JOJOBA'NIN (Simmondsia chinensis) IN VITRO HIZLI ÇOĞALTIMI VE MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLERLE ERKEK VE DİŞİ BİTKİLERİN BELİRLENMESİ

Transkript

1 T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ EĞİTİM BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ORTAÖĞRETİM FEN VE MATEMATİK ALANLAR EĞİTİMİ ANA BİLİM DALI BİYOLOJİ EĞİTİMİ BİLİM DALI JOJOBA'NIN (Simmondsia chinensis) IN VITRO HIZLI ÇOĞALTIMI VE MOLEKÜLER İŞARETLEYİCİLERLE ERKEK VE DİŞİ BİTKİLERİN BELİRLENMESİ Zeynep ÖNCEL YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMAN Yrd.Doç.Dr. Semiha ERİŞEN Konya-2011

2

3

4

5 iii TEŞEKKÜR Tez çalışmam boyunca, büyük sabır ve emek harcayan, gerek bilimsel gerekse manevi yönde desteğini benden esirgemeyen değerli hocam, Sayın Yrd. Doç. Dr. Semiha ERİŞEN e en derin teşekkür ve saygılarımı sunarım. Çalışmalarım boyunca her açıdan büyük destek gördüğüm ve yardımlarını benden hiçbir zaman esirgemeyen Sayın hocalarım, Prof. Dr. Mehmet BABAOĞLU ve Yrd. Doç. Dr. Mustafa YORGANCILAR a ve her zaman yanımda olan, ilgi, destek ve yardımlarını hiçbir zaman esirgemeyen Sayın hocam, Dr. Emine ATALAY a sonsuz teşekkürlerimi ve saygılarımı sunarım. Ayrıca laboratuvar çalışmalarımda destek ve yardımlarını gördüğüm Yük. Zir. Müh. M. Ufuk BACAKSIZ, Songül UYĞAN ve Zeynep TIRAŞ a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Maddi ve manevi desteklerini hayatımın her safhasında gördüğüm sevgili annem Perihan ÖNCEL e ve tüm aileme sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Zeynep ÖNCEL Konya, 2011

6 iv T. C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ Eğitim Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü Adı Soyadı Zeynep ÖNCEL Numarası Ortaöğretim Fen ve Matematik Alanlar Eğitimi/ Ana Bilim / Bilim Dalı Biyoloji Eğitimi Bilim Dalı Öğrencinin Programı Tezli Yüksek Lisans Doktora Tez Danışmanı Yrd.Doç.Dr. Semiha ERİŞEN Jojoba'nın (Simmondsia chinensis) in vitro hızlı Tezin Adı çoğaltımı ve moleküler işaretleyicilerle erkek ve dişi bitkilerin belirlenmesi ÖZET Bu tez çalışması, Jojoba (Simmondsia chinensis) bitkisinin in vitro hızlı çoğaltımı ve moleküler işaretleyicilerle erkek ve dişi bitkilerin belirlenmesi amacıyla yürütülmüştür. İn vitro hızlı çoğaltım için nodal segmentler (0.5, 1.0, 2.0 mg l -1 )BAP, KİN ve (0.22, 0.44, 0.88 mg l -1 ) TDZ ile 1.5, 2.0 ve 2.5 mg l -1 BAP ve bunların bazı oksinlerle (1.25 mg l -1 IAA, IBA, NAA) kombinasyonlarını içeren MS besin ortamında kültüre alınmıştır. Denemeler sonunda eksplant başına en çok sürgün sayısı 9.13 adet ile 2.0 mg l -1 BAP içeren MS besin ortamından elde edilmiştir. İn vitro da çoğalan sürgünler köklenme için NAA, IAA, IBA nın farklı konsantrasyonlarını içeren MS besin ortamına alınmışlardır. Köklenme yüzdesi bakımından en iyi sonuç % 40 ile 3.0 mg l -1 NAA ve %30 ile 1.0 mg l -1 IBA içeren MS besin ortamından elde edilmiştir. Köklenme yüzdesini artırmak amacıyla farklı şeker (%1.5) ve MS (1/2) konsantrasyonları ile aktif karbon (%0.5) ilavesinin etkisine bakılmıştır. En yüksek köklenme yüzdesi % 50 ile 1 mg l -1 IBA, % 1.5 şeker ve % 0.5AC (aktif karbon) içeren ½ MS besin ortamından elde edilmiştir. Köklenen sürgünler başarıyla dış ortama alıştırılmış ve bitkiciklerin %75 inin hayatta kaldığı gözlemlenmiştir.

7 v Cinsiyeti belirleme çalışmalarında; genomik DNA cinsiyeti belli erkek ve dişi bitkilere ve cinsiyeti belli olmayan rejenere sürgünlere ait genç yapraklardan izole edilmiştir. UBC-807 ve OPG-5 primerleri ile PCR uygulamaları gerçekleştirilmiştir. UBC-807 primerinden elde edilen jel görüntüsünden dişi ve erkek birey ayrımı başarıyla gerçekleştirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Jojoba, doku kültürü, mikroçoğaltım, dioik

8 vi Öğrencinin Adı Soyadı T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ Eğitim Bilimleri Enstitüsü Müdürlüğü Zeynep ÖNCEL Numarası Ana Bilim / Bilim Dalı Secondary School Science and Mathematics Education / Biology Education Programı Tezli Yüksek Lisans Doktora Tez Danışmanı Yrd.Doç.Dr. Semiha ERİŞEN In vitro micropropagation of jojoba (Simmondsia Tezin İngilizce Adı chinensis) and determination of male and female plants by molecular markers SUMMARY This thesis aimed in vitro micropropagation of jojoba plants and determination of male and female plants by the molecular markers. For in vitro micropropagation, nodal segments were cultured on MS basal medium containing (0.5, 1.0, 2.0 mg l -1 )BAP, KİN and (0.22, 0.44, 0.88 mg l -1 )TDZ or 1.5, 2.0 and 2.5 mg l -1 BAP alone and combinations with some auxine (1.25 mg l -1 IAA, IBA, NAA). The highest number of shoots per explant ( 9.13 shoots) was obtained on MS medium containing 2 mg l -1 BAP. Regenerated shoots were cultured on MS medium containing different concentrations of NAA, IAA, IBA for rooting. The highest percentage of rooting (40%) was obtained on MS with 3.0 mg l -1 NAA followed by 1.0 mg l -1 IBA (30%). In order to increase the percentage of rooting, different concentrations of MS, sugar and the addition of activated carbon was examined. The highest percentage of rooting (50%) was obtained on ½ MS medium with 1.0 mg l -1 IBA plus 1.5% sugar and 0.5% activated carbon. Rooted shoots were succesfully acclimatized and the survival rate of plantlets was 75%. Genomic DNA were isolated from leaves of male and female plants and nongender regenerated shoots. PCR reactions have been carried with primers UBC-807 and OPG-5. Gel image obtained from UBC-807 were succesfully determinated male and female plants. Key Words: Jojoba, tissue culture, micropropagation, dioecious

9 vii İÇİNDEKİLER Bilimsel Etik Sayfası... i Tez Kabul Formu... ii Teşekkür... iii Özet... iv Summary... vi İçindekiler... vii Kısaltmalar ve Simgeler... ix Tablolar Listesi... xi Şekiller Listesi... xii 1. GİRİŞ KAYNAK ARAŞTIRMASI Jojoba ile ilgili genel bilgiler Bitki doku kültürü ile ilgili genel bilgiler Jojobanın in vitro hızlı çoğaltımı ile ilgili araştırmalar Genetik Markörler MATERYAL VE METOT Materyal Metot Bitki doku kültürü çalışmaları Besin ortamlarının hazırlanışı ve sterilizasyonu Bitki büyüme düzenleyicileri Yeşil aksamın sterilizasyonu Tohumların sterilizasyonu ve çimlendirilmesi İn vitro'da yetiştirilen fidelerden eksplant izolasyonu Sürgünlerin köklendirilmesi ve dış ortama alıştırma Verilerin değerlendirilmesi Moleküler Genetik Çalışmalar... 21

