TÜRK GIDA KODEKSİ İNSAN TÜKETİMİNE SUNULAN ISIL İŞLEM GÖRMÜŞ SÜTLERİN ANALİZ METOTLARI TEBLİĞİ (TEBLİĞ NO:

Transkript

1 TEBLİĞ Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanlığından: TÜRK GIDA KODEKSİ İNSAN TÜKETİMİNE SUNULAN ISIL İŞLEM GÖRMÜŞ SÜTLERİN ANALİZ METOTLARI TEBLİĞİ (TEBLİĞ NO: 2012/Taslak ) Amaç ve kapsam MADDE 1 (1) Bu Tebliğin amacı, insan tüketimine sunulan ısıl işlem görmüş sütlerin analiz metotlarını düzenlemektir. Dayanak MADDE 2 (1) Bu Tebliğ, 29/12/2011 tarihli ve üncü mükerrer sayılı Resmî Gazete de yayımlanan Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliğine dayanılarak, 92/608/EEC sayılı Doğrudan İnsan Tüketimine Sunulan Isıl İşlem Görmüş Sütlerin Analiz ve Test Metotları hakkında Avrupa Birliği Konsey Kararına paralel olarak hazırlanmıştır. Tanımlar MADDE 3 (1) Bu Tebliğ de geçen; a) Tekrar edilebilirlik (r); Aynı numune, aynı uygulayıcı, aynı cihaz, aynı laboratuvar gibi tekrar edilebilirlik koşulları altında kısa zaman aralıklarıyla yapılan aynı işlem ile elde edilen iki analiz sonucu arasındaki mutlak farkın altındaki değeri, b) Yeniden üretilebilirlik (R); Aynı numunede, aynı metot kullanılarak, farklı uygulayıcı, farklı cihaz, farklı laboratuvar ve/veya farklı zaman gibi yeniden üretilebilirlik koşulları altında elde edilen iki analiz sonucu arasındaki mutlak farkın altındaki değeri ifade eder. Analiz metotları MADDE 4 (1) İnsan tüketimine sunulan ısıl işlem görmüş sütlerin resmi kontrolleri için aşağıdaki analiz metotları uygulanır: a) Toplam kuru madde miktarının belirlenmesi b) Yağ miktarının belirlenmesi c) Yağ dışındaki toplam kuru madde miktarının belirlenmesi ç) Toplam azot miktarının belirlenmesi d) Protein miktarının belirlenmesi e) Özgül kütlenin belirlenmesi (2) Referans analiz metotlarının uygulanması, güvenilirlik kriterlerinin belirlenmesi ve numunelerin toplanması Ek-1 de verilen hükümlere göre yapılır. (3) Birinci fıkrada bahsedilen metotlar, Ek-2 de verilmiştir. Uyum zorunluluğu GEÇİCİ MADDE 1 (1) Halen faaliyet gösteren ve bu Tebliğ kapsamında yer alan ürünlerde resmi kontroller için analiz yapan kurum ve kuruluşlar bir yıl içerisinde bu Tebliğ hükümlerine uymak zorundadırlar. Yürürlük MADDE 5- (1) Bu Tebliğ yayımı tarihinde yürürlüğe girer. Yürütme MADDE 6- (1) Bu Tebliğ hükümlerini Gıda, Tarım ve Hayvancılık Bakanı yürütür.

2 EK-1 A. Genel Hükümler 1. Giriş Reaktifler, araç ve gereçler, sonuçların ifade edilmesi, kesinlik ve analiz raporları ile ilgili hükümler bu ekte tanımlanmıştır. 2. Reaktifler 2.1. Su Çözelti hazırlama, dilüsyon veya yıkama işlemleri amacıyla kullanılan su, aksi belirtilmediği takdirde distile su, deiyonize su veya eşdeğer saflıktaki demineralize su olmalıdır Farklı bir açıklama yapılmadığı sürece çözelti veya dilüsyon işlemleri ile, sulu çözelti veya su ile dilüsyon ifade edilmektedir Kimyasallar Aksi belirtilmediği sürece kullanılan bütün kimyasallar analitik saflıkta olmalıdır. 3. Araç ve Gereçler 3.1. Araç ve gereç listesi Farklı referans metotlarında verilen araç ve gereç listeleri, yalnızca ilgili metot için kullanılan ve belirli özellikleri olan araç ve gereçleri kapsar 3.2. Analitik terazi Analizlerde kullanılan analitik terazi ; 0,1 mg hassasiyetinde tartım yapabilen bir terazi olmalıdır. 4. Sonuçların İfade Edilmesi 4.1. Sonuçlar Aksi belirtilmediği sürece, analiz raporunda verilen sonuçlar o metot için verilen tekrar edilebilirlik kriterleri doğrultusunda yapılan iki analizden elde edilen aritmetik ortalama olmalıdır. Tekrar edilebilirlik kriterleri verilmemiş ise, mümkünse analiz tekrarlanmalıdır veya sonuç geçersiz olarak bildirilmelidir Yüzde hesaplama Aksi belirtilmediği sürece; sonuç, numunenin kütlece yüzdesi olarak hesaplanmalıdır. 5. Kesinlik Kriterleri: Tekrar edilebilirlik ve Yeniden Üretilebilirlik 5.1. Her bir metot için verilen kesinlik kriterleri, bu Tebliğin 3 üncü maddesi ( a ) ve ( b ) bendinde tanımlanmıştır Aksi belirtilmediği takdirde; her bir işlemin tekrar edilebilirlik ve yeniden üretilebilirlik kriterleri için, her bir metot değer, %95 güven aralığında olmalıdır. 6. Analiz Raporu Analiz raporunda, elde edilen sonuç ile birlikte kullanılan analiz metodu da belirtilmelidir. Ayrıca, analiz metodunda belirtilmeyen ya da isteğe bağlı olarak uygulanan herhangi bir işlem detayı ve elde edilen sonucu etkileyebilecek olan diğer koşullar da verilmelidir. Analiz raporu, numunenin tam olarak tanımlanması için gerekli tüm bilgileri vermelidir. B. Numune Alma 1. Kapsam ve Uygulama Alanı Numune alma işlemi, ısıl işlem görmüş süt numunelerinin alınması, taşınması ve depolanması ile ilgili referans metodu belirler. 2. Genel hükümler Tank gibi yerlerden numune alma işlemi, öncesinde uygun bir eğitim almış kontrol görevlisi tarafından alınmalıdır. Eğer uygun olduğu düşünülüyorsa; yetkili kurum veya laboratuvar, numunenin bütün partiyi temsil etmesini sağlayacak numune alma tekniklerini uygulayacak numune alma personeli görevlendirmelidir. Eğer uygun olduğu düşünülüyorsa; yetkili kurum veya laboratuvar, numune işaretleme üzerine numunesini tam olarak ifade etmesini sağlayacak numune alma personeli görevlendirmelidir. 3. Numune alma ekipmanı Numune alma ekipmanı, paslanmaz çelikten ya da kullanım amacı için (karıştırma, numune alma gibi) uygun yapıya sahip ve yeterli dayanıklılıkta başka bir materyalden yapılmış olmalıdır. Kap içerisindeki sıvıları karıştırmak için kullanılan pistonlar ve karıştırıcılar, ürünün yeterli karıştırılmasını gerçekleştirecek, ancak ransidite gelişimine neden olmayacak elverişli yüzeye sahip olmalıdır. Kepçeler, konteynerin herhangi bir derinliğinden numune almaya elverişli uzunlukta bir sapa sahip olmalıdır. Kepçenin kapasitesi 50 ml den az olmamalıdır. Numune kabı ve kapağı cam, uygun bir metal ya da plastikten olmalıdır. Numune alma araç ve gereçlerinin (kaplar ve kapaklar dahil) yapıldığı materyaller, numunede analizin sonucunu etkileyecek herhangi bir değişime neden olmamalıdır. Numune alma araç ve gereçleri ile numune kaplarının tüm yüzeyleri temiz ve kuru, pürüzsüz ve çatlak içermeyen yapıda olmalı ve köşeler yuvarlatılmış olmalıdır. 4. Numune alma tekniği 4.1. Genel Gerçekleştirilen analiz ne olursa olsun, süt numune alma öncesi manuel ya da mekanik olarak iyice karıştırılmalıdır. Numune, karıştırma işleminin hemen sonrasında hala karıştırıyor iken alınmalıdır. Numune hacmi, analizin gereklilikleri için yeterli miktarda olmalıdır. Kullanılan numune kabının kapasitesi, neredeyse numune ile tamamen dolacak büyüklükte olmalıdır, böylece analiz öncesi içeriğin iyice karıştırılması mümkün olur; ancak, taşıma sırasında çalkalanması önlenir Manuel numune alma Bölünmüş dökme ürünlerden numune alma Numune alınacak süt miktarı, bir konteynerden fazla ise, her bir konteynerden temsili miktarda alınır ve her biri için numunenin ilişkilendiği sütün miktarı not edilir. Her bir konteynerden alınan numune ayrı ayrı analiz edilmediği zaman, bu

