DİSFONKSİYONEL HDL. Prof. Dr. Necat YILMAZ. XXVII. ULUSAL BIYOKIMYA KONGRESI 5 Kasım 2015 ANTALYA

Transkript

1 DİSFONKSİYONEL HDL Prof. Dr. Necat YILMAZ XXVII. ULUSAL BIYOKIMYA KONGRESI 5 Kasım 2015 ANTALYA

2 Tüm Zamanların En Etkili 100 Makalesi Science Citation Index (SCI), 50 yıl önce Eugene Garfield tarafından ilk kez yayınlaşmış ve günümüzün en yaygın kullanılan bilim atıf indeksini haline gelmiştir. Bu yıl dönümünde, Nature dergisi SCI dahilindeki 1900 den beri en çok atıf almış ilk 100 makalenin bir analizini yayınladı. van Noorden, R., Maher, B., & Nuzzo, R. (2014). The top 100 papers. Nature 514, Sonuçlar gerçekten şaşırtıcıdır. Sizce en çok atıf alan yayın ne olabilir?

3 1900 Yılından Bugüne En Çok Atıf Alan Makale Listenin başında, 1951 yılında basılan ve bir solüsyon içerisinde bulunan protein miktarının ölçümünü anlatan bir makale bulunmaktadır kere atıf alan bu makale Biyokimyacı Oliver Lowry ye aittir. Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., & Randall, R.J. (1951). Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193, Lowry metoduna benzer şekilde, ilk on sıradaki makalelerin sekizi, hatta listedeki kayıtların çoğu, laboratuvar metotlarını ve uygulamalarını tarif etmektedir.

4 Biyokimyanın Sağlık Alanında Yeri Bilim ve tıp alanında hiçbir büyük ilerleme, araştırmaları mümkün kılacak laboratuvar teknikleri olmadan hayata geçirilemez. Kresge, N., Simoni, R.D., & Hill, R.L. (2005). The Most Highly Cited Paper in Publishing History: Protein Determination by Oliver H. Lowry. J. Biol. Chem. 280, e25 e25. Benzer biçimde, tanısal laboratuvar testlerinin, klinik tanı ve tedavi yönetimi süreçlerine katkısı tartışılmazdır. Ne var ki, laboratuvarlarda üretilen bilgilerin klinik kararları yönlendirmesine, hatta bazen onların yerine geçmesine rağmen, biyokimya bilimi sağlık alanında hak ettiği takdiri bulamamaktadır. Bunun bir yansıması olarak, in vitro tanısal testlerin dünya çapında toplam sağlık harcamalarının en fazla %2 sini oluşturduğu, ama tıbbi kararların %70 ine etkisi olduğu görülmektedir.

5 Yeni HDL Tanımları: HDL Fonksiyonelliği Laboratuvar testlerinin önemi ve bilimin ilerlemesi için biyokimya alanında ilerlemenin gerekliliği, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL) çalışmaları ile bir kez daha onaylanmıştır. Düne kadar atheroskleroz riskini tahmin için HDL içerisindeki kolesterolün plazmadaki miktarına bakılırken (HDL-C, mg/dl veya mmol/l), artık bu değerin tek başına anlamlı olmadığı anlaşılmış, literatüre HDL disfonksiyonu adı altında hastalıkların risk hesaplamasında kullanılan yeni bir kavram girmiştir.

6 Yeni HDL Tanımları Normal HDL Disfonksiyonel HDL HDL disfonksiyon HDL kusurlu Sağlıklı HDL Koroner damar hastalığı HDL Kronik böbrek hastalığı HDL Pro-aterojenik HDL

7 HDL ve Kalp Hastalıkları Nüfus çalışmaları yüksek HDL seviyelerine sahip olanların daha düşük kalp hastalığı riski olduğunu göstermekteyse de, kalp krizi geçirmiş bireylerin yarısının sağlıklı kolesterol değerlerine sahip olduğu bir gerçektir. The Cooperative Lipoprotein Phenotyping Study, the Framingham Heart Study, vs. Öte yandan, plazma lesitin kolesterol açiltransferaz (LCAT) eksikliği veya Tangier Hastalığı olan hastalarda, plazma HDL-C seviyesi çok düşük, hatta sıfıra yakın olmasına rağmen, kalp hastalığı riskinde artış görülmemektedir. Demek ki, HDL-C seviyesinin ölçümü, HDL fonksiyonu ve HDL-bileşimi açısından bilgilendirici olmaktan uzaktır ve geçmişte yapılmış araştırmalar ile çelişki yaratan ana unsur budur.

