Laboratuvar Tekniği. Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji Bölümü TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 8. Hafta (04.04.

Transkript

1 Laboratuvar Tekniği Adnan Menderes Üniversitesi Tarımsal Biyoteknoloji TBY 118 Muavviz Ayvaz (Yrd. Doç. Dr.) 8. Hafta ( ) 1

2 6. Haftanın Ders İçeriği Bazı Temel Kavramlar Şekerlerin Tayini Enzimlerin Tayini 2

3 Amaç Maddelerin varlığını, konsantrasyonunu, ve/yada biyolojik aktivitesinin belirme testi (Enzimlerin, büyüme faktörlerinin, ilaçların, vitaminlerin, hormonların, vb.) 3

4 Enzimler hakkında bazı temel bilgiler Substrat: Enzimin bağlandığı ve ürüne dönüştürdüğü başlangıç maddesi, tepkimeye giren madde, tepken. Aktif bölge: Enzim yapısında substratın bağlandığı bölge. Enzimler belirli substrata bağlanarak belirli kimyasal reaksiyonu katalizlerler (hızlandırırlar). Enzimler reaksiyonda tükenmezler-bitmezlerazalmazlar. Her bir reaksiyondaki substratı ürüne çevirmeleri sonrası diğer bir substrata bağlanmaya hazırdırlar. 4

5 Enzimler hakkında bazı temel bilgiler 5

6 Amilaz Enzimi hakkında bilgi Aşağıdaki şekilde gösterilmiş olan reaksiyonu amilaz enzimi katalizler. Burada substrat, nişasta dır. Amilaz nişastayı maltoz şekerine dönüştürür. Burada ürün bir disakkarit olan maltozdur. 6

7 Amilaz Enzimi hakkında bilgi Amilaz ın aktivitesini belirli zaman içinde oluşan ürünün miktarına yada substratın zaman içinde azalma miktarına bakarak tayin edebiliriz. 7

8 Karbonhidratlar Disakkaritler: iki monomer Kimyasal olarak iki monomerin bağlanması ile oluşur. Disakkaritlere örnek sofra şekeri olarak bilinen sukroz ve süt şekeri laktoz verilebilir. 8

9 Değişken Bağımsız Değişken: Bu test edilen şartlardır. Bağımsız değişken bir gruptan diğerine değişen tek faktördür. Deney şartlarının tüm diğer şartları farklı örneklerde aynıdır. Bağımlı Değişken: ölçülerek kaydedilen data dır. Bağımlı değişken bağımsız değişkenin sonucu olarak değişir. 9

10 Değişken Bağımsız Değişken: Bir duruma etki eden değişkendir. Bağımlı değişken: Bir başka değişkene bağlı olan, yani etkilenen değişkendir. Örnek: Sigara (Bağımsız Değişken) Kanser (Bağımlı Değişken) Kanser (Bağımsız Değişken) Depresyon Düzeyi (Bağımlı Değişken) 10

11 Kontrol Sonucun araştırmacı tarafından belli yada kontrol edilebilir olduğu örnektir. Deneysel kontrolün amacı araştırmacının test ettiği kendi deney şartları hakkında bir sonuca varması amacıyla ortaya oluşturulur. 11

12 Kontrol Grubu Örneği Örneğin, baş ağrısını tedavi etmeye yönelik yeni bir ilaç tasarım çalışması yapılmaktadır. Başı ağrıyan 30 kişilik bir gruba ilaç verilir. Aralarında 20 kişinin ağrılarının azaldığını tespit ettiğimiz düşünelim. Kontrol grubu olmadan ilacın test edildiği 30 kişi arasından baş ağrısının iyileşenlerin ilaç nedeniyle baş ağrılarının geçtiğini söylememiz mümkün değildir. Kontrol grubu placebo yani ilacın etken maddesinin olmadığı kapsüllerdir. Kontrol grubu kullanılmadığımızda iyileşen 20 kişinin baş ağrısının dinmesinin nedeni olarak doğrudan ilaç olarak gösterilemez. Burada ilacın dışındaki faktörlerde etkili olmuş olabilir kabul edilir. 12