10 viii DNA izolasyonu, konsantrasyonu ve saflıklarının belirlenmesi PCR Çalışmaları ARAŞTIRMA SONUÇLARI VE TARTIŞMA Bitki doku kültürü çalışmaları Sterilizasyon çalışmaları Mikroçoğaltım çalışmaları Farklı sitokininlerin sürgün çoğaltımına etkisi BAP ın farklı oksinlerle kombinasyonunun sürgün çoğaltımına etkisi Köklendirme çalışmaları Moleküler Genetik Çalışmalar DNA izolasyonu, konsantrasyonu ve saflıklarının belirlenmesi PCR Çalışmaları SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 47

11 ix KISALTMALAR VE SİMGELER 2IP: İzopentil adenin 2,4-D: 2,4-Diklorofenoksi asetik asit 2,4,5-T: 2,4,5-Triklorofenoksi asetik asit A: Adenin AC: Aktif karbon atm: atmosfer B 5 : Gamborg ve ark BAP: 6-Benzil amino pürin Bp: Base pair-baz çifti C: Sitozin CH: Casein hydrolysate-kazein hidrolizat CTAB: Cetil Three Metil Amonyum Bromid cm: Santimetre DNA: Deoksiribo nükleik asit dntp: Deoksiribonükleotidtrifosfat EDTA: Etilen Diamin Tetra Asetik Asit F: F değeri G: Guanin g: Gram h/h: Hacim hacim HCl: Hidroklorik asit HgCl 2 : civa klorür IAA: İndol-3- asetik asit IBA: İndol-3- butirik asit ISSR: Inter Simple Sequence Repeat-İç Basit Dizi Tekrarları Kin: Kinetin KO: Kareler ortalaması KOH: Potasyum hidroksit LSD: Çoklu karşılaştırmalı istatistiksel test ml: Mililitre

12 x mg: Miligram MgCl 2 : Magnezyum klorür mg l -1 : Miligram / litre mm: Milimetre mm: Milimolar MS: Murashige ve Skoog, 1962 NAA: Naftalen asetik asit NaOCl: Sodyum hipoklorit ng: Nanogram nm: Nanometre PCR: Polymerase Chain Reaction-Polimeraz Zincir Reaksiyonu ph: Hidrojen gücü pmol: Pikomol ppm: Milyonda bir PVP: polyvinylpyrrolidone RAPD: Randomly Amplified Polymorphic DNA-Rastgele Çoğaltılmış DNA Farklılığı RNA: Ribonükleik asit rpm: Rotation Per Minute-Dakikadaki Devir Sayısı SD: Serbestlik derecesi T: Timin Taq: Thermus aquaticus TBE: Tris-Borik asit-edta TDZ: 1-Fenil-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl) üre Tm: Melting Temperature-Erime Sıcaklığı U: unit-ünite WPM: woody plant medium Zea: Zeatin ZR: Zeatin ribozid µm: Mikromolar µm: Mikrometre o C: Santigrad derece

13 xi TABLOLAR LİSTESİ Tablo-1: Kullanılan büyüme düzenleyiciler, çözücüleri ve stok saklama koşulları Tablo-2: Yeşil aksam için uygulanan sterilizasyon işlemleri Tablo-3: Çalışmada kullanılan primerlere ait bilgiler Tablo-4: Primerler için optimize edilmiş PCR reaksiyon koşulları ve süreleri Tablo-5: Sterilizasyon uygulamalarına ait steril eksplant yüzdeleri Tablo-6: Jojoba nodal segmentlerinde BAP, KİN ve TDZ konsantarasyonlarının eksplant başına sürgün sayısına ait varyans analizi Tablo-7: Jojoba nodal segmentlerinde BAP, KİN ve TDZ konsantarasyonlarının eksplant başına sürgün sayısına etkisi Tablo-8: Jojoba nodal segmentlerinde BAP ın farklı oksinlerle kombinasyonunun eksplant başına sürgün sayısına ait varyans analizi (6.hafta) Tablo-9: Jojoba nodal segmentlerinde BAP ın farklı oksinlerle kombinasyonunun eksplant başına sürgün sayısına ait varyans analizi (12.hafta) Tablo-10: Jojoba nodal segmentlerinde BAP ın farklı oksinlerle kombinasyonunun eksplant başına sürgün sayısına etkisi (6.hafta) Tablo-11: Jojoba nodal segmentlerinde BAP ın farklı oksinlerle kombinasyonunun eksplant başına sürgün sayısına etkisi (12.hafta) Tablo-12: İn vitro da elde edilen sürgünlerin farklı büyüme düzenleyicileri içeren besin ortamlarındaki köklenme yüzdeleri Tablo-13: İn vitro da elde edilen sürgünlerin farklı köklenme ortamlarındaki köklenme yüzdeleri Tablo-14: İzole edilen DNA lar, konsantrasyon ve saflıkları....37

14 xii ŞEKİLLER LİSTESİ Şekil-1: Jojoba bitkisinin genel görünüşü... 4 Şekil-2: Jojoba bitkisinin çiçekleri... 5 Şekil-3 : Jojoba bitkisinin tohumları... 6 Şekil-4: İn vitro da çimlendirilen steril jojoba tohumları Şekil-5: 2 mg l -1 BAP içeren MS besin ortamında çoğalan sürgünler Sekil-6: 2 mg l -1 BAP içeren besin ortamındaki cinsiyeti belli olan eksplantlar Şekil-7: İn vitro da köklenen sürgünler Şekil-8: İn vitro da köklenen sürgünler Şekil- 9: İn vitro da gelişen bitkiciklerin dış ortama alıştırılması Şekil-10: UBC-807 primeri ile elde edilen PCR ürünlerine ait agaroz jel görüntüsü... 38

15 1 1. GİRİŞ Yaygın olarak jojoba veya hohoba olarak bilinen, Simmondsia chinensis (Link) Schneider, Simmondsiaceae familyasına ait, herdem yeşil, dioik (iki evcikli) bir çöl çalısı olup, anavatanı; Kaliforniya Eyaleti ile kuzey batı Meksika nın Sonoran Çölüdür (Aktaran: Tyagi ve Prakash, 2004: 19). Jojoba bitkisi, tohumlarında ilaç, plastik sanayisinde ve kozmetikte kullanılan sıvı balmumu bulunduğundan iyi bir ekonomik potansiyele sahiptir (Jacoboni ve Standarti, 1987: ). Ayrıca jojoba yağı sperm balina yağı ile benzer özelliklere sahiptir (Greene ve Foster, 1933: ). Bu özelliğinden dolayı son otuz yıldır ilaç, köpürmeyen maddeler, yüksek sıcaklık ve basınca dayanıklı yağlayıcılar, reçineler, plastikleştiriciler olarak endüstriyel kullanım için bitkinin tarımı yoğun şekilde yapılmaktadır (Mills vd., 1997: ). Jojobanın çoğaltımı ağırlıklı olarak tohum aracılığıyla olmaktadır, rüzgarla tozlaşma nedeniyle yağ içeriği ve tohum veriminde yüksek derecede varyasyon olmakta ayrıca dişi ve erkek bitkileri belirlemek çiçek açana kadar mümkün olmamaktadır. İlk çiçek tomurcuklarının 1-4 yıl arasında görülmesi nedeniyle başlangıçta planlı bir ekim yapılamamaktadır. Jojoba bitkisinin ticari yetiştiriciliği için cinsiyeti belli, yüksek yağ kalitesine ve verime sahip klon üretimi oldukça önemlidir. Vejetatif çoğaltım istenilen cinsiyete özel klonların üretimi için alternatif bir yol olmakla birlikte uzun işlem ve yavaş büyüme sebebiyle geleneksel kök çelikleri yoluyla çoğaltımı etkili olamamıştır (Aktaran:Singh vd., 2008:538; Aktaran: Tyagi ve Prakash, 2004: 19). Jojobanın doku kültürü teknikleri ile çoğaltımı bir diğer alternatif olabilmektedir. Günümüzde mikroçoğaltım yoluyla tarımsal üretim özellikle süs bitkilerinde etkin olarak kullanılmaktadır. Doku kültürü yöntemleriyle yağ kalitesi ve verimi yüksek jojoba bitkilerinin cinsiyeti belli klonları yeterince geniş ölçüde üretilebilir (Aktaran: Tyagi ve Prakash, 2004: 19; Mills vd., 1997: ).