8 Lipoprotein Yapısına Yakından Bir Bakış Lipoproteini oluşturan protein ve lipitlerin suyu seven (hidrofilik) kısımları lipoproteinin dış yüzeyini kaplarken, suyu sevmeyen (hidrofobik), yani yağlı kısımları onun iç kısmında gömülüdürler. Bu yüzden plazma lipoproteinlerinin en dış tabakasında bulunan lipid türleri polar lipitler olarak nitelendirilirler. Polar lipitler arasında başlıca sfingomiyelin türleri, fosfolipitler ve kolesterol gelir, bu moleküllerin her birinin bir ucu sulu ortamda olmaya daha müsaittir. Lipoproteinlerin ortasında ise başlıca, nötral lipitler tabir edilen, kolesteril esterleri ve trigliseritler bulunur

9 HDL Çok Fonksiyonlu Bir Gemi Olarak Düşünülebilir

10 Plasma Lipoproteinleri Suda çözünmeyen bileşikler kanda sulu ortamda nasıl taşınabilmektedir? Kanda lipitlerin taşınmasına yarayan lipoproteinler, temelde trigliserit ve kolesteril esterlerden meydana gelmiş yağ damlacıklarıdır. Bunlar kendilerini saran fosfolipit tabakası ve apolipoproteinler tarafından "paketlenerek" stabilize olurlar. Lipoproteinler, taşıyıcı özelliklerinin yanı sıra, lipit metabolizmasında yer alan çeşitli enzimlerin, taşınan lipitleri birbirine dönüştürdüğü kimyasal reaksiyon platformları olarak da işlev görürler. Örneğin, LCAT enzimi dış yüzeyde bulunan bir kolesterolle bir fosfolipidi birleştirip lipoproteinin iç kısmında yer almayı tercih edecek bir kolesteril ester molekülü oluşturur.

11 Plasma Lipoproteinleri İç kısmında hemen hiç nötral lipid bulundurmayan boş lipoproteinler bir madeni para gibi yuvarlak ve yassıdırlar; içleri nötral lipit dolu olan lipoproteinler ise küreseldirler. Lipoproteinler büyüyebilir veya küçülebilir, onlara yeni apolipoproteinler eklenebilir veya eksilebilir. Bu süreçler yüzünden lipoproteinlerin boyutları, biçimleri ve içerikleri sürekli değişir. Örneğin yeni sentezlenen HDL, diskoid şeklindedir; apo A1, apo A2, lesitin ve serbest kolesterol içerir. Dolaşıma giren HDL, yapısındaki kolesteril esterlerinin artmasıyla küre şeklinde olgun HDL ye dönüşür.

12 Ana Yük Kolesterol Kolesterol, bir sterol, yani bir steroid ve alkol birleşimidir. İlk defa 1754'te safra taşlarında kolesterol bulunduğu için bu chole- (safra) ve steros (katı) sözcükleri ile kimyadaki -ol ekinden türetilmiştir. Vücuttaki kolesterolün çoğu vücut tarafından sentezlenir. Günlük üretimin %20-25'i karaciğerde gerçekleşir. Ayrıca, ince bağırsak, adrenal bezleri ve üreme organlarındaki sentezlenme miktarı diğer dokulara kıyasla daha yüksektir.

13 LCAT, Kargo Gemisinin Yükü Konteynerleri Üretir HDL konteyner gemisinin çatısını oluşturan apolipoprotein A-I (apo A1), karaciğerde üretilir. Bu lipoprotein karaciğerde fosfolipidler eşliğinde bileşikler olarak sentezlendiğinde madenî para gibi yassı bir görünümleri olur. Bu yeni oluşmuş tanecikler yakınından geçtikleri hücrelerin membranlarından kolesterol molekülleri absorblayabilirler. Plazmada bulunan LCAT adlı enzim bu kolesterolü kolesteril estere dönüştürür. HDL, dolaşım sırasında diğer lipoproteinlerden de kolesteril ester alır. Kolesteril esterler, kolesterolden daha hidrofobik lipitler olduğundan dolayı HDL'in ortasında birikirler ve bu birikmenin sonunda HDL küresel bir biçim alır. HDL dolaşım sırasında hücrelerde kolesterol absorblamaya devam eder ve büyür. Bu yüzden HDL'nin koruyucu özelliği taşıdığı kolesterol miktarı ile değil, büyük HDL taneciklerinin sayısı ile de ilişkilidir