3 temsili miktarlar her bir numunenin alındığı konteynerdeki miktar ile orantılı miktarlarda karıştırılır. Karıştırma işleminden sonra, bu dökme haldeki oransal miktarlardan numune/numuneler alınır Büyük kazanlardan depo, vagon ve tır tanklarından numune alma Numune alma öncesi uygun bir işlem ile süt karıştırılır. Büyük kazanların ya da depo, vagon veya tır tanklarının içeriğinin, mekanik karıştırıcı ile karıştırılması önerilir. Karıştırmanın süresi, sütün durağan olduğu zamanın üzerindeki zaman periyoduna uygun olmalıdır. Özel koşullarda uygulanan karıştırma işleminin etkinliği, öngörülen analizin amaçları için yeterli olacak şekilde gösterilmelidir. Karıştırma etkinliğinin kriteri, özellikle konteynerlerin farklı kısımlarından ya da boşaltma sırasında aralıklarla tankın dışından alınan numunelerden elde edilen analitik sonuçlar arasındaki benzerliği etkiler. Sütün (işlem görmemiş süt ya da tam yağlı süt) karıştırma işlemi, bu koşullar altında alınan iki numune arasındaki yağ miktarı farkı %0,1 den daha küçük ise etkin olarak değerlendirilir. Alt dış boşaltma bölümü olan geniş kazanda, boşaltma noktasında, karıştırma işlemi sonrasında bile tüm içeriği temsil etmeyen az miktarda süt bulunabilir. Bu nedenle, numuneler tercihen menhol boyunca alınmalıdır. Eğer numuneler boşaltma çıkışından alınıyorsa; numunelerin, sütün tamamını temsil ettiğinden emin olmak için yeterli miktarda süt akıtılır Büyük kazanların ya da depo, vagon veya tır tanklarının içeriğinin karıştırılması - Tankların içerisinde kurulan ve elektrik motor ile çalışan mekanik karıştırma ile - Elektrik motor ile çalışan ve süt içinde asılı duran karıştırıcı ile menhol üzerine yerleştirilmiş karıştırıcı ya da propellor ile - Vagon ya da tır tankerleri olduğu durumda; sütün boşaltma pompası tankerine bağlı ve menhol boyunca gömülü aktarma hortumu boyunca devirdaimi ile - Temiz, filtre edilmiş, basınçlı hava ile. Bu durumda, ransidite gelişimini önlemek için minimum hava basıncı ve hacmi kullanılmalıdır Perakende aşamasında doğrudan tüketime sunulan ısıl işlem görmüş sütten numune alma Perakende aşamasında doğrudan tüketime sunulan ısıl işlem görmüş süt numuneleri, tamamıyla kapatılmış paketler olmalıdır. Eğer mümkünse, numuneler paketleme makinesinden alınmalıdır ya da üretim sonrasında mümkün olduğu kadar kısa zamanda soğutma odasından alınmalıdır (pastörize süt için üretildiği gün). Numuneler, ilgili kurum ya da laboratuvar tarafından belirlenmiş talimatlar doğrultusunda ve yapılacak olan analizler için yeterli sayıda, ısıl işlem görmüş sütün her tipinden(pastörize, UHT uygulanmış ve sterilize edilmiş) alınmalıdır. 5. Numunenin tanımlaması Numune, analiz laboratuvarı ya da ilgili kurum tarafından verilen talimatlar kullanılarak kolayca tanımlanabilmesi için numune alma etiketi/tanımlama kodu ile işaretlenmelidir. 6. Numunelerin muhafazası, taşınması ve depolanması Bakanlık uyarınca, numune alınması ile sütün analiz edilmesi arasındaki süre ve muhafaza (kimyasal, sıcaklık), taşıma, depolama koşulları ile ilgili talimatlar, sütün çeşidine ve uygulanacak analiz prosedürüne göre laboratuvar tarafından hazırlanmalıdır. Talimatta aşağıdaki noktalara yer verilmelidir: Taşıma ve depolama sırasında, koku kontaminasyonuna ve doğrudan güneş ışığına maruz kalmayı önlemek amacıyla önlemler alınmalıdır. Numune kabı şeffaf ise, karanlık bir yerde saklanmalıdır. EK-2 I. Toplam Kuru Madde Miktarının Belirlenmesi Bu işlem, sütün toplam kuru madde miktarının belirlenmesi için referans metodu belirtir. 2.Tanım Toplam kuru madde miktarı: Kütlece yüzde olarak ifade edilen ve tanımlanan, kurutma işleminin tamamlanmasından sonra kalan kütledir. 3. Prensip 102 ± 2 o C de etüvde, analiz biriminden suyun evaporasyonuna dayanır. 4. Araç ve gereçler Genel olarak kullanılan laboratuvar cihazları ve ayrıca aşağıdaki araç gereçler kullanılır: 4.1. Analitik terazi 4.2. Desikatör; etkin bir desikant içeren (örneğin nem belirleyici indikatöre sahip taze kurutulmuş silikajel) 4.3. Etüv; havalandırma sistemli, çalışma alanı boyunca 102 ± 2 o C de termostatik kontrollü 4.4. Düz tabanlı kaplar; mm derinliğinde, mm çapında, iyi uyum sağlayan uygun materyalden, kolay çıkarılabilir kapaklı 4.5. Kaynar su banyosu 4.6. Homojenizatör 5. Analiz numunesinin hazırlanması Süt numunesinin sıcaklığı, o C ye getirilir. Numunede yağın homojen dağılımını sağlamak için süt iyice karıştırılır. Sütün köpürmesine ya da yağın çalkalanmasına neden olacak kadar kuvvetli bir karıştırmadan kaçınılmalıdır. Krem tabakasının dağılması zor ise, dikkatli bir karıştırma ile o C arasında yavaş bir şekilde ısıtılır ve kaba yapışmış olan kremaların da karışması sağlanır. Numune, hızla o C ye soğutulur. Eğer istenirse, yağın dağılmasına yardımcı olmak için bir homojenizatör kullanılabilir. Eğer numune ayrılmış sıvı yağ ya da kap duvarına yapışmış görünür ayrı düzensiz şekilli beyaz partiküller içeriyorsa; sonuçların doğru olduğu beklenmez. 6. İşlem 6.1. Kabın hazırlanması