16 2 Bu tez çalışmasında jojoba bitkisinin doku kültürü yöntemleri ile klonal çoğaltım yeteneği ile moleküler işaretleyicilerle bitkilerin cinsiyetleri belirlenmeye çalışılmıştır. Böylece üstün jojoba bitkilerine ait cinsiyeti belli klonlarla yapılacak olan yetiştiricilikte verim ve kalite artışı ile başlangıçtan itibaren planlı dikim yapılmasına ve arazi planlanmasında başarı ve üretimde zaman kazanılmasına olanak sağlanabilecektir.

17 3 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Jojoba ile ilgili genel bilgiler Alem: Plantae Bölüm: Magnoliophyta Sınıf: Magnoliopsida Takım: Euphorbiales Familya: Simmondsiaceae Cins: Simmondsia Tür: S. chinensis Jojoba, Simmondsiaceae familyasından Simmondsia chinensis olarak adlandırılmıştır. Ancak bu adlandırma bir hata sonucu gerçekleşmiştir de İngiliz doğabilimci H.F.Link Baja Kalifornia ya gelmiş ve jojobanın bitki örneklerini toplamış. Bitkiye başka bir İngiliz Botanikçi olan T.W.Simmonds un adını onur olarak vermiştir. Daha sonra Link farklı bitkiler için Çin i ziyaret etmiş. Jojobanın bulunduğu paketi, Çin den gelen bitki paketiyle yanlışlıkla karıştırmış, Kalifornia dan gelen bitkiler Çin bitkisiymiş gibi tanımlanmıştır. Böylece jojobaya Simmondsia chinensis ismi verilmiştir (Rosengarten, 2004: 295). Jojoba herdem yeşil, boyu 60 cm ile 4.5 metre uzunluğunda olabilen ve gri yeşil renginde yaklaşık 5 cm uzunluğunda oval yapraklara sahip bir çalı bitkisidir (şekil-1). Bazı çöl bitkilerinde olduğu gibi derin kök sistemine sahiptir (Rosengarten, 2004: 295). Bitki kuraklığa karşı yer altındaki neme ulaşabilmek için derin bir kök sistemine sahiptir. Köklerin %80 i toprak yüzünden itibaren ilk 80 cm içerisinde ise de bir iki yılda 4-5 metreye ulaşabilir. Bazı olgun bitkilerde kökler 13 metre derine inebilir (National Research Council, 2002: 20-21). Bu özelliği ile erozyon ile mücadelede mükemmel bir bitkidir.

18 4 Şekil-1: Jojoba bitkisinin genel görünüşü Olgun jojoba bitkisi -9 C ye uzun vadede zarar görmeden dayanabilir, fakat çiçek tomurcukları ve bazı yeni tohumlar -2 C de zarar görebilir ve -6 C de ölürler. Doğal olarak daha çok yıllık yağışı mm olan yerlerde yetişir. Kurak yer bitkisi denmesine rağmen iyi verim ve hızlı plantasyon kurulması için belli miktarda su gerekmektedir. Ticari başarı için yıllık nemin mm olması en iyi plantasyonlar için gereklidir. Bitki iyi drenajın olduğu yerlerde yetişebilir, fakat suyun biriktiği yerlerde hayatta kalamaz (National Research Council, 2002: 23). Sonoran çölünde en büyük ve güçlü jojoba bitkileri, alt toprak katmanlarında kil ve alüvyon içeren iyi drene olmuş topraklarda eğimli arazilerde bulunmaktadır. Ekili alanlarda, bazı bitkiler kumlu topraklarda bazıları ise alüvyonca zengin topraklarda daha iyi yetişmektedir. Bazı yerlerde çok killi toprak uygun olabilir ama iyi drenaja sahip olması şarttır. Bitki gözenekçe fakir toprağa dayanamayabilir. Örneğin sele meyilli topraklar bitki için uygun değildir (National Research Council, 2002: 23-24). Tuzun birikimi kurak toprakların genel bir problemidir. Jojoba toprak drenajı yeterli olan ve uygulamalarının akıllıca yönetimi sağlanan düşük kaliteli suya toleranslıdır. Kaliforniya da bitkiler 2000 ppm tuz içeren suyla yeterli derecede

19 5 büyümektedir. Bir çalışmada; jojobanın bir varyetesinde yaklaşık 7000 ppm tuzlu suya sahip toprakta çiçek oluşumunda bir gerileme olmadığı gösterilmiştir (National Research Council, 2002: 24). Jojoba dioik bir bitkidir. Cinsiyetinin belirlenebilmesi için ilk çiçek tomurcuklarının görülmesi ve bunun içinde 1 ila 4 yıl geçmesi gerekmektedir (National Research Council,2002: 17). Erkek bitki polen üretir ve sadece stamenleri olan çiçekleri vardır. Dişi bitkinin üç yumurta hücresine sahip bir yumurtalığı olan çiçekleri vardır. Çiçek tomurcukları genelde yazın ve sonbaharda büyüme gösterir ve ilkbaharda açarlar. Şekil-2: Jojoba bitkisinin çiçekleri a:dişi, b:erkek çiçekler, a b Normalde çiçeklerin dallar üzerinde almaşık olarak bulunmasına karşın, bazı bitkilerde bunun her boğumda, bazılarında ise üç boğum da bir gerçekleştiği görülmüştür. Erkek çiçekler salkım halinde oluşurken, dişi çiçekler tek tektir (şekil- 2). Dişi çiçeklerde böcekleri çekecek taç yaprağı veya koku yoktur ve bitkinin tozlaşması tamamen rüzgara bağlıdır. Dişi bitkiler çiçekleri tozlaştığında (genelde rüzgar ile) yağ içeren, kahverengi ve yaklaşık fındık tanesi kadar olan tohumlarını bulunduran meyvelerini verirler. Olgun bitkiler yılda kg tohum (kuru ağırlık) verimine sahiptirler, yıllık verim ortalama 2.3 kg civarındadır. Bitki yaklaşık 5 yıl sonra meyve vermeye başlar.

20 6 Hastalık veya böceklerle ciddi zarar görmeyen bir bitkinin ömrü 50 ila 200 yıl arasında değişmektedir (Rosengarten, 2004: 295). Meyveleri meşe palamudunun boyutlarındadır, başta yeşilimsi iken olgulaştıkça kahverengiye döner (şekil-3). Genelde bir tohum içerirler bazen de iki veya üç içerdikleri olur (National Research Council, 2002: 20). Şekil-3: Jojoba bitkisinin tohumları a b a:olgunlaşmamış meyve, b:olgun meyve, Jojobanın tohumlarında %50 oranında yağ bulunmaktadır ve yağı sperm balina yağı ile benzer özelliklere sahiptir (National Research Council, 2002: 76; Greene ve Foster, 1933: ). Sperm balinaları ve diğer yedi balina türünün azalan dünya populasyonunu korumak amacıyla Birleşmiş Milletler 1970 yılında, Sperm balinalarını tehlikedeki türler listesine ekledi ve balinalardan elde edilen yağ, et ve diğer üretimlerin ithalatını yasakladı. Jojoba yağının sperm balina yağının alternatifi olduğuna dair birçok deneysel kanıt bulunmaktadır. Jojoba yağının sperm balina yağından fazla birkaç avantajı bulunmaktadır; a)balık kokusu yok, b)jojobanın ham yağı donyağı içermiyor ve bazı endüstriyel amaçlar için herhangi bir işlem gerektirmiyor, c)daha fazla kükürt alabilir,

