Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ SİYAH ÜZÜMDE (Vitis vinifera L.) BULUNAN RESVERATROL ÜN ÜRETİM VERİMİNİN ARTIRILMASINA SES ÖTESİ DALGALARIN ETKİSİ Ebru ERTE KİMYA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ANKARA 2007 Her hakkı saklıdır

2 Doç. Dr. Afife GÜVENÇ danışmanlığında, Ebru ERTE tarafından hazırlanan Siyah üzümde (Vitis vinifera L.) bulunan Resveratrol ün Üretim Veriminin Artırılmasına Ses Ötesi Dalgaların Etkisi adlı tez çalışması 06/07/2007 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı nda YÜKSEK LİSANS TEZİ olarak kabul edilmiştir. Başkan : Prof. Dr. Birhan KUNTER Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Nuray YILDIZ Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Üye : Doç. Dr. Afife GÜVENÇ Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Yukarıdaki sonucu onaylarım Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU Enstitü Müdürü

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi SİYAH ÜZÜMDE (Vitis vinifera L.) BULUNAN RESVERATROL ÜN ÜRETİM VERİMİNİN ARTIRILMASINA SES ÖTESİ DALGALARIN ETKİSİ Ebru ERTE Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Mühendisliği Anabilim Dalı Danışman: Doç. Dr. Afife GÜVENÇ Bitkilerin biyotik veya abiyotik bir stres faktörü ile karşılaştıklarında sentezledikleri düşük molekül ağırlığındaki maddelere fitoaleksinler adı verilmektedir. Fitoaleksinler, bitki savunma mekanizmalarının ürünleri olarak sentezlenebilen, ikincil bitki metabolitleridir. Çok düşük derişimlerde sentezlenmekte olan bu maddelerin, bitkilerin, stres koşulları altında korunma ve dayanım mekanizmalarını oluşturmalarında rol oynadıkları bilinmektedir. Stilben grubuna dahil bir polifenol olan resveratrol, en önemli fitoaleksinlerden biridir. Tıp ve eczacılık araştırmalarında, kalp hastalıkları ve kanser riskini azaltan güçlü antioksidan özelliği olduğu bilinmektedir. Doğal koşullarda bitkilerin aynı düzeyde strese maruz kalmaları mümkün olmadığından fitoaleksin sentezi, her zaman aynı miktarda olamayacaktır. Bu nedenle, sekonder metabolitlerin kontrollü koşullarda elde edilmesi önem taşımaktadır. Kısa dalga boylu ışınlar (UV), ses ötesi dalgalar (SÖD) ve kimyasal maddeler (AlCI 3, CuSO 4, AgNO 3, salisilik asit vb.) gibi abiyotik uyarıcıların resveratrol ve diğer stilbenlerin üretimine etkileri araştırılmaktadır. Ses ötesi dalgalar ise, tepkimelerde başlatıcı olarak görev yapması, üretim verimini artırması, tepkime süresini kısaltması ve tepkime yol izini değiştirerek farklı ürünlerin elde edilmesini sağlaması ile kimyasal ve biyokimyasal tepkimeler üzerinde çoğunlukla olumlu etkiler göstermektedir. Bu çalışmanın amacı, taze ve dondurulmuş Kalecik Karası üzümündeki ( Vitis vinifera L.) resveratrolün üretim veriminin artırılmasına ses ötesi dalgaların etkisinin araştırılmasıdır. Tez kapsamında, tepkime süresi (24 saat,48 saat ve 72 saat), SÖD uygulama tipi (periyotlu ve sürekli), üzüm durumu (taze ve donmuş), frekans (20 ve 30 khz), SÖD uygulama süresi (10 dakika ve 1 saat) ve çubuk çapının (13 mm ve 19 mm) üretim verimine etkileri incelenmiştir. Taze ve donmuş üzüm kabuklarına SÖD uygulamadan önce ve sonra alınan örnekler, Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi yöntemiyle analizlenmiştir. Deneysel bulgulara göre, en yüksek resveratrol derişimi, taze üzümler için 24 saat, donmuş üzümler için 48 saat tepkime süresi sonunda elde edilmiştir. 30 khz frekansta SÖD uygulamasıyla, 20 khz frekanstaki uygulamaya göre daha yüksek resveratrol derişimine ulaşıldığı ve periyotlu uygulamanın sürekli uygulamaya göre daha etkili olduğu görülmüştür. 20 khz frekansta 1 saat süresince periyotlu ( 0.1 s açık- 0.9 s kapalı) SÖD uygulamasıyla, en yüksek resveratrol derişimi, taze üzümler için 24 saatlik tepkime süresi sonunda 20 kat artışla 3.63 mg/g kabuk, donmuş üzümler için ise, 48 saatlik tepkime süresi sonunda 8 kat artışla 1.33 mg/g kabuk olarak bulunmuştur. 30 khz frekansta taze üzümlere SÖD uygulandığında ise, 1 saat süresince periyotlu ( 0.5 s açık-0.5 s kapalı) uygulama ile 24 saatlik tepkime süresi sonunda, en yüksek resveratrol derişimi 2.92 mg/g kabuk (16 kat artış) olarak elde edilmiştir. Aynı frekansta, donmuş üzümlere 10 dakika boyunca periyotlu (0.5 s açık-0.5 s kapalı) SÖD uygulandığında, en yüksek resveratrol derişimine (2.53 mg/g kabuk) 15 kat artışla 48 saatlik tepkime süresi sonunda ulaşılmıştır. Bulgulardan da görüldüğü gibi, taze kabuklarda donmuş örneklere göre daha yüksek derişimde resveratrol üretilmektedir. Ayrıca, taze üzüm kabuklarına 20 khz frekansta 19 mm çaplı çubuk ile (3.81 mg/g kabuk) SÖD uygulandığında, 13 mm çaplı çubuk ile (3.63 mg/g kabuk) bulunan sonuçlara göre, biraz daha yüksek derişimde resveratrol üretildiği görülmüştür. Sonuç olarak, siyah üzüm kabuğunda abiyotik uyarıcı olarak ses ötesi dalga kullanımının resveratrol üretim veriminin artmasına olumlu etkisi olduğu gözlenmiştir. 2007, 115 sayfa Anahtar Kelimeler: Ses Ötesi Dalga, Resveratrol, Abiyotik Uyarıcı, Kalecik Karası i

4 ABSTRACT Master Thesis THE EFFECT OF ULTRASOUND TO INCREASE THE PRODUCTION EFFICIENCY OF RESVERATROL IN Vitis vinifera L. Ebru ERTE Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemical Engineering Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Afife GÜVENÇ Phytoalexins are called substances that are by plants when they are exposed to biotic or abiotic stress factor and have low molecular weight. Phytoalexins are secondary plant metabolites that could be synthesized as products of defense mechanisms of plant. It is known that these substances act to form preservation and resistance mechanisms of plants under stress. Also, they are synthesized in low concentrations. Resveratrol which is a polyphenol included in stilbene group are one of the most important phytoalexins. It is well known that it has a strong antioxidant property and reduces risk of cancer and heart diseases in the pharmacy and medicine research. Phytoalexins can not be always synthesized at the same amount because of the fact that the plants can not be exposed to stress at same level in natural conditions. For this reason, productions of secondary metabolites in controlled conditions are very important. The effects of abiotic elicitors such as short wavelength ray (UV), ultrasound (US) and chemicals (AlCI 3, CuSO 4, AgNO 3, salicylic acid etc.) on the resveratrol and other stilbenes productions have been searching. Ultrasound has positive effect on chemical and biochemical reactions. Generally, it acts as an initiator in reactions, decreases the reaction time, increases the production yield and provides to form of different products by changing reaction pathway. The aim of this study is to investigate of the effect of ultrasound on the production efficiency of transresveratrol in fresh and frozen Kalecik Karasi Clone 15 Cultivar (Vitis vinifera L.). The effects of incubation time (24 h, 48 h and 72 h), type of ultrasonic irradiation (in pulse mode and in continuous mode), state of grape (fresh and frozen), frequency (20 and 30 khz), time of ultrasonic irradiation (10 min and 1 h) and probe diameter (13mm and 19mm) on production efficiency was examined in this thesis. The samples taken before and after application of ultrasonic irradiation to fresh and frozen grape skins were analyzed by High Pressure Liquid Chromatography. According to experimental results, the highest resveratrol concentration was reached at the end of incubation time of 24 hours and 48 hours for fresh grapes and for frozen ones, respectively. It was observed that application ultrasound at 30 khz provided the higher trans-resveratrol concentration than that of 20 khz and application of ultrasonic irradiation in pulse mode was more effective than that of continuous mode. It was found that the highest concentration of resveratrol by ultrasonic irradiation at 20 khz during 1 hour in pulse mode (0.1 s on -0.9 s off) was 3.63 mg/g skin (20 fold increase) for fresh grapes at the end of incubation time of 24 hours and 1.33 mg/g skin (8 fold increase) for frozen grapes at the end of incubation time of 48 hours. The highest resveratrol concentration was 2.92 mg/g skin (16 fold increase) at the end of incubation time of 24 hours when ultrasonic irradiation was applied to fresh grapes at 30 khz during 1 hour in pulse mode. At the same frequency, when ultrasonic irradiation was applied to frozen grapes during 10 minutes in pulse mode (0.5 s on 0.5s off), the highest resveratrol concentration (2.53 mg/g skin) was reached with 15 fold increase at the end of incubation time of 48 hours. As it was seen from results, resveratrol could be produced in the high concentration in fresh skins when it compared with frozen ones. Also, it was observed that the fresh grape skins produced a little bit more resveratrol (3.81 mg/g skin) by ultrasonic irradiation at 20 khz using probe having 19 mm diameter than that of probe having 13 mm diameter (3.63 mg/g skin). As a result, it was observed that the usage of ultrasound as an abiotic elicitor in Vitis vinifera L. has a positive effect to increase of the production efficiency of trans-resveratrol. 2007, 115 pages Key Words: Ultrasound, Resveratrol, Abiotic elicitor, Kalecik Karasi ii

5 TEŞEKKÜR Tez çalışmalarımı yönlendiren, araştırmalarımın her aşamasında bilgi, öneri ve yardımlarını esirgemeyerek engin fikirleriyle yetişme ve gelişmeme katkıda bulunan danışman hocam sayın Doç. Dr. Afife GÜVENÇ e teşekkürlerimi sunarım. Araştırmam süresince büyük yardımlarını gördüğüm, bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım, akademik ortamda olduğu kadar beşeri ilişkilerde de engin fikirleriyle yetişme ve gelişmeme katkıda bulunan değerli hocalarım Prof. Dr. Birhan KUNTER, ve Dr. Nurhan KESKİN e (Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü) en içten teşekkürlerimi ve şükranlarımı sunarım. Tezimin değişik aşamalarında bilimsel düşüncelerini benimle paylaşan ve manevi desteklerini gördüğüm değerli hocam Prof. Dr. Ülkü MEHMETOĞLU ve Uzman Nilüfer VURAL a teşekkür ederim. Akademik çalışmaların yanı sıra hayatımın her aşamasında pratik çözümleriyle bir hoca bir arkadaş olarak değerli varlığını esirgemeyen Araş. Gör. H. Tuğba GÜMÜŞDERE ye ve yanımda olsun yada olmasın her konuda bana destek olan sayın Onur TUNA ya sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ve çalışmalarım süresince birçok fedakarlıklar göstererek maddi, manevi her konuda beni destekleyen annem Ayşe ERTE ye, babam Ali ERTE ye ve ablam Esra ERDEN e bana olan güvenleri ve hoşgörüleri için en derin duygularla teşekkür ederim. Son olarak, varlığıyla canıma can katan biricik anneanne me iyiki varsın der, teşekkür ederim. Bu tez çalışması, Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü ( No lu Proje) Asmada in vivo ve in vitro Koşullarda Resveratrol Üretim Veriminin Abiyotik Uyarıcılar ile Arttırılması konulu proje tarafından desteklenmiştir. Ebru ERTE Ankara, Temmuz 2007 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET...i ABSTRACT...ii TEŞEKKÜR...iii SİMGELER DİZİNİ...vii ŞEKİLLER DİZİNİ...viii ÇİZELGELER DİZİNİ...x 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Serbest Radikal ve Antioksidan Kavramı Serbest radikal nedir Serbest radikallerin görevi Antioksidan nedir Antioksidanlar nasıl etki ederler Antioksidan savunma sisteminin önemi Antioksidan kaynakları Besin Olarak Üzüm Kanser ve kalp krizine karşı kokulu üzüm Resveratrol Resveratrolün fiziksel özellikleri Resveratrolün sağlık üzerindeki etkileri Resveratrolün ilaç formları Fitoaleksin Kavramı ve Elisitörler Biyotik elisitörler Abiyotik elisitörler Ses Ötesi Dalgalar Ses ve ses ötesi dalgaların fiziği Kullanım alanları Ses ötesi dalgaların kimya mühendisliği alanındaki avantaj ve dezavantajları Ses ötesi dalga nasıl üretilir Kavitasyon Kavitasyonu etkileyen faktörler Sonokimyasal Tepkime Teorileri KAYNAK ARAŞTIRMASI Ses Ötesi Dalgaların Kimyasal ve Biyokimyasal Tepkimeler Üzerine Etkisinin İncelendiği Çalışmalar Resveratrolün Üretimine Abiyotik Elisitörlerin Etkisinin ve Üretim Mekanizmasının İncelendiği Çalışmalar Resveratrolün üretimine abiyotik ve biyotik elisitörlerin etkisi Resveratrolün kimyasal sentezi Resveratrolün biyokimyasal sentezi Resveratrol Üretimine Ses Ötesi Dalgaların Etkisinin İncelendiği Çalışmalar Resveratrolün HPLC ile analizinin gerçekleştirildiği çalışmalar MATERYAL VE YÖNTEM Materyal..61 iv

7 4.2 Yöntem Analiz 64 5.BULGULAR VE TARTIŞMA Tepkime Süresinin Etkisi Taze Kalecik karası üzümüne 20 khz frekansta SÖD uygulamanın etkisi Taze Kalecik karası üzümüne 30 khz frekansta SÖD uygulamanın etkisi Donmuş Kalecik karası üzümüne 20 khz frekansta SÖD uygulamanın etkisi Donmuş Kalecik karası üzümüne 30 khz frekansta SÖD uygulamanın etkisi Ses Ötesi Dalga Uygulama Tipinin Etkisi Taze Kalecik karası üzümüne SÖD uygulama tipinin etkisi Donmuş Kalecik karası üzümüne SÖD uygulama tipinin etkisi Taze Kalecik karası üzümüne 20 khz frekansta farklı çaptaki uçlar kullanılarak SÖD uygulama tipinin etkisi Üzüm Durumunun Etkisi Frekans Türünün Etkisi Ses Ötesi Dalgaların Uygulanma Süresinin Etkisi SONUÇ ÖNERİLER...88 KAYNAKLAR...89 EKLER...92 EK 1 Ekstraksiyon Yöntemi EK 2 Ekstraksiyon Yöntemi EK 3 Ekstraksiyon Yöntemi EK 4 Ekstraksiyon Yöntemlerinin Karşılaştırması...98 EK 5 Örneklerden Çözücü Uzaklaştırma İşlemi İçin Yöntem Araştırılması EK 6 Resveratrolün UV Analizi ile Dalga Boyunun Belirlenmesi..104 EK 7 HPLC analizinde Kalibrasyon İçin Standartların Hazırlanması ve Kalibrasyon Grafiği EK 8 Deney Sonuçlarının Toplu Gösterimi EK 9 Örnek HPLC Kromotogramı ÖZGEÇMİŞ v

8 SİMGELER DİZİNİ CoA Koenzim A HPLC Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi LDL Düşük Yoğunluklu Lipoprotein UV Ultraviyole SÖD Ses Ötesi Dalgalar DNS 3.5-dinitrosalisilat DCO 2 Çözünmüş CO 2 derişimi AlCI 3 Alüminyum klorür S Sürekli ses ötesi dalga uygulaması P Periyotlu ses ötesi dalga uygulaması P s açık 0.9 s kapalı periyotlarında ses ötesi dalga uygulaması P s açık 0.5 s kapalı periyotlarında ses ötesi dalga uygulaması O 3 E.Coli Ozon Escherichia Coli S. Cerevisiae Saccharomyces cerevisiae vi

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Çeşitli Antioxydantların aktivite kıyaslaması... 9 Şekil 2.2 Resveratrolün ilaç formu. 19 Şekil 2.3 Salınan bir pistonun bir tüp içerisinde ürettiği ses dalgaları..26 Şekil 2.4 İçi gaz dolu bir tüpte bir vurunun hareketi.27 Şekil 2.5 Ses ötesi dalganın oluşum mekanizması 34 Şekil 2.6 Kavitasyon kabarcığının oluşum mekanizması.35 Şekil 2.7 Bir kavitasyon kabarcığı üzerinde sonokimyasal tepkimelerin oluştuğu bölgeler 35 Şekil 3.1 SÖD varken ve yokken sakarozun invertaz katalizli, nişastanın ve glikojenin α - amilaz katalizli hidrolizi.41 Şekil 3.2 Şarap, bira ve sakenin CO2 üretimine SÖD etkisi..42 Şekil 3.3 Kolestrolün SÖD varken ( )ve yokken ( ) mikrobiyal olarak dönüşümü.43 Şekil 3.4. Kolestrolün farklı periyotlarda SÖD uygulanmasıyla mikrobiyal olarak Dönüşümü...44 Şekil 3.5 Süspansiyon örneklerine SÖD uygulamasının etkisi Şekil 3.6 Katı kallus örneklerine SÖD uygulamasının etkisi 45 Şekil 3.7 Ca2+-ATPase aktivitesine SÖD uygulamasının etkisi...46 Şekil 3.8 V. vinifera ve V. rupestris türlerinin resveratrol üretimine AlCl 3 ün çeşitli derişimlerinin etkisi. 50 Şekil 3.9 V. vinifera.( ) ve V.rupestris ( ) türlerinin resveratrol sentezinin zamanla Değişimi..51 Şekil 3.10 cv. Cabernet Sauvignon türü kallusunda resveratrol üretimine UV ışınının etkisi Şekil 3.11 Üzüm salkımının bölgeleri. 53 Şekil 3.12 Witting kondenzasyonu ile trans-resveratrol sentezi...54 Şekil 3.13 Fenilalanin den trans-resveratrolün biyosentezi..55 Şekil 3.14 Abiyotik stres uygulanmamış yerfıstıklarında trans-resveratrol derişimleri..56 Şekil 3.15 SÖD uygulanmış yerfıstıklarında trans-resveratrol derişimleri.56 Şekil 4.1 Kalecik Karası üzüm çeşidine ait olgun salkımın görünüşü...61 Şekil 4.2 Deney sisteminin şematik gösterimi...63 Şekil 5.1 Taze Kalecik karası için 20 khz frekansta 10 dakika süresince periyotlu (P01 ve P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi...68 Şekil 5.2 Taze Kalecik karası için 20 khz frekansta 1 saat süresince periyotlu (P01 ve P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi Şekil 5.3 Taze Kalecik karası için 30 khz frekansta 10 dakika süresince periyotlu (P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24, 48, 72 h) etkisi..69 Şekil 5.4 Taze Kalecik karası için 30 khz frekansta 1 saat süresince periyotlu (P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi. 70 Şekil 5.5 Donmuş Kalecik karası için 20 khz frekansta 10 dakika süresince periyotlu (P01 ve P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi. 71 vii

10 Şekil 5.6 Donmuş Kalecik karası için 20 khz frekansta 1 saat süresince periyotlu (P01 ve P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi 71 Şekil 5.7 Donmuş Kalecik karası için 30 khz frekansta 10 dakika süresince periyotlu (P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine etkisi...72 Şekil 5.8 Donmuş Kalecik karası için 30 khz frekansta 1 saat süresince periyotlu (P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine etkisi Şekil khz frekansta SÖD uygulamasının taze ve donmuş üzümün resveratrol üretimine etkisi..79 Şekil khz frekansta SÖD uygulamasının taze ve donmuş üzümün resveratrol üretimine etkisi 80 Şekil 5.11 Taze üzümde 20 khz frekansında SÖD uygulama süresinin etkisi...83 Şekil 5.12 Taze üzümde 30 khz frekansında SÖD uygulama süresinin etkisi...84 Şekil 6.1 Benzer koşullarda trans-resveratrol değerlerinin karşılaştırması..87 viii

11 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1 Resveratrolün fiziksel özellikleri Çizelge 2.2 SÖD lerin Kimyasal ve birbirine bağlı endüstrilerdeki uygulamaları.28 Çizelge 2.3 Ultrasoundun Diğer Uygulamaları...29 Çizelge 3.1 Biyotik elisitörler ile Vitis türlerinde üretimi uyarılan stilben bileşikleri 48 Çizelge 3.2 Abiyotik elisitörler ile Vitis türlerinde stilben bileşiklerinin uyarılması.49 Çizelge 3.3 UV ışığı etkisiyle uyarılan Vitis spp. nin fitoaleksin üretimi...51 Çizelge 3.4 Adrian et. al.(1996) trans- resveratrol ün HPLC analiz yöntemi...57 Çizelge 3.5 Jeandet et. al.(1997) trans- resveratrol ün HPLC analiz yöntemi. 58 Çizelge 3.6 Keller et. al (2000). trans- resveratrol ün HPLC analiz yöntemi.59 Çizelge 3.7 Pascual and Marti (2001) trans- resveratrol ün HPLC analiz yöntemi. 60 Çizelge 4.1 Kalecik Karası Üzüm çeşidine ait bazı özellikler.. 62 Çizelge 4.2 Tez kapsamında trans-resveratrol ün HPLC analizi için uygulanacak yöntem. 65 Çizelge 4.3 Tez kapsamında kullanılan HPLC analiz programı...65 Çizelge 5.1 Taze Kalecik karası üzümünde SÖD uygulama tipinin etkisi, tepkime süresi: 24 h..75 Çizelge 5.2 Donmuş Kalecik karası üzümünde SÖD uygulama tipinin etkisi, tepkime süresi: 48 h 76 Çizelge 5.3 Taze Kalecik karası üzümüne 20 khz frekans değerinde farklı çaptaki uçlar kullanılarak SÖD uygulama tipinin etkisi Çizelge 5.4 Taze Kalecik karası üzümüne ses ötesi dalga frekansının etkisi (tepkime süresi: 24 h)...81 Çizelge 5.5 Donmuş Kalecik karası üzümüne ses ötesi dalga frekansının etkisi (tepkime süresi: 48 h)...82 ix

12 1. GİRİŞ Başta ilaç sanayi olmak üzere kimya, kozmetik ve zirai mücadele sektörlerinde ekonomik açıdan önemli ve yeri doldurulamaz bazı kimyasallar bitkilerden elde edilmektedir. İlk insanların çeşitli hastalıkların tedavisi için bitkilerden yararlandıkları bilinmektedir. Bitkilerde bulunan ve bilinen kimyasal yapılar mikroorganizmalarda bulunanların yaklaşık dört katıdır yılında belirlenen 3500 yeni kimyasal yapının 2619 u bitkilerden elde edilmiştir. Tüm dünyada 121 klinik olarak faydalı ilaç bitkilerden elde edilmektedir. Günümüzde de dünya nüfusunun % 75 i bitkileri tedavi amaçlı kullanmaktadır (Payne et al. 1992). Resveratrol ün tanınması ve elde edilmesi çalışmaları Çin ve Japon halklarının kojokon olarak adlandırdıkları geleneksel ilaca dayanmaktadır. Polygonium cuspidatum (knotweed sivri uçlu çoban değneği) bitki kökünün kurutulup toz haline getirilmesiyle elde edilen bu ilaç damar tıkanıklığı, cilt iltihabı, alerji gibi birçok hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Resveratrol üzerine son yıllarda yapılan çalışmalar, kanserden korunmaya yönelik etkilerini açığa çıkarmıştır. Resveratrol hücrelerde değişim sonucunda tümör oluşumuna izin verebilecek hücre içi moleküller üzerine serbest radikallerin bağlanmasını önleyerek kanser oluşumunu engellemektedir ( ). Resveratrol ün sağlık üzerindeki olumlu etkilerinin anlaşılmasıyla kapsül formuna getirilmiş bitkisel özütlerinin elde edilmesi veya bu maddeyi taşıyan bitkilerin doğrudan tüketilmesi önem kazanmıştır. Resveratrol ün doğal olarak üretilebildiği türlerin başında gelen asmalar; sofralık üzüm, şarap, kuru üzüm, sirke veya geleneksel ürünler olarak tanımlanan pekmez, pestil gibi diğer işlenmiş ürünleri ile beslenmede yaygın olarak kullanılmaktadır. Üzümde resveratrol özellikle kabukta sentezlenmekte, meyve etinde çok düşük derişimlerde bulunmakta ya da hiç bulunmamaktadır (Jeandet et al. 1991). Günümüzde kontrollü koşullarda resveratrol üretimi için UV ışın ve kimyasal maddeler (AlCI 3, CuSO 4, AgNO 3 vb.) gibi abiyotik uyarıcıların etkisi araştırılmaktadır (Adrian et al. 1996). 1