4 Kapağı yanında olacak şekilde, bir kap (4.4) 102 ± 2 o C de termostatik kontrollü etüvde (4.3) en az 30 dakika ısıtılır. Kabın kapağı kapatılır ve hemen desikatöre alınır, oda sıcaklığına soğutulur (örneğin en az 30 dakika) ve 0,1 mg hassasiyet ile tartılır Analiz birimi Vakit kaybetmeden, hazırlanan numuneden hazırlanan kap içerisine 0,1 mg hassasiyet ile 3-5 gr tartılır Belirleme Kap, kaynar su banyosu (4.5) üzerinde 30 dakika ısıtılarak ön kurutma gerçekleştirilir Kap, kapağın yanında olacak şekilde 102 ± 2 o C de termostatik kontrollü etüvde (4.3) yaklaşık 2 saat ısıtılır. Kapağı kapatılır ve etüvden alınır Desikatörde oda sıcaklığına soğutulur (örneğin en az 30 dakika) ve 0,1 mg hassasiyet ile tartılır Kap kapağın yanında olacak şekilde, etüvde 1 saat tekrar ısıtılır. Kapağı kapatılır ve etüvden alınır. Desikatörde yaklaşık 30 dakika soğutulur ve 0,1 mg hassasiyet ile tartılır Madde te anlatılan işlem, arka arkaya yapılan iki tartım arasındaki fark 0,5 mg ı geçmeyene kadar tekrar edilir. En düşük kütle kaydedilir. 7. Sonuçların ifade edilmesi 7.1. Formül ve hesaplama Toplam kuru madde miktarı, kütlece yüzde olarak aşağıdaki formülle hesaplanır: m2 m0 W T = 100 m m 1 0 Burada; WT = Toplam kuru madde miktarını (g/100 g), m 0 = Kap ve kapağının kütlesini (g) (Bknz. 6.1), m 1 = Kap, kapak ve analiz biriminin kütlesini (g) (Bknz. 6.2), m 2 = Kap, kapak ve kurutulmuş analiz biriminin kütlesini (g) (Bknz ) ifade eder. %0,01 hassasiyeti ile elde edilen değer, tam sayıya yuvarlanır(kütlece yüzde) Kesinlik Tekrar edilebilirlik (r): Ürünün her 100 gramında toplam kuru maddenin 0,10 gramıdır Yeniden üretilebilirlik (R): Ürünün her 100 gramında toplam kuru maddenin 0,20 gramıdır. II. Yağ Miktarının Belirlenmesi Bu işlem; çiğ süt ile tam yağlı, yarım yağlı ve yağsız sütün yağ miktarının belirlenmesi için referans metodu tanımlar. 2. Tanım Sütün yağ miktarı: Tanımlanan metot ile belirlenen bütün materyaldir ve kütlece yüzde olarak ifade edilir. 3. Prensip Analiz biriminin amonyaklı etil alkol çözeltisi, dietil eter ve petrol eteri ile ekstrakte edilir, çözücüler distilasyon ya da evaporasyon ile uzaklaştırılır ve petrol eterinde çözünen, ekstrakte edilen maddenin kütlesi belirlenir. Bu işlem, Röse- Gottlieb metodu olarak bilinir. 4. Reaktifler Kullanılan tüm reaktifler analitik saflıkta olmalı ve kör analizde fark edilir kalıntı bırakmamalıdır. Reaktiflerin kalitesinin test edilmesi için; Madde 6.3 de tarif edilen şekilde belirleme işlemi gerçekleştirilir. Tartım için dara olarak (tartım sonucu üzerine atmosfer koşullarındaki değişikliklerin neden olduğu etkiler için düzeltme kullanılır.) Madde 6.4 de belirtildiği gibi hazırlanan boş erlen, beher ya da metal kap kullanılır. Eğer daranın kütlesindeki fark edilir değişiklik için düzeltilen kalıntı 2,5 mg dan daha fazla ise, sırasıyla 100 ml dietil eter ve 100 ml petrol eterinde evaporasyon ile kalıntı veya çözücüler ayrı ayrı belirlenir. Ayrıca, tartım için dara kullanılır. Kalıntı 2,5 gr dan daha fazla olduğu zaman, distilasyon ile çözücü temizlenir ya da çözücü değiştirilir Amonyak çözeltisi; yaklaşık % 25 (kütle/kütle) NH 3 içeren çözelti. Daha derişik konsantrasyonda amonyak çözeltisi de kullanılabilir. (Bknz ve ) 4.2. Etil alkol; en az % 94 lük (hacim/hacim). Belirleme sonucunu etkilemeyeceğinden emin olunması halinde metil alkol ile denatüre edilmiş etil alkol kullanılabilir Kongo kırmızısı ya da krezol kırmızısı çözeltisi; 1 gr kongo kırmızısı ya da krezol kırmızısı su içinde çözülür ve 100 ml ye seyreltilir. Not: çözücü ve sulu tabakalar arasındaki interfaz/arayüzün daha açık görülmesini sağlayan bu çözeltinin kullanımı, isteğe bağlıdır. Belirleme sonucunu etkilememesi koşuluyla diğer sulu renkli çözeltiler kullanılabilir. 4.4.Dietil eter; 2 mg/kg dan fazla antioksidan içermeyen peroksitsiz, kör analizin gerekliliklerini karşılayan Petrol eteri; kaynama noktası 30 ile 60 ºC arasında olmalıdır Karışım çözücü; eşit hacimde petrol eteri (4.5) ve dietil eter (4.4) karıştırılır. Karışım, kullanmadan hemen önce hazırlanmalıdır. 5. Araç ve Gereçler Uyarı: Belirleme işleminde uçucu yanar çözücüler kullanıldığı için, kullanılacak olan elektrikli cihazlar bu çözücülerin kullanımı ile ilgili gerekli hükümleri karşılamalıdır. Genel olarak kullanılan laboratuvar cihazları ve ayrıca aşağıdaki araç gereçler kullanılır: 5.1. Analitik terazi

5 5.2. Santrifüj, yağ ekstraksiyon balonları yada tüplerinin dış uçlarında g yerçekimi alanı oluşturmak için devir/dakika rotasyonel sıklıkla dönebilen. Not: Santrifüj kullanımı isteğe bağlıdır (6.5.5) Distilasyon ya da evaporasyon araçları; çözücülerin ve etil alkolün 100 o C yi geçmeyen sıcaklıkta balonlardan distile edilmesi ya da beherlerden ve kaplardan evapore edilmesini ( ve ) sağlamak amacıyla kullanılır Etüv; elektrikli ısıtmalı, ventilasyon deliği(delikleri) tamamen açık, çalışma alanı boyunca 102 ± 2 o C sıcaklıkta kontrol edilebilen. Etüv uygun bir termometre ile sabitlenmelidir Su banyosu; o C sıcaklığa ayarlanabilen Mojonnier tipi yağ ekstraksiyon balonları Not: Sifon ya da yıkama şişesi bağlantılı yağ ekstraksiyon tüpleri de kullanılabilir. Ancak, bu durumda işlem farklı olup, Madde 8 de tanımlanmıştır. Balonlar (ya da tüpler), rodajlı olmalıdır ya da kullanılan reaktifler ile etkilenmeyen iyi kalitede mantarlar ya da başka kapakları olmalıdır. Mantarlar, en az 15 dakika 60 o C ya da daha fazla sıcaklıkta suda tutulan dietil eter (4.4) ile ekstrakte edilmelidir ve daha sonra kullanılacağı zaman doymuş olması için suda soğutulmalıdır Tüplük; yağ ekstraksiyon balonları ya da tüplerini (5.6) tutmak için Yıkama şişesi; karışım çözücü (4.6) ile kullanıma uygun. Plastik yıkama şişesi kullanılmamalıdır Yağ toplama kapları; örneğin kaynatma balonları (düz tabanlı) ya da ml kapasiteli erlenmeyer balonu ya da metal kaplar. Eğer metal kaplar kullanılacak ise, paslanmaz çelik olmaları tercih edilmelidir ve düz tabanlı, tercihen musluklu, yaklaşık 50 mm yüksekliğinde ve mm çapında olmalıdır Kaynama taşları; yağdan arındırılmış, gözeneksiz porselen ya da silikon karbür ya da cam küreler (metal kaplar kullanıldığında isteğe bağlıdır) Ölçü silindirleri; 5-25 ml kapasiteli Pipetler; taksimatlı, 10 ml kapasiteli Maşalar; metal malzemeden, balonları, beherleri ya da kullanılacak kapları tutmaya uygun. 