21 7 d)kükürtleme işleminde kararmıyor, e)yüksek kükürtlenmiş yağı bile sıvı halde, sperm balina yağının yüksek kükürtlenmiş halinin sıvı kalabilmesi için mineral eklenmesi gerekmektedir (Wisniak, 1987: 1-2). Jojoba yağı yüksek sıcaklık ve basınçta kararlılığını ve viskositesini kaybetmeyen özellikte olması sebebiyle makinelerin yağlanmasında, E vitaminince zengin olmasından dolayı sağlık ve kozmetikte kullanılabilmektedir. Ayrıca penisilin üretiminde, besin endüstrisinde ve cilalama işlemlerinde de kullanılmaktadır Bitki doku kültürü ile ilgili genel bilgiler Modern ıslah metotları olarak kabul edilen tekniklerden birisi olan doku kültürünün bitki ıslahında kullanılması hem zaman hem de uzun dönemde uygulandığı takdirde yapılacak masraflar açısından büyük kolaylıklar sağlamaktadır. Bitki doku kültürü; aseptik şartlarda, yapay bir besin ortamında, bütün bir bitki, hücre (meristematik hücreler, süspansiyon veya kallus hücreleri), doku (çeşitli bitki kısımları=eksplant) veya organ (apikal meristem, kök vb.) gibi bitki kısımlarından yeni doku, bitki veya bitkisel ürünlerin (metabolitler gibi) üretilmesidir. Yeni çeşit geliştirmek ve mevcut çeşitlerde genetik varyabilite oluşturmak doku kültürünün temel amaçları arasında sayılabilir. Bu nedenle bitki doku kültürleri genetiksel iyileştirme çalışmalarında önemli bir rol oynamaktadır. Ayrıca kaybolmakta olan türlerin korunmasında ve çoğaltılması zor olan türlerin üretiminde, çeşitli doku kültürü yöntemleri rutin olarak uygulanmaktadır (Babaoğlu vd., 2001: 2). Bitkisel üretimde doku kültürü yöntemlerinin bir diğer kullanım alanı da ticari amaçlı klonal üretim (mikroçoğaltım) dir. Mikroçoğaltım: Bir bitkiden alınan ve tam bir bitkiyi oluşturabilme potansiyeline sahip bitki kısımlarından (embriyo, tohum, gövde, sürgün, kök, kallus vb) yapay besin ortamlarında ve aseptik koşullar altında yeni bitkilerin elde

22 8 edilmesidir. Mansuroğlu ve Gürel (2001) mikroçoğaltımın bitki yetiştiriciliği ve genetiği yönünden önemi ve avantajlarını şöyle sıralamışlardır: 1.Hastalık ve zararlılardan arındırılmış bitkisel materyal elde edilmesi 2.Kitlesel üretimde aşağıdaki yararların sağlanması: - üretilen bitkilerde fenotipik ve genotipik benzerlik (homojenite) - alışılagelen yöntemlerden daha kısa kültür süresi - zor üretilen türlerin daha kolay üretimi - seçilen belirli/üstün genotiplerin hızlı üretimi - üretimde daha az anaç kullanılması 3. Somaklonal varyasyondan dolayı yeni çeşitlerin/genotiplerin elde edilmesi Yukarıda sayılan yararlarına karşın mikroçoğaltım eğitimli personel, özel laboratuvar koşulları ve sürekli araştırmaya gereksinim duymaktadır. Bu nedenle, yapılan uygulamaların başarısı ekonomik faktörlerle büyük ölçüde sınırlanmaktadır. Doku kültürü ile bitkilerin çoğaltılması pahalı olmasına rağmen, iş gücünü azaltan otomasyon ve robotizasyon teknikleri kullanıldığında, kısa sürede fazla sayıda bitki ekonomik olarak elde edilebilmektedir yılı verilerine göre dünyada saksılı bitkiler, kesme çiçekler, meyve ağaçları ve geofitlerde mikroçoğaltım yöntemleri kullanılarak yaklaşık 600 milyon bitki elde edilmiştir. Başarılı bir mikroçoğaltım için sırasıyla şu aşamalar gerçekleştirilmelidir; 1. Hazırlık aşaması: Bu aşama esas olarak kontaminasyon problemlerinin en aza indirilmesi amacıyla, anaç bitkilerin hijyenik koşullar altında yetiştirilmesini kapsamaktadır. 2. Kültür başlangıç aşaması - Eksplant seçimi: Mikroçoğaltımda çoğunlukla eksplant olarak tepe ve koltuk altı tomurcuklar seçilmekle birlikte farklı organlarda eksplant olarak kullanılmaktadır.

23 9 - Sterilizasyon: Mikroçoğaltımda kullanılan eksplantlar aseptik koşullara konulmadan önce tam anlamıyla sterilize edilmelidir. Sterilizasyon yöntemleri bitkinin yetiştiği ortama ve eksplantın alındığı organa göre farklılık göstermektedir. Kullanılacak dezenfektan maddenin cinsi, konsantrasyonu ve uygulama süresi sterilizasyonun başarısını etkilemektedir. Ayrıca bitki dokularının zarar görmemesine dikkat edilmelidir. - Başlangıç ortamları: Her bitki türü için kullanılan besin ortamları, inorganik maddeler (makro ve mikro besin elementleri), organik maddeler, bitki büyüme düzenleyicileri ve diğer (şeker, agar) maddeleri içermektedir. Kültür amacına ve bitki özelliğine bağlı olarak ortam bileşimi ve konsantrasyonlarında değişiklik olabilmektedir. - Çevresel faktörler: Kültür odasındaki ışık, sıcaklık ve nem bitki türlerinin isteğine göre sürekli kontrol altında tutulmalıdır. 3. Sürgün çoğaltım aşamaları - Besin ortamları: Başlangıç için kullanılan ortamlar çoğaltım aşamasında da kullanılabilmekte ve bazı durumlarda değişiklik yapılabilmektedir. Bitki dokularından organ farklılaşmasında oksin ve sitokininler önemli rol oynamaktadır. - Kallus oluşumu: Kallustan sürgün çoğaltılması ile bazı bitkilerin üretimi yapılabilmektedir. - Adventif tomurcuk oluşumu: Yaprak koltuk altı ya da sürgün tepelerinin dışında herhangi bir yerde oluşan tomurcuklar adventif tomurcuk olarak adlandırılır. Bitki türlerinin klonal üretiminde organlardan doğrudan adventif sürgün oluşumu kallus yönteminden daha iyi sonuçlar vermektedir. - Aksillar (koltuk altı) tomurcuk oluşumu: Aksiller dallanma ile sürgün çoğaltımı yukarıda açıklanan diğer iki yönteme göre başlangıçta daha yavaştır. Fakat her alt kültürde sürgün sayısı logaritmik olarak artar. 4. Sürgün gelişimi ve köklendirme aşaması: Adventif ve aksiler sürgün gelişimi ortamlarında sitokinin varlığı köklenmeyi engellemektedir. Tam bir bitkiyi oluşturmak için sürgünler, farklı bir hormonal kompozisyona sahip olan yeni

24 10 bir ortama aktarılmaktadır. Sürgünler belli bir uzunluğa eriştikten sonra köklenmeleri amacıyla köklenme ortamına alınırlar. 5. Dış ortama alıştırma (aklimatizasyon) aşaması: Steril koşullarda, düşük ışık yoğunluğunda yüksek nem içeren ve tüm besin maddelerinin bulunduğu bir ortamda geliştirilen bitkilerin, daha düşük nem, daha yüksek ışık düzeyi ve steril olmayan koşullara sahip dış ortama aktarılması çok dikkatli ve aşamalı olarak yapılmalıdır. (Mansuroğlu ve Gürel, 2001: ) Jojobanın in vitro hızlı çoğaltımı ile ilgili araştırmalar 1999 da Roussos ve ark. nın yaptıkları bir çalışmada; Jojoba eksplantları BAP ın farklı konsantrasyonları ve bunun gümüş nitratla olan kombinasyonlarını içeren Driver Kuniyuki besin ortamında kültüre alınmıştır. Her ortamda sürgün çoğaltımı başarılmış, eksplant başına en çok sürgün sayısı 15,2 (26.6 μm BAP) olarak elde edilmiştir. Köklenme oranı 49.2 μm IBA μm NAA içeren ortamda %64 e ulaşmıştır. Hamama ve ark de; jojobanın yaprak dokusundan somatik embriyoların elde edilmesi, olgunlaşması ve çimlenmesi üzerine bir çalışma yapmışlardır. Eksplantlar ½ MS ortamı içeren petri kaplarına konmuş ve karanlıkta bekletilmişlerdir. 2,4-D ( μm) nin BAP ve 2 farklı sentetik sitokinin ile kombinasyonları somatik embriyo ve embriyogenik kültür oluşumunda sonuç vermiştir. Embriyogenik kültürler daha sonra farklı oksin ve sitokinin içeren ½ MS ortamına alınmıştır. 3.75μM NAA veya 3.44μM IBA nın BAP (0.44 /1.33μM) veya F3iP (0.37/ 1.11μM) ile kombinasyonlarında somatik embriyonun olgunlaşması, çimlenmesi ve bitkiciklerin gelişimi sağlanmıştır. Tyagi ve Prakash ın 2004 de yaptıkları bir çalışmada; beş farklı jojoba genotipinin erkek ve dişi bireylerinden alınan nodal eksplantlar MS besin ortamında kültüre alınmıştır. 10 μm BAP içeren MS ortamında eksplant başına en fazla sürgün (dişi bireyde 10,erkek bireyde 9) elde edilmiştir. Bazı genotiperde 10µM BAP içeren

