REKOMBİNANT DNA TEKNİKLERİ IV DR. ONUR YILMAZ 2017

Transkript

1 REKOMBİNANT DNA TEKNİKLERİ IV DR. ONUR YILMAZ 2017

2 GEN TRANSFER YÖNTEMLERİ

3 DOĞAL YOLLARLA GEN AKTARIM YÖNTEMLERİ Konjugasyon Transformasyon Transdüksiyon Retroviral transdüksiyon Agrobacterium

4 KONJUGASYON (CONJUGATION) F (Fertilite) plasmidi olarak adlandırılan özel bir plazmide ihtiyaç vardır. F faktörü taşıyan hücreye donör (erkek- F+), taşımayan hücreye ise resipient (dişi) adı verilmiştir. F plasmidleri fertilite özelliklerini kodlayan 25 gen taşımaktadır. F faktörü taşıyan plasmidin cinsiyet pilusları dişi hücre ile birleşerek konjugasyon olayını meydana getirir.

5 Birleşen bu piluslar geçici bir sitoplazmik köprü meydana getirerek gen aktarımı sağlanmış olur. Transfer tamamlandığında iki adet donör (erkek) hücre meydana gelir. F+ plasmidi bakteriyal kromosomun içine entegre oldu ise bu hücreler Hfr hücre (yüksek frekanslı rekombinasyon hücresi)olarak adlandırılır.

6 Transformasyon, egzojen DNA nın hücre tarafından içeri alınması ve genoma entegre edilmesi olayıdır. Transformasyon bazı bakteri türlerinde doğal olarak meydana gelmektedir ancak diğer türlerde ancak yapay yollarla gerçekleştirilebilir. Serbest DNA yı içine alabilen bakterilere kompetant bakteri adı verilir. Kromozoma entegre olamayan DNA degrade olur

7 TRANSDÜKSİYON (TRANSDUCTION) Bir bakteriyofaj aracılığı ile vericiden alıcıya yapılan gen transferidir. Lysogenic döngü adapte olursa, faj kromozomu nesiller boyunca aktarılacak olan bakteri kromozomuna kovalent bağlarla entegre olur. Litik döngü yeni konakçının lizizi tarafından salgılanan faj partiküllerinin üretimine yol açar

8 RETROVİRAL TRANSDÜKSİYON Hayvan hücrelerine yabancı DNA aktarımı nispeten düşük başarıya sahiptir Bu nedenle gen transferinde virüsler potansiyel bir gen transfer vektörüdür. Retrovirüsler memelilerin de dahil olduğu birçok türde bulunmaktadır Retrovirüslerin genomu ekzojen DNA taşımak için manipüle edilebilir Konakçı hücreye viral genom entegrasyon stabilitesi retrovirüs vektörlerinin önemli avantajlarındandır.

9 Viral DNA'nın tek bi kopyasının konakçı genomunda rastgele olarak entegre olması aktarılan yabancı genin uzun süreli olarak ekspresyonuna olanak sağlar

10 Virusler fetüs, genç ve erişkin dokuları gibi çok gelişmiş dokularda kullanılabilir Bu durum somatik gen terapisi anlamında büyük umut vaat etmektedir. Retroviral vektörler ile Embriyonik kök hücrelere (ES) de aktarım yapılabilmektedir.

11 AGROBACTERİUM TUMEFACİENS Toprak bakterisi Bitkileri yaralanan kısımlardan hastalığı bulaştırır Kök tacı uru hastalığına sebep olur T-DNA transferi ile tümör oluşturur. Toprakta doğal olarak yaşayan, hareketli, çubuk şekilli (Basil) bir bakteri olup, Yaralanmış dokulardan organizmaya girerek tümör benzeri dokular oluşturur.

12 Başta böğürtlen, ahududu, tüm meyve ağaçları, pek çok çalı formu ve asmalarda, özellikle hanımeli ve gülgiller gibi odunsular, papatya,yıldız çiçekleri, krizantem gibi otsular ve sebzeler olmak üzere yaklaşık dikotilde ve otlar ve tahıllar gibi monokotillerde taç tümör (crown gall) oluşumuna neden olur.