6. İşlem Not: Sifonlu ya da yıkama şişesi bağlantılı yağ ekstraksiyon tüpleri kullanılan alternatif işlem (Bknz. Madde 5.6. Not) Madde 8 de tarif edilmiştir Numunenin hazırlanması Laboratuvar numunesinin sıcaklığı su banyosu yardımıyla 15 dakika süresince yaklaşık o C ye ayarlanır. Köpürme veya çalkalanmaya neden olmadan numune şişesi sürekli ters çevrilerek iyice ve yavaş bir şekilde numune karıştırılır ve hızlı bir şekilde yaklaşık 20 o C ye soğutulur Analiz kısmı Numune şişesi 3-4 kez yavaşça ters çevrilerek analiz numunesi (6.1) karıştırılır ve hemen 1 mg hassasiyetle direkt veya farklı sayıda, gram analiz numunesi ekstraksiyon balonlarının (5.6) birine tartılır. Analiz kısmı, ekstraksiyon balonlarının küçük haznesi içerisine mümkün olduğu kadar tam olarak verilmelidir Şahit analiz Şahit analiz, analiz kısmı yerine ml su kullanılarak aynı işlem ve aynı reaktifler kullanılarak belirleme yolu ile eş zamanlı olarak yapılır. Yağ toplama kabının görünen ağırlığındaki değişim (kontrol kabının ağırlığındaki görünen değişim için düzeltilmiş) 2,5 mg dan daha fazla olmamalıdır Yağ toplama kabının hazırlanması Kap (5.9), çözücünün uzaklaştırılmasını müteakip kaynama işleminin yavaş gerçekleşmesine yardımcı olacak birkaç tane kaynama taşı ile birlikte etüvde (5.4) bir saat süresince kurutulur. Kap, (desikatörde değil ancak tozdan uzak bir şekilde) tartım odasının sıcaklığına kadar soğutulur (Cam kaplar için en az bir saat, metal kaplar için en az 30 dakika). Sıcaklık değişimlerinden kaçınmaya özen gösterilerek, maşa kullanılarak kap teraziye yerleştirilir ve 0,1 mg hassasiyetle tartılır Belirleme Balonun küçük haznesine analiz birimi ile birlikte 2 ml amonyak çözeltisi (4.1) veya daha derişik bir amonyak çözeltisinin eşdeğer hacmi ilave edilerek iyice karıştırılır. Amonyak eklendikten sonra gecikmeden belirleme işlemi gerçekleştirilmelidir ml etil alkol (4.2) eklenir ve balon içeriğinin iki hazne arasında ileri ve geri akışı sağlanarak yavaşça ancak iyi bir şekilde karıştırılır. (Bu esnada sıvının, balonun boyun kısmına çok yaklaşmasından kaçınılmalıdır.)eğer istenirse, iki damla Kongo kırmızısı ya da Krezol kırmızısı çözeltisi eklenir ml dietil eter eklenir (4.4), su ile doygun bir tıpa ile ya da su ile ıslatılmış bir kapak (5.6) ile balon kapatılır. Bir dakika süreyle yatay konumda tutularak ve küçük hazne yukarı doğru uzatılarak / alt üst edilerek kuvvetlice çalkalanır, ancak dirençli emülsiyonların oluşmaması için aşırı şekilde çalkalamaktan kaçınılmalıdır. Periyodik olarak büyük haznedeki sıvının küçük hazneye karışması sağlanmalıdır. Eğer gerekli ise, balon akan su altında soğutulur, daha sonra dikkatli bir şekilde tıpa ya da kapak çıkarılır. Yıkama sıvıları balon içerisine karışması için, tıpa ya da kapak ve balonun boyun kısmı az miktarda karışım çözücü (4.6) ile yıkama şişesi kullanılarak yıkanır ml petrol eteri (4.5) ilave edilir, tekrar ıslatılmış (su içerisine batırılarak ıslatılır) tıpa ya da kapak ile balon kapatılır, 30 saniye boyunca Madde de tarif edildiği gibi yavaşça balon çalkalanır Kapalı balon, devir/dakika rotasyonel sıklıkta (5.2) 1-5 dakika süresince santrifüj edilir. Eğer santrifüj cihazı yok ise (Bknz. Madde 5.2. Not), kapalı balon en az 30 dakika sıvı tabaka açıkça / belirgin biçimde ayrılana ve üst faz berrak olana kadar rafta bekletilir. Gerekli görülüyorsa, balon akan su altında soğutulur Dikkatli bir şekilde kapak ya da tıpa açılır. Tıpa ve balonun boynunun iç kısmında kalanlar birkaç ml karışım çözücü ile (4.6) yıkanır ve yıkanan kısım balonun içine aktarılır. Eğer ara faz balonun boyun kısmının bitiminin altında ise, çözücünün süzülmesini kolaylaştırmak için yavaşça su eklenerek bu seviyenin biraz üzerine çıkarılır.

6 Küçük hazne ile ekstraksiyon balonu tutulur; üst faz tabakası, birkaç tane kaynama taşı içeren hazırlanan yağ toplama kabına (6.4) mümkün olduğu kadar dikkatli bir şekilde herhangi bir sıvı tabakanın ayrımından kaçınılarak süzülür Ekstraksiyon balonunun boyun kısmının dış tarafı bir miktar karışım çözücü (4.6) ile yıkanır. Yıkantı yağ toplama kabı (6.4) içerisine toplanır ve karışım çözücünün ekstraksiyon balonunun dış tarafına yayılmamasına dikkat edilir. Eğer istenirse, çözücü ya da çözünün bir bölümü Madde de tarif edildiği gibi distilasyon ya da evaporasyon ile kaptan uzaklaştırılabilir Ekstraksiyon balonunun içeriğine 5 ml etil alkol (4.2) eklenir, balonun boyun kısmın iç tarafını yıkamak için etil alkol kullanılır ve Madde de tarif edildiği gibi karıştırılır Yalnızca 15 ml petrol eteri (4.5) ve 15 ml dietil eter (4.4) kullanılarak Madde ve Madde arasındaki işlemler tekrarlanarak ikinci bir ekstraksiyon gerçekleştirilir. Ekstraksiyon balonunun boyun kısmının iç tarafı eter kullanılarak yıkanır. Eğer gerekli ise, mümkün olduğu kadar tamamen çözücünün süzülmesini sağlamak için; ara faz balonun gövde kısmının ortasına kadar çıkarılır Yalnızca 15 ml petrol eteri (4.5) ve 15 ml dietil eter (4.4) kullanılarak Madde ve Madde arasındaki işlemler tekrarlanarak üçüncü ekstraksiyon gerçekleştirilir. Ekstraksiyon balonunun boyun kısmının iç tarafı eter kullanılarak yıkanır. Eğer gerekli ise, mümkün olduğu kadar tamamen çözücünün süzülmesini sağlamak için ara faz balonun boyun kısmının ortasına kadar çıkarılır. Yağsız süt için üçüncü ekstraksiyon yapılmayabilir Etil alkol dahil çözücüler mümkün olduğu kadar tamamen distilasyon ile balondan ya da evaporasyon ile kaptan ya da beherden uzaklaştırılır. Distilasyona başlamadan önce bir miktar karışım çözücü (4.6) ile balonun boyun kısmının iç tarafı yıkanır Yağ toplama kabı(çözücü buharı kaçışını sağlamak için yanına balon konulur) etüvde (5.4) bir saat boyunca ısıtılır. Yağ toplama kabı etüvden alınır, tartım odası sıcaklığına (Cam kaplar için en az bir saat, metal kaplar için en az 30 dakika) soğutulur (desikatörde değil, ancak tozdan uzak bir şekilde) ve 0,1 mg hassasiyetle tartılır. Tartımdan hemen önce kap silinmez. Maşa kullanılarak kap teraziye yerleştirilir ve özellikle sıcaklık değişimlerinden kaçınılır Madde te tarif edilen işlemler yağ toplama kabının kütlesi azalana kadar ya da birbirini takip eden iki tartım arasındaki artış ya da azalış 0,5 gram ya da daha az olana kadar tekrarlanır. Yağ toplama kabı ve ekstrakte edilen