13 Resveratrol Syntase genine abiyotik stres faktörü olarak UV, paraquat, yaralama, H 2 O 2, salisilik asit, jasmonik asit, absisik asit ve hormonların etkisinin incelendiği bir çalışmada resveratrol yerfıstığı bitkisinde, yaprak, kök ve kabukta önemli miktarlarda ( µg/g yaşağırlık) bulunurken, tarlada yetiştirilmiş yerfıstığı bitkilerinin tohum kısımlarında çok az miktarda olduğu ( µg/g yaşağırlık) görülmüştür. Çalışmada elde edilen sonuçlara göre; köklerde ve kabuklarda resveratrol birikimi, yaralama ve mantar enfeksiyonları gibi etkilerle artış göstermiştir. Yapraklarda ise, yaralama ve UV gibi abiyotik stres faktörlerinin etkisiyle birikim olduğu gözlenmiştir (Chung et al. 2003). Tez kapsamında resveratrol üretimine etkisinin incelendiği ses ötesi dalgalar SÖD ise kimyasal ve biyokimyasal tepkimeler üzerinde çoğunlukla olumlu etkiler göstermektedir. Bunlar, tepkimelerde başlatıcı olarak görev yapması, üretim verimini arttırması, tepkime süresini kısaltması ve tepkime yol izini değiştirerek farklı ürünlerin elde edilmesini sağlaması olarak sıralanabilir. Ses ötesi dalgaların başlatıcı olarak kullanıldığı Metoksiaminosilan tepkimesinin incelendiği bir çalışmada, yokluğunda tepkime gerçekleşmezken, ses ötesi dalgalar uygulandığında (35 o C, 3 saat) tepkime oluştuğu ve %100 dönüşüme ulaşıldığı saptanmıştır (Bremner et al. 1986). Ses ötesi dalgaların tepkimelerde üretim verimini artırmasına ait örneklerden biri, (Ph) 2 NH ın (Ph) 2 NCH 2 Ph a dönüşüm tepkimesidir. Bu sistemde mekanik karıştırma ile (ses ötesi dalga yokken) 48 saat sonunda % 70 verim elde edilirken, ses ötesi dalga uygulaması ile 1 saat sonunda verim % 98 e ulaşmıştır (Cordemans 1991). Steroidlerin enzimatik üretiminde ses ötesi dalgaların uygulanmasıyla klasik metodlara göre üretim veriminin bin kat artabileceği görüşü ileri sürülmekle birlikte, çalışma koşullarının önemli olduğu vurgulanmıştır. Örneğin, kolesterolün enzimatik oksidasyonunda 24 saat sonunda dönüşüm %54 iken ultrasound etkisiyle aynı süre sonunda % 99 dönüşüme ulaşmıştır (Bar et al. 1988). Aynı tepkime için 10 saat süreyle ses ötesi dalgaların her 10 dakikada 10 sn. uygulanmasıyla dönüşüm %40, her 10 dakikada 5 sn. uygulanmasıyla ise dönüşüm %99 olarak elde edilmiştir. Ses ötesi dalgaların diğer bir olumlu etkisi, sukrozun invertaz katalizli hidrolizinde başlangıç tepkime hızını %50 oranında artırması ile görülmüştür (Barton et al. 1996). 2

14 Şarap, bira ve sake üretiminde ses ötesi dalgaların fermentasyon süresini %50-64 oranında azalttığı belirtilmiştir (Matsuura et al. 1994). Resveratrol üretimine ultrasoundun etkisini inceleyen çalışmalar sınırlı sayıdadır. Kernels yerfıstığı çeşidinde, resveratrol sentezine UV ışınları ve ses ötesi dalgaların etkisinin incelendiği bir çalışmada öğütülmüş, kıyılmış, dilimlenmiş ve bütün haldeki yerfıstıklarına SÖD ve UV abiyotik stres faktörü olarak ayrı ayrı uygulanmıştır. SÖD uygulamasından sonra 0-48 saat tepkime süresi sonunda alınan örneklerde en fazla resveratrol derişiminin dilimlenmiş yerfıstıklarında bulunduğu ve en yüksek transresveratrol derişimine ise 36 saatlik tepkime süresinin sonunda ulaşıldığı görülmüştür. Bu durumda SÖD uygulanmış yerfıstıklarındaki resveratrol derişimi, uygulama yapılmamış yerfıstıklarındaki resveratrol derişimine göre 8,25 kat artış göstermiştir. Ayrıca yerfıstıklarında SÖD uygulamasının 36 saatten daha uzun tepkime süresinde bitki dokularına zarar verdiğinden, trans-resveratrol derişiminde olumsuz etkiye neden olduğu görülmüştür. Bu araştırma kapsamında, ayrıca fenolik bileşiklerin ve antioksidan aktivitesinin stres faktörleri ile değişimi incelenmiş ve sadece trans-resveratrol miktarının stres faktörlerinin etkisinde arttığı gözlenmiştir (Rudolf et al. 2005). Bu çalışmada, abiyotik uyarıcı olarak ses ötesi dalga kullanılarak siyah üzümde (Vitis vinifera L.) trans-resveratrol ün üretim veriminin artırılması amaçlanmıştır. Bu amaçla, sisteme ses ötesi dalgalar ultrasonik homojenizer ile 20 khz ve 30 khz frekansta verilir. En yüksek resveratrol derişimini belirlemek amacı ile en uygun süre belirlenerek sisteme çeşitli aralıklarla (periyotlu) ve sürekli olarak ses ötesi dalgalar gönderilmiştir. Ayrıca birim alana farklı güçte dalga uygulamak amacıyla farklı çaptaki uçlar kullanılmıştır. SÖD uygulamadan önce ve sonra örneklerdeki resveratrol derişimi Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (High Performance Liquid Chromatography) ile belirlenmiştir. 3

15 2. KURAMSAL TEMELLER Tez kapsamında incelenen resveratrol ve ses ötesi dalgalara yönelik genel bilgiler aşağıda yer almaktadır. 2.1 Serbest Radikal ve Antioksidan Kavramı Antioksidanlar, canlı bir hücreye en büyük zararı olan madde olarak bilinen serbest radikallere karşı etkili olan değerli maddelerdir. ( 2005). Serbest radikal ve antioksidanlar hakkında dataylı bilgiler aşağıda verilmiştir Serbest radikal nedir Serbest Radikaller, hem vücudumuzun normal metabolik faaliyetleri sırasında oluşabilen, hem de kimyasal ajanlar, radyasyon, alkol, sigara, ağır metaller gibi pek çok dış kaynaklı etkenlerle oluşturulan moleküllerdir. Kısa ömürlü, kararsız, molekül ağırlığı düşük ve çok etkin değillerdir (Anonim 2005) Serbest radikallerin görevi Serbest radikallerin yüksek oranda reaktif bileşikler olmaları en dış yörüngelerinde eşlenmemiş elektron içermeleri, kolayca diğer organik ve anorganik moleküllerle tepkimeye girmelerini sağlar. Aslında serbest radikaller, hücrelerin enerji üretiminde rol oynadıkları gibi, vücudun normal metabolik faaliyetleri sırasında gerçekleşen pek çok yararlı biyokimyasal süreçlerin içinde de yer alırlar. Oksidasyon sonucu kısa süreli oluşur ve vücudumuzun antijenlerle savaşmasında bağışıklık sistemine yardımcı olurlar. Ancak çevresel ajanlarında etkisiyle aşırı miktarlarda oluştuklarında durum değişerek hücre hasarına neden olabilirler lerden beri serbest radikallerin yaşlanma ve kanser, kalp hastalıkları, şeker hastalığı gibi pek çok hastalığa neden olduğu bilinmektedir. Serbest radikallerle yapılan 4

16 çalışmalar, bu moleküllerin yalnızca birkaç doku ya da sistemi değil, tüm organizmayı etkilediğini göstermektedir. Bu çok geniş etki alanı içine, merkezi sinir sistemi ( beyin ve omurilik), periferik sinir sistemi( tüm organizmayı bir ağ gibi saran ve merkezi sinir sistemiyle bağlantılı sinirler), eklemler, böbrekler, karaciğer,göz gibi birçok doku, organ ve sistemler girmektedir (Anonim 2005) Antioksidan nedir Vücut hücreleri tarafından üretildiği gibi, gıdalarla da alınan bir grup kimyasal maddeye antioksidan denir ( ). Antioksidanlar, serbest radikallerin etkilerini nötralize ederek onların neden oldukları dejeneratif hastalıklar ve erken yaşlanma süreçlerini başlatan zincirleme tepkimeleri engelleyen moleküllerdir. Serbest radikaller kararsız ve reaktif moleküller olmalarına yol açan elektron açığını kapatabilmek için başka atomların elektronlarını paylaşmak üzere onlara saldırırlar. Antioksidanlarsa, serbest radikaller için kolay bir elektron hedefi oluştururlar. Eğer serbest radikaller almak istedikleri elektronu antioksidanlardan sağlarlarsa başka bir yapıya zarar vermezler. Antioksidanlar, endojen (organizma tarafından sentezlenen) ya da ekzojen (dışarıdan besinlerle alınan) yapılar olup, oksidan moleküllerin hücreye zarar vermesini engellerler (Anonim 2005) Antioksidanlar nasıl etki ederler Soluduğumuz havadaki oksijen, vücut içinde serbest radikaller adı verilen ve toksik (zehirli) etki gösteren bazı maddelerin oluşmasına neden olmaktadır. Demirin paslanması ve balığın sudan çıktıktan sonra ölmesi, oksijenin zararlı etkilerine örnektir. Vücudumuzda bulunan antioksidanlar, serbest radikallere karşı etki göstererek bunların zarar vermesini önler ( ) Antioksidan savunma sisteminin önemi Antioksidan savunma sistemi, reaktif oksijen radikallerini daha az toksik ürünlere dönüştüren enzim sistemleri (katalaz, süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz gibi) 5

17 yada radikalleri yakalayıp nötralize eden antioksidan maddeler (melatonin,lipoik asit, vitamin A,E ve C gibi) olarak ayrılabilmektedir. Antioksidanlar, oksitleyici moleküllere karşı etkilerini çeşitli mekanizmalarla gösteriyorlar: Bu mekanizmalar, serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma yada daha zayıf yeni bir moleküle çevirme işlemi şeklinde toplayıcı ya da süpürücü bir etki; serbest radikallerle etkileşip onlara bir hidrojen katarak aktivitelerini azaltan ya da etkisiz hale getiren bastırıcı, giderici bir etki; serbest radikalleri kendilerine bağlayarak zincirleme olarak devam eden tepkimeleri belli yerlerinde kırarak zincir kırıcı bir etki ya da onarıcı, tamir edici bir etki şeklinde gerçekleşebilmektedir (Anonim 2005). Vücudumuzda bu mekanizmalar bulunsa da, doğal antioksidan üretimi yaş ilerledikçe, pek çok uzmana göre 25 yaşından itibaren, yavaşlamaktadır. Ayrıca, antioksidanların yararlı etkilerinin görülebilmesi için vücut sıvılarında belli miktarlarda bulunmaları gerektiğide ifade edilmektedir. Pek çok sebze ve meyve antioksidanlar açısından bizim için doğal kaynak konumundadır. Bu açıdan sağlıklı yaşam anlayışı içerisinde, günlük beslenme düzeninde antioksidanlarca zengin bir diyetin önemi büyüktür. Yapılan araştırmalar, günlük antioksidan tüketiminin arttırılmasının kalp hastalığı, kanser ve diğer birçok ciddi hastalığın oluşma riskini azalttığını göstermektedir. Ayrıca anti-aging yani yaşlanmayı engelleyebilme durumu söz konusudur Antioksidan kaynakları Antioksidanlar açısından en zengin kaynaklar sebze ve meyvelerdir. Bulaşıcı hastalıklar konusunda araştırma yapanların gözlemleri, sebze ve meyve yiyen insanlarda daha düşük oranda kanser görüldüğünü ortaya koymuştur. Bunun da besinlerin içerdiği antioksidanlardan kaynaklandığı düşünülmektedir. Diğer yandan beslenmenin de (ürünün ekiminden, toplanması, depolanması, işlemlerden geçirilmesi ve pişirme yöntemleri gibi pek çok etken sonucu oluşan kanserojen maddelerin alınması) kanserle çok yakından ilişkili olduğu da unutulmamalıdır. Diyetteki kanserojen maddelerin etkisi yine diyette bulunan antikanserojen maddeler tarafından engellenebilir. 6

18 Beta karoten, selenyum, E ve C vitaminleri bilinen en önemli antioksidanlardır. Bu besin öğelerini vücut kendi üretemediğinden dışarıdan alınmaları gerekmektedir. Yeşil çay, keten tohumu, biberiye, alıç çiçeği ve meyvesi, zerdeçal, ginko, çoban üzümü, üzüm çekirdeği antioksidan etkileri ön plana çıkan ürünlerdir. Koenzim Q10, çinko, lipoik asit ve B vitaminleri karışımlarıysa hazır ürünler olarak sıklıkla kullanılan antioksidanlardır. Gıdalardan alınan en önemli antioksidanlardan beta karoten, askorbik asit (C vitamini) ve alfa tokoferol (E vitamini) gibi antioksidanların serbest radikallerin neden olduğu oksidasyonu önlediği in vitro (canlı dışında kültür ortamında) ve in vivo (deney hayvanlarında canlı üzerinde) çalışmalarla gösterilmiştir. Bunların dışında, taurin, bilirubin ve ürik asit de bilinen doğal antioksidanlar ve sütte, karaciğerde ve böbrekte bulunmaktadırlar. Gıdalardan sağlanan antioksidanlar içinde en önemli sıkıntıysa E vitaminindedir. E vitamini yağda eriyen bir vitamindir ve en önemli kaynağı da bitkisel yağlardır. Ancak sağlık açısından yağların fazla alınmaması uygundur. Antioksidanlarla ilgili diğer bir önemli nokta da; serbest radikallerle savaşma yeteneklerinin farklı olmasıdır. Antioksidan ne kadar güçlü ve etkili olursa, kapasite güçleri de o kadar fazla olmaktadır. Bu nedenle her besin aynı güçte antioksidan etki göstermemektedir. Yapılan çalışmalarda hemen hemen her besin için değerler araştırılmış ve sebze ve meyvelerin en yüksek antioksidan kapasitesine sahip oldukları belirlenmiştir. İlginç bir sonuçsa, bazı meyvelerin kurusunun ( kuru üzüm ve kuru erik) tazesine göre daha yüksek değerlerde antioksidana sahip olmasıdır. Taze meyveler (özellikle turunçgiller, çilek ve biber) C vitamini açısından zengin durumdadırlar. Sarı renkli sebze ve meyveler (havuç gibi), bazı yeşil yapraklı sebzelerse A vitamini öncüsü olan beta karoten içermektedir. Son zamanlarda sıkça bahsedilen üzüm çekirdeği ekstraktı (özütü), Oligomeric Proanthocyanidin-OPC denilen güçlü antioksidanları içermektedir. Yeşil çayda sağlığı güçlendirici flavonoidlerden olan 7

19 catechin ve yanı sıra birçok yararlı bileşik bulunuyor. Balık, tahıllar, brokoli, lahana, çileki vişne, erik, soğan, sarımsak da etkili antioksidanlardır. Beta karotenle aynı aileden bir karotenoid olan likopen, domates, karpuz, gibi pek çok meyveye siyah rengini veren madde ve yalnızca bir renklendirici değil, aynı zamanda güçlü antioksidanlardandır. Son dönemlerde ilginin arttığı alfa lipoik asit, doğada bulunan en güçlü antioksidan maddelerden birisidir. Hem suda, hemde yağda çözünebildiğinden hücrenin her yerinde görev alan tek antioksidandır. Hücrenin zarını ve içindeki bütün yapıları serbest radikallerden korur. Ayrıca vitamin E, C ve glutatyon peroksidaz gibi diğer antioksidanların etkilerini kuvvetlendirmektedir. Enerji üretimini hızlandırıp, hücre yenilenmesini artırdığı için cilt kırışıklıklarını da azaltmaktadır. Alfa lipoik asit, karaciğer ve patateste bulunmaktadır. Antioksidan maddelerle ilgili çalışmalar artan bir hızla devam etmektedir. Besinlerin dışında dışarıdan takviyelerin de yapılmasıysa doz tespit çalışmalarını gerektirmektedir. Vücudumuzdaki hassas dengenin aşırı dozlarda bozulabileceği ya da aşırı dozların bir yerden sonra işe yaramadığı unutulmamalı ve sınırlar konmalıdır (Anonim 2005). Günümüzde antioksidan kaynaklarının yanı sıra aktivite değerleride önemli bir parametre durumundadır. Üzüm çekirdek ekstratı ve diğer çeşitli antioksidanlara yönelik aktivite kıyaslaması Şekil 2.1 de yer almaktadır. 8

20 Şekil 2.1 Çeşitli Antioksidantların Aktivite Kıyaslaması (Anonim 2005) * Gravinol : Üzüm çekirdek ekstraktı Şekil 2.1 de görüldüğü üzere üzüm çekirdeği ekstratı olarak bilinen Gravinol bileşeni en yüksek antioksidan değerine sahiptir. 2.2 Besin Olarak Üzüm Üzüm, yüksek şeker içeriği dolayısıyla kalori değeri fazla olan bir besin maddesidir. Beslenme değerini oluşturan maddelerin niteliği ve miktarı taze veya işlendikten sonra dönüştüğü ürüne bağlı olarak değişmektedir. Bazı karaciğer hastalıkları ve kansızlığın tedavisinde de etkili olan üzüm, içerdiği meyve asitleri ve lifli yapısından dolayı mideye zarar vermeden böbrek ve barsak sisteminin çalışmasını düzenler, kanın temizlenmesine de yardımcı olur. İçerdiği besin maddeleri sayesinde üzüm gerçek bir beyin besinidir. Öğleden sonra yenilecek bir salkım üzüm veya içilecek bir bardak üzüm suyu ( taze sıkılmış ) vücudu ve beyin hücrelerini zindeleştirmektedir. Bir kilo üzüm g. süt, 390 g. et, 300 g. ekmek ve 1200 g. patatese eşdeğer sayılmaktadır. Resveratrol (3,5,4-trihy-droxystilbene) maddesinin özellikle hayvan ve patojenlerin bitkilere saldırması, yaralanma veya ultraviyole (UV) ışığa maruz kalma sonucunda bitkiler tarafından dayanıklılık mekanizmasının oluşturulması amacıyla üretilen bir bileşik olduğu bilinmektedir (Jeandet et al. 1992). Resveratrol maddesinin dut, yaban 9

21 mersini ve yer fıstığının da içinde bulunduğu saptanmıştır. Ancak en iyi kaynağının üzüm olduğu ve en yüksek oranda renkli üzümlerde bulunduğu tespit edilmiştir. Nemli bölgelerde yetişen ve renkli olan üzümlerin kabuk kısımlarında bol miktarda sentezlenmektedir. Asmada dal, gövde, kök, çekirdek, yaprak, ve özellikle renkli olan üzüm tanelerinin kabuk kısımlarında sentezlendiğini belirten araştırmacılar, siyah üzüm şırasında bu maddenin bulunduğunu, beyaz üzüm şırasında ise olmadığını saptamıştır (Keskin ve Kunter 2005) Kanser ve kalp krizine karşı kokulu üzüm Günümüz dünyasında doğal gıda kaynaklarının giderek bozulması, kirlilik ve diğer etmenler kansere yol açmaktadır. Dünya üzerindeki ölümlerin önemli bir oranını kanser oluşturmaktadır. Resveratrol maddesinin ise, kanserden korunmada büyük bir potansiyele sahip olduğu bilim adamları tarafından ortaya konulmuştur. Renkli üzümlerin kabuklarında bulunan ve fitoaleksin gurubu bileşiklerden olan resveratrolün hücrelerde değişim sonucunda tümör oluşumuna izin verebilecek hücre içi moleküller üzerine serbest radikallerin saldırısını bloke eder ve sonuçta kanser oluşumunu engeller. Yapılan bir araştırmada, tümör aşılanmış farelere 18 hafta boyunca 2 kez 5, 10 veya 25 µmol resveratrol veren araştırıcılar tümör sayısının kontrole göre sırasıyla %50, %63, %88 oranında azaldığını ortaya koymuşlardır yılında İllinois Üniversitesinde yapılan bir araştırmada ise, kanser aşılanmış farelerde resveratrol maddesinin lezyon gelişimini engellediği ve deride tümör oluşumunu azalttığı saptanmıştır (Carbo et al. 1999). Besinlerin parçalanması sonucunda oluşan serbest radikallerin kılcal damarların duvarlarına saldırmasında güçlü bir antioksidant görev üstlenerek düşük yoğunluktaki lipoproteinlerin, trombositlerin kılcal damarlarda birikmesini engelleyerek kalp krizi riskini azaltmaktadır. Bunun yanı sıra, Fransa nın bazı bölgelerinde yaşayan insanların doymamış yağ oranı yüksek gıdalar almalarına ve plazmalarındaki kolesterolün yüksek olmasına rağmen kalp krizinden ölenlerin oranının az olduğu belirtilmektedir. Bu durum siyah üzüm şırasının tüketiminin fazla olmasına bağlanmaktadır. Kokulu üzüm olarak bilinen Vitis vinifera L. türünün faydaları aşağıda yer almaktadır. 10

22 - Amino asitler, B vitaminleri (B1, B2), mineraller, potasyum, magnezyum ve demir içerdiği için bağışıklık sistemini kuvvetlendirir. - İçerdiği doğal fruktoz sayesinde vücudun harcadığı enerjinin kısa sürede depolanmasını sağlar. - Bünyesindeki magnezyum insanın iş verimliliğini arttırır. - Bünyesindeki asitler (tartarik, sitrik, malik, süksinik, fumarik, piruvik, -oksaglutarik, gliserik, glikolik, dimetil-süksinik, şikiminik ve guinik asit) mideye zarar vermeden böbrek ve karaciğerin çalışmalarını hızlandırır, bu çalışmaları destekler. - Yağların erimesine yardımcı olur. - Vücudu virüslere karşı dirençli hale getirir. - Kabuk ve çekirdekleri bağırsak metabolizmasını hızlandırır. - Cildin taze ve temiz bir görünüm almasını sağlar. - İçerdiği bioflavonoidler sayesinde C vitamini aktivitesini arttırır. - Alerji ve kireçlenmelerde iltihap oluşumunu engeller. - Besinlerin parçalanması sonucunda oluşan serbest radikallerin kılcal damarların duvarlarına saldırmasında güçlü bir antioksidant görev üstlenerek düşük yoğunluktaki lipoproteinlerin (LDL) kılcal damarlarda birikmesini engeller. - Hücrelerde değişim sonucunda tümör oluşumuna izin verebilecek hücre için moleküller üzerine serbest radikallerin saldırısını bloke eder ve sonuçta kanser oluşumunu engeller". 2.3 Resveratrol Resveratrol bitkilerde geniş bir spektrumda biyolojik aktivite gösteren polifenolik bir bileşiktir. Resveratrol bitkilerde korunmasızlığa karşı çeşitli seviyelerde üretilir. Resveratrol stilbene ailesine ait bir polyphenol dür. cis veya trans konfigürasyonunda bulunabilir ve glycosylated formundadır. Üzüm, yer fıstığı, yumuşak meyve, polygonum kökü gibi birçok bitkide bulunmaktadır. Ayrıca doğuya özgü geleneksel bitki ilaçlarında da mevcuttur. Resveratrol (3,5,4 -trihyhoxystilbene), ilk olarak bundan 60 yıl önce Michio Takaoka tarafından Veratum grandiflorum un reçinesinde keşfedildi. Daha sonra 1977 yılında 11

23 Langcake tarafından asmaların (Vitis vinifera L.) incelenmesiyle, resveratrolün bu bitkinin yaprak ve dokuları tarafından ultraviyole ışın etkisi ile yada bitki de infeksiyonlara karşı korunma amacıyla üretildiğini buldu. Zararlı durumlara karşı bitki tarafından üretilmesi sebebiyle fitoaleksinler sınıfına dahil edildi (Corre et al. 2005) de Kimura et al. trans-resveratrolün metabolik aktivitesini buldular. Beyaz kan hücreleriyle yaptıkları çalışmalar göstermektedirki, Resveratrol prosesleri eicosanoid üretimini inhibe etmekte çok etkindir ( 2005). 12