13 T-DNA AKTARIMDA GEREKLİ OLAN ÖGELER T-DNA bölgesi Virülens (vir) bölgesi Bakteri kromozomlarında bulunan chva, chvb, psca ve attr genleridir

14 T-DNA BÖLGESİ T-DNA bölgesi çift sarmal Ti veya Ri plazmidi üzerinde bulunan ve bakteriden bitki hücresine aktarılarak bitkinin genomuyla birleşen küçük bir DNA parçasıdır Enfeksiyon sonucunda bitkinin genomik DNA'sına bir veya birden fazla T-DNA aktarılabilmektedir. T-DNA yaklaşık 23 kb uzunluğunda ve 13 adet gen bulundurmaktadır

15 T-DNA bölgeleri, sağ (RB/right border) ve soldan (LB/left border) 24 bp uzunluğundaki düzensiz nükleotid dizileri ile sınırlandırılmıştır. Bu diziler sınır dizileri olarak isimlendirilmektedir. Genelde, bu diziler arasında bulunan DNA bitki hücrelerine aktarılmaktadır. Bu diziler sınır dizileri olarak isimlendirilmektedir. Genelde, bu diziler arasında bulunan DNA bitki hücrelerine aktarılmaktadır

16 VİRÜLENS (VİR) BÖLGESİ Vir bölgesi, T-DNA aktarımında gerekli olan ürünlerin önemli bir kısmını sağlamaktadır. Bu bölgede meydana getirilen mutasyonların, bitki hücrelerine gen aktarımını önemli ölçüde engellediği bilinmektedir. Bu bölgenin, aynı bakteri hücresinde, ancak başka bir plazmid üzerinde bulunduğu zaman da T-DNA aktarımının gerçekleşebilmesi onun trans-hareket bir yapıda olduğunu göstermektedir

17 T-DNA nın dışında ve sol sınıra yakın olan, yaklaşık kb uzunluğundaki virulens (vir) bölgesi T-DNA aktarımında mutlak gerekli olan 6 ana operon (VirA, VirB, VirC, VirD, VirE ve VirG) ve gerekli olmayan diğer 2 operon (VirF ve VirH) dan meydana gelmektedir. VirA ve VirG operonları vir genlerinin aktivitelerini yönlendiren pozitif bir düzenleyici sistemini kodlamaktadır. VirA geninin üretmiş olduğu hücre içi membran proteini yaralanmış bitki hücrelerinin salgıladığı fenolik bileşikleri tanıyarak onlarla bağlantı kurar.

18 Daha sonra VirA geni, muhtemelen protein fosforilasyonu ile bu bilgiyi VirG lokusuna aktarır. Sonuçta, uyarılan VirG proteini ise kendi geni ve diğer vir genleri için transkripsiyon işlemcisi görevini üstlenmektedir. VirD operonu, T-DNA iplikciğinin rejenerasyonunu sağlarken; VirC, bu bölgenin sınırlardan kesilmesinde, VirB ve VirE operonları ise T-DNA nın bakteriden bitki hücresine hareketinde etkili olmaktadır.

19

20 Fiziksel Yöntemler YAPAY YOLLARLA DİREK OLARAK GEN AKTARIM YÖNTEMLERİ Kimyasal Yöntemler Elektriksel Yöntemler Pronüklear Mikroenjeksiyon Kalsiyum Fosfat Yöntemi ile transfer Polyethylene Glycol aracılığı ile transfer Elektroporasyon Biyolistik Transformasyon Liposome aracılığı ile transfer

21 FİZİKSEL YÖNTEMLER

22 PRONÜKLEAR MİKROENJEKSİYON (PRONUCLEAR MİCROİNJECTİON) Mikroenjeksiyon, mm ölçülerinde olan cam veya ince iğneler ile DNA nın hücre veya protoplast içerisine aktarılması işlemidir. Tekniğin etkinliğini artırmak için bilgisayar destekli pipetler geliştirilmiştir. Pronüklear mikroenjeksiyon teknolojisinin, hayvan uygulamalarındaki başarısı yöntemin insan embriyolarına gen aktarımı içinde uygulanabilir olduğunu ortaya koymaktadır

23 UYGULAMA Mikroenjeksiyon yönteminde transfer edilecek genin iki temel bölgeden oluşacak şekilde hazırlanması gerekmektedir. 1. Bölge Exon-Intron (Transkripsiyonel Ünite) 2. Bölge Gen ekspresyonunu düzenleyen Promotor, enhancer, reporter bölgeleri