maddenin kütlesi olarak gözlenen minimum kütle kaydedilir Ekstrakte edilen maddenin tamamının çözünebilir olup olmadığını kontrol amacı ile sırasıyla yağ toplama kabına 25 ml petrol eteri eklenir. Hafifçe ısıtılır ve yağın tamamı çözününceye kadar döndürülerek karıştırılır. Eğer ekstrakte edilen madde petrol eteri içinde tamamen çözünüyorsa, ekstraktı ihtiva eden kabın (6.5.14) ağırlığından kabın darası (6.4) çıkarılarak yağın kütlesi bulunur Eğer ekstrakte edilen madde petrol eteri içinde tamamen çözünmüyorsa veya şüpheli bir durum olursa, ılık petrol eteri ile tekrar tekrar yıkanarak; yağ, kaptan tamamen ekstrakte edilir. Çözünmeyen maddelerin çökmesi beklenir ve çözünmeyen maddeleri uzaklaştırmadan petrol eteri dikkatli bir şekilde süzülmelidir. Bu işlem üç ya da daha fazla tekrarlanır, petrol eteri kullanılarak kabın boyun kısmının iç tarafı yıkanır. Son olarak, karışım çözücü ile kabın üst kısmının dış tarafı, kabın dış kısmına çözücü yayılmaması için yıkanır. Kap etüvde bir saat ısıtılarak kaptan petrol eteri buharı uzaklaştırılır, Madde ve Madde deki gibi soğutulur ve tartılır. Yağın kütlesi, bu son kütle ile Madde de belirlenen kütle arasındaki fark olarak alınır. 7. Sonuçların ifade edilmesi 7.1. Formül ve hesaplama Yağ miktarı kütlece yüzde olarak aşağıdaki formül ile hesaplanır: ( m1 m2 ) ( m3 m4 ) F = 100 m 0 Burada; F = Yağ miktarını, m 0 = Analiz kısmının gram olarak kütlesini (6.2), m 1 = Madde de belirlenen ekstrakte maddenin ve yağ toplama kabının gram olarak kütlesini, m 2 = Hazırlanan yağ toplama kabının gram olarak kütlesi ya da çözünmeyen madde durumunda yağ toplama kabının ve Madde da belirlenen çözünmeyen artık maddenin gram olarak kütlesini, m 3 = Kör analizinde (6.3) kullanılan yağ toplama kabının ve Madde de belirlenen ekstrakte edilen maddenin gram olarak kütlesini, m 4 = kör analizinde (6.3) kullanılan hazırlanan yağ toplama kabının (Bknz. 6.4) gram olarak kütlesi ya da çözünmeyen madde durumunda yağ toplama kabı ve Madde da belirlenen artık çözünmeyen maddenin gram olarak kütlesini ifade eder. Sonuç, %0,01 hassasiyetle raporlanmalıdır Kesinlik Tekrar edilebilirlik (r): - Tam yağlı süt ve yarım yağlı süt için: 100 gram üründe 0,02 gram yağ - Yağsız süt için: 100 gram üründe 0,01 gram yağ Yeniden üretilebilirlik (R): - Tam yağlı süt için: 100 gram üründe 0,04 gram yağ - Yarım yağlı süt için: 100 gram üründe 0,03 gram yağ - Yağsız süt için: 100 gram üründe 0,025 gram yağ

7 8. Sifon ya da Yıkama Şişesi Bağlantıları Olan Yağ Ekstraksiyon Tüplerinin Kullanıldığı Alternatif İşlem 8.1. İşlem Analiz numunesinin hazırlanması Madde 6.1 de ifade edildiği gibi hazırlanır Analiz birimi Madde 6.2 de belirtilen yol izlenir, ancak yağ ekstraksiyon tüpleri kullanılır (Bknz. 5.6). Analiz birimi, ekstraksiyon tüpünün dip kısmında mümkün olduğu kadar tümüyle dağıtılır Kör analiz Madde 6.3 de belirtilen yol izlenir Yağ toplama kabının hazırlanması Madde 6.4 de belirtilen yol izlenir Belirleme Amonyak çözeltisinden (4.1) 2 ml ya da daha derişik amonyak çözeltisinden eş değer hacim eklenir ve tüpün dip kısmında önceden hazırlanmış analiz birimi ile iyice karıştırılır. Amonyak eklendikten sonra, vakit kaybetmeden analiz gerçekleştirilir ml etil alkol (4.2) eklenir ve tüpün dip kısmında yavaşça ancak iyi bir şekilde karıştırılır. Eğer istenirse, iki damla Kongo kırmızısı ya da Krezol kırmızısı çözeltisi (4.3) eklenir ml dietil eter (4.4) eklenir, su ile doygun bir tıpa ile ya da su ile ıslatılmış bir kapak ile balon kapatılır (5.6). Tüp bir dakika süreyle alt üst edilerek kuvvetlice karıştırılır, ancak dirençli emülsiyonların oluşmaması için aşırı şekilde yapılmamalıdır. Eğer gerekli ise, balon akan su altında soğutulur, daha sonra dikkatli bir şekilde tıpa ya da kapak çıkarılır. Yıkama sıvıları balon içerisine karışması için, tıpa ya da kapak ve balonun boyun kısmı az miktarda karışım çözücü ile (4.6) yıkama şişesi kullanılarak yıkanır ml petrol eteri (4.5) ilave edilir, tekrar ıslatılmış tıpa ya da kapak (su içerisine batırılarak ıslatılır) ile balon kapatılır ve 30 saniye boyunca Madde de tarif edildiği gibi yavaşça balon çalkalanır Kapalı balon, devir/dakika rotasyonel sıklıkta (5.2) 1-5 dakika süresince santrifüj edilir. Eğer santrifüj cihazı yok ise (Bknz. Madde 5.2.Not), kapalı balon en az 30 dakika sıvı tabaka açıkça / belirgin biçimde ayrılana ve üst faz berrak olana kadar rafta bekletilir. Gerekli görülüyorsa, balon akan su altında soğutulur Dikkatli bir şekilde kapak ya da tıpa açılır. Tıpa ve balonun boynunun iç kısmında kalanlar birkaç ml karışım çözücü ile (4.6) yıkanır ve yıkanan kısım balonun içine aktarılır Tüp içerisine sifon bağlantısı ya da yıkama şişesi bağlantısı yerleştirilir ve bağlantının içteki uzun bölümü, giriş noktası tabakalar arasındaki fazın yaklaşık 3 mm üzerinde oluncaya kadar aşağı itilir. Bağlantının içteki bölümü, ekstraksiyon tüpünün eksenine paralel olmalıdır. Tüpdeki üst faz tabakası, içerisinde birkaç tane kaynama taşı (5.10) bulunan hazırlanan yağ toplama kabına (6.4) herhangi bir sıvı tabakanın alınmamasına dikkat edilerek aktarılır. Bir miktar karışım çözücü ile bağlantının dış bölümü yıkanır ve yıkantı yağ toplama kabında toplanır Tüpün boyun kısmından bağlantı gevşetilir, yavaşça bağlantı kaldırılır ve bir miktar karışım çözücü ile bağlantının içteki uzun bölümünün alt kısmı yıkanır. Bağlantı indirilir ve tekrar yerleştirilir ve yıkantılar yağ toplama kabına aktarılır. Çok az miktar karışım çözücü ile bağlantının dış kısmı yıkanır, yıkantılar kap içerisine toplanır. Eğer istenirse, çözücü ya da çözücünün bir bölümü Madde de tarif edildiği gibi distilasyon ya da evaporasyon ile kaptan uzaklaştırılabilir Bağlantı tekrar boyun kısmından gevşetilir, yavaşça kaldırılır ve tüpün içeriğine 5 ml etil alkol eklenir, bağlantının içteki uzun bölümünü yıkamak için etil alkol kullanılır, Madde de tarif edildiği gibi karıştırılır İkinci ekstraksiyon, Madde ve Madde arasında tarif edilen işlemler tekrarlanarak gerçekleştirilir, ancak sadece 15 ml dietil eter (4.4) ve 15 ml petrol eteri (4.5) kullanılır. Önceki ekstraksiyondan sonra tüpten bağlantının uzaklaştırılması sırasında bağlantının içteki uzun bölümünü yıkamak için eter kullanılır Üçüncü ekstraksiyon, tekrar Madde ve Madde arasında tarif edilen işlemler tekrarlanarak gerçekleştirilir. Madde da belirtildiği gibi 15 ml dietil eter ve 15 ml petrol eteri kullanılır ve bağlantının içteki uzun bölümü yıkanır. Yağsız süt için üçüncü ekstraksiyon yapılmayabilir Madde ve Madde arasında tarif edilen yol izlenir. III. Yağ Dışındaki Toplam Kuru Maddenin Belirlenmesi Bu işlem, ısıl işlem uygulanmış sütlerde yağ dışındaki toplam kuru madde miktarının belirlenmesi için referans metodu belirtir. 