24 2.3.1 Resveratrolün fiziksel özellikleri Resveratrolün bazı fiziksel özellikleri Çizelge 2.1 de yer almaktadır. Çizelge 2.1 Resveratrolün fiziksel özelikleri ( Merk 2006 ) Kapalı formülü C 14 H 12 O 3 Açık Formülü Sistematik ismi Diğer isimleri 5-[(E)-2-(4-hidroxyphenyl)- ethenyl]benzene-1,3-diol trans-resveratrol Trans-3,5,4 -trihydrozystilbene 3,4,5-stilbenetriol (E)-5-(p-hydroxystyryl)resorcinol 3,5,4'-trihydroxy-cis-stilbene 3,5,4'-trihydroxy-trans-stilbene Molekül Ağırlığı (M.W) Erime Noktası ( C) 253 Görünüm Beyaz katı Kaynama Noktası ( C) 255 Çözünürlük Suda kolayca çözünür 13

25 2.3.2 Resveratrolün sağlık üzerindeki etkileri Son yıllardaki araştırmalarda resveratrolün insan sağlığına yararlı olan birkaç etkisi tanımlanarak, kanser önleyici ve kalp koruyucu aktiviteleri kaydedilmiştir. Bu aktivitenin sebebi ise antioksidant ve anticoagulant özelliklerine bağlanmaktadır. Resveratrolün platelet toplanmasını engelleyici etkisi olduğu ve sıvı peroksidasyon, eicosanoid sentezinin değişimini sağladığı, lipoprotein metabolizmasını ayarladığı ve vasorelaxing (damar genişletici) ve anti-inflamnotory (iltihap dağıtıcı) aktiviteleri gösterdiği belirlenmiştir. resveratrolün kanserin önemli 3 evresini engellediği kaydedilmiştir (Corre et al. 2005). Resveratrol ve damar tıkanıklığı Kalple ilgili zararın ve özellikle iskemik vascular hastalıkların temel sebebi damar tıkanmasıdir. Kısacası atherosclerotic proses atardamarla ilgili duvarın normal hücre elementleri ve kan (plasmatik proteinler, lipoproteinler, büyüme faktörleri, lenfositler, plateletler) arasındaki normal tepkimelerin bozulmasının sonucudur. Bu durumda, atheroclerotic lession oluşumunu frenlemeyi düzeltmesinde farklı hücrelerde çeşitli bileşikler rol oynayabilir. Yeni anti- atherogenic bileşenler yiyecekler içerisinde sunulur. Gerçekten yiyeceklerdeki E vitamini, flavonoidler ve polifenoller gibi çeşitli antioksidan bileşikler damar tıkanıklığına karşı iyi bir aday olabilir. Polifenoller içinde Resveratrol atherogenesis in farklı bölümlerinde (yağ biriktirme ve düşük yoğunluklu lipoproteinler (LDL) oksidasyon; monosit ve lenfosit süzme; hücre düzlüğüne zorla girip hızla çoğalma ve göçme, platelet toplama) iyi bir ajan rolü oynayabilir (Delmas et al. 2005). Resveratrol ve göğüs kanseri Resveratrol ile ilgili araştırmaların yoğunlaştığı alan kanserle ilgili olanlarıdır. Güvenilir pek çok kanıtın desteğiyle kanserin pek çok safhasında durdurucu ve engelleyici özelliği ile 1.dereceden doğal tedavi sağlamaktadır ( 2007). 14

26 Çoğu in vitro çalışma göğüs kanser hücreleri için resveratrol aktivitesi olarak hitap etmiştir. Resveratrol, göğüs kanseri hücrelerde hormon-duyarlı ve hormon-direnç etkilerinin ikisini de göstermektedir. Resveratrolün bunların yanı sıra göğüs kanseri olan hücrelerde anti- initiation, anti-promotion ve antiprognession aktivitelerinide gösterdiği kaydedilmiştir. Bu özelliklerin xenobiotic carcinogen metabolizması ve antiinflammotory (iltihap dağıtıcı), antiproliferative ve proapoptotic etkilerin düzenlenmesiyle ilişkili olduğu görülmüştür (Corre et al. 2005). Resveratrolün kanser tedavi mekanizması Resveratrol sadece kanser önleyici değil, ek tedavi olarak da önerilmektedir. Bilimsel çalışmalar resveratrolün eşsiz bir hücre yok etme sistemine sahip olduğunu göstermiştir ( Tümör başlangıcına etkisi hayvan modellerinde antimutajen ve serbest radikalleri inhibe etmesi ile antioksidan özelliğinden kaynaklanmaktadır. COX-1 in inhibisyonu ile tümör ilerleme aktivitesini azalttığı gözlenmektedir. Bu enzim tümör gelişimini uyaran bir maddedir. Resveratrol COX-1 enzimini %98 oranında inhibe etmektedir. Lösemi hücrelerinin diferentiationunu teşvik ettiği ve ve ribonükleotid redüktazı inhibe ettiği gösterilmiştir. Çoğalan hücrelerde DNA sentezi için bir enzime ihtiyaç vardır. Resveratrol ün kan-oluşturan hücrelere karşı minimum toksik etkisi anti-kanser potansiyalini cazip kılmaktadır. Kemik iliği nakline uğrayan hastalarda hastalarda resveratrol tümör hücrelerini temizleyerek hastalığın tekrarlanma oranını azaltmaktadır. Hemopoetik sistemde resveratrolün inhibitör etkisi kısmen dönüşümlü, oysa lösemi hücrelerinde dönüşümsüzdür. Resveratrolün antioksidan ve kemopreventif etkisiyle lösemi hücrelerinde ki proliferasyonu inhibe ettiği gösterilmiştir. Kanser oluşumuna neden olan pek çok madde örneğin sigara ve dioksinaril hidrokarbon reseptörünü aktive ederek yeni ve zararlı genlerin oluşmasına neden olmaktadır. Resveratrol doğal mekanizma ile bu maddeyi inaktive etmektedir. Araştırmacılar, ''resveratrol''ün farklı türlerdeki tümörlerde bulunan CYP1B1 adlı bir enzim tarafından işleme tabi tutulduğunu ve bu işlem sonucu molekülün ''piceatannol'' adlı antikanserojen 15

27 bir maddeye dönüştüğünü saptamışlardır. Resveratrolün, Kemik Kanseri, Prostat Kanseri, Akciğer Kanseri, Kolon kanseri, Meme Kanseri ve Mide Kanseri üzerine etkileri aşağıda sıralanmıştır. Kemik Kanseri; kanserin kemiğe yayılımını durdurmaktadır. Prostat Kanseri; kanser hücrelerindeki androjenleri ve reseptörlerinin fonksiyonlarını bloke etmektedir. Akciğer Kanseri; Resveratrol, %50 oranında bu hücrelerin gelişimini inhibe etmektedir. Akciğer kanserine karşı gerekli kemoterapötik ajan olan paclitaxel ile resveratrol/ün bu hücrelerde ki kombine kullanımında Resveratrol ün paclitaxelin sonradan ortaya çıkan antiproliferatif etkisini arttırdığı, paclitaxelin akciğer kanseri hücrelerindeki azaltıcı etkisinden dolayı resveratrol ün akciğer kanserinin alternatif tedavisi olabileceğini öne sürülmektedir. Kolon kanseri; Resveratrol ayrıca batı dietinin önemli bir parçası olan ve kanserli hücre gelişimin destekleyen linoleik asite karşı da etkilidir. Linoleik asit, araşidonik asitte yani hormon benzeri öğelere dönüşerek kanser hücre büyümesini tetikleyen faktörleri arttırır. Meme Kanseri; Japonya da yapılan araştırmalar da resveratrol ün dietlere eklenmesiyle meme kanseri hücrelerinin büyümesini inhibe ettiği ve batı tipi dietlerde ki linoleik asitin büyüme teşvikini bloke ettiğini göstermektedir. Son bilgiler resveratrol ün eşsiz bir hücre yok etme sistemine sahip olduğunu ve kanser hücrelerini öldürdüğünü göstermektedir. Ayrıca resveratrol ün meme kanseri üzerine etkisi östrojen reseptör pozitifte, östrojen reseptör negatifte olsa etki etmektedir. Mide Kanseri; Resveratrol midede ülser, gastrit ve kanser gelişimine neden olan helicobacter pylorinin gelişimi ve büyümesini inhibe etmektedir ( 2007). Resveratrol ve kemoterapi Kemoterapi ve Radyoterapi kanser tedavisinde kullanılan vücuda ciddi zarar veren ancak kanser tedavisinde henüz alternatifleri geliştirilemeyen tedavi şekilleridir. 16

28 Kemoterapi ilaçları kanser hücrelerini hedef alırken normal hücrelere de zarar vermektedir. Kemoterapi tedavisi sırasında zarar gören hücrelerin başında, 1. Kemik İliği( Bu Nedenle Kan Değerleri Düşer) 2. Saç Hücreleri( Saçlar Dökülür) 3. Sindirim Sitemi Hücreleri gelmektedir Günümüzde kemoterapi ve radyoterapi sırasında özellikle bazı bitkisel ürünleri kullanmaktan (Kullanılan Ürünün-Isırgan, Aloe Vera- kanser önleyici olurken karaciğer enzimlerini bozması, normal hücreleri koruyan bir bitkisel tedavi iken kanserli hücreleri de koruması, özellikle kemik iliğinin baskılanarak çalışmasının engellemesi vb gibi yan etkiler nedeniyle zaten zor olan kemoterapinin daha da içinden çıkılmaz bir hal almasını engellemek amacıyla tıbbı anlamda kullanılmaktan kaçınılmaktadır. Buna alternatif olarak siyah üzüm ideal bir meyve konumundadır. Siyah üzüm içerisinde yer alan resveratrol ; kemik iliğini koruyan ve çalıştıran ender maddelerden biridir. Bu nedenle siyah üzüm şurubu kullanan kemoterapi hastalarında kan değerleri düşmemektedir özellikle trombosit almaya ihtiyaç duymazlar. Antioksidan aktivitesiyle karaciğer korunur. Siyah üzümün içeriğindeki etken maddeler vücutta birikmez suyla parçalanıp atılır, toksik etkisi göstermez ( 2007). Resveratrolün spinal kord koruyucu etkisi Spinal kord yaralanması veya omurilik felci büyük bir yaralanma ve sakatlanma tipidir. Çokluk trafik kazaları, yüksekten düşme, ateşli silah yaralanmaları, sığ suya dalma gibi sebeplerle oluşmaktadır. Bazen infeksiyon ve tümörler de buna sebep olabilir ( Yapılan çeşitli çalışmalarda bu komplikasyonun gelişim sıklığı. %2.9 ile %23 arasında bildirilmiştir (Kızıltepe ve ark. 2003). Çocuklarda spinal kord iskemisi travmatik aort rüptürlerinde %25 değeri ile oldukça yüksek değerdedir (Elmacı 2000). 17

29 Torakoabdominal aorta yönelik cerrahi girişimlerde nörolojik defisit gelişiminin önlenmesine yönelik çeşitli teknikler geliştirilmiştir. Klinik çalışmalarda hipotermi, BOS drenaj gibi çeşitli cerrahi modifikasyonlar denenmiş ancak bu komplikasyonun önlenmesinde yeterli olmamıştır. Bunlara ek olarak çeşitli deneysel modellerde Pentobarbital, Pentoksifilin, L-NAME Metil Prednizolon, Diazoksit kullanımı gibi farmakolojik yaklaşımlar uygulanmış ancak genel kabul gören bir çözüm geliştirilememiştir. Alternatif olarak Resveratrol ün spinal kord koruyucu etkisinin incelendiği bir çalışmada Yeni Zelenda tavşanlarında, abdominal aort infrarenal ve bifurkasyon seviyelerinde klemplenerek spinal kord iskemisi oluşturulmuştur. Bu amaçla iskemi oluşturulmadan sham operasyonu uygulanan Grup S tavşanlarına ek olarak, Grup K daki tavşanlara (n:7) 30 dakikalık iskemi öncesi taşıyıcı (ethanol) IV, Grup R deki tavşanlara (n:7) ise 10 mg/kg resveratrol IV verilmiştir. Deney sonrasında Sham operasyonu uygulanan deney hayvanlarının hiçbirinde nörolojik defisit gelişmediği ve 48.saatte yapılan nörolojik değerlendirmede kontrol grubundaki 7 tavşandan 4 ünde parapleji gelişirken 10 mg/kg Resveratrol uygulanan 7 deney hayvanından 4 ünde tamamen normal nörolojik fonksiyonların varlığı saptanmıştır. Uygulanan deneysel modelde, resveratrol spinal kordun iskemi ve reperfüzyonu sonrası gelişen hasarı ve gelişen nörolojik defisiti azalttığı da tespit edilmiştir (Kızıltepe vd. 2003). Resveratrol ve alzheimer Kırmızı Şarabı oluşturan resveratrol, beta-amiloid nörotoksikliğe (neurotoxicity-sinir sistemi için zararlı maddeler) karşı koruma sağlamaktadır. Bir nörotoksik madde olan Beta-Amyloid peptid (Abeta), Alzheimer hastalığının oluşum sürecindeki hücre ölümleriyle büyük derecede ilişkilidir. Doğal bir polifenol olan resveratrol, esas olarak kırmızı şarapta bulunmakta, cardioprotective (kalp koruyucu) ve kemoprotektif (chemoprotective-kimyasal koruyucu) olarak görülmektedir. Makul miktarda şarap alımı, Alzheimer hastalığı için düşük risk olarak ilişkilendirilmekte, resveratrol ün ekstra nöroprotektif etki yarattığı varsayılmaktadır. 18

30 Şu an yapılmakta olan çalışmaların amacı, Abeta ile uyarılarak yapılan nörotoksikliğe resveratrolün mümkün olan sinir koruyucu etkilerine açıklık getirmektir. Abeta ya bağlı oksidatif gerilimdeki sinir koruyucu kapasite, bu gibi potansiyel nöroprotektif maddeleri çalışmak için uygun olan hücre kültürü modelinde incelenmiştir. Resveratrol hücre yaşayabilirliğini devam ettirmekte ve hücre içindeki serbest radikal leşçil glütasyon maddesini arttırarak anti-oksidatif etki gerçekleştirmektedir. Bu çalışma sonucunda kırmızı şarap resveratrol ün etkileri ile sinir sistemi koruyucusu olabileceği saptanıştır (www. raysahelian.com/resveratrol,2005) Resveratrolün ilaç formları Resverarol ün RES VIN adındaki ilaç formu İtalyada bulunan Geymonat firması tarafından üretilmektedir. Ayrıca İtalya da bulunan Nuova ICT firması da RESVELIFE adında başka bir ilaç piyasaya sürmüştür. Piyasada bu ilaçların 20 mg, 50 mg, 200 mg ve fazlası bulunmaktadır. Ancak kalp ve kanser hastalığı için günlük 5mg, 10mg, 15 mg lık dozajlar önerilir ( 2005). Şekil 2.2 Resveratrolün ilaç formu 60 kapsülden oluşan ve Resveratrol adı ile piyasaya sürülen diğer bir ilaç ise % 10 emodin, E vitamini, saf askorbik asit, yeşil çay ekstraktı, Pycnogenol, Tocotrienols, CV Forte gibi yapıların yanısıra %20 oranında Resveratrol içermektedir. Bu ilaçların piyasa değerleri yaklaşık olarak 17 ile 35 $ arasındadır (www. standardvitanet.com, 2005). 19

31 2.4 Fitoaleksin Kavramı ve Elisitörler Bitkilerin biyotik veya abiyotik bir stres faktörü ile karşılaştıklarında sentezledikleri düşük molekül ağırlığındaki antimikrobiyal organik bileşiklere fitoaleksinler adı verilmektedir. Fitoaleksinler, bitki savunma mekanizmalarının ürünleri olarak sentezlenen, sekonder (ikincil) metabolitlerdir. Çok düşük miktarlarda sentezlenmekte olan bu maddelerin; bitkilerin, stres koşulları altında korunma ve dayanım mekanizmalarını oluşturmalarında rol oynadıkları bilinmektedir. Fitoaleksin teriminin kullanımı 1940 yılında, Müller ve Börger tarafından önerilmiştir. Phytoalexin, Yunanca bir terim olup; phyton: bitki, alexein: koruyan madde anlamındadır. Yapılan çalışmalarda, 21 familyada 100 den fazla bitki türünde fitoaleksinlerin sentezlenebildiği belirlenmiştir. Bitki hücrelerinde varlığı saptanan fitoaleksinler; poliasetilenler, tiyofenler, seskiterpenler, diterpenler, kumarin ve izokumarinler, kalkonlar, izoflavonoidler, stilbenler ve alkaloidler gibi farklı kimyasal sınıflarda yer almaktadır. Fitoaleksin sentezin başlamasında enzimler etkilidir. Bazen tek bir fitoaleksinin sentezlenebilmesi için 20 den fazla enzime gerek duyulabilmektedir Enzimleri harekete geçiren ise biyotik ya da abiyotik uyarıcılardır (Keskin 2007). Fungal patojenlerle yapay olarak inokule edilen veya çeşitli abiyotik etkenlere maruz bırakılan bakla kotiledonlarında fitoaleksin üretimlerinin analizlendiği çalışma fitoaleksin üzerine yapılan bir çalışma olarak örnek verilebilir (Soylu et al. 2002). Fitoaleksinlerin üretimi bir etki-tepki mekanizmasının sonucu oduğundan, bu maddelerin üretimini teşvik eden farklı uygulamaların da olabileceği düşünülmüştür. Bitkilerde fitoaleksin sentezini teşvik edici maddelere ilk olarak uyarıcı (inducer) ismi verilmiştir. Daha sonra Keen, (1975) bu maddeleri açığa çıkarıcı (elicitor) olarak tanımlamıştır (Keskin 2007). 20

32 Fitoaleksin sentezine yol açan elisitörler; biyotik elisitörler (polisakkaritler, proteinler, glikoproteinler, bakteri, mantar ve hatta bitkisel kaynaklı hücre duvarı parçalanma ürünleri vb.) ve abiyotik elisitörler (UV, ağır metal iyonları vb.) olmak üzere iki gruba ayrılırlar. Fitoaleksinler birçok bitki türü tarafından üretilmekle birlikte, tüketilebilir türlerin sayısı daha sınırlıdır. Fitoaleksin üretiminin belirlendiği türlerden olan asmalar insan beslenmesine farklı değerlendirme şekilleri ile konu olması nedeniyle önem kazanmaktadır. Asmalarda fitoaleksinlerin üretilebildiği ilk olarak Langcake ve Pryce (1976) tarafından stilbenlerin belirlenmesiyle tanımlanmıştır. Araştırıcılar, stilbenleri Botrytis cineraea (kurşuni küf) ile enfekte olmuş farklı üzüm çeşitlerinin (Cabernet Sauvignon, Gordo, Sultani, Clare, Müller-Thurgau, RieslinxSylvaner) yapraklarında analizlemişlerdir. Asma stilbenlerine, trans- ve cis-resveratrol, resveratrolün glikoziti olan piceid (polydatin), viniferinler (ε-viniferin, α-viniferin, β-viniferin, γ-viniferin), pterostilben, astringin, piceatannol (astringinin) ve diğer resveratrol trimer ve tetramerleri gibi pek çok bileşik dahildir. Asmada stilben grubu bileşikler içerisinde en çok üretilen ve dikkat çeken organik ürün resveratrol (3,5,4'-trihydroxystilbene) dür. Resveratrol, ultraviyole ışın uygulanmamış sağlıklı yapraklarda belirlenemezken, UV ışın uygulanmış yapraklarda µg gfw -1 arasında değişen miktarlarda bulunmaktadır (Keskin ve Kunter 2005) Biyotik elisitörler Kurşuni küf (Botrytis cinerea), mildiyö (Plasmopara viticola), ölü kol (Phomopsis viticola), tane çürüklüğü (Rhizopus stolonifer) gibi fungal etmenlerin bulaştığı asmalarda stilbenler fitoaleksinler gibi davranırlar. Bu gibi koşullarda belirlenebilen stilbenler; trans-resveratrol, ε-viniferin, α-viniferin ve fterostilbendir. Bunlar yapraklarda ve meyve kabuğunda üretilirler. Detaylı bilgi Çizelge 5.1 de yer almaktadır. 21

33 Uyarılamamış yapraklar ve meyveler stilbenleri sentezleyemezler. Hastalıklara karşı dayanıklı genotipler, (Amerikan türleri ve türler arası hibritler) uyarılmadan sonra hızla ve yüksek miktarda yaprakta ve meyvede fitoaleksin birikimi gösterirken, hassas genotiplerde fitoaleksin sentezi yavaş ve düşük miktarlarda bulunur (Keskin 2007) Abiyotik elisitörler Fungus ve bakterilerin yanı sıra, asmada stilben fitoaleksinleri; ultraviyole ışın (UV), alüminyum klorür (AlCl 3 ), ozon, yaralama, fosetil-al (alüminyum etil fosfit) gibi abiyotik faktörlerle de açığa çıkabilmektedir. Detaylı bilgi Çizelge 3.1 ve 3.2 de yer almaktadır (Keskin ve Kunter 2005). Bu bölüme kadar üzüm ve resveratrol konusunda genel bilgi verilmiştir. Tez kapsamında resveratrol üretimine ses ötesi dalgaların etkisinin araştırılması sebebiyle bölüm de de ses ötesi dalgalara yönelik genel bilgi verilecektir. 2.5 Ses Ötesi Dalgalar Sonokimya mühendisliği kimyasal prosesler de ses (sonik) ve ses ötesi (ultrasonik) dalga uygulamalarını içermektedir. Sonokimya kimyasal tepkimeleri ve kütle aktarımını artırır veya ilerletir (Adewuyi et al. 2001). Ses ötesi dalgalar (ultrasound) ve kavitasyonun etkileri 100 yıldan daha fazla bir süre önce merak uyandırmıştır. Kavitasyon hakkındaki ilk kayıtlar 1895 yılında Thornycroft ve Bornaby nin HMS Daring denizaltılarının pervanelerinin aşındığını ve oyulduğunu not aldıkları zamana dayanır. Bundan 22 yıl sonra 1917 de Lord Rayleigh sıkıştırılamayan akışkanlardaki kavitasyon olayının ilk matematik model tanımını yayımladı. Ses ötesi dalgaların (SÖD), Richards ve Leomis ilk kimyasal ve Wood ve Loomis ise biyolojik etkilerini 1927 yılına kadar SÖD tepkime hızını artırmak amacıyla kullanılmıştı. 10 yıl sonra Brohult (1937) SÖD ü kullanarak biyolojik polimerlerin 22

34 bozunmasını keşfetti. Bu alandaki araştırmalarda; Schmid ve Romel tarafından 1939 da sentetik polimerlerin bozunması konusu genişletildi (Thompson et al. 1999) yılında Harvey difüzyon doğrultusundaki genel düşünceyi, bir başka deyişle, titreşim süresince kabarcıkların ara yüzeyinde yetersiz transfer olması sonucu mikro kabarcıkların büyümesi fikrini ortaya attı yılından önce sonokimya alanında heyecan verici ve yeni birkaç gelişme oldu. Noltink ve Neppirs (1950) kavitasyon kabarcığının ilk kez bilgisayarla hesaplama modelini oluşturdular. 3 yıl sonra organik akışkanların sonolizi Schultz ve Henglein tarafından kaydedildi yılında Elder et al.. heterojen sistemlerde günümüzde iyi bilinen ultrasonik temizleme etkilerinin faktörlerinden birini önerdi. Elder 1960 yıllarında çoğunlukla biyolojik sistemlerde sonokimyasal etkilere yönelik yayınlar yaptı. Ultrasonik temizleme banyosu ortaya çıkınca çoğu kimyasal ve metalürjik labratuvarlarda cam eşya için yapılan temizleme yolları popülerliğini yitirdi (Thompson et al. 1999) yılında akışkan sistemlerde ses ötesi dalgaların fiziksel etkilerinin arttığı anlaşıldı. Naude ve Ellis (1961) asimetrik kavitasyon süresince mikro jet formlarının varolduğunun hipotezini öne sürdü. Bu genel düşünce bugün hala canlıdır. Bu düşünce akışkan yüzeylerindeki korozyonu ve heterojen sistemlerde tüm parçacık boyutlarının indirgenmesini açıklamak için kullanılır yılında Weissler çevredeki tepkime sıcaklığının artışı ile sonokimyasal tepkimelerin hız azalışının ilk incelemelerini yaptı yılında Flynn şimdilerde genellikle kullanılan terimlerden süreksiz kavitasyon ve sürekli kavitasyon kavramını gündeme getiren ilk kişi oldu ler de sonokimya ile ilgili yayınlar durgunlaştı. Bununla birlikte 1980 ler de bu alandaki ilgi yeniden kazanıldı ve yayın sayısındaki artış heyecan vericiydi

