(KESİN RAPORU) ANKARA ORTAMLARINDA FARKLI PARAMETRELER İLE PROJE KODU: 21/

Transkript

1 GAZİ ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ (KESİN RAPORU) ZP3 PROTEİN YAPISININ ÇEŞİTLİ ÇÖZELTİ ORTAMLARINDA FARKLI PARAMETRELER İLE MOLEKÜLER DİNAMİK SİMÜLASYON ÇALIŞMASI PROJE KODU: 21/ PROJE YÜRÜTÜCÜSÜ: YARDIMCI ARAŞTIRMACI: Prof. Dr. E. Arzu KOÇKAYA Araş. Gör. Yusuf ŞİMŞEK ANKARA

2 ÖZET ZP3 Protein Yapısının Çeşitli Çözelti Ortamlarında Farklı Parametreler ile Moleküler Dinamik Simülasyon Çalışması ZP3 proteinine ait 3D4C kodlu protein protein data bank sitesinden elde edilerek, farklı çözelti ortamlarına yerleştirerek üç değişik sıcaklıkta moleküler dinamik hesaplamaları yapılmıştır. Bu hesaplamaları gerçekleştirmek için protein simülasyon çalışmalarında kullanılan gromacs programı kullanılmıştır. Protein saf su ve tuzlu su olmak üzere iki farklı çözelti ortamına konmuştur. Sıcaklık ise 290K, 300K ve 310K olarak alınmıştır. Hesaplamalar sonucunda protein yapının hazırlanan ortamlarda kararlılığı ve yaptığı yapısal değişiklikler analiz edildi. Yapılan analizlerde saf su ve tuzlu su ortamının protein yapısına farklı etki yaptığı ve sıcaklık ile de değişken davranışlarda dulunduğu tespit edilmiştir. Anahtar kelimeler: zp3, moleküler simülasyon, moleküler dinamik, gromacs. 2

3 ABSTRACT Molecular Dynamics Simulation Study of ZP3 Protein in Various Solutions with Different Parameters Once obtained 3D4C coded protein file from protein data bank website, molecular dynamics simulation calculations were studied for different parameters in various solutions. In order to study, gromacs program which is most applicable for protein simulations was used. Protein was placed into two different solutions (pure water and salty water). Temperatures were set to 290K, 300K and 310K values. After calculations, stability of protein in various media and structural changes with different temperatures were analysed. Different effects of pure water and salty water on protein have been observed. Also temperature variety shows us some structural shifts for different solvents. Key words: zp3, molecular simulation, molecular dynamics, gromacs. 3

4 İÇİNDEKİLER 1 GİRİŞ Protein Yapısının Belirlenmesi Deneysel Yaklaşımlar Teorik Yaklaşımlar Protein Dinamik Simülasyon ZP3 Proteinine ait moleküler yapılar TEORİ Bilgisayar ile Simülasyon Metodları Atomsal Bilgisayar Simulasyon Statik Metod Monte-Carlo Metod Moleküler-Dinamik Metodu Örgü-Dinamiği Metodu Deneysel Kuvvet Alanı Modelleri Basit Moleküler Dinamik Kuvvet Alanı Bağ Potansiyeli Bağ Açısı Potansiyeli Bağ Bükülme Potansiyeli Elektrostatik Potansiyel

5 2.3.6 Van der Waals Potansiyeli MATERYAL ve METOD Gromacs Programı PyMol Programı VMD Programı Gromacs Programının İş Akış Şeması pdb2gmx Programı editconf Programı genbox Programı genion Programı grompp Programı mdrun Programı Simülasyonun Hesaplanmasında Kullanılan Programlar ve Yönergeler SONUÇLAR Önçalışma Sonuçları Saf Su Ortamındaki Analizler Tuzlu Su Ortamındaki Analizler Genel Yapısal Analiz RMSD Davranışları Dönme Davranışı Protein Hareketleri K Saf Su Ortamı K Saf Su Ortamı K Saf Su Ortamı K Tuzlu Su Ortamı

6 K Tuzlu Su Ortamı K Tuzlu Su Ortamı

7 ŞEKİLLERİN LİSTESİ 1.1 3D4C kodlu proteine ait yapısal şekiller D4G kodlu proteine ait yapısal şekiller EF7 kodlu proteine ait yapısal şekiller NK3 kodlu proteine ait yapısal şekiller NK4 kodlu proteine ait yapısal şekiller Moleküler dinamik simülasyon tekniğinin genel hesaplama şeması MC adıma göre enerji değişimi Atomik bilgisayar teknikleri yöntemlerine ait diyagramsal gösterim [1, s. 6] Atomlar arasındaki etkileşimler İki atom ve arasındaki fiziksel yay İki bağ arasındaki açı ve fiziksel yay Ortadaki bağın bükülmesi Elektriksel etkileşim Van der Waals etkileşimi PyMol programı VMD programı