14 Kolesteril Ester Kolesterolün esterlenmesi onun hücre içinde depolanmasını ve kanda taşınmasını sağlar. LCAT enzimi dış yüzeyde bulunan bir kolesterolle bir fosfolipidi birleştirip lipoproteinin iç kısmında yer almayı tercih edecek bir kolesteril ester molekülü oluşturur. LCAT, HDL ve LDL ye bağlıdır. Bu tür değişiklikler lipoproteinin yüzeyi ile hacmi arasındaki oranın değişmesine yol açarlar. İç kısmında hemen hiç nötral lipit bulundurmayan lipoproteinler bır madeni para gibi yuvarlak ve yassıdırlar; içleri nötral lipit dolu olanlar ise küreseldirler. Bu reaksiyonlar sonucunda lipoprotein büyüyebilir veya küçülebilir, onlara yeni apolipoproteinler eklenebilir veya eksilebilir. Bu süreçler yüzünden lipoproteinlerin boyutları, biçimleri ve içerikleri sürekli değişir.

15 Kolesteril Ester Neden Gereklidir? Kolesteril esterler (KE) kolesterolden daha hidrofobiktir; kolesterolun sterol grubu hidrofobik olmasına karşın, hidroksil grubu hidrofilik oluğu için, kolesterol molekülleri suyla kısmen temas edebilecekleri hücre zarlarında ve lipoproteinlerin dış tabakasında yer alırlar. Serbest kolesterol HDL tarafından bir kez alındıktan sonra, hemen LCAT tarafından esterlenir. LCAT karaciğerde sentezlenen bir plazma enzimidir ve HDL dahilindeki apo A1 tarafından aktifleştirilir. Bu enzim sayesinde fosfatidilkolinin 2. karbonuna bağlı yağ asidi doğrudan kolesterole transfer edilir ve geriye lizofosfatidilkolin kalır. kolesterol + fosfatidilkolin -> kolesteril ester + lizofosfatidilkolin Oluşan kolesteril esteri öyle hidrofobiktir ki, HDL içinde etkili bir biçimde tutulur ve artık membrana transfer edilemez. Çok miktarda kolesterolun depolanması veya taşınması gerektiği zaman kolesterol, yağ asitleri ile esterleşerek yağ esteri haline gelir.

16 Kolesteril Ester Bir Konteyner Olarak Düşünülebilir HDL tarafından periferik dokulardan alınan serbest kolesterolün LCAT tarafından esterleştirilmesi, HDL yüzeyindeki serbest kolesterol içeriğinin düşük tutulmasına ve böylece hücrelerle HDL arasında serbest kolesterol konsantrasyon gradiyentinin sağlanmasına aracılık eder. Yani gemi güvertedeki yüklerini konteynerler (KE) haline getirerek ambarına alır ve güverteye yeni yük kolesterol alabilir. Kolesteril esterin HDL den uzaklaştırılmasını sağlayan tek mekanizma onun kolesteril ester transfer proteini (CTEP) tarafından çok düşük yoğunluklu lipoproteine (VLDL) transfer edilmesidir. VLDL den de LDL ye kolesteril ester yükü aktarılır.

17 Kolesteril Ester Bir Konteyner Olarak Düşünülebilir HDL fabrika gemisinin önemli bir vinç mekanizması CETP dir. Konteyner halinde HDL gemisinde taşınan kolesteril ester yükünü VLDL ye aktarır ve bu esnada VLDL gemisinin yükü trigliseritleri (TG) yük olarak HDL kendine alır. VLDL gemisi artık LDL gemisi haline dönüşür. LDL reseptör çapası SR-BI vasıtasıyla dolaşımdan yakalanarak çıkarılır. Fakat HDL fabrika gemisinin asıl yükü TG olamadığından dolayı konteyner oluşturmaz sabit taşınamaz hepatik lipaz enzimi bu yükü parçalar ve yeniden asıl yükü kolesterol konteynerleri oluşturmaya başlar.