25 11 ortamlardaki sürgünler daha fazla süre yaşamlarını sürdürürken, bazı genotiplerde ise 5µM BAP içeren ortamdakiler daha iyi sonuç vermiştir. Genel olarak dişi sürgünler, erkek sürgünlerden daha uzun süre hayatta kalmışlardır. Roussos ve ark de yaptıkları bir çalışmada; jojoba eksplantlarını 169 mm a kadar sodyum klorid içeren temel besin ortamında in vitro da kültüre almışlardır. İkinci ve üçüncü ay eksplantların makro ve mikro elementleri değerlendirilmiştir. Eksplantların potasyum, manganez, fosfor ve nitrat konsantrasyonu düşük olduğu zamanlarda sodyum ve kloridin büyük bir miktarını biriktirdikleri gözlenmiştir. Diğer elementlerin konsantrasyonlarında önemli değişiklikler gözlenmemiştir. Tuz stresinin her seviyesinde eksplantların içeriğinin belirgin şekilde etkilendiği belirtilmiştir. Jojoba eksplantlarının, herhangi bir stres belirtisi göstermeden, 113 mm sodyum klorid konsantrasyonuna kadar toleranslı oldukları saptanmıştır. Bu konsantrasyonun üzerindeki tuzun ise yaprak ve sürgünlerde sararma ve sulanmaya neden olduğu gözlenmiştir Bashir ve ark de; jojobanın altı ırkının in vitro da gelişen sürgünlerinden köklendirme çalışmaları yapmışlardır. MS besin ortamına üç farklı oksinin (IBA, IAA ve NAA) farklı konsantrasyonları ile iki farklı deneme (1.25, 2.50, 5.0 mg L -1 ve 0.5, 1.0, 1.5 mg L -1 ) kurmuşlardır. Birinci denemede 2.50 ve 5.0 mg L -1 oksin içeren ortamlardaki köklenmelerde kallus oluştuğu gözlenmiş, 1.25 mg L -1 oksin içeren ortam daha iyi sonuçlar vermiştir. İkinci denemede ise her ortamda kök gelişimi yeterli olmuş, fakat en iyi sonuç 0.5 mg L -1 IBA içeren ortamda elde edilmiştir. Llorente ve ark de yaptıkları bir çalışmada; organizmalar için karbonhidrat kaynağı ve strese karşı koruyucu olan trehalose nin jojobanın mikroçoğaltımına etkisini araştırmışlardır. 1mM trehalose içeren MS besin ortamında sürgün çoğaltımında büyük oranda artış gözlemlemişlerdir. Sürgün çoğaltım oranı 4.44 mm BAP ve1 mm trehalose içeren MS besin ortamında 4.8 olarak elde edilmiştir. Köklenme oranı 14.7 μm IBA içeren ortamda %46.6 ya ulaşmıştır. Fakat sadece trehalose içeren ortamda kök gelişimi yetersiz kalmıştır.

26 12 Singh ve ark. nın 2008 yılında yaptıkları bir çalışmada; nodal segmentler kullanılarak jojobanın elit dişi ve erkek genotipleri için etkili bir mikroçoğaltım protokolü geliştirilmiştir. Sürgün başlangıcı için en iyi ortam, 4,44µM BAP ve 88,8 μm adenine içeren MS besin ortamı olarak belirlenmiştir. Eksplant başına sürgün elde edilmiş (4.44 μm BAP ve 74.0 μm adenine içeren MS), uzayan sürgünler 48 saat boyunca çeşitli oksin (IAA, IBA, NAA) içeren sıvı ortamlarda tutulduktan sonra chlorogenic asit ve aktif karbon içeren ½ MS ortamında köklendirilmişlerdir (%92). Köklenen bitkiler %99 başarı oranıyla seraya transfer edilmiştir. Bashir ve ark. (2008) nın bir çalışmasında jojobanın altı genotipinin 1,5-3cm uzunluktaki nodal segmentleri, BAP ın, NAA, IAA ve IBA ile kombinasyonlarını içeren MS besin ortamında kültüre alınmıştır. Sürgün başlangıcı için en iyi kombinasyon 5.55 μm BAP μm IAA olarak belirlenmiştir. Gelişen sürgünler IAA(7.1 μm), IBA(6.1 μm), ve NAA(6.7 μm) içeren MS ortamında köklenmişlerdir. IBA içeren ortamda gelişen köklü bitkicikler seraya aktarmada en iyi hayatta kalma oranına (63,33) sahip olmuşlardır. Ancak bitkilerin hayatta kalmaları, onların genotipine ve yaşına bağlı olduğu ortaya konulmuştur. Mohasseb ve ark da; 5 yaşındaki jojoba ağaçlarından koltukaltı sürgünlerinin in vitro klonal çoğaltımını yapmışlardır. Nodal segmentler eksplat kaynağı bakımından en iyi dönem olan mart, mayıs aylarında toplanmıştır. MS+BAP (1 mg/l) + GA 3 (0.5 mg/l) ortamında sürgün çoğaltımı gerçekleştirilmiştir. MS+BAP (1 mg/l) + CH (500 mg/l) ortamına aktarılan kültürlerde sürgün sayısı daha da artmıştır. Ancak her iki ortamda da sürgün büyümesi sağlanamamış ve sürgünler küçük kalmışlardır. Dolayısıyla, uzama ve tekrar sürgün çoğaltımı için MS+BAP (1 mg/l) + CH (250 mg/l) ortamı kullanılmış her 5 haftada bir aynı ortamda alt kültüre alınarak nodal segment başına 7-8 sürgün elde edilmiştir. Köklenme ise %82 oranında 1/4 MS+IBA (0.5 μm) ortamında elde edilmiştir. Mikroçoğaltımı yapılan bitkicikler %70 den daha fazla başarıyla toprağa aktarılmışlardır.

27 13 Abass 2010 da yaptığı bir çalışmada; sürgün tipi eksplantı farklı tuz konsantrasyonları içeren MS, WPM ve B5 ortamlarında kültüre almıştır. Burada gelişen mikro sürgünleri hızlı çoğaltım amacıyla farklı konsantrasyon ve kombinasyonda 2ip, IAA, BAP, KİN içeren mgl -1 ZnSo 4.7H 2 o N 2 H 2Po mgl -1 Boric acid mgl -1 CuSo 4 eklenmiş MS ve 1.25 WPM ortamlarında kültüre almıştır. Sonuçta; sürgün büyümesi için 1.25 WPM veya MS ortamlarının, sürgün çoğaltımı için ise 0.1 2ip mgl mgl -1 IAA+2.0 mgl -1 Kin mgl -1 ZnSo 4.7H 2 o N 2 H 2 Po mgl -1 Boric acid mgl -1 CuSo 4 içeren MS veya 7.0 mgl -1 BA +0.5 mgl -1 IAA mgl -1 ZnSo 4.7H 2 O N 2 H 2 Po mgl -1 Boric acid mgl -1 CuSo 4 içeren 1.25 WPM ortamlarının en iyi sonucu (ortalama 2.5 adet sürgün) verdiğini bildirmiştir. IBA (4.9, 9.9 ve 15.9 mgl -1 ) içeren MS ortamında köklendirmeye aldığı rejenere sürgünlerin sadece 4.9 mgl -1 IBA içeren ortamda %15 oranında köklendiğini rapor etmiştir. Köklenen sürgünler %60 başarıyla aklimatize edilerek toprağa (torf:toprak 1:2 v/v) aktarılmıştır Genetik Markörler Kalıtım şekilleri, morfolojik (çiçek rengi gibi), biyokimyasal (izoenzimler gibi) ve DNA düzeyinde (moleküler markörler) izlenebilen karakterlere genetik markörler denir. Bu karakterlerin markör (işaret) olarak isimlendirilmesinin nedeni, çalışılan organizmadaki ilgilenilen diğer özelliklerin genetiği hakkında, dolaylı da olsa, bilgi sağlamalarıdır. Moleküler markörler DNA nın aktif bölgelerinden (genler) veya herhangi bir genetik kodlama fonksiyonuna sahip olmayan DNA dizilerinden geliştirilebilirler (Yıldırım ve Kandemir, 2001: 334). Genetik markörler morfolojik markörler, protein markörleri ve DNA markörleri olmak üzere üç ana başlık altında toplanabilir. Morfolojik markörler çok uzun zamandır bilinmelerine rağmen sayılarının az oluşu yanında çevreden ve diğer lokuslardan etkilenmeleri nedeniyle fazlaca kullanılmamaktadırlar (Yıldırım ve Kandemir, 2001: 349).