8 3.3 Su ortamında çözülmüş çeşitli atomlardan oluşan yapının moleküler dinamik simülasyon iş akışı şeması Potansiyel enerji değişimi Hesaplamalar üç farklı sıcaklık için yapılmıştır ve sistemin sıcaklığı hesaplamalar boyunca sabit kalması sağlanmıştır Üç farklı sıcaklık oranında yoğunluk değişimi Her üç farklı sistem için basınç değişimi birbirine çok yakındır Tuzlu su ortamında potansiyel enerji değişimi Tuzlu su çözeltisinde sıcaklık değişimi Tuzlu su çözelti ortamında yoğunluk değişimi Tuzlu su ortamında basınç değişimi Farklı çözelti ortamında basınç değişimi (290K) K sıcaklığında RMSD davranışı K sıcaklığında RMSD davranışı K sıcaklığında RMSD davranışı Saf su ortamında farklı sıcaklıklarda RMSD davranışı Tuzlu su ortamında farklı sıcaklıklarda RMSD davranışı K sıcaklığında dönme davranışı K sıcaklığında dönme davranışı K sıcaklığında dönme davranışı Saf su ortamında farklı sıcaklıklarda dönme davranışı Tuzlu su ortamında farklı sıcaklıklarda dönme davranışı

9 BÖLÜM 1 GİRİŞ 1.1 Protein Yapısının Belirlenmesi İnsan ve birçok diğer türün genomik dizisinin tamamlanması ile proteinler üzerinde çalışmalar, genetik ürünlerin, hayatın ve genlerin yorumlanması üzerinde son zamanlarda çok önemli bir yere sahip olmuştur. Bununla birlikte, proteinlerin anlaşılması, fonksiyonları ve 3-boyutlu yapılarını belirleme konusunda teknik zorluklar hala mevcuttur. Protein yapılarının belirlenmesi deneysel ve teorik çalışmalar ile birlikte devam etmektedir [2, s. 9] Deneysel Yaklaşımlar Proteinlerin istenilen çözünürlükte yapısını gözlemlemede doğrudan fiziksel imkan mevcut değildir. Mantıklı olan yapıların verilerini dolaylı olarak elde etmek için bazı deneysel yaklaşımlar kullanılır. X-ışını kristalografisi ile proteinler için x-ışını kırınım verisi elde edilir ve bu veri elektron yoğunluğu dağılımını bulmak için kullanılır. Bu yoğunluk dağılımı dolaylı olarak protein yapısı konusunda bilgi verir. Ayrıca nükleer manyetik rezoanas 2

10 tekniği ile proteinin çekirdek dönüşünün (nükleer spin) manyetik resonans spektrumu belirlenir ve bu veriler kullanılarak atomlar arasındaki eşleşmeler ve koordinatsal yerleşimler dolaylı olarak elde edilir. Bu bahsedilen iki deneysel yaklaşımlarda bilgisayarlı hesaplama teknikleri, protein yapısı için veri toplamada, analiz etmede ve en son yapısını oluşturmada çok önemli bir yere sahiptir. X-ışını kristallografi ve NMR spektroskopi teknikleri protein yapısını belirlemede büyük öneme sahiptir. Bütün yapısı belirlenen proteinler web ortamında Protein Data Bank (PDB) toplanmaktadır ve kullanıcılara sunulmaktadır. Burada yapılan çalışmaların %80 i x-ışını kristallografisi, %15 i NMR spektroskopisi ve kalan %5 i diğer yaklaşımlar kullanılarak elde edilmiştir. Deneysel yaklaşımlarda çeşitli kısıtlamalar vardır. X-ışını kristallografisi için proteinin kristalleştirilmesi gerekmektedir. Bu kristalleştirme işlemi çok uzun zaman gerektiren ve çoğunlukla başarısızlıkla sonuçlanan bir süreçtir. Yeterli ve doğru veri elde edebilmek için, NMR deneyinde kullanılan protein örneği bir kaç yüz kalıntı (rezidü) sayısından daha azdır. Dolayısıyla bu yöntem yüzlerce, binlerce proteinin yapısal verilerini yeterli bir şekilde belirleme konusunda uygunluğunu yitirmektedir [2, s. 9-10] Teorik Yaklaşımlar Teorik yaklaşımlar protein yapısını belirlemede tamamlayıcı ve alternatif çözümler olarak sıklıkla kullanılmaktadır. Bu yaklaşımlar fiziksel yasalar üzerinden yapılmaktadır ve dolayısıyla sıfırdan teorik (ab initio) yaklaşımlar olarak adlandırılır. Örneğin, proteinin hareketi kuvvet alanı ve klasik mekanik denklemlerin çözümü ile hesaplanması yani moleküler dinamik simülasyon yapılması. İdeal olanı, protein katlanmasının 3

11 tümünün simülasyon yapılması eğer mümkün ise, simülasyon proteinin denge durumuna ulaştığında proteinin katlanmış yapısını gözlemleyebilmek gereklidir. Malesef, proteinin katlanması hesaplamaları uzun süreç gerektirmektedir ve yeterli zamanda çözüme ulaştırılması günümüzün yazılımsal teknikleri ile mümkün gözükmemektedir. Başka bir yaklaşım protein katlanmasının fiziksel işlevini gözardı edip, doğrudan proteinin doğal katlanmasını uyarlanabilir uzayında optimize edilmiş algoritmalar kullanarak araştırmaktır. Bu yaklaşım proteinin katlanmış yapısının minimum potainsiyel enerjiye sahip olmasını varsayar. Dolayısıyla proteinlerin minimum enerji veren yapıları aranmaktadır. Proteinin doğal katlanımı potansiyel enerjinin global minimum seviyesini karşılamalıdır [2, s ]. 1.2 Protein Dinamik Simülasyon Proteinin yapısı sadece katlanma esnasında değil ayrıca denge durumunda da dinamik olarak değişmektedir. Belli bir zaman aralığında bir proteinin yapısındaki uyumlu değişimler genellikle dinamik özellikler olarak adlandırılırken, denge durumunda iken proteinin ortalama davranışına da termodinamik özellikler olarak adlandırılır. Birçok durumlarda, proteinlerin dinamik ve termadinamik özellikeri yapısal çalışmaları için çok önemlidir. Çünkü bu tür çalışmaları deneysel olarak yapmak çok zordur [2, s ]. Proteinin dinamik simülasyonunu yapmak için iki yol vardır. İlki Monte-Carlo yöntemdir. Bu yöntemde proteinin fiziksel durumunun çok miktarda rastgele modellerini ortaya çıkarmak amaçlanmıştır ve proteinin genel davranışı elde edilen modellerin değerlendirilmesiyle analiz edilir. Diğer yöntem ise parçacıkların hareketinin simülasyonunu temel almaktadır 4