2. Tanım ve hesaplama Yağ dışındaki toplam kuru madde miktarı, kütlece yüzde olarak ifade edilir. Yağ dışındaki toplam kuru madde miktarı, toplam kuru maddeden (Ek-2-I) yağ miktarının (Ek-2-II) çıkarılması ile elde edilen miktardır. IV. Toplam Azot Miktarının Belirlenmesi Bu işlem, çiğ süt, tam yağlı süt, yarım yağlı süt ve yağsız sütte toplam azot miktarının belirlenmesi için referans metodu belirtir. 2. Tanım Sütün toplam azot miktarı; Kjeldahl metodu ile belirlenen, kütlece yüzde olarak ifade edilen azot miktarıdır. 3. Prensip

8 Belirli miktardaki süt numunesi, derişik sülfürik asit karışımı ile amonyum sülfat içindeki organik bileşiklerin azotunu dönüştürmek için potasyum sülfat ve bakır (II) sülfat katalizatörlüğü eşliğinde parçalanır. Sodyum hidroksit çözeltisi eklenerek amonyak serbest hale geçer ve daha sonra distile edilerek borik asit çözeltisi içine absorbe edilir ve asit çözeltisi ile titre edilir. 4. Reaktifler 4.1. Potasyum sülfat (K 2 SO 4 ) 4.2. Bakır sülfat çözeltisi; 5,0 gram bakır (II) sülfat pentahidrat (CuSO 4.5H 2 O) su içerisinde çözündürülür ve 20 o C de 100 ml ye tamamlanır Sülfürik asit; en az %98,0 lik (kütle/kütle) H 2 SO Sodyum hidroksit çözeltisi; %47 lik (kütle/kütle) 704 g/l NaOH (20 o C) Not: Daha düşük konsantrasyonda sodyum hidroksit çözeltisi kullanılabilir. Örneğin; %40 lık (kütle/kütle) 572 g/l (20 o C) ya da %30 luk (kütle/kütle) 399 g/l (20 o C) Borik asit çözeltisi; 40 gram borik asit (H 3 BO 3 ), bir litre sıcak suda çözündürülür, soğutulur ve borosilikat cam şişede saklanır İndikatör çözeltisi; 0,01 gram metil kırmızısı, 0,02 gram bromotimol mavisi ve 0,06 gram bromokrezol yeşili, 100 ml etil alkol içerisinde çözündürülür. Çözelti kahverengi kapalı şişede, soğukta ve karanlıkta saklanır Hacimsel çözelti; c (½ H 2 SO 4 ) ya da c (HCl) = 0,1 mol/l (0,0001 mol/l hassasiyetle standardize edilmiş) 4.8. Sakkaroz (azot içermeyen) 4.9. Amonyum tuzu (saf); amonyum oksalat [(NH 4 ) 2 C 2 O 4,H 2 O] ya da amonyum sülfat [(NH 4 ) 2 SO 4 ] gibi Triptofan (C 11 H 12 N 2 O 2 ), fenasetin (C 10 H 7 CH 2 CONH 2 ) ya da lizin monohidroklorit (C 6 H 14 N 2 O 2.HCl) ya da lizin dihidroklorit (C 6 H 14 N 2 O 2.2HCl) Not: Madde 4.9 ve Madde 4.10 daki reaktiflerin saflığı analitik saflıktan daha yüksek olmalıdır. Eğer mümkün ise, sertifikalı amonyum tuzu çözeltisi (4.9) kullanılmalıdır. 5. Araç ve Gereçler Genel olarak kullanılan laboratuvar cihazları ve ayrıca aşağıdaki araç gereçler kullanılır: 5.1. Kjeldahl balonu; 500 ml kapasiteli Uygun kaynama taşları; yaklaşık 5 mm çaplı cam küreler, Hengar granülleri, ponzataşı gibi Büret ya da otomatik pipet; 1,0 ml aktarım yapan Dereceli ölçü silindirleri; cam malzemeden, 50, 100 ve 250 ml kapasiteli Parçalama düzeneği; eğik pozisyonda (yaklaşık 45 o ), balondaki içerik seviyesinin üst bölümünü ısıtmayan elektrik ısıtıcılı ya da gaz ocaklı ve duman boşaltma sistemli Distilasyon düzeneği; Kjeldahl balonunun (5.1) yerleştirilebildiği borosilikat camdan yapılmış olmalıdır. Düz iç tüpü olan ve alt ucuna bağlı dış tüpü olan etkili bir yoğuşturucuya bağlı etkili sıçratma başlığı (splash-head) içermelidir. Bağlayıcı tüpler ve kapaklar birbirine yakın bağlantılı olmalı ve tercihen neopren lastikten olmalıdır Pipet ya da otomatik pipet; 0,10 ml aktarım yapan Konik balonlar; 500 ml kapasiteli ve 200 ml taksimatlı Büret; 50 ml kapasiteli, 0,1 ml taksimatlı, azami hata payı ± 0,05 ml olan Büyüteç; büret (5.9) okumaları için ph metre Otomatik büret 6. İşlem 6.1. Kjeldahl balonu (5.1) içerisine; kaynama taşı (5.2), 15 gram potasyum sülfat (4.1), 1,0 ml bakır sülfat çözeltisi (4.2), 0,001 gram hassasiyetle tartılmış yaklaşık 5 gram süt numunesi ve 25 ml sülfürik asit (4.3) aktarılır. Balonun boyun kısmında kalabilecek herhangi bir süt, potasyum sülfat ya da bakır sülfat çözeltisi; asit ile balon içine yıkanır ve balon içeriği yavaşça karıştırılır. Not: Eğer süt %5 den (kütle/kütle) daha fazla yağ içeriyor ise, kaynama sırasında organik maddeler sülfürik asidi tüketeceği için, parçalama için 25 ml yerine 30 ml H 2 SO 4 (4.3) kullanılır. Bu aynı zamanda, kör analizde de bu şekilde yapılmalıdır Parçalama düzeneğinde (5.5) Kjeldahl balonu ısıtılır ancak, hazne içerisinde tüm siyah köpükler kalsın diye başlangıçta oldukça yavaş ısıtılır. İlk köpüklenme durduğunda ve bol miktarda beyaz buhar göründüğünde, hiç siyah partikül kalmayana kadar ve çözelti bariz soluk yeşil-mavi renk oluşuncaya kadar kuvvetli bir şekilde kaynatılır (Balonun boyun kısmının yarısının üstüne kadar asit buharı yoğunlaşacaktır). Daha sonra en az 1,5 saat süresince yavaşça kaynatılır. Aşağıdaki hususlara dikkat edilmelidir: (a) Berraklaşıncaya kadar parçalama işlemi için geçen süre bir saatten fazla olmamalıdır ve toplam parçalama süresi 2,5 saatten az olmamalıdır. Berraklığın elde edilmesinde bir saatten daha fazla zaman gerekli ise, toplam parçalama süresi bu doğrultuda arttırılmalıdır. (b) Potasyum sülfatın eklenmesi, karışımın kaynama sıcaklığını arttıracağı için parçalanmaya yardımcı olur. Artan H 2 SO 4 hacmi, parçalama süresi sonunda yaklaşık 15 ml den daha az ise, aşırı ısıtma nedeniyle azot kaybedilmiş olabilir. Gaz ile ısıtma yapılıyorsa, balon ısı yalıtımlı bir materyalin plakası üzerinde ısıtılır. Bu kısım, serbest alevin yalnızca balonun sıvı içeriğinin yüzeyinin altındaki kısmı ile temas eden bir çapa sahip dairesel açılış donanımlı olmalıdır. (c) Eğer siyah partiküller balonun boyun kısmına girerse ve kuvvetli kaynatma periyodunun başlangıç basamakları sırasında asit geri akışı ile hazne içerisine tamamen yıkama ile alınmıyorsa (bu balonun döndürülmesi ile sağlanabilir), balonun yeteri kadar soğuması sağlanır ve minimum miktarda su ile dikkatli bir şekilde yıkanır. Daha sonra yukarıda tarif edildiği gibi parçalamaya devam edilir Kjeldahl balonları soğuduğu zaman, balonun boynunun dikkatlice balon içine yıkanması için her birine 300 ml su eklenir (Bknz. Madde 6.3.Not) ve ayrılan kristallerin çözündüğünden emin olunana kadar içerik karıştırılır. Düzenli bir kaynama olması için bir miktar kaynama taşı (5.2) eklenir. Daha sonra her bir balona 70 ml sodyum hidroksit çözeltisi (4.4)