35 yılında Neppiras akustik kavitasyon derlemesi için ilk olarak sonokimya terimini kullandı yılında Makino ve arkadaşları ESR (Elektron Spin Rezonans) ölçümleriyle suyun sonolizi süresince H ve OH ın oluştuğunu kanıtladı. Bu yıllarda UK. da ki Warwick Üniversitesinde yapılan Royal Society of Chemistry, UK nın Atomic Energy Authority nin Harwell laboratuarın da Sonokimya Grubunun temelleri oluşturuldu. Bu topluluk Sonokimya Grubunun bakış açısıyla ses ötesi dalgaların endüstrideki kullanım alanlarını geliştirdi ler de ve 1990 lar dan önce sonokimya araştırmaları için cihazların tasarımına ve pazarlanmasına birkaç ürünle başlandı. Kimyada ses ötesi dalgaların uygulamaları yeni bir yayın olarak ilk kez 1994 yılında Ultrasonics Sonochemistry adıyla piyasaya sürüldü (Thompson et al. 1999) Ses ve ses ötesi dalgaların fiziği Ses dalgaları, değişik ortamlar içinde yayınan boyuna dalgalardır (Halliday, 1992). Bu dalgalar herhangi bir ortamda (yani gazlar, katılar veya sıvılar), ortamın özelliklerine bağlı olan bir hızla yayınırlar. Ses dalgası bir ortamda yayınırken; ortamın parçacıkları, dalganın hareket doğrultusu boyunca yoğunluk ve hacim değişiklikleri üreterek titreşirler. Bu parçacık hareketi, dalga hareketinin yönüne dik olan enine dalga hareketindeki durumun tersidir. Ses dalgaları şeklinde ortaya çıkan yer değiştirmeler, denge konumundan itibaren her bir molekülün boyuna yer değiştirmesini gerektirir. Bu sıkışma ve genişleme, yüksek ve alçak basınç düşmelerine yol açar. Bir mikrofonun diyaframındaki gibi, ses dalgası kaynağı sinüsel olarak titreşirse, basınç değişimleri de sinüsel olur. Frekanslarına göre, boyuna mekanik dalgalar üç gruba ayrılır. 24

36 1-) İşitilebilir dalgalar (sonic): İnsan kulağının duyarlık sınırı içinde olan ses dalgalarıdır. Bu dalgalar 20 Hz ile Hz frekansları arasındadır. Bu sesler değişik yollarla yaratılabilir; müzik aletleriyle, boğazdaki ses telleriyle ve hoparlör ile. 2-) Ses altı dalgalar ( infrasonic ) dalgalar; işitilebilir mertebenin altındaki frekansta olan boyuna dalgalardır. Deprem dalgaları bu dalgalara örnektir. 3-) Ses üstü dalgalar (ultrasonic ) dalgalar; işitilebilir mertebenin üstündeki frekansları olan boyuna dalgalardır. Örneğin, bu dalgalar, bir kuartz kristaline alternatif elektrik alanın uygulanmasıyla elde edilebilirler. Bu yol ile, 6*10 8 Hz (=600MHz) kadar yüksek ultrasonik frekanslar elde etmek mümkündür. Hava içinde bu frekansa tekabül eden dalga boyu 5*10-5 cm dir. Bu değer görünür ışık dalgalarının boyu ile aynı büyüklüktedir. Gücü, bir halden diğerine dönüştüren herhangi bir aygıt, transducer (dönüştürücü) olarak adlandırılır. Mikrofon ve kuartz kristal gibi, seramik ve magnetik fonograf pikaplar da ses dönüştürücülerine ait genel örneklerdir. Bazıları ise, ultrasonik dalgalar yaratabilirler. Böyle aygıtlar, ultrasonik temizleyicilerde ve sualtı denizciliğinde kullanılır (Halliday, 1992). Titreşim gösteren unsurların hepsi, havayı sıkıştırarak öne doğru ilerlemesine ve daha sonra gevşeterek geri gelmesine neden olurlar. Hava, bu etkileri kaynaktan dışarı doğru bir dalga olarak meydana getirir. Engellenmedikleri sürece ses dalgaları kaynaktan dışa doğru bütün yönlerde yayınırlar. Şekil 2.3 de sıkıştırılabilir bir ortam ile doldurulmuş uzun bir tüp ve ucundaki piston gösterilmiştir. Dikey çizgiler sıkıştırılabilir ortamı (akışkan) aynı kütleye sahip dilimlere bölmektedir. Çizgilerin birbirine yaklaştığı yerlerde akışkan basıncı ve yoğunluğu, normal dağılımı değerlerinden daha büyüktür. Akışkan, sürekli bir ortam olarak kabul edilecek ve akışkanı oluşturan moleküllerin gelişi güzel hareketleri göz önüne alınmayacaktır. 25

37 Şekil 2.3 Salınan bir pistonun bir tüp içerisinde ürettiği ses dalgaları Aynı renk tonundaki bölgeler tüp içindeki sıkıştırılabilir ortamı eşit kütleli kısımlara ayırır. Tüp sonsuz olacak şekilde kabul edilmiştir. Dolayısıyla yansımanın neden olduğu karmaşıklık söz konusu değildir. Şekil 2.3 de görülen pistonu ileriye doğru itecek olursak pistonun önünde duran akışkan sıkışır ve akışkan basıncı ile yoğunluğu artar. Sıkışan akışkan ileriye doğru hareket eder ve kendisinden sonra gelen akışkan tabakasını sıkıştırır. Böylece bir sıkıştırma vurusu tüp boyunca ilerler. Eğer piston geriye çekilirse pistonun önündeki akışkan genişler ve basıncı ile yoğunluğu başlangıçtaki normal değerinin altına düşer. Bu durumda seyrekleştirme vurusu tüp boyunca ilerler. Bu vurular bir cisim boyunca ilerleyen enine vurulara benzerler. Ancak titreşen akışkan elemanları yayılma yönü ile aynı yönde yer değiştirirken titreşen sicim parçacıkları yayılma yönü ile dik yönde değiştirirler. Eğer piston ileriye ve geriye doğru salınmaya devam ederse, bir sürekli sıkıştırma ve seyrekleştirme katarı tüp boyunca hareket edecektir (Bkz. Şekil 2.3). Bir sicimdeki enine dalgalar olduğu gibi Newton un hareket kanunlarını kullanarak, boyuna dalganın yayılma hızını, ortamın esneklik ve eylemsizlik özellikleri cinsinden ifade edilebilir (Halliday et al. 1992). 26

38 p SIKIŞTIRMA BÖLGESİ p+ p p υ R υ+ υ Q υ P υ t (υ+ υ) t υ t Şekil 2.4 İçi gaz dolu bir tüpte bir vurunun hareketi (Halliday et al. 1992). Bir dış etki ile tedirgin edilmeyen gaz referans sistemi olarak alınırsa vuru soldan sağa υ hızı ile hareket eder. Ancak vuruya kendisinin kararlı olduğu bir referans sisteminden bakılır. Böyle bir referans sisteminde vurunun dışında kalan gaz tüp boyunca sağdan sola doğru υ hızı ile hareket eder. P noktasındaki hacmi V(=Aυ t) olan akışkan sıkıştırılmış bölgeye girdiğinde A( υ) t = V kadar sıkışır. Böylece, ρo υ 2 = - p/( V/V) eşitliği elde edilir. Bir cisim üzerindeki p basınç değişiminin, - V/V ye oranında, cismin esnekliğinin hacim modülü (bulk modulus of elasticity) adı verilir ve B ile gösterilir. Yani B=-V p/ V dir. B pozitiftir. Çünkü basınç arttıkça hacim azalır. Böylece Şekil 2.4 deki ortam içinde ilerleyen boyuna vurunun hızı υ = (B/ ρo ) 1/2 dir (Halliday et al. 1992). 27

39 2.5.2 Kullanım alanları Ses ötesi dalgaların kimyasal ve birbirine bağlı endüstrilerdeki uygulamaları Çizelge 2.2 de ve Çizelge 2.3 de gösterilmiştir. Çizelge 2.2 SÖD lerin kimyasal ve birbirine bağlı endüstrilerdeki uygulamaları (Thompson et al. 1999) Kimyasal ve Birbirine Bağlı Endüstriler Atomizasyon Hücre bozulması Kristal büyümesi Kristalizasyon Köpük giderme Gaz giderme Depolimerizasyon Katıların dispersiyonu Kurutma Emülsiyonlaştırma Ekstraksiyon Filitrasyon Yüzdürme Homojenleştirme Sonokimya Kimyasal tepkimeler için uyarıcı 28

40 Çizelge 2.3 Ultrasoundun diğer uygulamaları (Thompson et al. 1999) DİĞER Aşınma Temizleme Kömür-Yağ karışımları Kesme Tozların ayrışması Sondaj yapma Yankı tarama keşfi(mesafe tayini) Erozyon Metal yorulması testi Kusur dedektörü Görüntüleme Medikal içine çekiciler Metal-parça arıtma Metal boru çizimi Metallerin bozucu olmayan testleri Fizik tedavisi Lehimlemek Sterilizasyon Kaynak Biyoteknoloji Polimerizasyon Medikal kullanımı SÖD ların yararlarının anlaşılması açısından ultrasoundun kullanım alanlarından bazıları aşağıda detaylı olarak açıklanmıştır. 29

41 Kusur dedektörü Ultrasonik uygulamalarının pek çoğu iki olgudan yararlanır. İlki, ultrasonik bir ses dalgasının, iki maddeyi birbirinden ayıran yüzeye ulaşır ulaşmaz geri yansımasıdır. Bu etki hem mühendislikte hemde tıpta kullanılan kusur dedektörünün temelini oluşturur. Bir kuvars kristali osilatöründen (alternatif akım üreteci) kalın bir metal levhaya uygulanan ultrasonik bir sinyal, normalde levhanın içinden dosdoğru geçer. Ancak metal levhanın içinde bir çatlak, hava kabarcığı, cüruf (maden posası) veya başka bir kusur varsa, ultrasonik sinyalin bir kısmı geri yansır ve vericinin yanına yerleştirilen uygun bir alıcı tarafından saptanabilir. Ayrıca ilk ultrasonik titreşimi yolladıktan sonra kristal, geri dönen yankıları toplayan bir mikrofon olarak da kullanılabilir. Kusur dedektörünün kullanımına bir diğer örnekte tıp alanından verilebilir. Şöyle ki; Kafatasının bir tarafından ultrasonik bir sinyal yollandığında, sinyalin büyük bir kısmı diğer taraftan geri yansır ve kafatası içinde orta hattaki anatomik yapılardan gelen algılanabilir bir yankı saptanır. Bu test kimi zaman kaza geçiren insanlara uygulanır. Yankı, iki kenar arasında yarı yolda beklenen şekilde oluşmazsa, cerrah iç kanamanın beyni yerinden ittiği kuşkusuna kapılabilir. Bu tekniğin daha karmaşık biçimi özellikle gebelik sırasında karın bölgesini incelemek için kullanılmaktadır. Temizleme Ses ötesi dalgaların diğer yararlı uygulaması da hala tam olarak anlaşılamayan ancak kesinlikle çok etkili olan kavitasyon işlemidir. Bu sayede etkin bir temizlik yapmak mümkündür. Şöyle ki; bir ses dalgası art arda meydana gelen sıkışma ve genişlemelerden oluşur. Bir sıvı sıkışmalara kolaylıkla dayanabilir ancak genişleme yani basıncın şiddetli bir biçimde düşmesi sıvının içinde bir boşluk meydana gelmesine neden olur. Boşluk buharla veya sıvıdaki çözünmüş gazın ortaya çıkışıyla hemen doldurularak küçük bir kabarcığa dönüşür. Bu kabarcık dağıldığında şiddetli bir şok dalgası meydana gelir ve açık etkilere yol açabilir. İster büyük isterse küçük olsun mühendislikte kullanılan parçalar içinden ultrasonik bir ses dalgasının geçtiği bir sıvı banyosuna batırılarak çok iyi temizlenebilir. Kavitasyon işleminden kaynaklanan 30

42 sarsıntılar, metal yüzeylerdeki kirleri ovarak temizler ve başka herhangi bir biçimde kolaylıkla sağlanmayacak bir temizlik sağlar (Cordemans 1991). Ultrasonik enerji kullanımında havadan kirlilikler uzaklaştırılmakta,su ve çözeltideki zehirli bileşikler yıkılmaktadır. Yaklaşık 189 tane havada kirlilik yaratan çoğunluğu uçucu olan organik bileşikler Clean Air Act Amendment tarafından 1990 yılında belirlenmiştir. Buna göre; genel çözücüler,metilen klorid, kloroform, trikloretilen gibi halojen alifatik bileşikler ultrasonik etki ile mineralleştirilir. Yani; kirlilik yaratan bu bileşikler CO 2 gibi kısa zincirli organik asitlere ve/veya organik iyonlara dönüştürülür ( Adewuyi et al. 2001). Medikal kullanımları Kost (1993) ultrasoundun klinik ilaçlarda kullanılarak dağıtımının artışını araştırmıştır. Bu araştırma sonucunda; peptitlerin, proteinlerin ve diğer ilaçların dağıtımının hızını arttırdığını açıklamıştır (Thompson et al. 1999). Kavitasyon ve onunla ilgili işlemlerden cerrahlarda çevre dokulara zarar vermeden küçük bir bölgeye zarar vermeleri gerektiğinde yararlanır (Cordemans, 1991). Biyoteknoloji Mikrobiyal hücrelerin bozunması için ultrasoundun kullanılması Suslick tarafından araştırılmıştır (Suclick,1988). Hücre materyalleri ultrasonik alana konulduğu zaman şok dalgaları üretir. Kavitasyon olayları tarafından hücre materyallerinin etrafını sararak mekanik zarara neden olur. Ses ötesi dalgalar biyoteknoloji alanında N-acetyl-aminoacid lerin amino asit ve asetik anhidritten sentezi içinde kullanılır (Thompson et al. 1999). 31

43 2.5.3 Ses ötesi dalgaların kimya mühendisliği alanındaki avantaj ve dezavantajları SÖS lerin Kimya Mühendisliği alanında ultrasoundun avantaj ve dezavantajlarını şöyle sıralayabiliriz. Avantajları Tepkime hızını ve dönüşümünü artırmaktadır, Sentez basamağının numarasını indirgemekle birlikte son verimin eş anlı olarak artışını sağlar verimi ilerletir, Tepkime yolunu değiştirir, Biyolojik,kimyasal ve elektrokimyasal sistemlerde tepkimeyi başlatır, Düşük saflık ayıraçları ve çözücülerin kullanımına imkan verir,bu sebeplerden dolayı miller operasyonlarının şartları(düşük sıcaklık ve basınç) ultrasoundun kullanımını elverişli kılar, yani ultrasound düşük sıcaklık ve basınçta kullanılabilir, Çözücüler için ekstra masrafı elimine eder, Temizleme amaçlı kullanılabilir, SÖD sıvı çözeltilerdeki metallerin indirgenmesinde başarılıdır. SÖD genellikle metal hızlarını aktive eder,yinede miller durumlarında dikkatli olunmalıdır. Dezavantajları SÖD reaktif olarak aktif metallerde kullanılır, ancak genellikle katalizlemek için Li, Mg, Zn ve Al da kullanılmaz. Çünkü bunlar su ve oksijenin yüzeyinde hazır bulunarak deaktive etmeye eğilimlidirler. Endüstride sınırlı olarak kullanılır çünkü büyük ölçekte proses kurmak için taslaklar ve tasarımlar henüz tamamlanamamıştır. Bununla birlikte tamamlansa bile masrafları azaltma noktası (minimum masraf) bile çok yüksek bir değerdir (Thompson et al. 1999). 32

44 2.5.4 Ses ötesi dalga nasıl üretilir 1912 yılından sonra, ses dalgalarıyla buz dağlarını saptamak için çalışmalar yapıldı. Bu çalışmalar, karanlıkta veya sisli havalarda görülemeyen büyük nesnelerin varlığını ortaya çıkarmak için, sesin bir yere çarpıp geri dönme özelliğinden yararlanıyordu. Patlama sesleri ve başka yüksek sesler kullanılarak yapılan ilk deneylerde pek başarı elde edilemedi. Bunun ana nedeni yansıyan sesin çok zayıf olması ve bir gemide epey yüksek olan sürekli gürültüden kolayca ayırt edilememesiydi yılında Fransız fizikçi Langevin, frekansı işitme eşiğinin üzerinde olan bir ses kullanmanın daha iyi olacağını fark etti. Böyle bir ses, geminin motorlarından kaynaklanan parazitlerden ve denizdeki çeşitli gürültülerden etkilenmeyecekti. Bu sebeple kuvars kristalini kullanmaya karar verdi. Çünkü uygun şekilde kesilmiş bir kuvars parçası piezoelektrik özellik gösterir. Yani, kristale belli bir doğrultuda basınç uygulandığında, buna dik bir doğrultuda bir elektrik sinyali oluşur. Bunu terside geçerlidir, kristale alternatif bir gerilim uygulandığında kristal titreşmeye başlar. Kristalin büyüklüğü, doğal titreşim frekansı uygulanan elektrik sinyalinin frekansına eşit olacak şekilde ayarlanırsa, titreşimler çok büyük olabilir ve yoğun bir ses dalgası veya ultrasonik dalga üretir. Kuvars ve benzeri birkaç madde, günümüzde de ultrasonik ses üretmek için kullanılmaktadır. Benzer özelliklere sahip bir kristal, ultrasonik bir ses dalgası ile bombardıman edildiğinde bir elektrik sinyali üreten hassas bir mikrofon olarakta kullanılabilir (Cordemans 1991). 33

45 Şekil 2.5 Ses ötesi dalganın oluşum mekanizması 2.6 Kavitasyon Ultrasonik enerjinin kimyasal gücü, kavitasyon olayı ile ortaya çıkmaktadır. Kavitasyon, sıvıya bir negatif basıncın uygulanması sonucunda, sıvı içinde mikrobaloncukların oluşması olayıdır. Bu baloncuklar birbirleri ile sürekli olarak çarpışmaktadırlar ve böylece kuvvetli bir lokal enerji ortaya çıkmaktadır. ( Ses ötesi dalgaların kimyasal ve mekanik etkileri, kavitasyon kabarcıkları tarafından meydana gelmektedir. Kavitasyon kabarcıklarının genleşme sırasında büyümeleri, büzüşme sırasındaki daralmalarına göre daha fazladır. Bu durum sıvı fazda oluşan kabarcıkların gaz ya da buhar olarak eşit olmayan dağılımına bağlıdır. Sıvıda yer alan bu kabarcıklar içinde yüksek sıcaklık ve basınç meydana gelmektedir (Suslick 1988). Bütün ses dalgaları gibi, ultrasonik ses dalgası da sıvı içinde dalgalar halinde iletilmektedir. Bu dalgalar, içinden geçtiği ortamın moleküller arasındaki mesafe, salınım yapıldıkça değişecektir. Eğer yeterli miktarda negatif basınç sıvıya uygulanırsa, sıvı bütünlüğünü bir arada tutmak için gerekli olan kritik mesafe aşılacaktır. Sıvıda 34

46 parçalanma gözlenecek, boşluklar oluşacaktır. Bu boşluklara "kavitasyon baloncukları" denir ( Şekil 2.6 Kavitasyon kabarcığının oluşum mekanizması (Cordemans 1991) Ses ötesi dalgaların kavitasyonel etkilerinin sadece tek bir kabarcıkla değil; kabarcık yığını içerisindeki kavitasyonel olaylarla da ilgili olduğu bazı araştırmacılar tarafından savunulmaktadır (Bkz. Şekil 2.7). Yığın çözelti ortamı: T 300 K H 2 O 2, N 2,HO 2, O 2, Kabarcığın merkezi T> 5000 K P> 500 atm H 2 O (g) OH (g) + H (g) Gaz-sıvı ara yüzeyi T 2000 K OH + 2. bölge Şekil 2.7 Bir kavitasyon kabarcığı üzerinde sonokimyasal tepkimelerin oluştuğu bölgeler (Adewuyi 2001) 35

47 1. Bölge (Gaz Bölge) : Buharlaşmış tepkime karışımı ve gazlar bulunur. Bu bölgede yüksek sıcaklık ve basınç değerlerine ulaşılmıştır. Böylece serbest radikaller oluşur ki bunlar ya kendi aralarında tepkimeye girerler ya da sıvı bölgeye geçerler. 2. Bölge (Ara Bölge) : Daha az uçucu tepkime bileşenleri ve sürfaktantlar bulunur. 3. Bölge (Yığın Çözelti ortamı) : Sadece sıvı bulunur Kavitasyonu etkileyen faktörler Bir akışkanın hızı arttığı zaman basıncı düşer ve düşük basınçta akışkanın buharlaşma sıcaklığı azalır. Ortam sıcaklığının yüksek oluşu kavitasyon etkisini arttırır. Kavitasyon durumunda, akışkan (su) içinde kısa süreli buhar zerrecikleri oluşur ( 2006). Tepkime sistemlerini kavitasyon yoğunluğu direk olarak etkileyebilmektedir. Örneğin tepkime sıcaklığı, hidrostatik basınç, akustik güç kavitasyon yoğunluğundan etkilenmektedirler. Bununla birlikte kavitasyon yoğunluğunu etkileyen parametreler ise çözünmüş gazlar çözücü cinsi gibi faktörlerdir. Çözünmüş gazlar kavitasyon olayında önemli bir yer tutmaktadır. Kavitasyon kabarcıklarının patlamasıyla gazlar tepkime karışımından ayrılarak, yeni kavitasyonel olayların başlamasını zorlaştırır. Gaz karışımında kabarcıkların olması, kavitasyon kabarcıklarının oluşmasını hızlandırmaktadır. Ayrıca kullanılan gazın cinsi de kavitasyon kabarcıklarının meydana gelmesini etkiler. Kavitasyon olayında, kararlı ve kararsız olmak üzere iki tür baloncuk vardır. "Kararlı Baloncuklar", birden fazla akustik çevrimde kalıcıdırlar. "Kararsız Baloncuklar", ortamda genellikle bir akustik çevrimden daha fazla süre kalamazlar, şiddetle çarpışmadan önce başlangıç boyutlarının en az iki misli genişlerler. Önceleri kavitasyon etkilerinin yalnızca kararsız baloncukların çarpışmalarından dolayı ortaya çıktığı düşünülmekteydi. Fakat günümüzde, kararlı baloncukların çarpışmalarının sonokimyasal etkinin tümüne önemli bir katkı sağladığına inanılmaktadır ( 2007). 36

48 Sıcaklık, genellikle sonokimyasal tepkimelerin hızını azaltmaktadır. Bu azalış bir dizi olayın sonucunda gerçekleşmektedir. Tepkime sıcaklığının artması denge buhar basıncını artırmaktadır. Böylece daha çok kabarcık oluşumu gerçekleşmektedir. Ancak bu durum kavitasyonel kabarcığın daha fazla buhar içermesi anlamına da gelmektedir ki, buhar ses ötesi eriyiğin gücünü azaltmaktadır. Sonuç olarak sonokimyasal tepkimeler en iyi düşük sıcaklıklarda gerçekleşir. Basınç artışı ise sonokimyasal etki ile doğru orantılıdır. Çünkü kavitasyon sırasında oluşan ses ötesi enerji artmaktadır. Kavitasyon yoğunluğu yüksek viskoziteli sıvılarda daha yüksektir (Thompson et al. 1999). 2.7 Sonokimyasal Tepkime Teorileri Sonokimyasal tepkimeler, sisteme ses ötesi dalgalar verilerek gerçekleştirilen tepkimelerdir. Ses ötesi dalgaların kimyasal tepkimeler üzerindeki etkileri fiziksel ve kimyasal etkiler olmak üzere iki şekilde açıklanmaktadır. Ses ötesi dalgaların fiziksel etkileriyle katalizörün aktifliğini artırarak tepkimenin yürüyüşünü daha verimli hale getirmektedir. Ses ötesi dalgaların kimyasal etkileri ise, kavitasyon sırasında oluşan Reaktif radikal bileşenlerin oluşumu nedeniyle tepkime hızının artması şeklinde açıklanmaktadır (Adewuyi 2001). Ses ötesi dalgalar sıvı fazlı homojen sistemlerde kavitasyon olayını meydana getirerek akustik mikroakım veya çok küçük şekildeki girdaplara neden olmakta, böylece yığın çözeltinin kütle ve ısı aktarımını artırmakta ve hız gradyeni yaratarak kesme gerilimiyle sonuçlanmaktadır. Heterojen sistemlerde ise kavitasyonun mekanik etkileri görülmektedir. Kabarcık ile yığın çözelti ara yüzeyinde kabarcıkların asimetrik parçalanmasını sağlayarak, mikrojet şeklinde erozyon oluşturmaktadır. Şimdiye kadar bahsedilen bu kimyasal olayları açıklamak için 4 teori önerilmektedir. Bu teoriler (1) Sıcak-nokta teorisi (2) elektrik alan teorisi (3) plazma yük dağılımı teorisi ve (4) süperkritik teori şeklinde sıralanabilir. Bunlar prolitik bozunma, hidroksil radikal oksidasyonu, plazma kimyası ve süperkritik su oksidasyonu gibi bazı aktivitelerin oluştuğunu öne sürmektedir. 37