12 ve atomlar için zamana bağlı klasik mekanik denklemlerinin çözülmesiyle mümkün olmaktadır. Çözümlerin sonucunda proteinin faz uzayının yörüngesini ve çeşitli dinamik özelliklerini analiz etmek mümkün olmaktadır [2, s. 14]. 1.3 ZP3 Proteinine ait moleküler yapılar ZP3 proteinine ait farklı çözünürlükte yapılar mevcuttur. x-ışınımı kırınım teknikleri ile elde edilmiştir [3]. Bu yapılar (a) Küresel (b) Kartonsal (c) Çubuksal (d) Yüzeysel Şekil 1.1: 3D4C kodlu proteine ait yapısal şekiller. 5

13 (a) Küresel (b) Kartonsal (c) Çubuksal (d) Yüzeysel Şekil 1.2: 3D4G kodlu proteine ait yapısal şekiller. 6

14 (a) Küresel (b) Kartonsal (c) Çubuksal (d) Yüzeysel Şekil 1.3: 3EF7 kodlu proteine ait yapısal şekiller. 7

15 (a) Küresel (b) Kartonsal (c) Çubuksal (d) Yüzeysel Şekil 1.4: 3NK3 kodlu proteine ait yapısal şekiller. 8

16 (a) Küresel (b) Kartonsal (c) Çubuksal (d) Yüzeysel Şekil 1.5: 3NK4 kodlu proteine ait yapısal şekiller. 9

17 BÖLÜM 2 TEORİ Şekil 2.1: Moleküler dinamik simülasyon tekniğinin genel hesaplama şeması. Şekil 2.1 yapıya göre, moleküler dinamik hesaplama yapabilmek için ilk önce bazı giriş bilgilerine ihtiyaç vardır. Bu bilgiler etkileşim modeli yani potansiyel enerji fonksiyonu ve atomların ilk pozisyonlarından oluşmaktadır. Potansiyel enerji fonksiyonu atomik yapıya ve atom cinslerine göre değişen bir matematiksel ifadedir. Bu ifadenin türevi bize kuvvet hesaplamızı sağlar. Atomların ilk pozisyonları x, y, z koordinat düzleminde yerleştirilmesiyle 10

18 oluşturulur. İlk yerleştirmede atomlar asıl olması gereken yerde değillerdir. Enerjiyi minimize etme hesaplamasında atomlar kımıldayarak en uygun ve en düşük enerjili koordinatlara yerleşmeye zorlanırlar. Hesaplama işleminde giriş bilgileri alındıktan sonra ilk önce her atoma düşen kuvvetler, potansiyel enerji fonksiyonunun gradyant (düşüm) türevi alınarak hesaplanır. Kuvvetler hesaplandıktan sonra Newton nun ikinci kanunu dikkate alınarak her atoma ait ivmeler bulunur. Hız vektörleri ise ivme ve moleküler dinamik adım zamanı yardımı ile bulunur. Artık, atomlar yeni pozisyonlarına elde edilen hız bilgileriyle yerleştirilir ve tekrar potansiyel enerji fonksiyonu dikkate alınarak döngü sistemin toplam potansiyel enerjisinin sabitleşmesine kadar ilerletilir. Moleküler dinamik simülasyon teknikleri, şekil 2.1 de gösterilen izlenceye göre özetlemek mümkündür. 2.1 Bilgisayar ile Simülasyon Metodları Bilgisayar simülasyon metodlarında, birbirleriyle etkileşen atomların özelliklerini potansiyel enerji fonksiyonu yardımıyla bulma yöntemlerini içerir. Potansiyel enerji fonksiyonu nötr elektirik enerji durumundaki atomların davranışını çekirdek koordinatları fonksiyonu cinsinden tanımlamak için kullanılır. Bu potansiyel enerji fonksiyonu yarı-deneysel veya tam-deneysel sonuçlar kullanılarak modellenir. Bir kere, sistemin temel fiziksel davranışı potansiyel enerji fonksiyonuna giydirildiğinde, yüksek miktarda sayısal hesaplamalar etkileşen atomların temel yapısal, enerjisel ve dinamiksel davranış özelliklerini ortaya çıkarmak mümkün olur. Bu yöntem bilgisayarla simülasyon metodları olarak bahsedilir. Bu metodun uygulanamabilmesi için üç temel öğeye ihtiyaç vardır [1]. 11