13 Negatif ve Pozitif Kontrol Negatif kontrol Test edilen değişkenin olmaması durumudur. Negatif sonuç elde etmek için planlanır. Örneğin: NaOH ve CuSO 4 ı kullanan proteinin varlığını test ediyor olsak bu deneyde negatif kontrol NaOH ve CuSO 4 ın olmadığı, proteinin yerini suyun aldığı örnektir. Pozitif kontrol Pozitif sonuç verilmesi için tasarlanır. Örneğin; : NaOH ve CuSO 4 ı kullanan proteinin varlığını test ettiğimizde pozitif kontrol: NaOH ve CuSO 4 ın olduğu, bilinen protein konsantrasyonunun olduğu örnektir. 13

14 Amilaz Aktivitesi Deney Tasarımı Amilaz aktivitesini tayin etmek için deneyde iki farklı belirteç kullanılır. Belirteç bir maddenin varlığında renk değiştiren kimyasal bir maddedir. Bu iş için maltozunda (amilaz tarafından katalizlenen reaksiyonun ürünü) bulunduğu şekerlerin varlığını ölçen Benedik çözeltisi belirtecidir. İkinci belirteç iodin çözeltisi olup örneğimizdeki nişastanın (amilaz için substrat) varlığını tayin eder. Dolayısıyla amilaz ın varlığını nişasta miktarındaki azalma ve maltoz miktarındaki artma ile tayin edebiliriz. 14

15 Nişasta ve Şekerlerin Tayini Burada her iki belirtecin kullanılması öğrenilecektir. İyot (Iodine) (I 3- ): Nişastanın belirtecidir. Uzun nişasta molekülleri tarafından İyot yakalandığında renk değişimi olur. Benedik çözeltisi: maltoz gibi bazı basit şekerlerin belirtecidir. Yapısında bakırlı bir bileşik içerir ve şekerlerin kimyasal grupları ile etkileşir. 15

16 Amilaz aktivitesi tayini Burada rekombinant bakteriden izole amilaz ve tükrükteki amilaz aktivitesi tayin edilecektir. İnsanlar diğer hayvanlarda olduğu gibi tükettikleri gıdaları parçalamak için bünyelerin iki farklı organda amilaz üretirler. 16

17 Amilaz aktivitesi tayini Tükürükteki amilaz ağzımızdaki tükürük salgı bezleri tarafından üretilir. Pankreasta üretilen amilaz ise ince bağırsağa salgılanır. Burada yoğunluğu bilinmeyen tükürükteki amilaz ile bakteri kaynaklı amilaz aktivitesinin (10 mg/ml) karşılaştırılması gerçekleştirilecektir. 17

18 Bitkilerden elde edilen maddelerin Antibakteriyal aktivite tayini ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Burada bitkilerden elde edilen özütlerin antimikrobiyal aktivitesinin olup olmadığı test edilecektir. Organizmalar virüsler enfeksiyonu ya da bakteriyel hastalıkların tehdidi altındadır. Birçok organizmanın yabancı istilacıların tehdidi ile başa çıkabilmesi için savunma mekanizmaları vardır. 18

19 Bitkilerden elde edilen maddelerin Antibakteriyal aktivite tayini ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Birçok bitki, mantar ve bakteri mikroplarla mücadele etmek için antimikrobiyal maddeler üretirler. Antimikrobiyal moleküllerin bulunması ve izole edilmesi olası terapötik ilaçların ortaya çıkması demektir. Örnekler daha sonra örneklerin farklı mikropları öldürme yetenekleri test edilir. Bitki ekstraklarının antimikrobiyal aktivitelerini test etmek için bir yol bitki ekstraktının içine daldırılmış filtre kağıdının petri içindeki bakteri kültürü ortamına bırakılmasıdır. 19

20 Bitkilerden elde edilen maddelerin Antibakteriyal aktivite tayini ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Eğer bitki ekstraktleri bakterilerin büyümesine karşı etken maddeleri içeriyorlarsa disklerin çevresinde haleler oluşturular. Bu haleli yapıya inhibisyon zonu adı verilir. Bu bölgeler bakteri büyümesinin engellendiği/inhibe edildiği ya da bakterilerin ölümünün gerçekleştiği bölgelerdir. 20