24 Promotor bölgeler: Transgenin ekspresyon göstereceği bölgeleri ve zamanı belirleyen düzenleyici dizilerdir. Enhancer bölgeler: Bulunduğu genin transkripsiyonunu arttıran dizilerdir. Reporter Bölgeler: Protein kodlayan dizilerdir ve translasyon başlama kodunu, transgen sonlandırma kodonu ile kozak dizisi olarak adlandırılan özel dizilerden oluşurlar

25 Mikroenjeksiyon zamanı ve uygulama bölgesi oldukça önemlidir. Mikroenjeksiyon aşamasında dişi ve erkek pronükleusunun görünür halde olması ve bir hücreli aşamadaki embriyoların seçilmesi gerekmektedir.

26 Mikroenjeksiyonun dişiye göre ortalama iki kat büyüklükteki erkek pronükleusa 1-2 pikolitre olacak şekilde yapıldığı ve pronükleusun iki katı büyüklüğe ulaşmasının mikroenjeksiyonun başarılı bir şekilde gerçekleştirildiğini göstermektedir. Aktarım başarısını etkileyen önemli diğer parametrenin Mikroenjekte edilen genin konsantrasyonu (yüksek konsantrasyon embriyoların ölümüne sebep olabilmektedir). Ortam Sıcaklığı Mikroenjekte embriyoların taşıyıcı dişilere aktarımı

27 AVANTAJLAR Proses bitki hücrelerinde de uygulanabilir ancak yaygın olarak hayvan hücreleri için tercih edilmektedir. Hızlı transgenik hayvan üretiminde ideal bir tekniktir. Genin aktarımında, genler genoma birkaç ile yüzlerce kopya arasında değişen sayıda rastgele bölgelerden entegre olmaktadır Aktarılan gen kalıtsal yolla anadan yavruya aktarılabilmektedir. Diğer yöntemlere göre DNA'nın kararlı entegrasyon sıklığı daha iyidir. Aktarılan DNA daha az değişime maruz kalır.

28 YÖNTEMİN KISITLAYICI YÖNLERİ Pahalı olması, Deneyimli personel ihtiyacı, Hayvansal hücreler için daha uygun olması Manipülasyon için embriyonik hücrelerin tercih edilmesi Oositlerin doğru zamanda alınabilmesi amacıyla çiftleşme takibi ve kayı tutma Protoplast için uygundur. Hücre duvarına sahip hücrelerde uygulanamaz İşlem rastgele entegrasyona neden olmaktadır.

29 BİYOLİSTİK (BİOLİSTİCS TRANSFORMATİON) (PARÇACIK BOMBARDIMANI) Biyolistik olarak da bilinen, parçacık bombardımanı tekniği, daha çok bitki hücreleri için kullanılan fiziksel gen transferi tekniğidir Yüksek düzeyde hızlandırılmış mikrotaşıyıcı adı verilen metal partiküller aracılığı ile, DNA nın hedef dokulara aktarılmasıdır. Agrobacterium tumefaciens aracılığıyla gen aktarımının zor olduğu çfit çenekli bitkilerde gen aktarımında kullanılmaktadır.

30 Bitki hücrelerinin sahip olduğu hücre duvarı, gen transferi işlemleri için bir engel niteliğindedir. Bu teknik ile hücre duvarını yok etmeden yabancı DNA yı hücre içine aktarmak hedeflenmiştir.

31 Bu yöntem, basit olarak, DNA ile kaplanmıs olan parçacıkların, hızlandırılarak hücre içine aktarılmasını kapsamaktadır. Kullanılan parçacık türü genellikle, tungsten veya altındır.

32 DNA İLE KAPLANMIŞ PARÇACIKLARIN HAZIRLANMASI 30 μl altın stoğu (1 μm lık) ve 30 μl DNA karıştırılır ve 1 dakika vorteks 20 μl spermidine(0.1 M lık) ve 50 μl CaCl2 (2.5 M lık) eklenir ve 1 dakika vorteks Altın ile karışması ve yerleşmesi için santrifüj Sıvı kısım ayrıştırılır, pellete dikkat edilerek, etanol(%100) ile yıkanır Tekrar santrifüje maruz bırakılır ve sıvı kısım ayrıştırılır Örnek 90 μl Ethanol(%100) ile yeniden süspanse edilir ve 2 saniye sonifikasyon. Tüplere hafifçe vurarak ve ışık kaynağı altında, tüplerin içinde DNA kümelenmesi olmadığından emin olunur Hazırlanan örnekten, bir atım için 5μl örnek kullanılması yeterlidir.