18

19 HDL Heterojenitesi 1929 da keşfedilen HDL nin etkileşim gösterdiği bir protein (apo A1) fraksiyonunun izole edilmesi 1960 ların sonlarını bulmuştur. HDL nin 1990 ların başında yaklaşık 15 protein barındırdığı sanılıyorken, günümüzde insan HDL numunelerinde 200 den fazla farklı protein tanımlanmış, bir o kadar da lipit çeşidi bulunmuştur. HDL nin özündeki muazzam fonksiyonel heterojenlik, aslında HDL nin yapısal heterojenliğinin doğal bir sonucudur.

20 Çok Yüzlü HDL Çöp Kamyonu Olarak Tanımlanabilir mi? Birinci görev? Makrofajlar ve perifer dokulardan karaciğere atılım ve yeniden kullanım için ters kolesterol akışını (KE-konteyner) sağlamaktır (reverse cholesterol transport).

21 HDL Bir Taşıma Aracıdır, Fakat Çöp Kamyonu Değildir HDL aynı zamanda adeta bir cephane ve silah taşıyan savaş gemisidir. Örneğin antioksidan enzimler PON1 ve glutatyon peroksidaz önemli bir savunma araçlarıdır. HDL yapı olarak gerçekten de kolesteril esterlerini ve lipofilik birçok molekülü, örneğin ilaçları, taşımak için çok uygun bir yapıya sahiptir. Son zamanlarda HDL ilaç taşıyıcı/terapötik bir ajan gibi kullanılmaktadır! Bu durumda HDL aynı zamanda bir terapötik ajan taşıyıcıdır. Örneğin, HDL ile taşınan sitotoksik ilaçlar, kanserli hücrelere karşı serbest ilaç dozuna göre 2-3 kat daha fazla sitotoksik etki yapabilmektedir.

22

23 HDL Yapısı ve Koroner Kalp Hastalığı HDL alt grupları kalp hastalıkları tahmininde HDL-C ölçümünden çok daha değerlidir. Örneğin; Her 1 mg/dl apo A1 çok büyük a-1 HDL, kalp hastalığı riskinde %26 oranında azalma demektir. Framingham Offspring Study (2004) a-1 ve a-2 HDL nin düşük seviyeleri ile preβ-1 HDL nin yüksek seviyesi, düşük HDL-C ölçümüne göre çok daha öngörücü değere sahiptir. Veterans Affairs HDL Intervention Trial (2005) Niacin/simvastatin tedavisi sonrası görülen atherosklerozda gerilemeye apo A1 a-1 HDL seviyesinin artması eşlik etmektedir. High-density Lipoprotein Atherosclerosis Treatment Study (2003)

24 Fabrika Gemi HDL Metabolizması HDL metabolizması 3 aşama halindedir: üretim, olgunlaşma ve atılım. Başlangıçta HDL karaciğer ve bağırsakta ham preβ-1 HDL veya yassı-hdl olarak üretilir. Başlıca apo A1 ve fosofolipid içerir. Bu adeta boş bir gemi gibidir. Gemi yükünü bırakacağı periferi dokulara gider ve ana yükü olan serbest kolesterolü alır ve ters taşıma ile ana limanı karaciğere taşır. Boş HDL, yani lipit fakir, apo A1 zengin fabrika gemi HDL partikülleri ana yükü serbest kolesterolleri ABCA-1 isimli bir vinç protein vasıtasıyla limanlardan yani periferi hücrelerden, özellikle makrofajlardan alır.

25 Fabrika Gemi HDL Metabolizması Kolesterol çıkışı regülatör proteini (CERP) olarak da bilinen bu «vinç» protein hücre membranında yer alır ABCA hücre içine ve dışına birçok moleküllün taşınmasını sağlar. Bu taşıyıcı vinç kolesterolü kolaylıkla hücre dışına adeta bir pompa gibi aktarır böylece hücre içi lipit dışarıya çıkarılır. Genellikle alıcı gemisi lipit fakir apo A1 ve Apo E içeren boş nascent-hdl gemisidir. Sonuçta fabrika gemi HDL ye alınan bu serbest kolesteroller LCAT ile konteynerler halinde ambarlara taşınır ve yavaş yavaş gemi dolu olgun HDL gemisi haline dönüşür. Dolu gemi ana liman olan karaciğere bu konyteyner yüklerini taşır ve boşaltır. Bu ana limanda çapa olarak SR-BI çapası reseptörü esas belirleyici olmaktadır.