21 Deney Tasarımı İki farklı bitki ekstraktinin kullanıldığı, pozitif kontrol olarak ampicilin, negatif kontrol olarak su kullanılan deney tasarlanabilir. Aynı deney düzeneği iki tekrarlı şekilde yürütülür. Test edilmeye uygun olası bitki özütleri/ ekstraktleri listesi oluşturulur. Antimikrobiyal aktivitesine bakmak istediğiniz iki bitki özütü seçilir ve bunlar not defterine kayıt edilir. 21

22 Deney Tasarımı Her bir agar kabının altı şekilde görüldüğü üzere çıkmayan bir kalem ile bölünür. Her bir petri kabına steril bir pipet yardımıyla 1mL E.coli ilave edilir. Steril bir yayma aleti ile bakteri petri kabının her yerine dağıtılır. Kap hızlıca kapatılır bakterinin ortama nufüz etmesi için en az 15 dakika beklenir. E.coli ile bulaşan her şey kırmızı renkli biohazard poşetine atılır. 22

23 Deney Tasarımı Steril pens yardımıyla filtre dikslerini 4 parçaya bölünmüş agar petrisinin her birparçanın ortasına gelecek şekilde yerleştirilir. 1. bölge: su 2. bölge: ampisilin (antibiyotik) 3. bölge: bitki esktrakti 1 4. bölge: bitki ekstrakti 2 6. Disklerin agar yüzeyine iyi şekilde yerleştiğinden emin olunur. 7. Petri kaplarınıza grup adınızı yazarak 37 o C de saat inkübasyona bırakınız. 23

24 Elma Suyu Üretimi için Farklı Enzimlerin Denenmesi Deney Tasarımı ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Farklı enzimlerin, farklı koşullarda elma suyu üretim miktarı üzerine olan etkisi incelir. Her bir grup farklı şartlar altında deney yürütür ve sonuçlarını kayıt altına alır. Sonuçlar laboratuvar defterine kayıt edilmelidir. 24

25 Elma Suyu Üretimi için Farklı Enzimlerin Denenmesi Deney Tasarımı ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Birçok endüstri kolu daha iyi ürün elde edebilmek için enzimleri kullanırlar. Örneğin, amilaz nişastayı şekerlere ayırır. Bu enzim kumaş ve içecek endüstrisinde kullanılır. Süt endüstrisi, peynir üretiminde sütün pıhtılaşmasını hızlandırmak için enzimlerden faydalanır. 25

26 Elma Suyu Üretimi için Farklı Enzimlerin Denenmesi Deney Tasarımı ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Reaksiyonların hızlanması için enzim kullanılması ürün miktarının artmasına buradan da satışların oranının arttırılabilmesi imkanını sağlar. Doğal olarak bulunan yada genetik mühendisliği ile üretilmiş olan enzimlerin üretim süreçlerinde varlığı/kullanılması pahalıdır. 26

27 Elma Suyu Üretimi için Farklı Enzimlerin Denenmesi Deney Tasarımı ADÜ Tarımsal Biyoteknoloji Bu nedenle üretim süreçlerinde enzimleri kullanan firmalar için hangi enzimlerin onlar için en etkin olduğunun yanında hangi miktardaki enzim en optimum üretimi sağlar gibi sorular enzimlerin pahalı maliyetleri açısından oldukça önem arz eder. 27

28 Elma Suyu Üretimi için Farklı Enzimlerin Denenmesi Deney Tasarımı Deney Burada püre haline getirilmiş elma dan elma suyu üretim verimi incelenir. 3 farklı tipteki enzim üretim sürecinin verimi konusunda test edilebilir. Meyve suyu esasta meyve hücrelerinden çıkan hücre sitoplazmasıdır.. 28

29 Elma Suyu Üretimi için Farklı Enzimlerin Denenmesi Deney Tasarımı Deney Enzimler en fazla meyve suyu üretimi için bitki hücre içeriğindeki maddeleri ya da meyve suyu oluşumunu engelleyicilere etki ederler. Her grup 2 farklı hacimde bir enzimi ve suyu test edilir. Çevresel sıcaklık, oda sıcaklığı ve 37 o C olacak şekilde 2 farklı ortamda enzimlerin çalışması test edilir. 29

30 Never Stop Thinking! 30