19 1. Sistemdeki atomsal etkileşimi tanımlayan bir adet potansiyel enerji fonksiyonu, 2. Yüksek hızlı bilgisayarlar yardımıyla, potansiyel enerji fonksiyonunu kullanarak temel atomik yapıyı, enerjiyi ve dinamik özellikleri hesaplamak için yinelemeli sayısal algoritmalar, ve 3. Temel miksorkopik sonuçları karşılaştırma ve yorumlamak için istatistiksel terimler 2.2 Atomsal Bilgisayar Simulasyon Temel olarak dört adet atomsal bilgisayar simülasyon yaklaşımı kullanılmaktadır [1]. 1. Statik 2. Monte-Carlo 3. Moleküler dinamik 4. Örgü-dinamiği Statik Metod Statik yöntem bu bahsedilen dört metodun en basit olanıdır. Atomlara etkiyen kuvvet potansiyel enerji fonksiyonu ve giriş koordinatları kullanılarak denklem 2.1 ile bulunur. F i = i Φ (2.1) Tüm atomlar üzerine etkiyen net kuvvet yönünde yerdeğiştirirler. Bu yerdeğiştirme miktarı atomun üzerine düşen kuvvet ile orantılı olacaktır. 12

20 Böylece atomlar ilk pozisyonlardan yerel minimum noktalarına gradyantı üzerinde zigzag çizerek yerleşirler. Statik metod sadece yerel kararlı minimumları bulmaya elverişlidir ama tüm termodinamik hesaplamalar için uygun değildir Monte-Carlo Metod Sabit sıcaklığın sınırlanması şu şekilde gerçekleştirilir. Atoma küçük miktarda rastgele bir yerdeğiştirme uygulanır ve potansiyel enerji fonksiyonu kullanılarak enerjideki değişime bakılır. Bu yerdeğiştirme sonucunda, eğer Φ negatif ise bu yerdeğiştirme uygun görülür ve yeni yerleşimler olarak kaydedilir. Eğer Φ pozitif ise Boltzman faktörü, e Φ/kT, istenilen sıcaklı için hesaplanır. Daha sonra bu Boltzman faktörü Metropolis şartı ile karşılaştırılır ve (0 1) aralığındaki rastgele elde edilen değerden büyük olursa bu yerdeğiştirme kalbul edilir eğer küçükse daha önceki yerdeğiştirme tekrar dönülür [1, s. 2], [2, s. 15]. Monte-Carlo Metodu için işlem özeti: Φ = Φ(r 1, r 2, r 3,..., r N ) E (2.2) 1. Koordinatlar seçilir ve enerji E 1 hesaplanır. 2. Atomların koordinatları rastgele olarak değiştirilir ve tekrar enerji E 2 hesaplanır. 3. Eğer E 2 < E 1 ise, bu yeni yerdeğiştirmeler kabul edilir ve E 1 = E 2 alınır ve 2. adıma tekrar dönülür. 4. Eğer E 2 > E 1 ise, Metropolis şartı kontrol edilir. Eğer şart sağlandı ise E 1 = E 2 alınır ve yeni yerleşimler kabul edilerek 2. adıma tekrar 13

21 dönülür. Sağlanmadı ise ilk yerleşime tekrar dönerek 2. adımdan tekrarlanır. Şekil 2.2: MC adıma göre enerji değişimi Moleküler-Dinamik Metodu Φ = Φ(r 1, r 2, r 3,..., r N ) E (2.3) F i = i Φ (2.4) F i = m i dv i dt (2.5) 1. Koordinatlar seçilir ve enerji E 1 hesaplanır. 2. Verilen sıcaklıkta (T ) Maxwell dağılımını dikkate alarak hızların belirlenmesi {V i }. 14

22 3. Atomları dt süresini ve hızını dikkate alarak yeni yerlere öteleme yapılır ve yeni enerjileri hesaplanır. 4. Denklem 2.4 kullanılarak kuvvetler, denklem 2.5 kullanılara hızlar hesaplanır. Adım 2 ye veya 3 e dönülür. Sabit sıcaklık için sıcaklık hız hesabından sonra yeniden ayarlanır. Eğer gevşeme (ralaksasyon) yapılacaksa yeniden sıcaklık ayarlamasına gerek yoktur Örgü-Dinamiği Metodu Bu metod yukarıda bahsedilen üç metoddan farklıdır. Atomik hareket için harmonik fonksiyonlar cinsinden analitik gösterimler kullanılır. Monte-Carlo veya moleküler dinamik yöntemlerine göre karşılaştırdığımızda bazı sınırlamalar mevcut olmasına karşın faz uzayı analitik olarak integrali alınabilmektedir. Dolayısı ile entropi ve ilgili özellikler direk olarak elde edilebilir. Yukarıda bahsedilen yöntemlere ait yerel minimumlara ulaşım statik metod için şekil 2.3a, Monte-Carlo için şekil 2.3b, moleküler dinamik yöntem için şekil 2.3c ve örgü dinamiği yöntemi için şekil 2.3d ile gösterilmiştir [1, s. 3]. 15