49 1.Sıcak-nokta teorisi: Bu teoriye göre, oluşan kabarcıkların şiddetle parçalanması esnasında noktasal olarak basınç 1000 atmosfer üzerinde ve sıcaklık yaklaşık 5000 K olmaktadır (Adewuyi 2001). Teorik hesaplamalar, su içinde kavitasyonu oluşturmak için, oldukça yüksek bir enerjiye ihtiyaç olduğunu göstermektedir. Eğer, saf su için kritik mesafenin 8-10 cm olduğu düşünülürse, gerekli negatif basınç atmosferlik bir mertebede olacaktır. Baloncukların, suyun buharlaşmasından meydana gelen buhar ile dolduğu düşünülerek bu hesaplama yapılırsa, kavitasyonu oluşturmak için yaklaşık 1000 atmosferlik bir negatif basınç gerekli olacaktır. Pratikte kavitasyon olayı, sıvının içinde dayanıklılığını zayıflatacak merkezler bulunmasından dolayı uygulanan daha düşük akustik basınçlarla meydana getirilebilir. Sıvı içinde zayıf noktaların bulunması, sıvı içinde gaz bulunmasından, asılı duran çok az miktardaki gaz baloncuklarından veya asılı durumdaki partiküllerden dolayı olmaktadır. Ultrafiltrasyon uygulanmamış tüm sıvıların içinde küçük parçacıklar bulunmaktadır ( 2007). 2. Elektrik alan teorisi: Sınır koşullarda yoğun elektrik alan yüzünden parçalanma ile birlikte aşırı uçta (extreme) koşullar meydana gelmektedir. Kabarcık oluşumu ve parçalanması esnasında ciddi bir elektrik alan gradyeni oluşmaktadır. Bunlar bağların kırılmasını ve kimyasal aktivitenin artmasını sağlamaktadır. 3.Plazma teorisi: Elektrik alan teorisinde olduğu gibi yoğun elektriksel alandan dolayı aşırı uçta (extreme) koşullar meydana gelmekte ve gerçek bir iç patlamanın gerçekleşmediği vurgulanmaktadır. Kavitasyon kimyasının esası parçalanmış, bir parçalanma prosesi ile oluşan korona-tipi akıma benzetilmektedir. Sonokimya ile korona kimyası arasında pek çok benzerlik olması bu fikri desteklemekte ve kabarcıklar içinde mikroplazmaların oluşturması bu görüşleri desteklemektedir. 4.Süperkritik teori: Kabarcık-çözelti ara yüzeyinde bir tabakanın var olduğunu ileri sürmektedir ve burada sıcaklık ve basınç suyun kritik koşullarının (647 K, 22.1 MPa) üstünde olabilmekte ve fiziksel özelikler gaz ile sıvı arasında yeralmaktadır. Sonolitik 38

50 olarak oluşan kavitasyon kabarcıklarının parçalanması sırasında süperkritik su elde edilmektedir (Adewuyi 2001). Genellikle, sonokimyanın çevresel konularında pek çok çalışma Sıcak-nokta kavramını kabul ederek deney sonuçlarını açıklamaktadır. 39

51 3. KAYNAK ARAŞTIRMASI Kaynak araştırması temel olarak; 1. Ses ötesi dalgaların kimyasal ve biyokimyasal tepkimeler üzerine etkisinin incelendiği çalışmalar 2. Resveratrol üretimine abiyotik uyarıcıların etkisinin ve üretim mekanizmasının incelendiği çalışmalar 3. Resveratrol üretimine ses ötesi dalgaların etkisinin incelendiği çalışmalar 4. Resveratrolün HPLC ile analizinin gerçekleştirildiği çalışmalar olmak üzere dört bölümde incelenmiştir. 3.1 Ses Ötesi Dalgaların Kimyasal ve Biyokimyasal Tepkimeler Üzerine Etkisinin İncelendiği Çalışmalar Ses ötesi dalgalar insan duyma sınırının üzerinde 20 khz ile 100 MHz frekans aralığındaki boyuna dalgalardır. Sonokimya ise, ses dalgaları ve ses ötesi dalgaların kimyasal proseslerde kullanımı şeklinde tanımlanmaktadır. İlk olarak ses ötesi dalgaların kimyasal ve biyolojik etkileri Loomis tarafından 1927 yılında belirlenmiştir (Thompson et al. 1999, Vajnhandl et al. 2005). Ses ötesi dalgaların en önemli etkilerinden biri tepkime hızını artırmasıdır (Thompson et al. 1999). Sakarozun hidrolizi tepkimesinde invertazın, nişasta ve glikojenin hidrolizi tepkimelerinde ise, alfa-amilaz ve amilo glikozoksidazın aktiviteleri üzerine ses ötesi dalgaların etkisinin incelendiği çalışmada, sisteme ses ötesi dalga 60 W gücündeki ultrasonik banyo kullanılarak verilmiştir (Barton et al. 1996). Substrat hidrolizi, 3,5- dinitrosalisilat (DNS) belirteci ile belli zaman aralıklarında şeker miktarındaki azalmanın izlenmesiyle belirlenmiştir. Tepkime hızı ses ötesi dalganın varlığında ve yokluğunda belirlenerek karşılaştırılmıştır. Sakaroz için invertaz aktivitesinde önemli bir (0.9 M da % 37) artışla en yüksek başlangıç hızına SÖD varlığında ulaşmıştır (Şekil 3.1.a). 40

52 Şekil 3.1 SÖD varken ve yokken sakarozun invertaz katalizli, Nişastanın ve glikojenin α - amilaz katalizli hidrolizi (a. SÖD varken ve yokken sakarozun invertaz katalizli hidrolizi, b. SÖD varken ve yokken nişastanın α - amilaz katalizli hidrolizi,c. SÖD varken ve yokken glikojenin α - amilaz katalizli hidrolizi ( Barton et al. 1996)) Nişastanın α- amilaz katalizörlüğünde gerçekleşen hidrolizinde ise, SÖD varken 8 g/l de hızın yaklaşık %57 arttığı gözlenmiştir (Şekil 3.1.b). 41

53 Şekil 3.1.c de görüldüğü üzere glikojenin alfa-amilaz katalizörlüğünde SÖD varken ve yokken hidrolizinde ise, 100 g/l başlangıç derişiminde başlangıç tepkime hızı % 6 artmıştır ( Barton et al. 1996). Matsuura et al. (1994) hücre büyümesi ve fermentasyon prosesinde etanol ve diğer uçucu bileşenlerin üretimine ses ötesi dalgaların etkisini araştırmışlardır. 30 mw/cm 2 de zayıf ses ötesi dalga uygulandığı zaman, sakkarifiye edilmiş pirinç çözeltisinden üretilen sake, bira ve şarapta fermentasyon süresi % oranında azaltılmıştır (bkz. Şekil 3.2). İzotermal koşullar (20 C) altında sürekli ses ötesi dalga etkisiyle yaklaşık 2.5 kat daha yüksek izoamilasetat derişimine ulaşılmaktadır. Bu çalışmada ayrıca, ses ötesi dalga etkisinin etanol ve diğer uçucu bileşiklerin üretiminin çözünmüş CO 2 derişiminin (DCO 2 ) azalması ile hızlandığı vurgulanmıştır (bkz. Şekil 3.2) Şekil 3.2 Şarap, bira ve sakenin CO2 üretimine SÖD etkisi, SÖD uygulanmamamış ( ), SÖD uygulanmış ( ) Bar (1988), kolestrolün Rhodococcus erythropolis ATCC tarafından kolestenona oksidasyonuna 20 khz frekansta ses ötesi dalgaların etkisini araştırmıştır. Bu çalışmada, ses ötesi dalga şiddetinin optimizasyonu ve karıştırmalı biyoreaktöre uygulama şekli hücrelerin yapısal bütünlüğü koruyacak ve onların metabolik aktivitesini güçlendirecek seviyede, ilk olarak incelenmiştir. Sisteme 2.2 W/cm 2 güç ile her 10 dakikada 5 saniye 42

54 sonikasyon uygulandığı zaman, 1.0 ve 2.5 g/l derişiminde kolestrolün mikrobiyal dönüşümünün kinetik hızında önemli artış olduğu ileri sürülmektedir. Kolesterolün enzimatik oksidasyonunda (1.0 g/l için) 16 saat sonunda dönüşüm % 62 iken SÖD etkisiyle aynı süre sonunda % 99 dönüşüme ulaşmıştır (Şekil 3.3). Aynı tepkime için 10 saat süreyle ses ötesi dalgaların her 10 dakikada 10 sn. uygulanmasıyla dönüşüm %40, her 10 dakikada 5 sn. uygulanmasıyla ise dönüşüm %99 olarak elde edilmiştir (Şekil 3.4). Bunun yanı sıra, tepkime süresi 22 saatten 16 saate düşmüştür. Buradan da SÖD süresini kısalttığı görülmektedir. Bu çalışmada ses ötesi dalgaların varlığında hücre içi ve dışı kütle aktarımının arttığı belirlenmiştir (Bar, 1988). Şekil 3.3 Kolestrolün SÖD varken ( )ve yokken ( ) mikrobiyal olarak dönüşümü (Başlangıç derişimi:1.0 g/l, SÖD her 10 dakika 5 s uygulanmıştır) (Bar, 1988). 43

55 Zaman (dakika) Şekil 3.4 Kolestrolün farklı periyotlarda SÖD uygulanmasıyla mikrobiyal olarak dönüşümü (Başlangıç derişimi: 0.5 g/l, SÖD her 10 dakika 5 s ( ) ve her 10 dakika 10 s ( )uygulanmıştır) (Bar 1988) Ses ötesi dalgaların başlatıcı olarak kullanıldığı Metoksiaminosilan tepkimesinin incelendiği bir çalışmada, yokluğunda tepkime gerçekleşmezken, ses ötesi dalgalar uygulandığında (35 o C, 3 saat) tepkime oluştuğu ve %100 dönüşüme ulaşıldığı saptanmıştır (Bremner, 1986). Ses ötesi dalgaların tepkimelerde üretim verimini artırmasına ait örneklerden biri, (Ph) 2 NH ın (Ph) 2 NCH 2 Ph a dönüşüm tepkimesidir. Bu sistemde mekanik karıştırma ile (ses ötesi dalga yokken) 48 saat sonunda % 70 verim elde edilirken, ses ötesi dalga uygulaması ile 1 saat sonunda verim % 98 e ulaşmıştır (Cordemans 1991). Takatsuki et al. (2003), Aleo arborescent kallus hücrelerindeki H + -ATPase enziminin aktivitesine SÖD ların etkisini incelemişlerdir. Geliştirilen aleo arborescent kalluslarının uyarılması için; 2, 5, 10, 30 ve 60 s. sürelerde, 28 khz lik ultrasonik banyo kullanılmıştır. Süspansiyon halindeki aleo arborescent kallus kültürlerinde SÖD uygulama sonucunda elde edilen veriler Şekil 3.5 de sunulmuştur. Bulgulara göre, yaş ağırlık, 2. gün sonunda 2, 5 ve 10 s. lik uygulamalarda artmış, 2. günden sonra, özellikle 44

56 2 ve 5 s uygulamalarda daha hızlı bir artış olmuştur. Şekil 3.5 de görüldüğü gibi, uzun süreli SÖD uygulamalarında (30s, 60s) yaş ağırlıkta belirgin bir azalma olmuştur. Şekil 3.5 Süspansiyon örneklerine SÖD uygulamasının etkisi Şekil 3.6 Katı kallus örneklerine SÖD uygulamasının etkisi 45

57 Farklı bir şekilde 20 khz frekansta SÖD uygulaması yapılmış katı aleo kallusları için elde edilen sonuçlar uygulama süresine karşı, başlangıç ile 15. gündeki ağırlıklar (F 0, F 15 ) arasındaki yüzdesel fark (100(F 15 F 0 )/F 0 /%) olarak Şekil 3.6 da gösterilmiştir. Şekil 3.6 ya göre, en fazla artış yani değişim 2W lık uygulama için 2 s. sonunda olmuştur. 3W gücünde SÖD uygulamasında kontrol durumu ile bir fark görülmemiştir. Ayrıca, 5W ve 10W güçteki SÖD uygulamalarında, tüm sürelerde olumsuz etki yaptığı bulunmuştur. Liu et al. (2006) Aleo arborescent kallusları içerisinde bulunan Ca 2+ -ATPase aktivitesine, 20kHz frekansta 2W gücünde sürekli ve %10 luk periyotlu, 10W gücünde sürekli SÖD uygulamasının etkisini incelemişlerdir. Çalışmada elde edilen bulgular Şekil 3.7 de gösterilmiştir. Buna göre, 2W güçte sürekli ve periyotlu olarak yapılan uygulamaların her ikisinde de 2s-10s arasındaki sürelerde düzenli olarak aktivite artışı olmuştur. Buna karşın, 10W güçte yapılan sürekli SÖD uygulamasında, 2s-10s aralığında aktivite azaldığı gözlenmiştir. Aktivite; 2W güçte 10s uygulama sonunda, sürekli SÖD ile %17, periyotlu SÖD ile %26 aktivite artışı ölçülürken, 10W güçte sürekli SÖD dalga uygulamasında %25 oranında aktivite azalması meydana geldiği görülmüştür. 100 enzim aktivitesi W %50 kesikli 2 W sürekli 10 W sürekli tepkime süresi (gün) Şekil 3.7 Ca 2+ -ATPase aktivitesine SÖD uygulamasının etkisi 46

58 Fizik, kimya, maden, metalürji, tıp, denizcilik, haberleşme ve daha pek çok alanlarda (Suslick 1988) kullanılan ses ötesi dalgaların endüstriyel anlamda hücrelerin parçalanması, kristal büyümesi, köpük ve gazların uzaklaştırılması, kristalizasyon, depolimerizasyon, kurutma, emülsiyon oluşturma, ekstraksiyon, filtrasyon gibi uygulamaları bulunmaktadır (Thompson et al. 1999). 3.2 Resveratrolün Üretimine Abiyotik Elisitörlerin Etkisinin Ve Üretim Mekanizmasının İncelendiği Çalışmalar Literatürde Resveratrol üretimine yönelik yapılan çalışmalarda, abiyotik uyarıcı olarak UV ve biyotik uyarıcı olarakda Botrytis cinerea üzerinde durulmuştur. Bunun yanısıra AlCI 3, Fosetil- Al ve ozon gibi abiyotik uyarıcıların kullanıldığı çalışmalar da mevcuttur Resveratrolün üretimine abiyotik ve biyotik elisitörlerin etkisi Baveresco ve Fregoni nin 2001 yılında yaptıkları çalışmanın sonucunda biyotik elisitörler ile Vitis türlerinde üretimi uyarılan stilben bileşikleri Çizelge 3.1 de gösterilmektedir (Keskin ve Kunter 2005). 47

59 Çizelge 3.1 Biyotik elisitörler ile Vitis türlerinde üretimi uyarılan stilben bileşikleri (Keskin ve Kunter 2005) Organ Elisitör Stilben bileşiği Derişim (µg gfw -1 ) Yapraklar Botrytis cinerea Plasmopara viticola Trans-resveratrol α-viniferin ε-viniferin Trans-resveratrol 10 ε-viniferin 100 Trans-pterostilbene 22 Bacillus sp. Trans-resveratrol Tane kabuğu Botrytis cinerea Trans-resveratrol 4-7 Tane eti Botrytis cinerea Trans-resveratrol <0.10 Çekirdekleri Botrytis cinerea Trans-resveratrol çıkartılmış tane ε-viniferin trans-pterostilbene trans-resveratrol 18 Bütün meyve Rhizopus stolonifer trans-pterostilbene 15 Çizelge 3.1 e göre; biyotik elisitör kullanılarak; Botrytis cinerea türü ile yaprakta yüksek derişimde trans-resveratrol (72.4 µg gfw -1 ) üretmek mümkündür. Yine aynı tür ile yapılan çalışma sonucunda tane etinde trans-resveratrol en az derişimde (0.1 µg gfw -1 ) üretildiği tespit edilmiştir. Bacillus sp. ile yapılan çalışmada ise en yüksek derişimde trans-resveratrol (78.3 µg gfw -1 ) yaprakta üretilmiştir. UV, AlCI 3, Fosetil- Al ve ozon gibi abiyotik elisitör kullanılarak yapılan çalışma sonucunda elde edilen veriler Çizelge 3.2 de verilmiştir. 48

60 Çizelge 3.2 Abiyotik elisitörler ile Vitis türlerinde stilben bileşiklerinin uyarılması (Keskin ve Kunter 2005) Organ Elisitör Stilben bileşiği Derişim (µg gfw -1 ) Yaprak Tane kabuğu Tane eti Bütün meyve UV trans-resveratrol α-viniferin 20 ε-viniferin 15 β-viniferin 9 γ-viniferin 80 trans-pterostilbene 9 AlCl 3 trans-resveratrol Fosetil-Al trans-resveratrol 4.80 ε-viniferin UV trans-resveratrol µg sq. cm -1 UV trans-resveratrol trans-resveratrol 1-3 trans-resveratrol 22 O 3 trans-pterostilbene 1.50 Çizelge 3.2 ye göre; UV ile en yüksek derişimde trans-resveratrol (750 µg gfw -1 ) yaprakta üretildiği ve tane etinde trans-resveratrolün en az derişimde (1-3 µg gfw -1 ) üretildiği saptanmıştır. Sonuç olarak; çalışma kapsamında kullanılan ve Resveratrol üretiminde etkili olan abiyotik elisitörleri en yüksek derişimden en düşüğe göre UV, AlCI 3, Fosetil- Al ve ozon olarak sıralamak mümkündür (Keskin ve Kunter 2005) Adrian et al. (1996) ın yaptığı çalışmada ise Resveratrol sentezine AlCI 3 ün etkisi incelenmiştir. Bu çalışma kapsamında 7 ay süresince 16 saat ışık/8 saat karanlık koşullarında oda sıcaklığında bekletilen Vitis Vinifera L. Cv pinot noir clone 113 ve Vitis Rupestris L. Cv Rupestris du Lot clone T110 türlerinin yapraklarını kullanmışlardır. Trans-resverarolün cis formuna dönüşmesini engellemek amacıyla ışıktan korunarak yaptıkları çalışmada abiyotik uyarıcı olarak AlCI 3 ü kullanmışlardır mm AlCl3 çözeltileri içerisine atılan örnekler 25 saat oda sıcaklığında ve karanlıkta bekletilmiştir. Deneyler 3 kez tekrarlanarak sonuçların yakın olduğu 49

61 gözlenmiş ve standart sapma hesaplanmıştır. Sonuçlar HPLC ile analizlenmiştir. Sonuçlar değerlendirilerek Şekil 3.8 de verilmiştir. Resveratrol Derişimi (µg/ g fw) AlCl3 in derişimi (mm) Şekil 3.8 V. vinifera ve V. rupestris türlerinin resveratrol üretimine AlCl3 ün çeşitli derişimlerinin etkisi (Adrian et al. 1996) Şekil 3.8 e göre; AlCl 3 ile muamele sonucunda iki türün trans-resvertrol sentezi farklı miktarlarda olduğu ve AlCl 3 ün tüm derişimleri (7-90 mm) dikkate alındığında resveratrol üretiminin yüksek olması için yüksek derişimlerde (22-90 mm aralığında) çalışılması gerektiği; ancak, 90 mm AlCl 3 dan V. rupestris türü için AlCl 3 zehir etkisi yaparak resveratrol derişimini düşürmesi sebebiyle bu tür için 90 mm değerini aşmamak gerektiği sonucuna varılmıştır. Araştırma kapsamında resveratrol üretim tepkime süresinin incelenmesi amacıyla 9, 15, 17, 22 ve 25 saat oda sıcaklığında ve karanlıkta bekletilmiştir. Deneyler 3 kez tekrarlanarak sonuçların yakın olduğu gözlenmiş ve standart sapma hesaplanarak Şekil 3.9 da verilmiştir. 50

62 Resveratrol Derişimi (µg/ g fw) Tepkime süresi (saat) Şekil 3.9 V. vinifera.( ) ve V.rupestris ( ) türlerinin resveratrol sentezinin zamanla değişimi(adrian et al. 1996) Şekil 3.9 a göre dayanıklı tür olarak bilinen V. rupestris türünün hassas tür olarak bilinen V. vinifera dan daha yüksek derişimde resveratrol ürettiği tespit edilmiştir. Ayrıca, V. rupestris derişiminin de arttığı görülmektedir. türü için, tepkime süesinin artması ile üretilen resveratrol Vitis vinifera L. Cv Pinot noir ve Vitis Rupestris L. Cv Rupestris du Lot türlerinin kullanıldığı benzer bir çalışmada ise, AlCl 3 yerine UV ışığının etkisi incelenmiştir. Işıktan korunan sistemde sadece yapraklar kullanılmış ve fitoaleksin üretimi incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar Çizelge 3.3 de yer almaktadır. Çizelge 3.3 UV ışığı etkisiyle uyarılan Vitis spp. nin fitoaleksin üretimi(jeandet et al.1997) µg/g fw V.vinifera V.rupestris transresveratrol transresveratrol Cis-resveratrol glukozit Trans- ε-viniferin trans-pterostilben

63 Çizelge 3.3 e göre; V.Rupestris türünün fitoaleksin üretiminde daha başarılı olduğu ve V.Rupestris in V.Vinifera dan daha dayanıklı bir tür olduğu sonucuna varılmıştır. Fitoaleksinler içerisinde en yüksek değerde oluşan maddenin ise trans-resveratrol olduğu saptanmıştır (Jeandet et al. 1997). UV ışının cv. Cabernet Sauvignon nun kallusu üzerindeki etkisi ise Keller et al. (2000) tarafından incelenmiştir. Bu çalışma sırasında 10 dk. UV verildikten sonra kallus örnekleri 80 o C de saklanmış ve sistem diğer çalışmalarda olduğu gibi ışıktan korunmuştur. Deneysel bulgular Şekil 3.10 da verilmiştir , Tepkime süresi (saat) Şekil 3.10 cv. Cabernet Sauvignon türü kallusunda resveratrol üretimine UV ışınının etkisi (Keller et al. 2000) Şekil 3.10 a göre; bu çalışmada UV ışını etkisi ile cv. Cabernet Sauvignon nun kallusunda da resveratrol üretilebileceği ancak UV ışığının uzun süreli verilmesi (64 saatten sonra) durumunda kallus ta dokulara zarar verici etki yapabileceği sonucuna varılmıştır (Keller et al. 2000) yılında Adrian et al. yaptığı bir başka çalışmada ise Pinot Noir,Gamay (Siyah tür) ve Chardonnay (Beyaz tür) üzerine abiyotik bir uyarıcı olarak UV ışının etkisi araştırılmıştır. Bu çalışma kapsamında B. Cinere nın enfekte ettiği yer (I nolu bölge), I bölgesi etrafında enfekte olmamış meyve bölgesi (II nolu bölge) ve çürümüş dokulardan uzak meyvelerin bölgesi (III nolu bölge) olmak üzere üzümleri 3 bölüme ayrılan üzüm yapısı Şekil 3.11 de yer almaktadır. 52