28 14 Protein markörleri, depo proteinleri ve enzim proteinleri olarak iki ana gruba ayrılırlar. Proteinler bir jel üzerinde hareket ettirilip boyandıklarında, farklı genotiplerde ortaya çıkan yapı farklılıkları genetik markör olarak kullanılabilir. En önemli avantajları analizlerinin çabuk, güvenilir ve tekrarlanabilir olmasıdır. En büyük dezavantajları ise, sayıca çok az olmalarıdır. DNA markörleri farklı genotiplere ait DNA nükleik asit diziliş farklılığını çeşitli şekillerde ortaya koyan markörlerdir. Bunlar, a) DNA melezleme markörleri ve b) Polimeraz zincir reaksiyonu kullanımına dayalı DNA çoğaltım markörleri olmak üzere iki grup altında incelenirler (Yıldırım ve Kandemir, 2001: ) yılında Kary Mullis tarafından geliştirilen ve günümüzde yaygın olarak kullanılan PCR, (Polymerase Chain Reaction) DNA polimeraz enziminin kullanılmasıyla suni şartlarda DNA üretilmesini ifade etmektedir (Ateş, 2006: 367). Bu üretim için 6-25 nükleotid uzunluğunda başlatıcı DNA lar (primerler) gerekir. Reaksiyon ortamında ayrıca ph yı ve tuz konsantrasyonunu optimum hale getiren tampon çözelti, polimeraz enziminin ihtiyaç duyduğu MgSO 4 ve DNA üretiminde kullanılacak A, T, G, C nükleotidlerinden her biri bulunur. Polimeraz enzimi, bu başlatıcı DNA nın bir kalıp DNA üzerine bağlanmasından sonra, onu bir uçtan uzatmaya başlar ve kalıp DNA nın aynısını üretir. DNA üretim işlemi birbirini izleyen bir seri çok spesifik sıcaklık devrelerinde yapılır. Önce 95 C civarında bir sıcaklık kullanımıyla kalıp DNA nın çift sarmal yapısı açılır ve DNA tek iplik haline getirilir. Sonra C arasında bir sıcaklıkta başlatıcı DNA nın kalıp DNA ya yapışması sağlanır. Son olarak 72 C DNA üretimi yapılır. Bu devrelerin her birinde sadece 1-2 dakika kullanılır. Bu üç devre isteğe bağlı olarak defalarca (normalde yaklaşık30-45 defa) tekrarlanır ve DNA üretimi tamamlanmış olur (Yıldırım ve Kandemir, 2001: 354). PCR yöntemi kolay uygulanabilir olması ve hızlı sonuç vermesi gibi avantajları nedeniyle; tür içi ve türler arası genetik varyasyonların belirlenmesinde, kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısında, prenatal (doğum öncesi) tanıda, patojen (hastalık yapabilecek) organizmaların saptanmasında, adli tıpta, kanser yapan

29 15 hücrelerin oluşum evresinin araştırılmasında ve benzeri birçok farklı alanda kullanılabilmektedir. Jojoba bitkisinde de cinsiyetin belirlenmesinde PCR yöntemi kullanılmıştır. Yapılan bazı çalışmalar aşağıda verilmiştir. ISSR (Inter-simple sequence repeat) tekniği ile jojobanın cinsiyetini belirlemeye çalışan Sharma ve ark. (2008) araştırmalarında 42 ISSR primeri kullanmışlar ve bunlardan sadece birinde (UBC-807) erkek bireylerde yaklaşık 1200 baz çifti uzunluğunda bir parçacık üretildiğini tespit etmişlerdir. Çalışmada UBC-807 ile taranan erkek bitkilerin hepsinde bu parçanın sentezlendiği, buna rağmen dişi bitkilerde parçanın oluşmadığı, bu verilere göre UBC-807 primerinin jojobanın cinsiyet tayini için kullanılabileceği ifade edilmiştir. Agrawal ve ark. (2007) jojobanın cinsiyet tayini için RAPD (random amplified polymorphic DNA) tekniğini kullanmışlar, denedikleri 72 primerden sadece bir tanesinde (OPG-5) erkek bireylerde yaklaşık 1400 baz çifti uzunluğunda bir parçacık üretildiğini tespit etmişlerdir. Çalışmada erkek bitkilerle birlikte dişi bitkilerde taranmış, OPG-5 primeri ile taranan bitkilerden sadece erkek bireylerde bu parçanın oluştuğu belirlenmiş, bu primerin jojobanın cinsiyet tayini için kullanılabileceğini vurgulanmıştır.

30 16 3. MATERYAL VE METOT Tüm doku kültürü ve moleküler genetik çalışmalar Selçuk Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarla Bitkileri Bölümü Biyoteknoloji Laboratuvarı nda gerçekleştirilmiştir Materyal Tez çalışmasında materyal olarak, Simmondsia chinensis (Link) Schneider, türüne ait tohumlar ile Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü nden temin edilen cinsiyeti belli fidanlara ait bitki örnekleri kullanılmıştır Metot Bitki doku kültürü çalışmaları Besin ortamlarının hazırlanışı ve sterilizasyonu Bütün ortamlar ve stok solüsyonları, Sigma ve Merck ten elde edilen analitik seviyede kimyasallar kullanılarak hazırlanmıştır. MS (Murashige ve Skoog, 1962) besin ortamı ticari olarak hazırlanmış toz preparatlar veya stok solüsyonları ile hazırlanmış çözeltilere karbon kaynağı olarak sakkaroz ve yarı-katı hale getirmek için agar ve bitki büyüme düzenleyicileri ilave edilerek hazırlanmıştır. Sakkaroz (%3) katı olarak ilave edilmiştir. Sakkaroz tamamen eritildikten sonra ortamın ph sı N KOH ya da N HCl ile 5.8 e ayarlanmış, distile su ile istenilen hacme tamamlanmış, 8 g l -1 agar ilave edilmiş ve ısıtıcılı manyetik karıştırıcıda eritildikten sonra otoklava dayanıklı cam şişelere konularak 121 C de 1.5 atm. basınç altında 20 dakika boyunca sterilize edilmiştir. Sterilize edilmiş ve aynı zamanda agarı tam olarak erimiş olan besin ortamları, içerisi % 96 lık etil alkolle silinmiş ve 20 dakika süreyle açık bırakılan ultra-viyole (U.V.) lambası ile sterilize edilmiş olan 0.22 µm porozitede hepa filtrelere sahip yatay hava akışlı (0.5 m sn -1 ) kabin içerisinde