9 (Bknz. Madde 6.3.Not) haznenin içinde dip tabaka/alt faz oluşacak şekilde balonun boynundan eğimli olarak ilave edilir. Sodyum hidroksit çözeltisi le balonun boyun kısmının üstü ıslatılmaz. Not: Düzensiz kaynamanın (6.4) hemen öncesinde yaklaşık 150 ml distilat toplamak için toplam 370 ml su ve sodyum hidroksit çözeltisinin birleştirilmiş hacmi gereklidir. Bu nedenle, % 47 den (kütle/kütle) daha düşük konsantrasyonda sodyum hidroksit çözeltisinin daha fazla eşdeğer hacmi eklenirse, eklenen su hacmi buna göre azaltılmalıdır. Örneğin, 85 ml %40 lık (kütle/kütle) ya da 125 ml %30 luk (kütle/kütle) sodyum hidroksit çözeltisi eklenirse, eklenen su hacmi sırasıyla 285 ml ya da 245 ml olmalıdır Vakit kaybetmeden her bir Kjeldahl balonu distilasyon düzeneğine (5.6) bağlanır. Yoğuşturucunun dış tüpünün uç kısmı, 50 ml borik asit çözeltisi (4.5) ve 0,2 ml (5-6 damla) indikatör çözeltisi (4.6) içeren bir konik balon içerisine batırılır. Her bir Kjeldahl balonunun içeriği döndürülerek iyice karıştırılır ve kaynatılır, ancak aşırı köpürmeyi önlemek için başlangıçta yavaş ısıtılır ml distilat toplandığı zaman, yoğuşturucu dış tüpünün ucu 200 ml işaretinden yaklaşık 40 mm yukarda olacak şekilde her bir konik balon aşağı indirilir. Her bir distilasyona, düzensiz kaynama başlayana kadar devam edilir ve sonra hemen ısıtma durdurulur. Her bir Kjeldahl balonu uzaklaştırılır ve az miktarda su ile her bir yoğuşturucunun dış tüp ucu yıkanır, yıkama suyu konik balon içinde toplanır. Aşağıdaki gerekliliklere dikkat edilir: (a) Distilasyon hızı, düzensiz kaynama başladığı zaman yaklaşık 150 ml distilat toplanacak şekilde olmalıdır, her bir konik balonun içeriğinin hacmi daha sonra yaklaşık 200 ml olacaktır. (b) Her bir yoğuşturucunun verimi, distilasyon sırasında her bir konik balon içeriğinin sıcaklığı 25 o C yi geçmeyecek şekilde olmalıdır Her bir distilat, standart volumetrik çözelti (4.7) ile ph 4,6 ± 0,1 olana kadar titre edilir (ph metre kullanılır; istenirse, otomatik büret de kullanılır). İndikatörün eklenmesi, titrasyonun doğru ilerlediğini kontrol etmek için yardımcı olur. Her bir büretin okuması paralaks/kaçıklık hatasından kaçınmak için büyüteç (5.10) yardımıyla 0,01 ml hassasiyetinde yapılır. Titrasyon, sadece indikatör ile gerçekleştirilebilir. Distilatın rengi, 50 ml borik asit çözeltisi ve 0,2 ml indikatör içeren konik balona 150 ml su eklenerek hazırlanan çözeltinin rengine karşılık gelen bir renk olana kadar titre edilir Süt numunesi yerine işlem süresince yaklaşık 0,1 gram sakkaroz (4.8) ile birlikte 5 ml distile su alınarak Madde 6.1 ve Madde 6.5 arasında anlatıldığı şekilde bir kör analiz gerçekleştirilir. Not: Kör distilatın titrasyonu, standart volumetrik çözeltinin (4.7) yalnızca çok az bir miktarına ihtiyaç duyacaktır İşlemin doğruluğu, Madde 6.1 ve Madde 6.5 arasında anlatılan işlemlerin ardından iki geri alma denemesi kullanılarak düzenli olarak kontrol edilir Distilasyon sırasında aşırı ısıtma ya da mekanik kaçak sonucu görülen azot kaybının olmadığı, 0,1 gram sakkaroz (4.8) ile birlikte 0,001 gram hassasiyetle tartılan 0,15 gram amonyum okzalat ya da sülfat (4.9) kullanılarak kontrol edilir. Geri kazanılan azot yüzdesi %99,0-100,0 arasında olmalıdır. Daha düşük ya da daha yüksek sonuçlar, işlemde hataları ve/veya hatalı standart çözelti (4.7) konsantrasyonunu gösterir Tüm protein azotunun açığa çıkması için, parçalama işleminin yeterliliği; 0,2 g saf triptofan, 0,35 g fenasetin ya da 0,2 g lizin hidroklorit (4.10) in analiz birimi kullanılarak kontrol edilir. Tüm tartımlar, 0,001 g hassasiyetinde olmalıdır. Azotun en az %98-99 u geri kazanılmalıdır. 7. Güvenlik uyarıları Derişik sülfürik asit ve sodyum hidroksit ile çalışırken ve Kjeldahl balonunun tutulması sırasında her zaman laboratuvar önlüğü, güvenlik gözlükleri ve aside dayanıklı eldivenler kullanılmalıdır. Distilasyon sırasında, Kjeldahl balonları asla gözetimsiz bırakılmamalıdır. Olası tehlike için, eğer balon içeriğinde aşırı derecede patlamalar olursa hemen distilasyon durdurulur. Eğer enerji 2-3 dakikadan daha fazla süre çalışmaz ise, distilasyon ucu sıvının dışına çıksın diye toplama balonu aşağı indirilir. 8. Sonuçların ifade edilmesi 8.1. Formül ve hesaplama: Azot miktarı (WN), 100 gram üründe gram olarak azot cinsinden ifade edilerek aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanır: W N = 1,40(V V ) O c m Burada; WN = Azot miktarını, V = Belirlemede kullanılan standart volumetrik asit çözeltisinin mililitre olarak hacmini, V o = Kör analizde kullanılan standart volumetrik asit çözeltisinin mililitre olarak hacmini, c = Standart volumetrik asit çözeltisinin mol/l olarak ifade edilen konsantrasyonunu(4.7), m = Analiz biriminin gram olarak kütlesini ifade eder. Sonuç, 100 g başına 0,001 hassasiyet ile yuvarlatılır Kesinlik Tekrar edilebilirlik (r): 0,007 g/100 g Yeniden üretilebilirlik (R): 0,015 g/100 g 9. Modifiye işlemler 9.1. Parçalama düzeneği ve Kjeldahl balonları (Madde 5.5 ve Madde 5.1 de tarif edildiği gibi) yerine, silindirik balonlara bağlı bir blok parçalama düzeneği kullanılır. Bu durumda, potansiyel aksamayı tanımlamak için, her bir nokta ayrı ayrı kontrol edilmelidir (6.7) Balonları doğrudan ısıtmak yerine (6.4), buhar distilasyonu kullanılır. Düzenek distile suyun kullanımına izin vermediği zaman, suyun asit ya da baz uçucular içermemesine özen gösterilmelidir Süt numunesinden 5 gram yerine (6.1), 1 gram analiz birimi (semi-macro Kjeldahl) olarak kullanılabilir.