64 B. Cinere nın enfekte ettiği yer Şekil 3.11 Üzüm salkımının bölgeleri (Adrian et al. 2000) I bölgesi etrafında enfekte olmamış meyve bölgesi Çürümüş dokulardan uzak meyvelerin bölgesi 10 dakika UV ışını verilen örnekler 24 saat ve 48 saat sonunda dondurularak muhafaza edilmişlerdir. Bulgulara göre; Gamay ve Chardonnay türleri herhangi bir ışıma olmadan Resveratrol üretmektedir. Başka bir deyişle iki tür her zaman streste gibi davranarak stilben bileşiklerini çeşitli derişimlerde üretmektedir. Ayrıca, UV-C ışınının 24 saat ve 48 saat etki etmesi 3 türde de Resveratrol üretimini farklı değerlerde artırmaktadır. (2) ve (3) nolu bölgelerde resveratrol derişimi ışıma olmadığı duruma göre 2-30 kat artmıştır (Adrian et al. 2000). Yerfıstığı bitkisinde, abiyotik stres faktörleri ve hormonların, resveratrol syntase geni üzerine etkisinin incelendiği bir çalışmada, yerfıstığı bitkilerinde Resveratrol Syntase genine abiyotik stres faktörleri ve hormonların etkisi incelenmiştir (Chung et al. 2003). Yerfıstığı bitkisinde, resveratrol; yaprak, kök ve kabukta önemli miktarlarda ( µg/g FW) bulunurken, tarlada yetiştirilmiş yerfıstığı bitkilerinin tohum kısımlarında çok az ( µg/g FW) görülmüştür. Abiyotik stres faktörleri olarak; UV, paraquat, yaralama, H 2 O 2, salisilik asit, jasmonik asit ve absisik asit kullanılmıştır. Diğer tüm stres faktörlerine karşı bir artış gözlenirken, absisik asit uygulanmasına karşın bir değişim olmamıştır. Çalışmada elde edilen sonuçlara göre; köklerde ve kabuklarda resveratrol birikimi, yaralama ve mantar enfeksiyonları gibi etkilerle artış göstermiştir. Yapraklarda ise, yaralama ve UV gibi abiyotik stres faktörlerinin etkisiyle birikim olduğu gözlenmiştir (Chung et al. 2003). 53

65 3.2.2 Resveratrolün kimyasal sentezi Resveratrolün üretiminin kimyasal üretimini ise Jeandet et al. (1991) incelemiştir. Witting kondenzasyonu olarak anılan tepkime Şekil 3.12 de gösterilmektedir. Şekil 3.12 Trans-resveratrolün kimyasal sentezi (Becker et al. 2003) (1. metiltrifenilposponyumbromit, 2. 4-trimetilsikloksibenzaldehit 3. tuz yapısı, 4. trans-resveratrol) Witting kondenzasyonu sonucunda ham ürün elde edilmektedir ve elde edilen ham ürün etanol- su karışımı ile saflaştırılarak yeniden kristallendirme işlemi yapılır. Bu işlem sonucunda ise % saflıkta trans-resveratrol sentezlenebilir (Jeandet et al. 1991) Resveratrolün biyokimyasal sentezi Günümüzde en son teknik olarak kullanılan biyokimyasal yöntemle resveratrol üretimini ise Becker et al yılında incelemiştir. Saccharomyces cerevisiae kullanılarak trans-resveratrol üretimi yapılması amaçlanan bu çalışmada, genetik yapısı bilinmesi sebebiyle E.Coli kullanılmış ve elde edilen plazmit S. Cerevisiae ya verilmiştir. Fenilalaninden trans-resveratrol sentezi olarak bilinen yol izi Şekil 3.13 de gösterilmektedir. 54

66 Şekil 3.13 Fenilalanin den trans-resveratrolün biyosentezi (Becker et al. 2003) Elde edilen sonuçlar incelendiğinde rekombinant nesli 5 türü 1.45 µg/l kültür hacmi ile diğer rekombinant nesillere göre en yüksek derişimde trans-resveratrol üretmeyi başarmıştır (Becker et al. 2003). 3.3 Resveratrol Üretimine Ses Ötesi Dalgaların Etkisinin İncelendiği Çalışmalar Kernels yerfıstığında resveratrol üretimine abiyotik elisitör etkisinin incelendiği çalışmada, resveratrol sentezine UV ışınları ses ötesi dalga (ultrasound) ve biyotik stres faktörlerinin etkisi incelenmiştir (Rudolf et al. 2005). Bu araştırma kapsamında, ayrıca fenolik bileşiklerin ve antioksidan aktivitesinin stres faktörleri ile değişimi incelenmiş, sadece trans-resveratrol miktarının stres faktörlerinin etkisinde arttığı gözlenmiştir. Öğütülmüş, kıyılmış, dilimlenmiş ve bütün haldeki yerfıstıklarına ayrı ayrı SÖD ve UV abiyotik stres faktörleri uygulanmıştır saat bekleme sürelerinin sonunda alınan örneklerin HPLC ile analizi yapılarak trans-resveratrol derişimleri belirlenmiştir. 55

67 Abiyotik stres faktörü uygulanmamış olan yerfıstıklarında trans-resveratrol derişimleri Şekil 3.14 de gösterilmiştir. Ayrıca SÖD uygulanan yerfıstıklarında trans-resveratrol derişimleri de Şekil 3.15 de yer almaktadır (Rudolf et al. 2005). Şekil 3.14 Abiyotik stres uygulanmamış yerfıstıklarında trans-resveratrol derişimleri (Rudolf et al. 2005). Şekil 3.15 SÖD uygulanmış yerfıstıklarında trans-resveratrol derişimleri (Rudolf et al. 2005) Yapılan araştırmanın sonuçlarına bakıldığında, en yüksek resveratrol derişimi dilimlenmiş (2 mm) yerfıstıklarında bulunmuştur. SÖD uygulanması (4 dakika) durumunda en yüksek trans-resveratrol derişimi 36 saatlik tepkime süresi sonunda görülmüştür. Bu durumda elde edilen resveratrol derişimi, uygulama yapılmamış yerfıstıklarındaki resveratrol derişimine göre 8,25 kat (0.48 µg/g değerinden 3.96 µg/g 56

68 değerine) artış göstermiştir. Yerfıstıklarında SÖD uygulaması için, örneklerin 36 saatten fazla tepkime süresine bırakılmasının, bitki dokularına ve resveratrol içeriğine zarar verdiğinden, trans-resveratrol derişiminde olumsuz etkiye neden olduğu görülmüştür. 3.4 Resveratrolün HPLC ile Analizinin Gerçekleştirildiği Çalışmalar HPLC analiz yöntemi için en uygun yöntemin belirlenmesi amacıyla yapılan kaynak araştırması aşağıda verilmiştir: M. Adrian et al. (1996) yaptıkları araştırmada, alüminyum klorür (AlCI 3 ) ün resveratrol üretimine etkisini incelemiş ve analiz metodunu geliştirmişlerdir. Bu çalışma kapsamında, 4. ve 5. yapraklardan kesilen Vitis Vinifera L. Cv pinot noir ve Vitis Rupestris L. Cv Rupestris du Lot clone T110 türleri oda sıcaklığında bekletilmiştir. Abiyotik uyarıcı olarak AlCI 3.6H 2 O kullanılan sistemde trans-resveratrol ün, cisformuna dönüşmesini engellemek amacı ile sistem ışıktan korunmuştur. Bu çalışma da kullanılan HPLC analiz koşulları Çizelge 3.4 de yer almaktadır. Çizelge 3.4 Trans- resveratrol ün HPLC analiz yöntemi (Adrian et al. 1996) Taşıyıcı Faz A: %40 Asetonitril B :% 60 Su Örnek miktarı 10 µl veya 20 µl Akış Hızı Kolon Dedektör λ (dalga boyu) 0.6 ml/ dakika Lichrocart Merck C18 (Merck- Clevenot Corp.,Darmstadt,Germany, 250mm*4mm,5 µm veya Model W 996 fotodiode Array Dedektör λ : 380 nm (resveratrol) λ : 340nm (max excitation) λ : 374 nm (emision) Çizelge 3.4 de görüldüğü üzere bu çalışmada analizin başlangıcında çözücü olarak %40 Asetonitril % 60 Su kullanılmıştır. Ayrıca akış hızı 0.6 ml/dk olarak düşük bir değer seçilmiştir. Bu değerin düşük olması piklerin tam olarak ayrışmasını engellemekte ve 57

69 kalma süresinin uzamasına neden olmaktadır. Bununla beraber alınan örnek miktarı 10 µl veya 20 µl olarak alınmasından dolayı piklerin keskinliği değişmektedir. Jeandet et al. (1997) yaptıkları çalışmada, Vitis Vinifera L. Cv pinot noir ve Vitis Rupestris L. Cv Rupestris du Lot türlerinin sadece yaprakları örnek olarak alınarak asm fitoaleksinlerine UV ışının etkisini incelemişler ve trans-resveratrol derişimini HPLC yöntemi ile belirlemişlerdir. Adrian et al. (1996) nın yaptığı çalışmada olduğu gibi, izomerizasyonu önlemek amacıyla sistem ışıktan korunmuştur. Bu çalışma sırasında kullandıkları yöntem Çizelge 3.5 de yer almaktadır (Jeandet et al. 1997). Çizelge 3.5 Jeandet et al. (1997) trans- resveratrol ün HPLC analiz yöntemi Taşıyıcı Faz A: Asetonitril B :Su Örnek miktarı 10 µl Akış Hızı 1 ml/ dakika Kolon Lichrocart Merck C18 (Merck- Clevenot Corp.,Darmstadt,Germany,250mm*4mm,5 µm veya 250*4mm LiChrospher 100 RP-18 (5µm)analitik kolon (Merck KGaA,Darmstadt,Germany) ve 4*4 mm C18 kolonu Dedektör Fotodiode Array Dedektör Program 10% A ve 90% B 15% B ve 85% A için 18 dakika 85% A ve 15%B için 5 dakika 10%A ve 90% B için 7 dakika λ (dalga boyu) λ : 380 nm (resveratrol): 340nm (max excitation): 374 nm (emission) Çizelge 3.5 de görüldüğü üzere bu çalışmada, Adrian et al. (1996) yöntemini geliştirerek çözücü olarak asetonitril miktarı % 40 yerine % 10 olarak alınmış ve analiz bu koşulda başlatılmıştır. Ayrıca gradient bir program uygulanmıştır. Bu yöntemin ekonomik olması açısından önemlidir. Bunun yanı sıra akış hızının 0.6 ml/dk dan 1 ml/dk ya arttırılmıştır. 58

70 Keller et al. (2000) yaptıkları bir çalışmada ise, asma örneklerine 12 gün UV ışın verip 8 saatte bir örnek almış ve 80 o C de dondurarak saklamışlardır. Sistem, izomerizasyonu engellemek amacıyla ışıktan korunmuştur. Araştırma kapsamında HPLC analizi için kullanılan yöntemin özellikleri Çizelge 3.6 da yer almaktadır. Çizelge 3.6 Keller et al. (2000). trans- resveratrol ün HPLC analiz yöntemi Taşıyıcı Faz A (2.5% (v:v) Sıvı asetik asit B (Asetonitril) Örnek 10 µl miktarı Akış Hızı 1 ml/ dakika Kolon 250*4mm LiChrospher 100 RP-18 (5µm)analitik kolon ve 4*4 mm C18 kolonu Dedektör Diode Array Dedektör Program 0% A ve 30% B :40 dakika 30% B den 90% B için 10 dakika 5 dakika 90% B 0% B için 5 dakika λ boyu) (dalga λ λ λ : 306 nm (stitbenes) : 358 nm (flavanols) : 278 nm (diğer fenolikler) Keller et al. (2000) yılında yaptıkları bu çalışmada, HPLC yönteminde çözücü olarak su yerine sıvı asetik asit kullanılarak Jeandet et al. (1997) kullandıkları yöntem de bazı değişiklikler yapmışlardır. Ancak asetik asitin su dan daha pahalı bir kimyasal olması sebebiyle, Keller et al. yönteminin ekonomik olmadığı düşünülebilir. Yöntemdeki diğer bir farklılık ise, kullanılan gradient programdır. Bu yöntem ile bir örneğin analizi 60 dakika sürmektedir. Buna karşın Jeandet et al. yaptıkları çalışmada kullandıkları HPLC yönteminde analiz süresi 35 dakika olarak belirlenmiştir. 59

71 Pascual and Marti (2001) nin araştırdığı bir diğer çalışmada ise, resveratrol ekstraksiyonunu süperkritik akışkan ile gerçekleştirmişlerdir. Trans-resveratrol analizi, 6 farklı üzüm çeşidi için C-18 ve C-8 kolonları kullanılarak HPLC yöntemi ile yapılmıştır. Çalışma süresince örneklerin aynı coğrafik alan ve yıllara ait olması ve gün ışığından korunmasına dikkat edilmiştir. C-18 kolonu kullanılarak yapılan HPLC analiz yöntemi Çizelge 3.7 de yer almaktadır. Çizelge 3.7 Pascual and Marti (2001) trans- resveratrol ün HPLC analiz yöntemi Taşıyıcı Faz Asetik asit: Metanol: Su ( 5:20:75) Örnek miktarı 20 µl Akış Hızı 1,5 ml/ dakika Kolon LiChrocart LiChrosphere 100 RP-18 (C-18 Dedektör λ (dalga boyu) antrepolanmış faz 5 µm parçacık boyutu) kolon uzunluğu 12,5 cm ve 4 mm iç çap. UV-Vis dedektör λ : 306 nm Pascual ve Marti nin yaptıkları araştırma da ise, taşıyıcı faz olarak asetik asit: metanol: su ( 5:20:75) karışımını kullanmıştır. Taşıyıcı fazın metanol ve asetik asit gibi kimyasalları da içermesi, yöntemin ekonomik bakımdan maliyetin artmasına sebep olmaktadır. Yöntemdeki diğer bir farklılık ise örnek miktarının ve akış hızının yüksek değerlerde tutulmasıdır. 60

72 4. MATERYAL VE YÖNTEM Tez çalışmasının bir bölümü Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü tarafından desteklenen Asmada in vivo ve in vitro Koşullarda Resveratrol Üretim Veriminin Abiyotik Uyarıcılar ile Arttırılması konulu projenin bir alt bölümünü oluşturmaktadır. Çalışmalar temel olarak; Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Kimya Mühendisliği Bölümü ve laboratuvarları, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Araştırma ve Uygulama Bağı Biyoteknoloji laboratuvarları ile, Biyoteknoloji Enstitüsü Laboratuvarlarının olanaklarından yararlanılarak gerçekleştirilmiştir. Tez çalışmasında kullanılan materyaller ve izlenilen yöntemlere ilişkin bilgiler aşağıda verilmiştir. 4.1 Materyal Çalışmada, siyah tane rengine sahip Kalecik karası klon 15 üzüm çeşidi üzerinde çalışılmıştır. Kalecik karası ülkemizin önde gelen kırmızı şaraplık üzüm çeşitlerindendir (Çelik 2006). Şekil 4.1 de çalışmada kullanılan kalecik karası üzümünün olgun salkımlarının görünüşü yer almakta olup Çizelge 4.1 de bu üzümün bazı özellikleri sunulmuştur. Şekil 4.1 Kalecik Karası üzüm çeşidine ait olgun salkımın görünüşü ( www. kalecikhem.meb.gov.tr, 2007) 61

73 Çizelge 4.1 Kalecik Karası Üzüm çeşidine ait bazı özellikler (Keskin 2007) Özellikler Kalecik Karası Çeşidi Çiçek tipi Erdişi Tane rengi Mavi puslu siyah Tane iriliği Orta,2-2.5 g Salkım şekli Kanatlı konik Salkım iriliği Küçük-orta,200 g Olgunlaşma Orta mevsim Kalite özelliği Menekşe-yakut renkli, çeşide özgü aromalı, dolgun ve dengeli şarabı ile ülkemizin en tanınmış kırmızı şaraplık çeşitlerinden birisidir 4.2 Yöntem Bu çalışmada Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü Araştırma ve Uygulama Bağlarından hasat edilen Kalecik karası klon 15 üzümünün kabukları kullanılmıştır. Deney sisteminin şematik gösterimi Şekil 4.2 de verilmiştir. Hasat edilen Kalecik Karası klon 15 üzümlerinin bir kısmına hasat edildiği gün (taze üzüm), diğer kısmına ise 20 0 C de dondurularak 1 yıl süresince bekletildikten (dondurulmuş üzümler) sonra SÖD uygulamaları yapılmıştır. Deneyden önce üzümlerin kabukları, etinden ve çekirdeğinden ayrılarak SÖD uygulanmamış örneklerdeki trans-resveratrolün derişimini belirleyebilmek amacı ile 1 gram kabuk ve ayrıca SÖD uygulamaları için 10 gram kabuk tartılmıştır. 50 ml lik tüplere yerleştirilen kabukların üzerine 10 ml ultra saf su eklendikten sonra kabuk boyutunu küçültme ve ortamı homojenleştirmek amacı ile sırasıyla 5 dakika rpm ve 5 dakika 7500 rpm değerindeki mekanik homojenizerler kullanılmıştır. Deneyden önce 20 ml daha ultra saf su eklenen örnekler 100 ml hacimli ceketli cam tepkime kabına yerleştirilerek deney başlatılmıştır. Ses ötesi dalgalar 20 khz ve 30 khz sabit frekans değerine sahip ultrasonik homojenizer (13 mm veya 19 mm çaplı çubuk bağlantılı) ile sisteme sürekli (S) ve belirli periyotlarda (P) verilmiştir. Ses ötesi 62

74 dalganın uygulama süresinin etkisini belirlemek amacıyla, 1 saat ve 10 dakika süresince sisteme ses ötesi dalgalar uygulanmıştır. Bununla birlikte, SÖD ların 20 khz frekansta periyotlu olarak verildiği uygulamalarda, 0.1 s açık 0.9 s kapalı (P01) ve 0.5 s açık 0.5 s kapalı (P05) olmak üzere iki koşulun etkisi incelenmiştir. SÖD ların 30 khz frekansta periyotlu olarak verildiği uygulamalarda ise, cihazda 0.1 s açık 0.9 s kapalı (P01) koşulunun bulunmaması sebebiyle sadece 0.5 s açık 0.5 s kapalı (P05) koşulunun etkisi araştırılmıştır. Ayrıca, birim alana farklı güçte dalga uygulamak amacıyla farklı çaptaki uçlar kullanılmıştır. Tepkime ortamını istenen sıcaklıkta tutmak için soğutmalı sirkülatörden yararlanılmıştır. Sistemde kütle aktarımını artırmak amacı ile manyetik karıştırıcı kulanılmıştır. SÖD uygulamasının bitiminde reaktörden alınan örnekler 0, 24 saat, 48 saat ve 72 saat süreyle trans- resveratrol üretilmesi ve -cis yapısına dönmemesi için karanlıkta ve oda koşulunda bekletilmiştir. Sözü edilen tepkime süreleri sonunda ortamdan alınan örneklerdeki resveratrol, Keller et al. (2000) tarafından belirtilen yönteme göre ekstrakte edilmiş ve derişimi Jeandet et al. (1997) in çalışmasında belirttikleri yönteme benzer şekilde C18 kolonu ( 5 µm, 250 x 4.6 mm I.D.) kullanılarak Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi (High Performance Liquid Chromatography; HPLC) yöntemi ile belirlenmiştir. çubuk Sirkülatörlü soğutma banyosu Ultrasonik homojenizer reaktör Manyetik karıştırıcı Şekil 4.2 Deney sisteminin şematik gösterimi 63

75 4.2.1 Analiz Kalecik Karası üzüm kültürüne ait örnekler içerisinde bulunan Resveratrolün (3,5,4 - trihyhoxystilbene) derişiminin belirlenmesi için öncelikle 3. bölümde verilen kaynak araştırması yapılmış, daha sonra en uygun ekstraksiyon yöntemi ve HPLC koşulları belirlenmiştir. Sonra, kalibrasyon için standartlar hazırlanarak trans-resveratrolün kalibrasyon grafiği oluşturulmuş ve Ek 7 de verilmiştir. Üzüm kabuğundan resveratrol ekstraksiyonu için literatürde 3 yöntem yer almaktadır. Resveratrolün ekstraksiyonuna yönelik incelenen çalışmalar Ek 1, Ek 2 ve Ek 3 de detaylı olarak açıklanarak Ek 4 de karşılaştırmaları yapılmıştır. En uygun yöntemin seçilmesi amacıyla kalecik karası, pinot noir ve Hamburg misketi üzümlerinden 1 gram kabuk tartılarak 3 yöntemle de ekstraksiyon yapılmıştır. Bu çalışmalar temel alındığında Kalecik Karası üzümünden resveratrolün ekstraksiyonu için en etkili yöntemin 1. yöntem (Keller et al. 2000) olduğuna karar verilmiştir. Ekstraksiyon aşamasından sonra, örneklerdeki resveratrolün HPLC analizine hazır duruma getirilmesi için çözücü uzaklaştırma işlemi yapılmaktadır. Çözücü uzaklaştırma işlemi de azot gazı ve döner buharlaştırıcı ile yapılarak, resveratrolün yapısı bozunmadan en ekonomik ve en kısa sürede gerçekleştirilebilecek yöntem araştırılmıştır. Metanol içerisinde saf resveratrolün çözünmesi ile elde edilen çözeltinin, döner buharlaştırıcı kullanılarak çözücüsünün uzaklaştırılma işlemi için, çeşitli sıcaklıklar denenmiştir. Yapılan deneylere göre 60 o C den daha yüksek sıcaklıklarda resveratrolün yapısı bozunarak farklı bir maddeye dönüşmektedir. Ayrıca Ek 5 de yer alan görüldüğü gibi, çözücünün uzaklaşma süresi azalmakta ve zamandan tasarruf sağlanabilmektedir. Bu sebeple çözücü uzaklaştırma işlemi için 60 o C de döner buharlaştrıcı kullanılmasının uygun olduğuna karar verilmiştir. Resveratrolün HPLC ile analizi için bölüm 3 de verilen kaynak araştırması yapılmış olup, diğer yöntemlere göre etkili ve kısa bir gradient program uygulanması sebebiyle, tez çalışması süresince Jeandet et al. (1977) nın çalışması temel alınmıştır. Bununla birlikte örnek miktarı olarak 10 yerine 5 µl olarak değiştirilmiştir. Bu değer piklerin 64

76 daha keskin olmasını sağlayarak sonuçların hassasiyetini artırmaktadır. Tez çalışması kapsamında kullanılan yöntem Çizelge 4.2 de ve analiz programı Çizelge 4.3 de verilmiştir. Çizelge 4.2 Tez kapsamında trans-resveratrol ün HPLC analizi için uygulanacak yöntem Cihaz Taşıyıcı Faz Agilent 1100 Series A: Asetonitril B :Su Örnek miktarı 5 µl Akış Hızı Kolon 1 ml/ dakika C18 ( 5 µm, 250 x 4.6 mm I.D.) Program 10% A ve 90% B 15% B ve 85% A için 18 dakika λ (dalga boyu) λ 330 nm 85% A ve 15%B için 5 dakika 10%A ve 90% B için 7 dakika Minimum Basınç Maksimum basınç Kalma süresi 0 bar 200 bar 12.6 dakika Çizelge 4.3 Tez kapsamında kullanılan HPLC analiz programı No Süre (dk) % A (Ultra saf su) % B (Asetonitril) % C % D Akış hızı(ml/dakika) Basınç (bar)

77 5. BULGULAR VE TARTIŞMA Taze ve dondurulmuş Kalecik Karası üzümündeki ( Vitis vinifera L.) resveratrolün üretim veriminin artırılmasına ses ötesi dalgaların etkisinin araştırıldığı bu çalışmada incelenen parametreler aşağıda yer almaktadır. 1.Tepkime süresinin etkisi (24 saat,48 saat ve 72 saat) 2. SÖD uygulama tipinin etkisi (periyotlu ve sürekli) 3.Üzüm durumu etkisi (taze ve dondurulmuş) 4.Frekans etkisi (20 ve 30 khz) 5. SÖD uygulama süresi etkisi (10 dakika ve 1 saat) Ayrıca yukarıda incelenen parametrelerin yanı sıra en iyi uygulama koşullarında çubuk çapının etkisi ( 13 mm ve 19 mm) araştırılmış ve deneylerin tekrar edilebilirliği de incelenmiştir. Resveratrolün üretim verimini arttırma çalışmaları ceketli cam tepkime kabında gerçekleştirilmiş ve ortam sıcaklığı, soğutma akışkanı olarak etilen glikol-su karışımının kullanıldığı bir soğutmalı sirkülatör yardımıyla sabit tutulmaya çalışılmıştır. Deney süresince ortam sıcaklığı sürekli izlenmiştir. Sürekli uygulamada ses ötesi dalgaların ortama sürekli verilmesi sonucunda 18 o C de başlayan tepkime sıcaklığı ilk 10 dakika süresince hızlı bir artış göstermiştir. Bununla birlikte yüksek sıcaklıkların resveratrolün yapısına olumsuz etki göstermesi sebebiyle tepkime süresince sıcaklık 40 ± 5 o C de tutulmuştur. Sisteme ses ötesi dalgaların periyotlu uygulanması esnasında ise ortama verilen enerjinin sürekliye göre daha az olması nedeniyle sistemde etkin sıcaklık artışı gözlenmemiştir. Periyotlu uygulamada 18 o C de başlayan tepkime sıcaklığı deney süresince 18 ± 2 C de tutulmuştur. 66

