İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ

Transkript

1 İMMUNOLOJİK TANI YÖNTEMLERİ

2 Presipitasyon

3 G)İMMUNOASSAY TESTLER İşaretli antikorların kullanılmasıyla 1942 de; FA Fluoresan Antikor (Fluorokromlar) 1954 de; IFA (İndirekt Fluoresan Antikor) 1960 da; RIA (Radyoizotopla- iyotla) 1970 de; EIA (enzimle) kullanıma girmiştir Antikor yada antijen saptamak için kullanılırlar

4 I- İmmun Fluoresan (IF) testler FLUORESANS Fluorokrom veya florofor boyaların Ultraviyole ışık altında ışık enerjisini emerek bu enerjiyi farklı dalga boyuna çevirmesine denir

5 Antikorlar en sık fluoresin isotiyosiyanat (FITC)) ile işaretlenir. BUNA GÖRE; Direk fluoresan antikor (DFA) Katı fazda klinik örnek (Ag) Üzerine FITC li Ab Pozitif sonuç (fluoresan-yeşil( görüntü) Bakteri ve virusleri hızlı tanıda Kuduzda negri cisimciği Kolera tanısında

6 İndirek fluoresan antikor (İFA) Katı fazda hazır Ag Hasta serumu(aranan Ab) FITC li Anti-Ig Pozitif sonuç (fluoresan( görüntü) Birçok bakteri virus enf ve otoimmun hast. IF yöntemiyle klinik örneklerden hem Ag hem Ab aranır Fluoresan mikroskobu olması ve uzman kişi gereklidir

7 II-Radioimmuno Assay (RIA) Yöntem aynı IF ve EIA gibidir Antikorda işaretliyici madde olarak Radyoaktif madde I. 125 ve I. 132 kullanılır Gamma sayaçlarında değerlendirilir

8 Radyoaktif madde kullanımından dolayı sınırlıdır Özellikle hormon testlerinde (TSH,( T3, T4) ) kullanılır Radyo allergo sorbent (RAST( RAST) deneyi Allerjene spesifik IgE tayininde kullanılır Radioimmunosorbent (RIST( RIST) Serumda total IgE tayininde

9 VI. ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Plastik yüzeylere yapıştırılmış bilinen antijenler üzerine, önce araştırılacak serumun (antikor) ilavesi; sonra yıkanması, daha sonra ise peroksidazlı insan antiglobulini ilavesi ve buna da renk veren bir substrat ın eklenmesi esasına dayalı kolorimetrik deneylerdir.

10 Antikoru ENZİMLE İŞARETLEME yöntemidir Peroksidaz, alkalin fosfataz ve beta galaktozidaz gibi enzimler Spesifik substratları renkli ürünlere çevirirler. Peroksidaz/Orthofenilendiamin Alkali fosfataz/nitrofenil fosfat Renkli ürünler spektrofotometrede belirli dalga boylarında olurlar.

11 Yöntemin; Kullanılan reaktifler uzun ömürlü olması Artık maddelerle ilgili radyasyon sorunu olmaması Uygulamasının basit ve otomatize edilebilmesi yönleriyle Aynı prensipli (işaretleme) RIA ve IF ye göre avantajlıdır

12 Dezavantajları ise; Antijen saptamada klinik örneğin uygunluğunun değerlendirememesi Bazı viral enfeksiyonlarda düşük Ag yoğunluğu saptanmaması IgM saptanmasında RF-IgM ile çatışmanın olması Bunun için Absorblama işlemi olması

13 Antijen veya antikorun çeşitli vücut sıvılarında <5pg düzeyinde saptandığı için yüksek ANALİTİK DUYARLILIKTA olması UYGULAMA PRENSİPLERİ Ag ve Ab (sınıfa özgül) saptayabilir Katı faz olarak; Plastik tabanlı mikrotitrasyon plakları Boncuk veya filtre kullanılır

14 Bazı ELISA uygulama şekilleri: 1)İNDİREK ELISA ile Ab Tayini Ag kaplı kuyucuk Hasta serumu (Aranan Ab) Yıkama Enzim işaretli ikincil Ab Yıkama Substrat H2SO4 (Reaksiyonu durdurur) Spektrofotometre

15

16 Yarışmasız İndirekt ELISA ile Ab saptama

17 2)Sandwich ELISA ile Ag Tayini Katı yüzeyde capture monoklonal yada poliklonal Ag içeren hasta serum örneği Yıkama Enzimle işaretli saptayıcı monoklonal yada poliklonal Yıkama Substrat H2SO4 (Reaksiyonu durdurma) Spektrofotometrede okuma

18

19 3) İNDİREK SANDWİCH ELISA ile Ag Tayini Katı yüzeyde capture Ab Ag içeren hasta serum örneği Yıkama Spesifik bir saptayıcı antikor ilave edilir antijene bağlanır Ag iki antikor arasında kalır Enzimle işaretli ikincil Ab saptayıcı antikora Fc bölgesinden bağlanır HRP ile işaretli

20 Yıkama Substrat H2SO4 (Reaksiyonu durdurma) Spektrofotometrede okuma

21

22 4) YARIŞMACI (KOMPETATİF)ELISA: Serumda Ag Arama (Sıklıkla kullanılır) Katı yüzeyde Ab Şüpheli serum (Ag aranan klinik örnek) ve enzimli işaretli antijenin beraber konulduğu antijen rekabet (Competetive) yöntemidir. İşaretli antijen katı yüzeye bağlanırsa, substratla da birleşir RENK OLUŞUR. Bu sonuç klinik örnekteki Ag nin olmadığı bir sonuçtur.

23 Fakat klinik örnekteki antijen katı faza bağlanırsa enzim olmadığından substratla reaksiyon olmaz. RENK OLUŞMAZ.

24

25 5) YAKALAMALI (CAPTURE)ELISA: Sıklıkla; Enfeksiyoz etkene yönelik, Spesifik IgM ve IgG saptama testidir 1)Spesifik Ag saptama Katı faza poliklonal veya M.ab lar konulur Poli Ab ler, M Ab lere göre Farklı Ag epitoplarını bağladığı için güvenilirdir

26 2)Spesifik Ab (IgM) saptama Katı faz formu IgM in Fc bölgesine karşıt anti-igm Ab katı faza bağlanır Üzerine hasta serumu (IgM?) konulur Üzerine viral antijen Enzimle işaretli antikor Substrat

27 Konjugat faz formu Katı fazda viral Ag Hasta serumu (IgM?) ENZİMLE İŞARETLİ anti IgM Ab (KONJUGAT) Substrat

28