23 (a) Statik yöntem (b) Monte-Carlo Yöntemi (c) Moleküler dinamik (d) Örgü dinamiği Şekil 2.3: Atomik bilgisayar teknikleri yöntemlerine ait diyagramsal gösterim [1, s. 6]. 2.3 Deneysel Kuvvet Alanı Modelleri Moleküler dinamik çalışmalarında kuantum mekanik hesaplamaları çok önemli bir yere sahiptir, çünkü kuantum mekanik elektronların da etkisini göz önünde bulundurmaktadır ve arzu edilmesine rağmen kantum mekanik hesaplamaları bilgisayar açısından çok miktarda iş yükü çıkardığı için şu anki imkanlar çerçevesinde pek tercih edilen bir yöntem değildir. Kuvvet alanları metodu (moleküler mekanik) elektronların hareketini yok sayar ve sistemin enerjisini, her bir atomun tümünü bir parçacık olarak kabul edip 16

24 hasaplamarı yapar. Bu yöntemle çok sayıda atom kullanılarak moleküler dinamik hesaplamaların yapılabilmesi mümkündür. Bazen kuvvet alanını kullanarak yapılan çalışmalar kuantum makanik hesaplamaları kadar doğru sonuç vermektedir. Moleküler dinamik yönteminin kauntum mekanik karşısında çok miktarda atom kullanma ve hızlı iş yapma gibi avantajalarının yanında elektronik özelliklerin belirlenmesi konusunda herhangi bir şey yapılamamaktadır [1, s. 15] Basit Moleküler Dinamik Kuvvet Alanı Moleküler sistemler için günümüzde kullanılan kuvvet alanları iç ve dış kuvvetler olarak dört temel bileşende toplamak mümkündür. Enerji hesaplamalarında bazı kısıtlamalar mevcuttur, bunlar atomlar arasındaki bağlarda oluşan açısal değerlerin denge ve referans değerlerinden sapması ile ilgilidir. Kuvvet alanı fonksiyonunda, bu açısal ifadeler bağlar dönerek büküldüğünde sistemin enerjisindeki değişmeyi ifade eder. Daha karmaşık kuvvet alanı fonksiyonunda bağ gerilmesi, bağların kıvrılması, bağların bükülmesi ve kendi aralarında bağ yapmamış sistemin elektrostatik etkileşimlerini belirten ifadelere yer verilir. Tüm bu dört etkileşimi denklem 2.6 deki gibi ifade edebiliriz ve bu etkileşimler şekil 2.4a, 2.4b, 2.4c ve 2.4d deki gibi resimlendirmek mümkündür [2, s. 100]. ψ(r N ) = baglar + acılar + + bukulme N i=1 j=i+1 k i 2 (l i l i,0 ) 2 k i 2 (θ i θ i,0 ) 2 V n (1 + cos(nω γ)) 2 N (4ε ij )[( σ ij ) 12 ( σ ij ) 6 ] + r ij r ij 17 q iq j 4πε 0 r ij ) (2.6)

25 (a) Bağların gerilmesi (b) Bağları eğilmesi (c) Bağların bükülmesi (d) Elektriksel etki Şekil 2.4: Atomlar arasındaki etkileşimler Bağ Potansiyeli İki atom bir kimyasal bağ ile bağlantılı duruma geldiği zaman aralarındaki mesafe belli bir ölçüye sınırlanır. Bu iki atom arasındaki etkileşim bağ uzunluk potansiyeli ile belirlenir bu potansiyel genellikle ikinci dereceden bir denklemdir. Fiziksel olarak iki atom arasına yerleştirilmiş bir yay varmış gibi düşünülebilir. Dolayısıyla, genellikle kimyasal deneylerden elde edilen bağ türüne ve içeriğinde bulunan atomlara bağlı olan fonksiyonun katsayısı yay sabitine denk gelir. E bag = i,j k b i,j(r ij r 0 ij) 2 (2.7) 18

26 Şekil 2.5: İki atom ve arasındaki fiziksel yay. Burada ki,j b ve rij 0 kuvvet sabiti ve denge durumundaki atom i ve atom j arasındaki bağ uzunluğu ve r ij = x i x j değişkeni de anlık bağ uzunluğudur Bağ Açısı Potansiyeli Benzer olarak, atomlar kimyasal bağlar ile bağlandıklarında iki bağ arasında bir sabit açı da oluşmaktadır. Bu açısal etkileşim bağ açı potansiyeli olarak ifade edilir ve ikinci dereceden bir denklem ile yazılır. Fiziksel olarak, iki bağ arasında yay yerleştirilmiş gibi düşünülebilir. Buradaki iki bağın arasındaki yayın sabiti de potansiyel fonksiyon katsayısı olarak kabul edilir. E aci = i,j k a i,j,k(θ ijk θ 0 ijk) 2 (2.8) 19

27 Şekil 2.6: İki bağ arasındaki açı ve fiziksel yay. Burada k a i,j,k ve θ0 ijk θ ijk ise anlık açısal değerdir. kuvvet sabiti ve denge durumundaki açısal değer ve Bağ Bükülme Potansiyeli Eğer dört atom üç tane kimyasal bağ ile birbirine bağlandığında, ortadaki bağ belli bir açı ile dönebilir. Bu dönme, bükülme (torsiyon) olarak adalandırılır ve sistem genellikle belli bir açıyı tercih eder. Bu tür etkileşim atomlara ve aralardaki bağlara bağımlıdır fakat bükülme açı potansiyeli ile ifade edilir. Şekil 2.7: Ortadaki bağın bükülmesi. E Bukulme = kijkl[1 t + cos(nθ ijkl θijkl)] 0 (2.9) i,j,k,l Burada, kijkl t ve θijkl 0 kuvvet sabiti ve denge açısı, θ ijkl açısı ise i, j, k ve l atomlarını birbirine bağlayan bağların anlık açısıdır. 20