31 17 önceden steril edilmiş olan Magenta kültür kaplarına dağıtılmıştır. Besin ortamları donduktan sonra kapakları sıkıca kapatılmış ve kullanıma hazır hale gelmişlerdir Bitki büyüme düzenleyicileri Toz halindeki büyüme düzenleyiciler uygun çözücülerde çözülmüş, saf su ile istenilen miktarda ve oranda hacimleri ayarlanarak stok solüsyonları hazırlanmıştır. Kullanılan büyüme düzenleyicileri, çözücüleri ve saklama koşulları tablo-1 de verilmiştir. Temel besin ortamına (MS) çeşitli oksin (NAA, IAA, IBA) ve sitokinin (BAP, KİN, TDZ) büyüme düzenleyicileri ilave edilmiştir. Sürgün çoğaltımı için BAP, KİN,(0.5, 1, 2 mg l -1 ), TDZ(0.22, 0.44, 0.88mg l -1 ) ve BAP(1.5, 2, 2.5 mg l - 1 ) ın NAA, IAA, IBA (1.25 mg l -1 ) ile kombinasyonları kullanılmıştır. Köklenme için ise temel besin ortamına (MS, 1/2MS ve sakkarozu yarıya düşürülmüş 1/2MS) oksinlerin ( NAA, IAA, IBA) farklı konsantrasyonları eklenmiştir. Tablo-1: Kullanılan büyüme düzenleyiciler, çözücüleri ve stok saklama koşulları Büyüme Düzenleyicileri Çözücü Saklama Koşulları ( o C) Sterilizasyon şekli otoklav(o)-filtre(f) Oksinler NAA (α-naftalenasetik asit) 1N KOH +4 O IAA (Indol-3-asetik asit) 1N KOH +4 F IBA(Indol-3-bütirik asit) 1N KOH +4 F Sitokininler BAP (6-benzilaminopürin) 1N NaOH +4 O KIN (Kinetin) 1N NaOH +4 F TDZ(Thidiazuran) 1N KOH +4 O

32 Yeşil aksamın sterilizasyonu Bitki dalları yapraklarından ayrıldıktan sonra, nodal segmentleri zarar görmeyecek şekilde belli aralıklarla kesilerek farklı konsantrasyonlardaki alkol, ticari çamaşır suyu, HgCl 2 (civa klorür) ve yayıcı-yapıştırıcı madde (Tween-20) içeren çözeltiler ile muamele edildikten sonra steril saf su ile durulanarak sterilize edilmişlerdir. Yapılan uygulamalar tablo-2 de verilmiştir. Tablo-2: Yeşil aksam için uygulanan sterilizasyon işlemleri Uy. no Sterilizasyon öncesi Ön sterilizasyon aşaması Sterilizasyon aşaması Durulama aşaması yarım saat musluk suyu altında tutuldu yarım saat musluk suyu altında tutuldu yarım saat musluk suyu altında tutuldu yarım saat musluk suyu altında tutuldu yarım saat musluk suyu altında tutuldu yarım saat musluk suyu altında tutuldu _ %50 lik alkol de 30 sn bekletildi ve 1 kez steril saf sudan geçirildi. %50 lik alkol de 30 sn bekletildi ve 1 kez steril saf sudan geçirildi. _ %10 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk. karıştırıldı. %30 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk. karıştırıldı. %60 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk. karıştırıldı. %20 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 10dk. karıştırıldı. %30 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk. karıştırıldı. %30 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 30dk. karıştırıldı ve %96 lık alkolde 2-4 sn bekletildi. 3 kez steril saf su ile durulandı. 3 kez steril saf su ile durulandı. 3 kez steril saf su ile durulandı. 3 kez steril saf su ile durulandı. 3 kez steril saf su ile durulandı. 3 kez steril saf su ile durulandı.

33 yarım saat musluk suyu altında tutuldu yarım saat musluk suyu altında tutuldu yarım saat musluk suyu altında tutuldu yarım saat musluk suyu altında tutuldu yarım saat musluk suyu altında tutuldu 1-2 damla tween-20 damlatılmış suda 15 dk karıştırıldı ve ardından 1 kez steril saf sudan geçirildi 1-2 damla tween-20 damlatılmış suda 15 dk karıştırıldı ve ardından 1 kez steril saf sudan geçirildi 1-2 damla tween-20 damlatılmış suda 15 dk karıştırıldı ve ardından 1 kez steril saf sudan geçirildi _ %70 lik alkol de 30 sn bekletildi ve 1 kez steril saf sudan geçirildi %96 lık alkol de 30 sn bekletildi ve 1 kez steril saf sudan geçirildi _ %40 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 20dk. karıştırıldı ve %96 lık alkolde 2-4 sn bekletildi %50 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 20dk. karıştırıldı ve %96 lık alkolde 2-4 sn bekletildi. %0,05 HgCl 2 de 20dk. karıştırıldı. %0,1 HgCl 2 de 15dk. karıştırıldı. %0,2 HgCl 2 de 10dk. karıştırıldı. %30 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk. karıştırıldı. %30 çamaşır suyu+1-2 damla tween-20 de 15dk. karıştırıldı. %0,2 HgCl 2 de 10dk. karıştırıldı. 3 kez steril saf su ile durulandı. 3 kez steril saf su ile durulandı. 4 kez steril saf ile durulandı. 4 kez steril saf ile durulandı. 4 kez steril saf su ile durulandı. 4 kez steril saf ile durulandı 4 kez steril saf ile durulandı 4 kez steril saf ile durulandı

34 Tohumların sterilizasyonu ve çimlendirilmesi Sterilizasyon işleminde ilk olarak 30 saniye süreyle % 50 lik (h/h) alkol ile muamele edilen tohumlar 1 kez steril saf sudan geçirildikten sonra, 1-2 damla yayıcıyapıştırıcı madde (Tween-20) ihtiva eden % 30 luk (h/h) ticari hipoklorit çözeltisi (%50 NaOCl içeren HES) içinde 15 dakika çalkalanmıştır. Sürenin sonunda 3 defa steril saf su ile durulanarak sterilizasyon işlemi tamamlanmıştır. Steril olan tohumlar bistüri yardımıyla çizilerek, 50 ml MS besin ortamı içeren magenta kültür kaplarında 24 o C de 16 saat ışık ve 8 saat karanlık fotoperiyotta çimlendirmeye alınmışlardır (şekil-4). Şekil-4: İn vitro da çimlendirilen steril jojoba tohumları İn vitro'da yetiştirilen fidelerden eksplant izolasyonu İn vitro da çimlenen bitkilere ait nodal segment eksplantı 12 haftalık bitkilerden, bir nod bölgesi içerecek biçimde yaklaşık 1.5 cm uzunluğunda parçalara ayrılmış ve sürgün çoğaltımı için magenta kültür kaplarına 5 er eksplant içerecek şekilde yerleştirilmiştir. Tüm kültürler 16 saat fotoperiyot, % oransal nem, 24±1 C ve 3000 lüks beyaz floresan ışık yoğunluğu koşullarında raflı kültür dolabında tutulmuştur.

35 Sürgünlerin köklendirilmesi ve dış ortama alıştırma İn vitro da çoğalan sürgünler köklenme için temel besin ortamına (MS, 1/2MS ve sakkarozu yarıya düşürülmüş 1/2MS) oksinlerin ( NAA, IAA, IBA) farklı konsantrasyonları eklenerek oluşturulan ortamlara alınmışlardır. Köklenen sürgünler daha sonra iklim odasında steril torf içeren küçük saksılara aktarılmıştır. Saksılara naylon poşet geçirilmiş ve 1 hafta sonra poşet belli yerlerinden açılarak ve daha sonraki haftalar tamamen çıkartılarak bitkiciklerin hem dış şartlara uyumu hem de kök sisteminin gelişmesi sağlanmıştır Verilerin değerlendirilmesi Mikroçoğaltım denemeleri her bir doz için Magenta kültür kaplarına 5 er eksplant olacak şekilde 3 tekerrürlü (toplam 15 eksplant), köklenme denemeleri ise her bir doz için 10 deney tüpüne 1 er eksplant konularak kurulmuştur. Mikroçoğaltım denemelerinde eksplantlardan oluşan sürgün sayıları (adet) sayılmıştır. Köklenme denemelerinde köklenen sürgün sayıları kayıt edilmiştir. Deneme sonunda elde edilen veriler bilgisayarda MSTAT-C istatistik programı kullanılarak analiz edilmiş, önemli bulunan sonuçlarda çoklu karşılaştırma testi olan LSD yapılmış ve literatür bilgileri ile kıyaslamalı olarak yorumlanmıştır Moleküler Genetik Çalışmalar DNA izolasyonu, konsantrasyonu ve saflıklarının belirlenmesi DNA izolasyonu hassas terazide 0.2 g tartılarak toplam 10 bitkiden alınan örneklerle ayrı ayrı (bireysel) olarak gerçekleştirilmiştir. DNA izolasyonu için Doyle ve Doyle (1987) ile Özkaya ve ark. (2009) da belirtilen metodların birleştirilip tekrar modifiye edilmesiyle oluşturulan aşağıdaki metoda göre yapılmıştır.