10 - Mineralizasyon (6.1) için kullanılan reaktif miktarları: H 2 SO 4, CuSO 4.5H 2 O, K 2 SO 4, aynı oranda düşer (1/5). - Toplam parçalanma süresi (6.2), 75 dakikaya düşer. - Sodyum hidroksit çözeltisi miktarı (6.3), aynı oranda düşer (1/5). - Daha düşük konsantrasyonda bir asit standart çözeltisi (4.7) kullanılmalıdır (0,02-0,03 mol/l). Not: Yalnızca tekrar edilebilirlik değeri (8.2.1) ve iki tane doğruluk testinin sonuçları (6.7), bu metotta verilen hükümler ile uyum içerisinde ise; bu seçeneklerin bir ya da daha fazlası kullanılır. V. Protein Miktarının Belirlenmesi Bu işlem, ısıl işlem görmüş sütlerde protein miktarının belirlenmesi için referans metodu belirtir. 2. Tanım Protein miktarı: Ek-2-IV de tarif edilen metot doğrultusunda belirlenen toplam azot miktarının uygun bir faktör ile çarpılması ile elde edilen ve kütlece yüzde olarak ifade edilen değerdir. 3. Hesaplama Kütlece yüzde olarak sütün protein miktarı = 6,38 x Sütün toplam azot miktarı yüzdesi VI. Özgül Kütlenin Belirlenmesi Bu işlem, çiğ süt ve tam yağlı süt, yarım yağlı süt ve yağsız sütün 20 o C de özgül kütlesinin belirlenmesi için referans metodu belirtir. 2. Tanım Sütün özgül kütlesi, 20 o C deki sütün bilinen hacminin kütlesinin aynı hacimdeki 20 o C deki suyun kütlesine oranıdır. 3. Prensip 20 o C de özgül kütle hidrometre ile belirlenir. 4. Araç ve gereçler Genel olarak kullanılan laboratuvar cihazları ve ayrıca aşağıdaki araç gereçler kullanılır: 4.1. Hidrometre Özgül ağırlık hidrometresi, alt kısmında ağır ve geniş bir cam haznesi bulunan bir araçtır. Üst kısmına bağlı ve eşmerkezli olarak yönelmiş silindirik şekilli cam çubuk vardır. Çubuğun üst kısmı kapalıdır. Cam hazne, hidrometre kütlesinin ayarlamak için tasarlanan kurşun, civa gibi yüklerle doludur. Çubuk, 1,025-1,035 g/ml aralığında derecelendirilmiştir. Hidrometre, hassas termometresi olan ve yaklaşık 100 ml kapasiteli piknometre kullanılarak piknometrik metot ile kontrol edilmelidir Silindirler (cam ya da paslanmaz çelik) Boyutları en az şu şekilde olmalıdır: -İç çapı yaklaşık 35 mm -İç yüksekliği yaklaşık 225 mm 4.3. Su banyosu, 20 ± 0,1 o C ye ayarlanmış Su banyosu, 40 ± 2 o C ye ayarlanmış Termometre, 0,5 o C aralıklarla derecelendirilmiş. 5. İşlem 5.1. Numune, yağın dağılması amacıyla tersyüz edilerek karıştırılır ve su banyosuna (4.4) yerleştirilir. Numune sıcaklığı 40 o C ye ulaştırılır ve bu sıcaklıkta 5 dakika bekletilir. Yağın homojen olarak dağıldığından emin olmak için dikkatli bir şekilde tersyüz edilerek iyice karıştırılır. İkinci su banyosunda (4.3), 20 o C ye soğutulur Numune, içine hava almasından kaçınılarak dikkatli bir şekilde tersyüz etmek suretiyle iyice karıştırılır. Süt, silindir (4.2) içerisine aktarılır, köpük ya da hava kabarcığı oluşumunu önlemek için eğik konumda tutulur. Hidrometre (4.1) içerisine yerleştirildiğinde silindirden bir miktar sütün akacağı düşünülerek yeterli miktarda süt numunesi kullanılır. Dikkatli bir şekilde hidrometre süt içerisine bırakılır ve denge konumuna gelene kadar serbest bir şekilde yüzdürülür. Silindir, dik konumda yerleştirilmiş olmalıdır. Hidrometre, sıvı kolonunun orta kısmında olmalıdır ve silindirin yan tarafları ile temas etmemelidir Hidrometre dengeye ulaştığı zaman menüsküsün üst noktasında ölçü işareti okunur Hidrometre okuması alındıktan hemen sonra, termometre (4.5) numune içerisine aktarılır ve 0,5 o C hassasiyet ile sıcaklık okunur. Sıcaklık, ± 20 o C den ± 2 o C den daha fazla sapma göstermemelidir. 6. Sıcaklık düzeltmesi 6.1. Süt numunesinin sıcaklığı, özgül ağırlığının ölçümü yapıldığı zaman tam olarak 20 o C değil ise, elde edilen sonuç 20 o C nin üzerindeki sıcaklıklar için belirlenen özgül ağırlığa her bir derecede 0,0002 eklenerek ya da 20 o C nin altındaki her bir derece için 0,0002 çıkarılarak düzeltilmelidir. Bu düzeltme, yalnızca süt numunesinin sıcaklığı 20 o C den 5 o C lik bir sapmadan daha fazla sapma göstermiyor ise; geçerlidir. 7. Sonuçların ifade edilmesi Süt numunesinin özgül ağırlığı hesaplama metodu ve formülü, aşağıdaki formüle göre 20 o C deki yağsız sütün g/ml sinde ifade edilir: 1000 mv MG mv 0,92mv(1000 MG) = MG mv 920 MG mv ,92

11 Burada; mv = Numunenin hidrometreden (5.4) okunan g/l olarak özgül ağırlığını, MG = Numunenin g/l olarak yağ miktarını, 0,92 = Yağın yoğunluğunu ifade eder. 8. Kesinlik 8.1. Tekrar edilebilirlik (r): 0,0003 g/ml 8.2. Yeniden üretilebilirlik (R): 0,0015 g/ml