28 2.3.5 Elektrostatik Potansiyel Elekrostatik potansiyel yüklü iki atom arasındaki potansiyel enerjiyi hesaplamak için kullanılır. Bu potansiyel iki atom arasındaki uzaklığı ile ters orantılıdır. Elekrostatik fonksiyonun katsayısı sistemdeki atomların türüne bağlıdır ve elektrostatik teori ve fiziksel deneyler sonucunda elde edilir. Şekil 2.8: Elektriksel etkileşim. E elektrostatik = i,j q i q j e ij r ij (2.10) Burada, e ij elektriksel sabit; q i ve q j atom i ve atom j lere ait yüklerdir. r ij = x i x j ise iki atom arasındaki uzaklıktır Van der Waals Potansiyeli Ayrıca, aralarında herhangi bir bağ olmayan ve herhangi bir elekriksel yüke sahip olmadığı için elektriksel çekim kuvveti olmayan atomlar arasında hala önemli bir etkileşim mevcuttur. Van der Waals zayıf etkileşimi toplam potansiyel enerjiye ihmal edilemeyecek katkı sağlar. Bu potansiyel Lennard-Jones potansiyeli ile modellenebilir. Bu Lennard-Jones potansiyeli eğer iki atom çok uzakta ise sıfır, eğer çok yakınsa sonsuz büyüklükte bir değer verir. Bu etkileşimler, atomların van der Waals yarıçapını kimya teorisini kullanarak belirlenebilir. 21

29 Şekil 2.9: Van der Waals etkileşimi. E vdw = i,j [ (σij ) 12 ɛ ij 2 r ij ( σij r ij ) 6 ] (2.11) Farklı türden potansiyeller için farklı matematiksel fonksiyonlar gereklidir, fakat fonksiyonlar ikiz, üçüz ve dördüz atom eşleşmeleri için farklı parametreler ile de değişeblir. Proteinler çok az sayıda atom türünden oluştuğu için olası farklı parametreler azdır ve daha önceden belirlenir ve gerektiğinde potansiyel fonksiyonda kullanılır. Tüm farklı potansiyel enerji türlerini toplayarak sistemin tüm potansiyel enerjisini denklem 2.12 ile hesaplamak mümkündür [4, s ]. E = E bag + E aci + E bukulme + E elekrostatik + E vdw (2.12) 22

30 BÖLÜM 3 MATERYAL ve METOD 3.1 Gromacs Programı Gromacs programı görsel arayüzü olmayan birçok alt programlardan oluşan bir paket programdır. Gromacs programı özellikler biyolojik moleküllerin simülasyon çalışmalarında çok tercih edilen programdır ve ücretsizdir. Yukarıdaki iş akış şeması bir moleküler dinamik simülasyon çalışmasına ait işlemlerin sıralamasını ve işlemler sırasında oluşan ve kullanılan dosya türleri ve giriş parametrelerini göstermektedir. İlk önce protein data bank sisteminden indirilen protein yapısı pdb formatındadır. pdb2gmx programı kullanılarak pdb dosyası gromos dosyasına (.gro) ve topoloji (.top) dosyalarını oluşturur. Simülasyonda kullanılacak olan kutu geometrisinin türü (triklinik, küp, sekizyüzlü gibi) ve ölçüleri edifconf programı ile oluşturulur. Bir sonraki iş proteini kutu içine yerleştirmek ve çözmektir. Bunu yapmak için genbox programı kullanılır. Program editconf programından elde edilen ölçülere göre su modelini belirleyerek sisteme su moleküllerini ekler ve proteini su ortamında çözer. 23

31 Moleküler ortama su eklemesi yapıldıktan sonra, proteine ait moleküler yapıdaki atomlarda birbirlerine çok yakınlaşmalar olabilir ve dolayısıyla çarpışmalara neden olabilir. Bunun üstesinden gelmek için sistemde enerji minimumlaştırma işlemleri gereklidir. Gromacs programında bu adımda (mdp) moleküler dinamik parametrelerini barındıran dosya kullanılır. Bu dosyadaki parametreleri dikkate alarak gromp programı moleküler dinamik hesaplama işlemi için gerekli girdi dosyalarını oluşturur. Daha sonra mdrun programı kullanılarak enerjiyi minimumlaştırma işlemine başlanır ve bu işlem ayarlanan parametrelere göre zaman alan bir işlem sürecidir. Enerji minimumlaştırma işlemi tamamlandıktan sonra moleküler simülasyon çalışmasına geçilebilir. Bunu yapmak için yine bir önceki işlemdeki gibi adımlar takip edilir. Önce yine mdp dosyasına simülasyonda kullanılacak olan parametreleri ve yöntemleri girmek gerekir. Gerekli ayarlamalar yapıldıktan sonra grommp programı çalıştırılır ve moleküler dinamik için gerekli girdi dosyaları oluşturulur. Artık moleküler dinamik simülasyon hesaplamasına mdrun programı ile başlanır ve bu süreç çok daha uzun sürmektedir. Moleküler dinamik simülasyon hesaplaması bitirdikten sonra sonuçları analiz etmek gerekir. Simülasyon yörüngesini görüntüleyebilmek için ngmx programı kullanılır. Enerjiyi görmek için g enerji programı kullanılır. G rms programı ile de RMSD (root mean square deviation) analizi yapılır [5]. 3.2 PyMol Programı PDB dosyalarındaki protein veya herhangi bir moleküler yapıyı görselleştirmek için kullanılan bir yazılımdır. PyMol görsel araçlarının barınıdırmasının yanında kod tabanlı çalışmalara da imkan vermektedir. Bu 24