26

27 Fosfolipit Transfer Proteini (PLTP) Fabrika gemi HDL nin bir diğer önemli taşıyıcı vinci PLTP dir. TG zengini diğer gemilerin fosfolipit yükünü üstlerinden alarak HDL gemisine taşır. Özellikle HDL 3 lipoprotein lipaz vasıtasıyla VLDL ve şilomikronlardan fosfolipit ve apoprotein yüklerini kabul eder. PLTP bu taşıdığı fosfolipitler ile HDL gemisinin yükünün artışına ve HDL2 adlı yeni ve daha fazla fosfolipit yükü taşıyan bir fabrika gemiye dönüşmesini sağlar.

28 Çöpçü Reseptörler - Lipoprotein Çapaları Sonunda ana limanlar olan karaciğer ve steroidejenik dokular HDL den özel yükü konteynerleri olan kolesterolü alır. Kolesterol ya safra ile atılır ya da yeni sentez işlemlerinde kullanabilir. Bu esnada fabrika gemimiz (HDL) yıkım için karaciğer ve böbrek limanlarında tersanelerde kullanılır veya çöpçü reseptör sınıf B tip I (SR-BI) vasıtasıyla endositoza uğrar. Böylece kendisi ile beraber tüm yükünü limana bırakır, ters kolesterol akımını bitirir.

29 Çöpçü Reseptörler - Lipoprotein Çapaları SR-BI aslında LDL nin ana çapasıdır. Özellikle okside (oxldl) veya asetile olan LDL için çöpçü reseptörü görevi yapar. Bazen bu çapa makrofajlarda oxldl yakalar ve köpük hücre oluşturur. A sınıfı çöpçü reseptörler gibi negatif yüklü makromolekülleri yakalar. Çöpcü reseptörler SR-BI Megalin Kubilin SR-BI nin fazladan sentezi çok güçlü anti-atherojenik potansiyele sahiptir. Artan hepatik SR-BI sentezi; Atherosklerotik lezyonda ve HDL kolesterol seviyelerinde azalmaya yol açar.

30 HDL Yapı ve Heterojenitesine Genel Bir Bakış HDL yaklaşık olarak eşit miktarda protein ve lipit içerse dahi heterojen bir yapıya sahiptir. HDL partikülleri 1,063 g/ml ve daha yüksek yoğunluklu, çok küçük partiküllerdir (Stoke çevresi 5 17 nm) Değişik HDL alt grupları, içerdikleri lipitler, apolipoproteinler, enzimler ve lipit transfer proteinleri açısından kalitatif ve kantitatif olarak çok değişiklik gösterebilir. Bu farklılıklar sonucu şekil, yoğunluk, elektriksel yükü ve antijenitesi çok farklı olabilir.

31 HDL Yapı ve Heterojenitesine Genel Bir Bakış HDL jel elektroforezi ile, önce apo A1, yani ana HDL proteinin elektrik yüküne bağlı, sonra da HDL yapısına bağlı olarak alt gruplara ayrılabilir. Böylece alt grup elde edilir. Oysa ultrasantrifüj kullanılır ise, yoğunluğa bağlı olarak, iki ana alt fraksiyon, yani HDL2 (1,063 1,125 g/ml) ve HDL3 (1,125 1,21 g/ml) ortaya çıkar. HDL küçük fraksiyonu protozoa enfeksiyonlarına karşı koruyucudur (örneğin, Trypanosoma brucei brucei). HDL nin bir alt fraksiyonu trypanosome litik faktörü (TLF) içerir.