36 22 1- Hassas terazide tartılan örnekler steril havan içerisinde sıvı azotta topuz yardımıyla ezilerek toz haline getirilmiş ve 2 ml lik mini santrifüj tüplerine alınmıştır. 2 - Üzerine 1 ml çözelti (CTAB + %1 β-mercaptoethanol + %2 PVP) ilave edilmiş ve tüpler 65 C deki blok ısıtıcıda 30 dk bekletilmiştir. 3- Blok ısıtıcıdan çıkarılan tüplerin üzerine 500 µl kloroform ilave edilmiştir. 4- Tüpler, 7000 rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir. 5- Santrifüj işlemi sonrasında tüpün üst kısmındaki ayrılmış fazdan 600 µl çekilerek yeni bir 2 ml lik mini santrifüj tüpüne konularak ve üzerine 400 µl isopropanol ilave edilerek DNA nın ayrıştığı gözlenmiştir. 6- Tüpler, rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir. 7- Santrifüj sonrasında tüpün dip kısmına çökelen DNA nın (DNA pelleti) düşmemesine dikkat edilerek üsteki faz tüpten uzaklaştırılmıştır. 8- Pelletin üzerine %70 ethanol+10 mm amonyum asetat çözeltisinden 1ml ilave edilmiş ve rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir. 9- Santrifüj sonrasında pellet görülerek üsteki faz dökülmüş, tüplere %70 lik ethanol konulmuş ve yeniden rpm de 5 dk santrifüj edilmiştir. 10- Üsteki sıvı uzaklaştırılıp DNA pelleti oda sıcaklığında kurumaya bırakılmıştır. 11- Kuruyan pelletin üzerine 200 µl PCR suyu (ddh2o ) konulmuş, DNA çözündürülmüş ve etiketlenerek -20 C de muhafaza edilmiştir. İzolasyon sonrasında elde edilen DNA ların, konsantrasyon ve saflıkları spektrofotometrede (Nanodrop ND-100) belirlenmiştir. DNA lar % 1 lik agaroz jelinde yürütülmüş ve görüntüleme cihazında (Vilber Laurmat, Fransa) DNA nın varlığı tespit edilmiştir PCR Çalışmaları Agrawal vd.(2007) ve Sharma vd.(2008) e göre jojoba bitkisi için cinsiyet teşhisinde başarılı sonuç elde edildiği ifade edilen iki primer OPG-5 ve UBC-807

37 23 çalışmadaki bitkilerin cinsiyet tespiti için kullanılmış ve primerlere ait bilgiler tablo- 3 te verilmiştir. Tablo-3: Çalışmada kullanılan primerlere ait bilgiler Primer Primer sekans %G C Tm ( C) (5-3 ) oranları OPG-5 5 CTGAGACGGA UBC AGAGAGAGAGAGAGAGT Reaksiyonlar ön denemeler ile optimize edildikten sonra, 1 µl DNA (20 ng µl - 1 ) ve 24 µl reaksiyon karışımı [2.5 µl x10 PCR tampon çözeltisi (Fermentas), 2.5 µl 25 mm Mg +2 (Fermentas), 0.4 µl 25 mm dntp (Fermentas), 0.3 µl 500 U Taq DNA Polimeraz (Fermentas), 0.5 µl 50 pmol. µl -1 primer ve 17.8 µl PCR suyu] ile tablo- 4 de verilen pcr koşullarına göre Eppendorf mastercycler gradient cihazında gerçekleştirilmiştir. Tablo-4: Primerler için optimize edilmiş PCR reaksiyon koşulları ve süreleri OPG-5 UBC C 3 dk 94 C 3 dk 94 C 1 dk 30 C 1 dk x38 94 C 20 sn 50 C 1 dk 72 C 2 dk 72 C 1.5 dk 72 C 10 dk 72 C 7 d x35 PCR ürünleri %2 lik agaroz (Serva) jel elektroforezi ile marker (Fermentas 200bp DNA ladder) eşliğinde yürütülmüş ve Vilber Lourmat (Fransa) görüntüleme sistemiyle görüntülenmiştir.

38 24 4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI VE TARTIŞMA 4.1. Bitki doku kültürü çalışmaları Sterilizasyon çalışmaları Simmondsia chinensis (Link) Schneider türünün yeşil aksam kısmı için uygulanan sterilizasyon işlemlerinde (tablo-2) istenilen sonuçlara ulaşılamamıştır. Bu denemelerden en iyi sonuç 11(önce yarım saat musluk suyu altıda tutulan eksplantlar %0,2 HgCl 2 de 10dk. karıştırıldıktan sonra 4 kez steril saf sudan geçirildi) ve 14 (önce 15 dk. 1-2 damla tween-20 damlatılmış suda tutulan eksplantlar %0,2 HgCl 2 de 10dk. karıştırıldıktan sonra 4 kez steril saf sudan geçirildi) nolu uygulamalarda elde edilmesine rağmen istenilen oranda bir sterilizasyon sağlanamamıştır. Ayrıca HgCl 2 uygulanarak sterilizasyonu sağlanan eksplantların çoğunda daha sonraki zamanlarda kahverengileşerek canlılıklarını yitirdikleri gözlemlenmiştir. Tablo-5 te uygulanan sterilizasyon uygulamalarındaki 10. gün sonunda kontamine (bulaşma) olmayan yani steril kalan eksplant yüzdeleri verilmiştir. Her bir sterilizasyon uygulamasında 20 eksplant kullanılmıştır. Tablo-5: Sterilizasyon uygulamalarına ait steril eksplant yüzdeleri Uygulama No Steril eksplant yüzdesi (%)

39 25 Uygulamalarımızdaki sterilizasyon yüzdelerinin genelde düşük olması ve % 40 ın üzerindeki sterilizasyon yüzdesine sahip uygulamalarda da HgCl 2 kullanılmasının etkisiyle eksplantların çoğu canlılıklarını kaybettiklerinden dolayı mikroçoğaltım için in vitro da steril tohumlardan elde edilen steril fidelerin kullanılmasına karar verilmiştir. Eksplantlar gelişme mevsiminin başlangıcında aktif büyüyen sürgünlerden alındığında daha başarılı sonuçlar elde edilmektedir (Mansuroğlu ve Gürel 2001:266). Alata Bahçe Kültürleri Araştırma Enstitüsü nden gelen bitki örneklerinin dallarının yaşlı olması ve bize ulaşımı sırasındaki olumsuz koşulların (nemli ve gazeteye sarılı olarak gelmesi) sterilizasyonu önemli derecede etkilediği düşünülmektedir. Ayrıca doku kültürü çalışmaları boyunca sera koşullarında saksılarda tohumdan yetiştirdiğimiz bitkilerin genç dallarından alınan eksplantlar en iyi sterilizasyon yöntemiyle sterilize edildiğinde sterilizasyon oranının % 80 e ulaştığı belirlenmiştir Mikroçoğaltım çalışmaları Tohumlarında %50 oranında yağ bulunan jojoba bitkisinin erkek ve dişi çiçekleri ayrı ayrı fertlerde bulunmakta ve yalnız dişi çiçekli olanlar meyve bağlayabilmektedir. Cinsiyetinin belirlenebilmesi için ilk çiçek tomurcuklarının (1-4 yıl) görülmesi gerekmektedir (National Research Council, 2002:17). Bu yüzden planlı bir şekilde ekimi yapılamamakta ve zaman kaybına neden olunmaktadır. Son zamanlarda jojoba bitkisinin doku kültürü yöntemleri ile çoğaltımı cinsiyeti belli bitkilerin üretilmesinde uygun bir yöntem olarak uygulanmaktadır. Bu yöntemle kurulan plantasyonlarda, erkek ve dişi bitkiler yetiştiricinin bilgisi dahilinde olduğundan, tohumla üretmeye nazaran uzun zaman beklemeden planlı bir şekilde dikim yapılabilmektedir.