32 özellik profosyonel kullanım için çok uygundur. Örneğin moleküler yapıyı fonksiyonel olarak görselleştirmek için görsel arayüzde birçok iş yapmak gerekir. Fakat kod tabanlı desteginin olmasından dolayı tüm yapılması gereken işlemleri bir dosyaya yazıp kaydettikten sonra, onlarca kez yapılacak işi tek satır bir kod ile halletmek mümkün olmaktadır. Program birçok özelliginin yanında en çok kullanılacak olan özelliklerinin içinde simülasyon yörüngesini bir video dosyası haline getirme, istenilen çözünürlükte baskı için resim dosyası oluşturma ve üç boyutlu gözlük kullanmak için çeşitli imkanlar verebilmektedir [6]. Şekil 3.1: PyMol programı. 3.3 VMD Programı VMD (Visual Molecular Dynamics) programı da moleküler yörüngeleri, atomların hareketini ve taşınımını görselleştiren ve bu yörünge verileri 25

33 üzerinde birçok analizi kendi üzerinde modüler programlar kullanarak yapılmasına olanak veren bir açık kaynak kodlu ücretsiz bir programdır. Proteine ait üç boyutlu yapısının istenilen şekilde (çubuksal, noktasal, küresel, kartunsal, yüzeysel gibi) görselleştirmenin yanında proteinleri çoklu olarak dizilerini karşılaştırma yapabilir, filogenetik ağaçlandırma yapabilir veya RMSD hesap verilerini grafiğe dökebilir şekil 3.2 de görüldüğü gibi [7] Şekil 3.2: VMD programı. 26

34 3.4 Gromacs Programının İş Akış Şeması 27

35 28

36 Şekil 3.3: Su ortamında çözülmüş çeşitli atomlardan oluşan yapının moleküler dinamik simülasyon iş akışı şeması. 3.5 pdb2gmx Programı Bu program.pdb veya.gro dosyalarını, kendi kütüphanesinde veya çalışma klasöründeki veritabanı türü dosyalarını okur, moleküler yapıya hidrojen ekleyerek koordinatları topoloji formatında oluşturur. pdb2gmx çalışılan klasörde veya kendi kütüphane klasöründe forcefield.ff klasörünün içinde forcefield.itp dosyasına bakar. Program çalışma anında kullanılacak kuvvet alanını kullanıcıya seçtirir. Eğer program içince seçilmek istenirse -ff ile belirtilir. Eğer kuvvet alanın seçildikten sonra program kuvvet alanının altındaki verileri kullanacaktır. Eğer herhangi bir rezidü eklemek veya düzenlemek gerekirse, gromacs kütüphanesindeki bulunan forcefield.ff klasörünü çalışma klasörüne kopyalayıp gerekli değişiklikleri yapmak gerekir. Yeni bir protein rezidü türü eklemek gerektğinde residuetypes.dat dosyasının düzenlenmesi gerekir. Programın kullanımında dosyalar ve seçenekler: 29

37 Dosyalar: -f eiwit.pdb girdi yapı dosyası: gro g96 pdb tpr vs. -o conf.gro çıktı yapı dosyası: gro g96 pdb vs. -p topol.top çıktı topoloji dosyası -i porse.itp çıktı topoloji için dosya içerir -n clean.ndx çıktı, opsiyonel indeks dosyası -q clean.pdb çıktı, opsiyonel yapı dosyası: gro, g96, pdb vs. Diğer seçenekler: -h bool hayır yardım bilgisini yazdır -ignh bool hayır koordinat dosyasındaki hidrojen atomlarını yoksay -missing bool hayır atomlar eksik olduğu zaman devam et, tehlikeli -v bool hayır program çalışma durumunu ekrana yazar -renum bool hayır çıktıdaki rezidüleri yeniden numaralandırır 3.6 editconf Programı editconf genel formatı.gro,.g96 veya.pdb formatına çevirir. Kutu -box, -d ve -angles gibi seçenekler ile modifiye edilir. -box ve -d seçeneklerinin her ikisi de sistemi kutuda merkezler. -bt seçeneği kutunun türünü (triclinic, cubic, dodecahedron, octahedron) belirtir. 30

38 Dosyalar: -f conf.gro girdi yapı dosyası: gro g96 pdb tpr vs. -n index.ndx girdi, opsiyonel İndex dosyası -o out.gro çıktı, opsiyonel yapı dosyası: gro g96 pdb vs. -mead mead.pqr çıktı, opsiyonel MEAD için koordinat dosyası -bf bfact.dat girdi, opsiyonel Genel data dosyası Diğer seçenekler: -w bool no çıktı sonuçlarını göster.xvg,.xpm,.eps,.pdb -bt enum - kutu türü -box vektör kutu vektör uzunlukları -angles vektör kutu vektörleri arasındaki açılar -d sayı 0 kutu ve çözünen arasındaki mesafe -c bool hayır molekülü merkezleme -center vektör geometrik merkezin koordinatları -aligcenter vektör hizalama için dönmenin merkezi -align vektör hedef vektöre hizalama -translate vektör öteleme -rotate vektör x,y,z ekseni etrafında açısal döndürme -princ bool hayır molekülü esas ekseni etrafında hizalama -scale vektör ölçekleme faktörü -density sayı 1000 ölçekleme sonundaki kutunun yoğunluğu (g/l) -pbc bool hayır peryodikliği kaldır -resnr sayı -1 rezidüleri yeniden numaralandır 31