78 5.1 Tepkime Süresinin Etkisi Kalecik Karası üzüm kabuğunda resveratrol üretimine tepkime süresinin etkisi incelenmiştir. Bu amaçla Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü serasından hasat edilen Kalecik Karası klon 15 üzümünün kabukları kullanılmıştır. 20 ve 30 khz olmak üzere iki farklı frekansta, sürekli ve periyotlu koşullarda, 10 dakika ve 1 saat süresince ses ötesi dalga uygulanan örnekler deney sonrasında 72 saat süresince oda koşullarında bekletilmiştir. Bu aşamada, trans-resveratrolün ışıktan etkilenerek cis formuna dönüşmesini engellemek için örnekler karanlıkta bekletilmiştir. Reaktörden her 24 saat sonunda 5 ml örnek alınarak 1. ekstraksiyon yöntemine (Keller et al. 2000) göre ekstraksiyon yapılmıştır. Örneklerin HPLC analizi Çizelge de yer alan analiz yöntemi kullanarak gerçekleştirilmiştir. Kalecik Karası üzüm kabuğunda resveratrol üretimine tepkime süresinin etkisine ait sonuçları detaylı inceleyebilmek amacıyla, taze ve dondurulmuş üzümler için 20 ve 30 khz frekansa ait sonuçlar temel alınarak 4 farklı açıdan değerlendirme yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar sırasıyla bölüm 5.1.1, 5.1.2, ve de verilmiştir Taze Kalecik karası üzümüne 20 khz frekansta SÖD uygulamanın etkisi Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü serasından hasat edilen taze Kalecik karası üzümlerine, 20 khz frekans kullanılarak, sürekli (S) ve periyotlu (P01: 0.1 s açık 0.9 s kapalı ve P05: 0.5 s açık 0.5 s kapalı) olmak üzere 10 dakika ve 1 saat süresince SÖD uygulanmıştır. SÖD uygulamasından sonra her 24 saatte bir alınan örneklerin resveratrol derişimleri Şekil 5.1 ve 5.2 de yer almaktadır. 67

79 Şekil 5.1 Taze Kalecik karası için 20 khz frekansta 10 dakika süresince periyotlu (P01 ve P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi Şekil 5.2 Taze Kalecik karası için 20 khz frekansta 1 saat süresince periyotlu (P01 ve P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi Şekil 5.1 ve 5.2 den de görüldüğü gibi; taze Kalecik karası üzümü için 20 khz frekansta SÖD uygulaması sonucunda uygulama tipinden (periyotlu ve sürekli) bağımsız olarak resveratrol derişim, ilk 24 saatte SÖD uygulanmamış örneklere göre artış göstermiş olup, sonraki 48 ve 72 saatlik tepkime sürelerinde azalmaya başlamıştır. Bu değerlerin ışığında, taze Kalecik karası için 20 khz frekansta SÖD uygulaması sonucunda en 68

80 uygun (en yüksek resveratrol derişiminin elde edildiği) tepkime süresi 24 saat olarak belirlenmiştir Taze Kalecik karası üzümüne 30 khz frekansta SÖD uygulamanın etkisi Taze Kalecik karası üzümü için 30 khz frekans kullanılarak, sürekli (S) ve periyotlu (P05: 0.5 s açık 0.5 s kapalı) olmak üzere 10 dakika ve 1 saat süresince SÖD uygulanmıştır. SÖD uygulamasından sonra her 24 saatte bir alınan örneklerin HPLC analiz sonuçları Şekil de yer almaktadır. Şekil 5.3 Taze Kalecik karası için 30 khz frekansta 10 dakika süresince periyotlu (P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi 69

81 Şekil 5.4 Taze Kalecik karası için 30 khz frekansta 1 saat süresince periyotlu (P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi Şekil 5.3 ve 5.4 den de görüldüğü üzere; taze Kalecik karası üzümü için 30 khz frekansta SÖD uygulaması sonucunda, 20 khz frekans değerindeki uygulamada görüldüğü gibi, tipinden (periyotlu ve sürekli) bağımsız olarak resveratrol derişim, ilk 24 saatte SÖD uygulanmamış örneklere göre artışmış, sonraki 48 ve 72 saat sürelerinde azalmıştır. Bu bulguların ışığında, taze Kalecik karası için 20 khz frekansta olduğu gibi, 30 khz frekansta SÖD uygulaması sonucunda da en uygun (en yüksek resveratrol derişiminin elde edildiği) tepkime süresi 24 saat olarak belirlenmiştir Dondurulmuş Kalecik karası üzümüne 20 khz frekansta SÖD uygulamanın etkisi Dondurulmuş üzüm için en uygun tepkime süresini belirlemek amacıyla ham madde olarak kullanılan ve Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü serasından hasat edilen Kalecik karası klon 15 üzümünün kabukları deneyden önce -20 o C de bekletilmiştir. Deneyler mekanik homojenizer ile parçalanmış olan dondurulmuş Kalecik karası üzüm çeşidinin kabuklarının bulunduğu 100 ml hacimli ceketli cam reaktörde gerçekleştirilmiştir. Ses ötesi dalgalar 20 khz sabit frekans değerine sahip ultrasonik homojenizer ile sisteme sürekli ve belirli periyotlarda ( P01 ve P05) ve farklı 70

82 sürelerde (10 dakika ve 1 saat) verilmiştir. SÖD uygulamasından sonra her 24 saatte bir alınan örneklerin trans-resveratrol derişimleri Şekil 5.5 ve 5.6 da verilmiştir. Şekil 5.5 Dondurulmuş Kalecik karası için 20 khz frekansta 10 dakika süresince periyotlu (P01 ve P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi Şekil 5.6 Dondurulmuş Kalecik karası için 20 khz frekansta 1 saat süresince periyotlu (P01 ve P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine (24,48,72 h) etkisi 71

83 Şekil 5.5 ve 5.6 dan da görüldüğü üzere; dondurulmuş Kalecik karası üzümü için 20 khz frekansta SÖD uygulaması sonucunda uygulama tipinden (periyotlu ve sürekli) bağımsız olarak resveratrol derişim, ilk 24 saat SÖD uygulanmamış örneklere göre biraz artmış ve en yüksek değerine 48 saat sonunda ulaşmıştır. Bunu takip eden sürede ise, azalma göstermiştir. Bu sonuçlara göre, dondurulmuş Kalecik karası için 20 khz frekansta SÖD uygulaması sonucunda en uygun (en yüksek resveratrol derişiminin elde edildiği) tepkime süresi 48 saat olarak belirlenmiştir Dondurulmuş Kalecik karası üzümüne 30 khz frekansta SÖD uygulamanın etkisi Dondurulmuş Kalecik karası üzümü için 30 khz frekans kullanılarak, sürekli (S) ve periyotlu (P05: 0.5 s açık 0.5 s kapalı) olmak üzere 10 dakika ve 1 saat süresince SÖD uygulanmıştır. SÖD uygulamasından sonra her 24 saatte bir alınan örneklerin trans resveratrol derişimleri Şekil 5.7 ve 5.8 de görülmektedir. Şekil 5.7 Dondurulmuş Kalecik karası için 30 khz frekansta 10 dakika süresince periyotlu (P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine etkisi 72

84 Şekil 5.8 Dondurulmuş Kalecik karası için 30 khz frekansta 1 saat süresince periyotlu (P05) ve sürekli SÖD uygulamasının tepkime süresine etkisi Şekil 5.7 ve 5.8 den de görüldüğü gibi; dondurulmuş Kalecik karası üzümü için 30 khz frekansta SÖD uygulaması sonucunda, 20 khz frekanstaki uygulamaya benzer şekilde, uygulama tipinden (periyotlu ve sürekli) bağımsız olarak resveratrol derişimi, ilk 24 saat SÖD uygulanmamış örneklere göre biraz artarak en yüksek değerine 48 saat sonunda ulaşmıştır ve 72 saatte azalmıştır. Bu sonuçlara göre, dondurulmuş Kalecik karası için 30 khz frekansta SÖD uygulaması sonucunda en uygun (en yüksek res derişiminin elde edildiği) tepkime süresi 48 saat olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak; en uygun tepkime süresi taze Kalecik karası üzümü için 24 saat olarak belirlenirken, dondurulmuş Kalecik karası üzümü için bu süre 48 saat olarak gözlenmiştir. Bu bulgular literatürle uyumludur. Şöyleki; Adrian et al. (1996) ın V. vinifera ve V. rupestris türlerinin trans-resveratrol üretimi için abiyotik uyarıcı olarak AlCI 3 ü kullanarak (25 saat süresince) tepkime süresini inceledikleri çalışmada, taze üzümlerde ilk 24 saatte trans-resveratrol derişiminin arttığını kaydetmişlerdir. Keller et al. (2000) un yaptıkları çalışmada ise, 10 dk. UV verildikten sonra 80 o C de saklanan kallus örneklerinde trans-resveratrol derişimi, Adrian et al. (1996) ın çalışmasında olduğu gibi, ilk 24 saatte artış göstermiş ve bu artış 64 saate kadar devam etmiştir. 64 saatten sonra ise, UV ışın dokulara zarar verici etki gösterdiği için trans-resveratrol 73

85 derişiminde azalma görüldüğü belirtilmiştir. Bunun yanı sıra, Keskin nin 2007 yılında yaptığı çalışmasında, Kalecik karası kalluslarında en etkili tepkime süresinin 48 saat olarak belirtilmiş ve bu süreden sonra trans-resveratrol derişiminde azalma kaydedilmiştir. Bunun yanı sıra, dondurulma işlemine maruz kalan Kalecik karası hücreleri için en etkili tepkime süresi 24 saatten 48 saate doğru kayma gösterdiği düşünülebilir. 5.2 Ses Ötesi Dalga Uygulama Tipinin Etkisi Resveratrol üretim veriminin arttırılmasına ses ötesi dalgaların uygulama tipinin etkisi araştırılmıştır. Uygulama tipi, sürekli (S) ve periyotlu (P) olmak üzere iki şekilde gerçekleştirilmiştir. Sürekli uygulama, ses ötesi dalgaların 10 dakika ve 1 saat boyunca aralıksız olarak sisteme uygulanmasıyla sağlanmıştır. Periyotlu uygulamalar da ise, 20 khz ve 30 khz sabit frekansa sahip iki farklı ultrasonik homojenizer kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 20 khz frekansa sahip homojenizer ile ses ötesi dalgalar sisteme 10 dakika ve 1 saat boyunca 0.1 s açık 0.9 s kapalı (P01) ve 0.5 s s açık 0.5 s kapalı (P05) olmak üzere iki farklı periyot halinde verilmiştir. 30 khz frekansa sahip homojenizerin kullanıldığı deneylerde ise ses ötesi dalgalar sisteme aynı süreler boyunca 0.5 s s açık 0.5 s kapalı (P05) periyodunda verilmiştir. Elde edilen sonuçların daha iyi anlaşılabilmesi için Çizelgeler taze ve dondurulmuş üzüm referans alınarak hazırlanmıştır. Bulgular bölüm 5.2.1, ve de sunulmuştur Taze Kalecik karası üzümüne SÖD uygulama tipinin etkisi Resveratrol üretim veriminin arttırılmasına SÖD uygulama tipinin etkisini araştırmak amacı ile taze Kalecik karası üzümlerine 20 ve 30 khz frekanstaki SÖD sürekli ve periyotlu (P01 ve P05) olmak üzere 10 dakika ve 1 saat süresince uygulanmıştır. Ancak, SÖD ların 30 khz frekansta periyotlu olarak verildiği uygulamalarda ise, cihazda 0.1 s açık 0.9 s kapalı (P01) koşulunun bulunmaması sebebiyle sadece 0.5 s açık 0.5 s kapalı (P05) koşulunun etkisi araştırılmıştır. Bölüm 5.1 de taze üzüm için en uygun tepkime süresi 24 saat olarak belirlendiği için Çizelge 5.1 de 24. saat sonunda elde edilen resveratrol derişimleri verilmiştir. 74

86 Çizelge 5.1 Taze Kalecik karası üzümünde SÖD uygulama tipinin etkisi, tepkime süresi: 24 h Resveratrol Derişimi (mg/g kabuk) Frekans 10 dk 1 h SÖD uygulanmamış P01 P05 S P01 P05 S khz khz Taze Kalecik karası üzümlerine ses ötesi dalga uygulamadan önce, kabuklardaki resveratrol derişimi 0.18 mg/gkabuk olmasına karşın, SÖD uygulanması ile bu değerlerde artış olduğu görülmüştür. Sisteme 10 dakika boyunca hem 20 khz hem de 30 khz frekansılarda periyotlu SÖD uygulanması sonucunda ulaşılan resveratrol derişiminin sürekli uygulama sonuçlarına göre daha yüksek olduğu görülmüştür. Periyotlu uygulamalar içerisinde de, P01 (0.1 s açık 0.9 s kapalı) uygulamanın P05 (0.5 s açık 0.5 s kapalı) uygulamaya göre daha etkili olmuştur. Aynı koşullarda 1 saat süresince SÖD uygulanması sonucunda, periyotlu (P01 ve P05) uygulamanın sürekli uygulamaya göre daha yüksek derişimde resveratrol üretimini sağladığı bulunmuştur Dondurulmuş Kalecik karası üzümüne SÖD uygulama tipinin etkisi Dondurulmuş Kalecik karası üzümlerine SÖD uygulama tipinin etkisini araştırmak amacı ile sisteme ses ötesi dalgalar 20 ve 30 khz frekansta sürekli ve periyotlu (P01 ve P05) olmak üzere 10 dakika ve 1 saat süresince uygulanmıştır. Bunun yanı sıra, SÖD ların 30 khz frekansta periyotlu olarak verildiği uygulamalarda, bölüm de belirtildiği gibi cihazın kısıtlayıcı etkisi sebebiyle sadece 0.5 s açık 0.5 s kapalı (P05) koşulunun etkisi araştırılmıştır. Bölüm 5.1 de dondurulmuş üzüm için en uygun tepkime süresi 48 saat olarak belirlendiği için, sadece 48. saat sonunda örneklerdeki resveratrol derişimleri dikkate alınmış ve Çizelge 5.2 de verilmiştir. 75

87 Çizelge 5.2 Dondurulmuş Kalecik karası üzümünde SÖD uygulama tipinin etkisi, (Tepkime süresi: 48 h) Resveratrol Derişimi (mg/g kabuk) Frekans 10 dk 1 h SÖD uygulanmamış P01 P05 S P01 P05 S khz khz Çizelge 5.2 de görüldüğü üzere, dondurulmuş Kalecik karası üzümlerine SÖD uygulamadan önce kabuklardaki resveratrol derişimi 0.17 mg/gkabuk olmasına karşın SÖD uygulanması sonuncunda bu değerlerin artığı gözlenmiştir. Bu bulgular ışığında, hem taze hem de dondurulmuş üzümlerde trans-resveratrol derişimini artırmak amacıyla abiyotik uyarıcı olarak ses ötesi dalgaların kullanılabileceği net olarak söylenebilir. Bununla birlikte taze üzümlerde olduğu gibi, sisteme 10 dakika ve 1 saat boyunca her iki frekanstada yapılan periyotlu (P01 ve P05) uygulamanın sürekli uygulamadan daha etkili olduğu görülmektedir. Ayrıca, periyotlu uygulamalar içerisinde P01 uygulamasının P05 uygulamaya göre daha etkilidir Taze Kalecik karası üzümüne 20 khz frekansta farklı çaptaki uçlar kullanılarak SÖD uygulama tipinin etkisi Taze Kalecik karası üzümüne 20 khz frekans değerinde farklı çaptaki uçlar kullanılarak SÖD uygulama tipinin etkisini incelemek amacı ile, ses ötesi dalgalar sisteme 0.1 s açık 0.9 s kapalı (P01) ve 0.5 s s açık 0.5 s kapalı (P05) olmak üzere iki farklı periyotta 10 dakika ve 1 saat süresince uygulanmıştır. Bölüm 5.1 de taze üzüm için en uygun tepkime süresi 24 saat olarak belirlendiği için, Çizelge 5.3 de 24. saat tepkime süresi sonunda elde edilen resveratrol derişimleri görülmektedir. 76

88 Çizelge 5.3. Taze Kalecik karası üzümüne 20 khz frekans değerinde farklı çaptaki uçlar kullanılarak SÖD uygulama tipinin etkisi Resveratrol Derişimi (mg/g kabuk) Tepkime süresi (h) SÖD uygulanmamış 20 khz-13 mm çapındaki uç 20 khz-19 mm çapındaki uç 10 dk 1 h P01 P05 P01 P Çizelge 5.3 de görüldüğü gibi, taze Kalecik karası üzümlerine 20 khz frekansta ses ötesi dalga uygulamadan önce kabuklardaki resveratrol derişimi 0.18 mg/gkabuk değerinde olmasına karşın, ses ötesi dalga uygulanması (P01, 1 h) sonucunda bu değerler 13 mm çapındaki uç kullanıldığında yaklaşık 20 kat ve 19 mm çapındaki uç kullanıldığında ise yaklaşık 21 kat artmıştır. Buna göre, ultrasonik homojenizerin çubuk uç çapının değişmesi ile trans-resveratrol üretiminde etkili olduğu görülmüştür. Ancak, 20 khz sabit frekansta P01 periyotlu uygulama sonucunda elde edilen resveratrol derişimleri, hem 13 mm uç hemde 19 mm uç için süreden (10 dk ve 1 h) bağımsız olarak, P05 uygulamaya göre daha yüksek değere ulaşmıştır. Başka bir deyişle, Çizelge 5.1 ve 5.2 deki sonuçlarda da olduğu gibi P01 uygulamasının P05 uygulamasına göre daha etkili olduğu görülmektedir. Sonuç olarak; taze ve dondurulmuş Kalecik karası üzümlerine SÖD uygulama tipinin etkisi incelendiğinde, süreden (10 dk ve 1 h),frekans türünden (20 ve 30 khz) ve uç çapından (13 mm ve 19 mm) bağımsız olarak periyotlu (P01 ve P05) uygulamanın sürekli (S) uygulamaya göre daha yüksek derişimde trans-resveratrol ürettiği görülmüştür. Ayrıca periyotlu uygulamalar içerisinde de P01 uygulama P05 uygulamaya göre daha etkili olmuştur. 77

89 Liu et al., (2006) aleo arborescent kallusları içerisinde bulunan Ca 2+ -ATPase aktivitesine, 20 khz frekansta sürekli ve periyotlu SÖD uygulamasının etkisi inceledikleri çalışmada enzim aktivitesinin sisteme verilen enerjiye bağlı olarak değiştiğini bulmuşlardır. Yaptıkları deneyler sonucunda aktivite; 2W güçte 10s SÖD uygulaması sonunda, sürekli dalga ile %17, periyotlu uygulama ile %26 aktivite artışı ölçülmüştür. Sisteme verilen enerjinin artırılması ile (10W güçte) sürekli SÖD uygulamasında ise %25 oranında aktivite azalması meydana geldiği görülmüştür. Takatsuki et al yılında yaptıkları çalışmada ise, 20 khz frekansta SÖD ların gelişmiş aleo arborescent kallus hücrelerinde bulunan H + -ATPase enziminin aktivitesine etkisini incelemişlerdir. Bulgulara göre, enzim aktivitesinde en fazla artış 2W lık uygulama için 2 s. sonunda olmuştur. 3W lık gücünde uygulamada kontrol durumu ile bir fark görülmemiştir. Ayrıca, 5W ve 10W güçteki ultrasound uygulamalarında, tüm sürelerde olumsuz etki ortaya çıkmıştır. Buradan da görüldüğü gibi, sisteme verilen enerji arttıkça enzim aktivitesi azalmakta ve buna bağlı olarak ürün derişimi azalmaktadır. Bununla birlikte, Takatsuki et al. (2003) un çalışmalarından da görüldüğü gibi, enzim aktivitesinin değişmesi sisteme verilen enerjinin yanı sıra SÖD uygulama süresine de bağlıdır. Literatürde abiyotik uyarıcı olarak AlCl 3 ün kullanıldığı diğer bir çalışmada da, V. rupestris türünün 7-90 mm derişim aralığında AlCl 3 ile muamelesi sonucunda transresvertrol sentezinin farklı miktarlarda olduğu ve uyarıcının derişiminin artmasıyla olumsuz etkinin arttığı 90 mm derişiminde ise V. rupestris türü için AlCl 3 ün zehir etkisi yaparak resveratrol derişimini azalttığı belirtilmiştir (Adrian et al. 1996). Benzer şekilde, ses ötesi dalgalar vasıtasıyla sisteme verilen enerjinin de, belli bir değerden sonra, ya bitkinin hücre yapısında deformasyona yada içerdiği enzimlerin aktivitesinde düşüşe neden olduğu düşünülebilir. Bu görüş doğrultusunda, 20 khz frekanstaki ses ötesi dalgaların en düşük seviyede periyotlu (P01; 0.1 s açık 0.9 s kapalı) verilmesinin resveratrol üretiminde olumlu etkisi olduğu söylenebilir (bkz. Çizelge 5.3). 78

90 5.3 Üzüm Durumunun Etkisi 20 ve 30 khz sabit frekansta 10 dakika ve 1 saat süresince periyotlu ve sürekli SÖD uygulanan üzümün taze ve dondurulmuş olmasının resveratrol üretimi üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Yüksek lisans tez çalışmasında, Ankara Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümü serasından hasat edilen Kalecik karası klon 15 üzümünün kabukları kullanılmıştır. Çalışma kapsamında hasat edildiği gün SÖD uygulanan üzümler taze üzüm olarak, deneyden önce -20 o C de bekletilen üzümler ise dondurulmuş üzüm olarak adlandırılmıştır. Deneyler, mekanik homojenizer ile parçalanmış olan dondurulmuş Kalecik Karası üzüm çeşidinin kabuklarının bulunduğu 100 ml hacimli ceketli cam reaktörde gerçekleştirilmiştir. Ses ötesi dalgalar 20 ve 30 khz sabit frekans değerine sahip ultrasonik homojenizer ile sisteme sürekli ve belirli periyotlar da (P01 ve P05) ve sürelerde (10 dakika ve 1 saat) verilmiştir. Bölüm 5.2 de de belirtildiği gibi, ses ötesi dalgaların sisteme periyotlu uygulanması (P01 ve P05) sürekli uygulamadan daha etkili olmuştur. Bu sebeple Şekil Şekil 5.10 da yer alan sonuçlar sadece periyotlu uygulamayı içermektedir. Şekil khz frekansta SÖD uygulamasının taze ve dondurulmuş üzümün resveratrol üretimine etkisi 79

91 Şekil 5.9 da görüldüğü üzere 20 khz sabit frekansta SÖD uygulandığında süreden (10 dakika ve 1 saat) ve uygulama tipinden (P01 ve P05) bağımsız olarak taze üzümler dondurulmuş üzümlere kıyasla daha yüksek derişimde resveratrol üretmiştir. Şekil khz frekansta SÖD uygulamasının taze ve dondurulmuş üzümün resveratrol üretimine etkisi Benzer sonuçlar 30 khz sabit frekansta SÖD uygulanması sonucunda da elde edilmiş olup taze üzümler süreden (10 dakika ve 1 saat) ve uygulama tipinden (P01 ve P05) bağımsız olarak dondurulmuş üzümlere kıyasla daha yüksek derişimde resveratrol üretmiştir (Bkz. Şekil 5.10). Sonuç olarak; SÖD uygulanmadan önce resveratrol derişimleri çok yakın olmasına rağmen, 20 ve 30 khz sabit frekansta 10 dakika ve 1 saat süresince P01 (0.1 s açık 0.9 s kapalı) ve P05 (0.5 s açık ve 0.5 s kapalı) koşulundaki periyotlu uygulama sonucunda taze üzümlerin dondurulmuş üzümlere göre daha yüksek derişimde resveratrol ürettiği belirlenmiştir. Resveratrolün üretim tepkimesine ait yol izi dikkate alındığında derişimlerdeki farklılığın sebebi şöyle açıklanabilir: Becker et al yılında yaptıkları çalışmada fenilalaninden trans-resveratrol biyosentezi incelemiş olup üretime ait tepkime yol izi bölüm 3.1 de detaylı olarak verilmiştir. Şekil 3.11 de görüldüğü üzere resveratrolün üretim tepkimesinde CoA-ligase ve resveratrol-synthase enzimleri başta olmak üzere 4 farklı enzim etki etmektedir. Bilindiği üzere enzim aktiviteleri zaman 80