33 Bu partikül bombardımanı metoduyla DNA fragmanı yerine faj, bakteri vb hedef dokuya aktarılabilir. Yüksek moleküler DNA transferi kolaydır

34 KİMYASAL YÖNTEMLER

35 KALSİYUM FOSFAT YÖNTEMİ İLE GEN TRANSFERİ Transfeksiyon izole edilmiş DNA, kalsiyum klorid ve potasyum fosfat ile karıştırılarak uygun koşullar altında Kalsiyum fosfat formunda çökelmesini kapsamaktadır. Hücreler daha sonra, çökelen DNA ile bir çözelti yada doku kültürü içeren petri kaplarında inkübe edilir. Hücreler endositoz ile kalsiyum fosfat ile çöktürülmüş DNA'yı bünyesine alır.

36 Kalsiyum fosfat kullanılarak gerçekleştirilen transfeksiyon oldukça düşük bir verimliliğe sahiptir (% 1-2) Verimlilik yüksek saflığa sahip DNA kullanımı ve çöktürme işleminin yavaş yapılması ile bir miktar yükseltilebilir. Çeşitli manipülasyonlar ile eksogen DNA nın hücre içine aktarılmasındaki verimliliği %20 ye kadar artırmak mümkündür.

37 POLYETHYLENE GLYCOL (PEG) ARACILIĞI İLE GEN TRANSFERİ Protoplastlara gen aktarımında kullanılan en yaygın ve en eski metot protoplastları DNA ile birlikte PEG ile muamele etmektir. PEG sitoplazmik membranda dönüşümlü geçirgenliğe sebep olmakta ve bu yolla makro molekülerin aktarımı sağlanmaktadır. Bu yöntem ile çok az sayıda transforme olmuş bitki elde edilebilmektedir.

38 LİPOZOMLAR ARACILIĞI İLE GEN TRANSFERİ Lipozomlar hücre içine molekülleri taşımak için kullanılan lipit küreleridir. Bunlar aktarılacak geni içeren eksogen materyaller için taşıma ajanları olarak görev yapan çift katmanlı yapay lipit keseciklerdir. Yabancı DNA lipozom adı verilen küresel çift tabakalı yağ molekülleri ile kaplanır. PEG varlığında konak hücrenin protoplastlarının plazma zarları lipozom ile birleşir. Birleşme sonucu DNA sitoplazmaya ulaşarak genoma girer

39 ELETRİKSEL YÖNTEM

40 ELEKTROPORASYON (ELECTROPORATİON) Elektroporasyon yönteminde elektrik impulsları kullanılarak plasma membranında makromoleküllerin hücre içerisine aktarılmasına olanak sağlayan geçici porlar oluşturulur.

41 Memelilerde transgenesis bakımından elektroporasyon embriyonik kök hücrelere yabancı DNA fragmanı aktarımının en etkili yoludur. Bu yöntemle hayvan hücreleri, bitki, maya, ve bakterial protoplastlara DNA aktarımı gerçekleştirilebilmektedir. Elektroporasyon bakteri hücrelerinin transformasyon etkinliğini artırmak için kullanılabilmektedir. Bu yöntemle buğday, mısır, pirinç ve tütün %1 frekansa kadar stabil bir transformasyon gerçekleştirilebilmektedir.

42 Alıcı hücreler ve bu hücrelere aktarılacak moleküller solüsyonda süspansiyon halindedir Tipik olarak elektroporasyon için bir akımda bir mikrosaniye bir mili saniye arasında V/cm gereklidir. Aktarım gerçekleştikten sonra aktarımın olup olmadığı marker genler aracılığı ile kontrol edilir. Aktarımın gerçekleştiğinden emin olduktan sonra reporter genler ile ekspresyon varlığının tanımlanması (ateş böceği lusiferazı)

43