış DNA analizi DNA Sekans Analizi Restriksiyon Analizi Rekombinant teknolojinin uygulamaları Gen Kütüphaneleri 2 1

2 # Başlık Bölgesel Yönlendirilmiş Mutasyon (Site-Directed Mutagenesis) Homolog Rekombinasyon Yöntemi ile gen aktarımı DNA modifying enzymes/dna binding proteins Transpozonların DNA manipülasyonlarında kullanımı P1 transdüksiyon yöntemi ile gen silinmesi Southern Blotting Northern Blotting DNA mikrodizinleme (Microarray) Kimyasal uygulama ve elektroporasyon ile bakterilerde transformasyon, Transformasyon için Yetkin Hücrelerin (Bakteri) Hazırlanması DNA saflaştırma Total RNA izolasyonu PCR optimizasyonu ve PCR çeşitleri DNA saklama koşulları ve miktar belirleme Moleküler Tanımlama DNA tamir mekanizmaları Floresansla etkinleşmiş hücre tasnifleyicisi (FACS) PCR için oligonükleotid (primer) tasarımı DNA jel elektroforezi, RE ile kesme Derse hiç gelmedi??? Örnek Ref (lar)/ Notlar Burası için web sayfasında bilgi olacak Sunacak Kişi Dicle Ebru Zeynep Handan Olgu Gökçe Bakiye Nurşen Hande Araz Merve Göksu İlkay Gamze Burcu S Gökçe Kaynak ule Burcu Güven Cem 13 Kasım m için i in Sunum Konularınız * Max 8 dk, 10 slide * Rapor yok * Slide lar bana , 12 Kasım, 17:00 SON. * Referanslara dikkat, en sonda değil, slide içinde! * Final için 3 sınav sorusu ve cevabı da . * 2012 basımı 1 makaleden örnek. * Sınıf sizi değerlendirecek, soru soracak. * 1. Ara sınav yerine sayılacak 3 Moleküler ler Klonlama (Gen Klonlama) ekildeki DNA parçası bir gen ise, gen klonlama Seçilen koloniler çoğaltılır ve gerçek rekombinant klonlar mı diye analiz edilir. 4 2

3 5 6 3

4 Control 7 Dikkat: Gen isimleri, organizmaların isimleri ve RE lerinin organizmayı tanımlayan kısımları italik yazılır!! 8 4

5 Determine production target Recombinant microorganism development Structural analysis of the purified r-product Medium design and optimization of bioprocess design parameters Akım eması: Doktora çalışmalarımda izlediğim yol. Diğer sonuçlar, ilerleyen derslerde Pilot-scale production Stoichiometric and kinetic modeling of the bioprocess 9 Restriksiyon Analizi Klonlardan saflaştırılan plazmid, rekombinant plazmidin oluşturulması aşamasında kullanılan RE ile tekrar kesilip, istenilen DNA parçasını içerip içermediği kontrol edilebilir. Fig. Pearson Education Inc.,

6 Fig. Pearson Education Inc., Sanger Metodu ile DNA Sekans Analizi 1977: Sanger DNA sekans tespiti için metot geliştirdi. Sanger metodu halen kullanılan DNA sekans analizlerinin temelidir. Dideoksinükleotit (ddntp) lerin zincir sonlandırma özelliğine dayanır. 12 Fig. Pearson Education Inc., 2009 Ref: Alberts et al., Molecular Biology of the Cell,

7 Figure Polyacrylamide gel electrophoresis is used to visualize the results of the sequencing reaction 14 7

8 Günümüzde floresan ddntp ler kullanılıyor. Figure Floresan boyalar sayesinde otomatik DNA sekanslama 16 8

9 4 reaksiyon aynı aynı tüpte gerç gerçekleş ekleşebiliyor, 1 primer ile ~900 bç bç okunabiliyor 17 * Ape * BioEdit - DNAStar gibi programlar ile sekanslar karşılaştırılır. sequence alignment

10 NCBI BLAST

11 21 NCBI Databases 22 11

12

13

14 Genomik Kütüphaneler Bir genomik kütüphane genomdaki tüm dizilerden en az bir kopya içerir. DNA izolasyonu RE ile muamele Uygun vektörün seçilmesi Fig. modified from: Pierce, B. Genetics: A Conceptual Approach. 27 Genomik Kütüphanelerin Boyutu Örneğin xx genomu kapsayan genomik kütüphane boyu ~10 9 koloni ise, transformasyon sonucu elde edilmesi gereken koloni sayısı 10 9 dur. Bu sayıyı elde etmek için, transformasyon tekniği ve kompetant hücrelerin durumu önem taşır

15 cdna Kütüphaneleri mrna üzerinden reverse transcriptase ile cdna sentezi Spesifik bir anda transcripsiyonu gerçekleşen genleri temsil eder. Sentezlenen cdna nın her iki ucuna bir RE tanıma dizisini içeren kısa çift zincirli DNA takılıp klonlanması cdna kütüphaneleri hücre/doku spesifik olarak hazırlanır 29 Fig. Pearson Education Inc.,

16 Kütüphanelerin taranması için kullanılan yöntemlerden bir tanesi Plak Hibridizasyonu Yöntemidir. Fig. Pearson Education Inc.,