92 içerisinde azalma göstermektedir. Bu sebeple, literatürde dondurma işleminin abiyotik bir uyarıcı olarak belirtilmesine karşın 1 yıl süresince C de bekletilen dondurulmuş üzümlerin enzim aktiviteleride uzun süre geçmesi sebebiyle azalma olmuş ve enzimler taze üzümlerinki kadar etkili olamamıştır. Dolayısı ile taze üzümler dondurulmuş üzümlere kıyasla daha yüksek derişimde trans-resveratrol üretmiştir. 5.4 Frekans Türünün Etkisi Çalışma kapsamında Kalecik Karası üzüm kabuğunda resveratrol üretimine frekans türünün etkisi incelenmiştir. Bu amaçla 20 ve 30 khz olmak üzere iki farklı frekans kullanılmıştır. Deneyler sürekli (S) ve periyotlu (P05) koşullarda 10 dakika ve 1 saat süresince gerçekleştirilmiş olup ses ötesi dalga uygulanan örnekler deney sonrasında 72 saat tepkime süresince karanlıkta ve oda koşullarında bekletilmiştir. Reaktörden her 24 saat sonunda 5 ml örnek alınarak yöntem 1 e göre ekstraksiyon yapılmış olup, Çizelge 4.2 ve Çizelge 4.3 de yer alan analiz yöntemi kullanarak HPLC analizi gerçekleştirilmiştir. Taze üzüme frekans etkisini gösteren sonuçlar Çizelge 5.4 de, dondurulmuş üzüme ses ötesi dalga frekansının etkisini gösteren sonuçlar Çizelge 5.5 de sunulmuştur. Çizelge 5.4 Taze Kalecik karası üzümüne ses ötesi dalga frekansının etkisi(tepkime süresi: 24 h) Resveratrol Derişimi (mg/g kabuk) Frekans P05 10 dk 1 saat 10 dk 1 saat S SÖD uygulanmamış khz khz , Taze üzüme SÖD uygulanmasından önce 0.18 mg/gkabuk olan resveratrol derişimi 20 ve 30 khz frekansta ses ötesi dalga uygulanması sonucunda en yüksek değere (2.92 mg 81

93 /gkabuk) 30 khz frekansında 1 saat süresince P05 periyotlu SÖD uygulanması ile ulaşmıştır. Bunun yanı sıra Çizelge 5.4 ve 5.5 de görüldüğü üzere 30 khz frekansta SÖD uygulanması 20 khz frekansından daha etkilidir. Çizelge 5.5 Dondurulmuş Kalecik karası üzümüne ses ötesi dalga frekansının etkisi (Tepkime Süresi: 48 h) Resveratrol Derişimi (mg/g kabuk) Frekans P05 10 dk 1 saat 10 dk 1 saat S SÖD uygulanmamış khz khz dondurulmuş üzüme 20 ve 30 khz frekansta periyotlu ve sürekli olarak ses ötesi dalga uygulanması sonucunda da, taze üzümlerinkine benzer şekilde süreden bağımsız olarak 30 khz frekansın 20 khz frekansa göre daha yüksek derişimde resveratrol üretimi sağladığı görülmüştür. Sonuç olarak; hem taze üzümler hem de dondurulmuş üzümler için 30 khz frekansında SÖD uygulaması, süreden (10 dakika ve 1 saat) ve uygulama türünden (sürekli ve periyotlu) bağımsız olarak 20 khz frekansından daha etkili olmuştur. 30 khz frekans uygulama sonucunda 20 khz frekansa kıyasla sisteme daha fazla enerji verilmesi sebebiyle daha etkili olduğu düşünülmektedir. 82

94 5.5 Ses Ötesi Dalgaların Uygulanma Süresinin Etkisi Resveratrol üretim veriminin artırılmasına ses ötesi dalgaların uygulanma süresinin etkisini araştırmak amacı ile Kalecik karası üzümlerine 20 ve 30 khz frekanstaki ses ötesi dalgalar sürekli (S) ve periyotlu (P01 ve P05) olmak üzere 10 dakika ve 1 saat süresince uygulanmıştır. Bölüm 5.3 de taze üzümlerin daha yüksek derişimde resveratrol üretebildiğinin belirlenmesi sebebiyle Şekil 5.11 ve 5.12 de sadece taze üzümlere ait sonuçlara yer verilmiştir. Şekil 5.11 Taze üzümde 20 khz frekansında SÖD uygulama süresinin etkisi Şekil 5.11 de görüldüğü üzere 20 khz frekansında ses ötesi dalgaların taze üzümlere 10 dakika ve 1 saat süresince P01 ve P05 periyotlu ve sürekli koşullarda uygulanması resveratrol üretimine olumlu etki göstermektedir. P01 uygulama türünde 1 saatte 10 dakikaya kıyasla daha yüksek derişimde resveratrol üretilmiştir. P05 ve sürekli uygulama türü dikkate alındığında ise 10 dakika SÖD uygulamasının resveratrol üretimine 1 saate göre daha etkili olduğu görülmektedir. 83

95 Şekil 5.12 Taze üzümde 30 khz frekansında SÖD uygulama süresinin etkisi Şekil 5.12 de görüldüğü üzere 30 khz frekansında SÖD uygulaması sonucunda da 20 khz frekans uygulamasına benzer şekilde 10 dakika sürekli uygulama sonucunda 1 saate göre daha yüksek derişimde resveratrol üretilmiştir. Sonuç olarak, ses ötesi dalgaların abiyotik uyarıcı olması sebebiyle üzümlerin uyarılarak yapılarında eser miktarda olan resveratrol derişiminin artması beklenmektedir. Buna bağlı olarak, resveratrol derişimine SÖD uygulanmadan önce 0.18 mg/gkabuk olan değer SÖD uygulama türüne ve sisteme verilen enerjiye bağlı olarak artış göstermiştir. Üzümlerin resveratrol üretebilmesi için gerekli enerjinin sisteme verilmesi ve yeterli süre bu etkinin devam etmesi gerekmektedir. Bulgular literatürle uyumludur. Takatsuki et al yılında yaptıkları çalışmada 2, 5, 10, 30 ve 60 s. sürelerde 28 khz lik bir ultrasonik banyo kullanarak SÖD uygulamanın gelişmiş aleo arborescent kallus hücrelerine etkisini incelemişlerdir. Çalışma sonucunda, yaş ağırlık, 2. gün sonunda 2, 5 ve 10 s. lik uygulamalarda artmış, 2. günden sonra, özellikle 2 ve 5 s uygulamalarda daha hızlı bir artış olmuştur. Uzun süreli SÖD uygulamalarında (30s, 60s) yaş ağırlıkta belirgin bir azalma olmuştur (Bkz. Şekil 3.5). 84

96 Buna bağlı olarak, her iki frekansta sürekli uygulamalarda da sisteme periyotluya göre daha fazla enerji verilmesi sebebiyle, 10 dakika SÖD uygulama daha etkili olmuştur. Ayrıca, 20 khz frekansta, P01 ve P05 uygulamalarının her ikisinde de resveratrol derişimi SÖD uygulanmamış değerlere göre artış göstermesine karşın 0.1 s açık 0.9 s kapalı periyotlu uygulama sonucunda, sisteme ultrasonik homojenizerin sağlayabileceği minimum değerde enerji verildiği için P01 uygulamasında 1 saat daha etkili olurken, P05 uygulaması için 10 dakika yeterli olmuştur. 30 khz frekansta P05 uygulaması ile sisteme sürekli uygulamaya göre daha az enerji verildiği için 1 saat SÖD uygulaması biraz daha yüksek derişimde( 2,92 mg/g kabuk) resveratrol üretimini sağlamakla birlikte 10 dakika değerine (2,73 mg/g kabuk) yakındır. Başka bir deyişle, 50 dakika fazla SÖD uygulamak için harcanan süre ve enerjide dikkate alınırsa 30 khz frekans için hem sürekli hem periyotlu SÖD uygulamalarda 10 dakika yeterlidir. 85

97 6. SONUÇ Bu çalışmada, taze ve dondurulmuş Kalecik Karası üzümündeki (Vitis vinifera L.) resveratrolün üretim veriminin artırılmasına ses ötesi dalgaların etkisinin araştırılmıştır. Tez kapsamında, tepkime süresi (24 saat,48 saat ve 72 saat), SÖD uygulama tipi (periyotlu ve sürekli), üzüm durumu (taze ve dondurulmuş), frekans (20 ve 30 khz), SÖD uygulama süresi (10 dakika ve 1 saat) ve çubuk çapının (13 mm ve 19 mm) üretim verimine etkileri incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar aşağıdaki gibi özetlenebilir. Taze ve dondurulmuş üzüm kabuklarına SÖD uygulamadan önce ve sonra alınan örnekler, Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografi yöntemiyle analizlenmiştir. Deneysel bulgulara göre, en yüksek resveratrol derişimi, taze üzümler için 24 saat, dondurulmuş üzümler için 48 saat tepkime süresi sonunda elde edilmiştir. Ayrıca, literatürde belirttiği gibi bitki hücreleri belirli bir süreden sonra yaşlanmaya başlayarak taze durumdaki kadar etkili olamamaktadır (Keskin, 2007). Bu sebeple, dondurulma işlemine maruz kalan Kalecik karası hücreleri için en etkili tepkime süresi 24 saatten 48 saate doğru kaymıştır. Periyotlu uygulamanın sürekli uygulamaya göre daha etkili olduğu görülmüştür. Aynı koşullar altında, 30 khz frekansta SÖD uygulamasıyla, 20 khz frekanstaki uygulamaya göre daha yüksek resveratrol derişimine ulaşıldığı görülmüştür. 20 khz frekansta 1 saat süresince periyotlu ( 0.1 s açık-0.9 s kapalı) SÖD uygulamasıyla, en yüksek resveratrol derişimi, taze üzümler için 24 saatlik tepkime süresi sonunda 20 kat artışla 3.63 mg/g kabuk, dondurulmuş üzümler için ise, 48 saatlik tepkime süresi sonunda 8 kat artışla 1.33 mg/g kabuk olarak bulunmuştur. Şekil 2 de yer aldığı gibi, 30 khz frekansta taze üzümlere SÖD uygulandığında ise, 1 saat süresince periyotlu ( 0.5 s açık- 0.5 s kapalı) uygulama ile 24 saatlik tepkime süresi sonunda, en yüksek resveratrol derişimi 2.92 mg/g kabuk (16 kat artış) olarak elde edilmiştir. Bu bulgular literatürle paralellik göstermektedir şöyleki; ses ötesi dalgalar vasıtasıyla sisteme verilen enerjinin belli bir değerden sonra, ya bitkinin hücre yapısında deformasyona ya da içerdiği enzimlerin aktivitesinde düşüşe neden olduğu görülmüştür. Bu görüş doğrultusunda, 20 khz 86

98 frekanstaki ses ötesi dalgaların en düşük seviyede periyotlu (P01; 0.1 s açık 0.9 s kapalı) verilmesinin resveratrol üretiminde olumlu etkisi olduğu söylenebilir. Şekil 6.1 Benzer koşullarda trans-resveratrol değerlerinin karşılaştırması Aynı frekansta, dondurulmuş üzümlere 10 dakika boyunca periyotlu (0.5 s açık-0.5 s kapalı) SÖD uygulandığında, en yüksek resveratrol derişimine (2.53 mg/g kabuk) 15 kat artışla 48 saatlik tepkime süresi sonunda ulaşılmıştır. Bu bulgulara göre, taze kabuklarda dondurulmuş örneklere göre daha yüksek derişimde resveratrol üretilmektedir (Bkz. Şekil 6.1). Ayrıca, taze üzüm kabuklarına 20 khz frekansta 19 mm çaplı çubuk ile (3.81 mg/g kabuk) SÖD uygulandığında, 13 mm çaplı çubuk ile (3.63 mg/g kabuk) bulunan sonuçlara göre, biraz daha yüksek derişimde resveratrol üretildiği görülmüştür. Sonuç olarak, Şekil 6.1 de de görüldüğü üzere, siyah üzüm kabuğunda abiyotik uyarıcı olarak ses ötesi dalga kullanımının trans-resveratrol üretim veriminin artmasına olumlu etkisi olduğu gözlenmiştir. Bu bulgular ışığında, hem taze hem de dondurulmuş üzümlerde trans-resveratrol derişimini artırmak amacıyla abiyotik uyarıcı olarak ses ötesi dalgaların kullanılabileceği net olarak söylenebilir. 87

99 7. ÖNERİLER Bu yüksek lisans çalışmasının devamında yapılabilecek bir başka araştırma için öneriler aşağıda sıralanmıştır. - Diğer siyah üzümler üzerine ses ötesi dalgaların etkileri araştırılabilir. - Kalecik Karasının kullanıldığı sisteme ses ötesi dalgalar ultrasonik homojenizer yerine ultrasonik banyo kullanılarak verilebilir. - Kalecik Karası üzümüne ses ötesi dalgalara ek olarak biyotik elisitörlerin (bakteri, mantar vb.) veya abiyotik elisitörlerin (UV, AlCI 3, ağır metal iyonları vb.) birlikte kullanıldığı kombine sistemlerin etkisi incelenebilir. - Kalecik Karası üzümüne ses ötesi dalga uygulanmadan önce derin dondurucuda bekletme süresinin etkisi (1 ay, 6 ay, 2 yıl vb.) araştırılabilir. - Kalecik Karası üzümünden resveratrolün, süperkritik karbondioksit kullanılarak ekstraksiyonu araştırılabilir. 88

100 KAYNAKLAR Adrian, M., Jeandet, P., Bessis, R. and Joubert, M.J Induction of Phytoalexin (Resveratrol) Synthesis in Grapevine Leaves Treated with Aluminum Chloride (AlCl 3 ). J. Agric. Food Chem. 44; Adrian,M., Jeandet, P., Douillet- Breuril, A.C., Tesson, L. and Bessis R., R Stilbene Content of Mature Vitis Vinifera Berries in Response to UV-C Elicitation. J. Agric. Food Chem. 48, Adewuyi, Y.G, Ind. Eng. Chem. Res., (40); Anonim Bilim ve teknik dergisi.serbest radikallere karşı antioksidan savunma Anonim Web sitesi. Erişim tarihi: Anonim Web sitesi: Erişim tarihi: Anonim tarihi: Anonim Web sitesi: Erişim tarihi: Anonim Web sitesi: Erişim tarihi: 2006 Anonymous Web sitesi: raysahelian.com/resveratrol. Erişim tarihi: Anonymous Web sitesi: Erişim tarihi: Bar, R Ultrasound Enhanced Bioprocesses: Cholestrol Oxidation by Rhodococcus erythropolis. Biotechnology and Bioengineering, 32; Barton, S., Bullock, C. and Weir, D The Effects of Ultrasound on the Activities of Some Glycosidase Enzymes of Industrial Importance. Enzyme and Microbial Technology, 18: Bavaresco L, and Fregoni, C Physiological role and molecular aspects of grapevine stilbenic compounds. P: In Molecular Biology and Biotechnology of the Grapevine. Ed. Roubelakis-Angelakis K A, Ed Kluwer Acad Publ. Netherlands. Becker, J.V.W., Armstrong, G.O., Merwe, M.J., Lambrechts, M.G., Vivier, M.A. and Pretorius, I.S Metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for the synthesis of the winw- related antioxidant resveratrol. FEMS Yeast Research Anonim Web sitesi: tarihi: Bremner, D.H Chemical Ultrasonics, Chem. Br. P:633. Carbo, N., Costelli, P., Baccino, F. M., Lopez-Sariano, F. I. and Argiles, J. M Resveratrol, a Natural Product Present in Wine, Decreases Tumour Growth in a Rat Tumour Model, Biochem Biophys Res Commun 254; Chung, M.R., Chun, J.C. and Yun, S.J Resveratrol Accumulation and Resveratrol Synthase Gene Expression in Response to Abiotic Stresses and Hormones in Peanut Plants, III.Min, Park, Korea, 164; Cordemans, E Ultrasound A New Performance Tool For The Chemical Industry. Chimicaoggi, Undatim Ultrasonics 10, November, Cordemans, E Ultrasound, A new performance tool fort he chemical industry. Chimicaoggi, November,

101 Corre,L.L, Chalabi, N., Delort, L., Bingon, Y.J. and Bernard-Gallon, D.J Resveratrol and breast cancer chemoprevention: Molecular mechanisms. Mol. Nutr. Food Res. (Review) 49; Çelik, H Üzüm Çeşit Kataloğu (Grape Cultivar Catalog). Sunfidan A.Ş. Mesleki Kitaplar Serisi: 3, 165 S. Ankara. Delmas, D., Jannin, B. and Latruffe, N Resveratrol: Preventing properties against vascular alterations and ageing. Mol. Nutr. Food Res. ( Review) 49, Elmacı, T.T Kardiovasküler Cerrahi Girişimlerde Spinal İskemi İst. Tıp Fak. Mecmuası 63:4 Halliday, D. and Resnick, R. (Çeviren: Prof. Dr. Cengiz YALÇIN) Fiziğin Temelleri-1, 3. baskı, Jeandet, P. and Sbaghi, M The Production of Resveratrol (3,5,4 trihydroxystilbene) by Grapevine in vitro Cultures, and Its Application to screening for Grey Mould Resistance. J. Wine Res. 3: Jeandet, P., Bessis, R. and Gautheron, B The Production of Resveratrol (3,5,4 trihydroxystilbene) by Grape Berries in Different Developmental Stages. Am.J.Enol.Vitic. 42(1);41-46 Jeandet, P., Breuil, A.C., Adrian,M., Weston,L.A., Debord, S., Meunier P., Maume G. and Bessis, R HPLC Analysis of Grapevine Phytoalexins Coupling Photodiode Array Dedection and Fluorometry. Anal. Chem.69: Anonim Web sitesi: kalecikhem.meb.gov.tr. Erşim tarihi: Keller, M., Steel, C.C. and Creasy, G.L Stilbene Accumulation In Grapevine Tissues: Developmental And Environmental Effects. XXV International Horticultural Congress, Part 4: Culture Techniques with Special Emphasis on Environmental Implications, ISHS Acta Horticulturae. 514: Keskin, N Asma kallus kültürlerinde UV ışını etkisi ile resveratrol üretiminin uyarılması ve belirlenmesi. Doktora tezi. Ankara Keskin, N. ve Marasali-Kunter, B Asma Fitoaleksinleri Yıl fen bilimleri enstitüsü yayınları, Kızıltepe, U., Turan, N.N., Han, Ü., Ulus, T., Akar, F Spınal cord protectıon wıth resveratrol: Neurologıcal and hıstopathologıcal fındıngs Turkish J Vasc Surg.12(2); Liu, Y., Yang, H., Takatsuki, H. and Sakanishi, A Effect of Ultrasound Exposure on Ca 2+ - ATPase Activity in Plasma Membrane From Aloe Arborescent Callus Cells, China, 13, Matsuura,K., Hirotsune, M., Nunokawa, Y., Satoh, M. and Honda, K Acceleration of Cell Growth and Ester Formation by Ultrasonic Wave Irradiation. Journal of Fermentation and Bioengineering, 77(1); Pascual-Marti M.C., A. Salvador, A. Chafer and A. Berna Supercritical fluid extraction of resveratrol from grape skin of Vitis vinifera and determination by HPLC, Talanta, 54; Payne,G., Bringi,V., Prince C. and Schuler, M.L.,1992. Plant Cell and Tissue Culture In Liquid Systems, Anonim Web sitesi: Erişim tarihi: Rudolf, J.R. and Resurreccion, A.V.A Elicitation of resveratrol in Peanut Kernels by Application of abiyotic Stresses. J. Agric. Food Chem.,53,

102 Anonymous 2005.Web sitesi. Erişim tarihi: Soner, S., Bennett, M.H., and Mansfıeld, J.W Induction of Phytoalexin Accumulation in Broad Bean (Vicia faba L.) Cotyledons Following Treatments with Biotic and Abiotic Elicitors. Turk J Agric For Anonim Web sitesi, tarihi: Suslick, K.S., 1988 Ultrasound, VCH Publishers, 1, , 144. Takatsuki, H., Liu, Y., Yoshikoshi, A., Wang, B. and Sakanishi, A., Effects of Ultrasound on The Growth and Vacoular H + - ATPase Activity of Aloe Arborescent Callus Cells, China, 32, Thompson, L.H. and Doraiswamy L.K., Sonochemistry: science and Engineering, Ind. Eng. Chem. Res. 38: Anonim Web sitesi: Erişim tarihi: Vajnhandl, S. and Marechal, A., M., 2005, Ultrasound in textile dyeing and the colouration/ mineralization of textile dyes, Dyes and Pigments, 65:

103 EKLER EK 1 Ekstraksiyon Yöntemi 1 EK 2 Ekstraksiyon Yöntemi 2 EK 3 Ekstraksiyon Yöntemi 3 EK 4 Ekstraksiyon Yöntemlerinin Karşılaştırması EK 5 Örneklerden Çözücü Uzaklaştırma İşlemi İçin Yöntem Araştırılması EK 6 Resveratrolün UV Analizi ile Dalga Boyunun Belirlenmesi EK 7 HPLC Analizinde Kalibrasyon İçin Standartların Hazırlanması ve Kalibrasyon Grafiği EK 8 Deney Sonuçlarının Toplu Gösterimi EK 9 Örnek HPLC Kromotogramları 92

104 EK 1 Ekstraksiyon Yöntemi 1 Keller et al yılında asma örneklerindeki resveratrol üretimine UV ışığının etkisini inceledikleri çalışmada kullandıkları ekstraksiyon yönteminin detayları ve şeması aşağıda yer almaktadır.yöntem temel olarak 2 aşamadan oluşmaktadır. a.hplc viallerinin temizlenmesi aşaması; Vialler ve kapakları; 1. Ultra saf su (HPLC saflıkta su) + TFA (%0.1) olacak şekilde hazırlanan çözelti ile yıkanır. Eğer TFA mevcut değilse sadece ultra saf su kullanılabilir. Bu aşamada gerekmedikçe fırça kullanılmamalıdır. 2. HPLC saflıktaki metanolle yıkanır. 3. Vialler; ultra saf su + TFA (%0.1) olacak şekilde hazırlanan çözelti ile yıkanır. Eğer TFA mevcut değilse sadece ultra saf su kullanılabilir. 4. HPLC saflıktaki asetonitril ile yıkanır. 5. Ultra saf su ile yıkanır. 6. Vialler etüv kullanılarak kurutulur. b. Resveratrolün ekstarksiyon aşaması; 1. Bir gram üzüm kabuğu tartılır C de beketilmiş olan asetonasetondan 10 ml bu kabuğun üzerine eklenir. 3. Mekanik homojenizer ile ortam homojenleşene ve kabuk boyutları küçülene kadar (yaklaşık 1dk) sistem homojenize edilir dakika çalkalayıcı ile çalkalama işlemi yapılır g değerinde 10 dakika santrifüj yapılır. 6. Örnek tüpünün üzerindeki süzüntü alınarak ayrı bir tüpe aktarılır. 7. Örnek tüpünde kalan kabuk parçalarının üzerine 5 ml aseton 5 ml metanol eklenerek yeniden aynı koşullarda santrifüj yapılır. 8. Tüpün üzerindeki kısım ilk süzüntünün olduğu tüpe eklenir. 9. Santrifüj tüpünde kalan kalıntılar atılır. 10. Ekstratların alındığı tüp çözücü uzaklaştırma işlemi için hazırdır. 93

105 EK 1 Ekstraksiyon Yöntemi 1 (devam) 11. Çözücü uzaklaştırma işlemi 40 derecede su banyosu kullanarak azot gazı kullanarak yapılır. 12. Kalıntının üzerine 2 ml HPLC saflıkta metanol eklenerek HPLC analizi yapılır. 10 ml C de aseton 1 g donmuş doku homojenizasyon 30 dk. çalkalayıcı 3000x g de 10 dk. santrifüj 2 ml metanol N 2 ile uçurma Üst süzüntü alınır HPLC ooo oo 40 0 C deki su banyosu KOMBİNE EKSTRAT Doku atılır Şekil.1 Ekstraksiyon Yöntemi 1 94