32 HDL Çok Kompleks Bir Yapı ve Fonksiyona Sahiptir

33 HDL Proteomu ve Lipidomu

34 Protein İzoformları, Transkripsiyon ve Translasyon Modifikasyonları Glikozilasyon, kırpma, fosforilasyon gibi olağan translasyon sonrası modifikasyonlar, proteinlerin elektrik yükünü ve/veya boyutunu değiştirir. Bu durum protein izoformlarının ayrılması için kullanılabilir; öyle ki, modern kütle spektrometri teknikleri ile proteinler arasındaki çok küçük kütle değişikliklerini saptamak, karakterize etmek ve ölçmek günümüzde mümkündür. HDL bünyesindeki proteinlerin çoğu, translasyon sırasında ve sonrasında uğradıkları modifikasyonlar sonucu izoformlar halinde bulunur. Bu HDL proteomunu hem kompleks hem de dinamik hale getirir. Böylece, çeşitli etkenlere bağlı olarak, birçok değişik protein kompozisyonuna sahip HDL tanecikleri ortaya çıkar. Böylesi protein modifikasyonların HDL proteomu ve fonksiyonunu nasıl etkilediği üzerine kısıtlı bilgi bulunmaktadır. von Eckardstein, A. & Kardassis, D. (2014) High Density Lipoproteins: From Biological Understanding to Clinical Exploitation. Vol Springer.

35 HDL Disfonksiyonunda Çevresel Etki Var mıdır? Tip 2 diyabette uzun süren hiperglisemi apo A1 yapısında glikasyona yol açar. Kronik enflamasyon apo A1 miktarında azalmaya, serum amyloid A miktarında artışa yol açarak HDL yapısını ve fonksiyonunu bozabilir. Beslenmeye bağlı olarak da HDL yapı ve fonksiyonu değişebilir. Örneğin, yüksek yağlı diyet HDL nin antioksidan ve antienflamatuvar aktivitesini ilk 6 saat içinde bozabilir. Benzer şekilde, düşük fiziksel aktivite veya sigara içmek de HDL disfonksiyonuna yol açabilir. Özellikle LCAT, CETP ve HL aktivitesi bozularak oksidatif stres oluşabilir. PAF-AH, HDL'de bulunan bir enzimdir ve bu oksitlenmiş fosfolipidleri hidrolize eder. Ayrıca insan PAF-AH ile sıçan HDL sinin köpük hücre formasyonunu inhibe ettiği ve makrofajlarda kolesterol akışını kolaylaştırdığı gösterilmiştir Gelecekte HDL fonksiyonunu korumak ve düzeltebilmek adına etkili olacak çevresel etkenler, ileride daha fazla araştırılacak bir alandır.

36 HDL Disfonksiyonu

37 HDL Disfonksiyonu

38 HDL nin Tedavi Amaçlı Kullanımı HDL, kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde hem hedef faktör hem de ilaç taşıyıcısı olarak kullanılabiliir. Kanser hücreleri SR-BI reseptörünü daha fazla üretirler. Kanser tedavisinde kullanılmak üzere apo A1 mimetik ilaçlar ve sentetik HDL (rhdl) geliştirilmektedir. HDL, innate immün sistem ve vasküler endotel yapıyı korur. Endotoksinleri bağlayarak detoksifiye edebilir. Bu sayede özellikle bakteriyel sepsislere karşı koruyucudur. Gram negatif bakterilerin lipopolisakkarit LPS salınması ve TLR4 aracılı enflamasyonu engeller. Düşük HDL seviyesi bir sepsis risk faktörüdür.

39 HDL Fonksiyonunu Belirlemek için Kullanılabilecek Laboratuvar Testleri Test Kriteri Kolesterol atımı ve Tersine kolesterol taşınması Ölçülen Değer ex vivo hücresel kolesterol atılımı in vivo makrofaja özel RCT Periferal sentez ve alınım değerlerinden kestirilen sentripetal kolesterol fluksu Dışkıdaki toplam steroit ekskresyonu İzotop seyreltilmesi yöntemiyle, dokulardan in vivo kolesterol atımının kinetik modellemesi Anti-enflamatuar aktivite indeksi Anti-oksidatif aktivite indeksi NO üretimi ve Endotel fonksiyonu Pıhtılaşma önleyici ve Anti-trombotik aktivite ölçümleri Endotel adezyon moleküllerinin ekspresyonu Monosit şimiotaksi HDL ile etkileşen enzimler Paraoxonaz (PON1) Glutatyon Selenoperoksidaz Oksidize LDL ve fosfolipitler

40 TEŞEKKÜRLER