39 3.7 genbox Programı genbox, aşağıdaki üç tane işlemi yapabilir. Çözelti kutusu oluşturur. -cs ve -box seçenekleri ile belirtilir veya -cs ve -cp ile yapı dosyası kullanarak atomsuz çözelti kutu sınırlarını oluşturulur. Çözelti konfigurasyonunu çözmek için kullanılır. -cp çözünen ve -cs çözen i belirtir. Eğer -box kullanılmadığında, -cp çözünenin koordinat dosyası ile belirlenir. Sisteme rasgele yerlere fazla (-nmol) moleküller (-ci) ekler. Dosyalar: -cp protein.gro girdi yapı dosyası: gro g96 pdb tpr vs. -cs spc216.gro girdi yapı dosyası: gro g96 pdb tpr vs. -ci insert.gro girdi yapı dosyası: gro g96 pdb tpr vs. -o out.gro çıktı yapı dosyası: gro g96 pdb tpr vs. -p topol.top girdi,çıktı Topology dosyası Diğer seçenekler: -box vektör Kutu boyutları -nmol sayı 0 sisteme fazladan molekül ekleme -try sayı 10 küçük boşlukları doldurmayı dener -vel bool hayır çözen ve çözünenin hızlarının sabitliğini sağlar 32

40 3.8 genion Programı genion programı çözelti atomlarını iyon atomları ile yerdeğiştirmek için kullanılır. İyon molekül türü programda -pname (pozitif iyon) -nname (negatif iyon) ile belirtilir. Tüm atomların üzerindeki potansiyel GROMACS particle based metodu ile hesaplanır. Her iyon eklendiğinde tüm potansiyeller hesaplanarak devam eder. Dosyalar: -s topol.top girdi Girdi çalıştır:tpr, tbp, tpa -n index.ndx girdi xvgr/xmgr dosyaları -o out.gro çıktı yapısal dosya: gro, g96, pdb -g genion.log çıktı log dosyası -pot pot.pdb çıktı,opsiyonel protein data bank dosyası -p topol.top girdi topoloji dosyası Diğer seçenekler: -np sayı 0 pozitif iyon sayısı -nn sayı 0 negatif iyon sayısı -nname kelime CL negatif iyon adı -nq sayı -1 negatif iyonun yükü -neutral bool no sistemi nötralize etmek -conc sayı 0 tuz yoğunluğu 3.9 grompp Programı Gromacs önişlemcisi moleküler topoloji dosyasını okur, dosyaların uygulanabilirliğini kontrol eder ve topoloji dosyasını moleküler tanımdan atomik tanıma genişletir. Topoloji dosyası molekül türü, molekül sayısı ve gerekli önişlem kopyalarını barındırır. grompp topoloji dosyasından atom 33

41 isimlerini kullanır. Dosyalar: -f grompp.mdp girdi grompp girdi dosyası, MD parametreleri ile -po mdout.mdp çıktı grompp girdi dosyası, MD parametreleri ile -c conf.gro girdi yapı dosyası: gro g96 pdb tpr -r conf.gro girdi,opsiyonel yapı dosyası: gro g96 pdb tpr -rb conf.gro girdi,opsiyonel yapı dosyası: gro g96 pdb tpr -n index.ndx girdi,opsiyonel indeks dosyası -p topol.top girdi topoloji dosyası -pp processed.top çıktı, opsiyonel topoloji dosyası -o topol.tpr çıktı çalışma girdi dosyası: trr tpb -t traj.trr girdi, opsiyonel tüm yörünge: trr trj vs. vs. vs. tpa -e ener.edr girdi, opsiyonel enerji dosyası Diğer seçenekler: -time sayı -1 belirtilen zamandan sonra başla -maxwarn sayı 0 izin verilen uyarı sayısı -zero bool hayır bağ etkileşimi için parametre ayarlama -renum bool evet atom türünü yeniden adlandır ve atom türü sayısını enaz yap 34

42 3.10 mdrun Programı mdrun programı GROMACS programının ana hesaplama programıdır. Moleküler dinamik simülasyon hesaplaması bu program aracılığı ile yapılır. Ayrıca stokastik dinamik, enerji minumumlaştırma, test parçacığı yerleştirme ve yenide enerji hesaplaması yapabilmektedir. mdrun programı girdi dosyasını okur ve topoloji dosyasını gerekli bilgisayarlara dağıtır. Program en az dört tür çıktı dosyası oluşturur. Log dosyası (-g), trajektori dosyası (-o), yapısal dosya (-c) ve enerji dosyası (-e). MPI kütüphanesi kullanarak mdrun birden fazla bilgisayar üzerinde paralel olarak çalıştırılabilir. Dosyalar: -s topol.top girdi çalışma girdisi: tpr, tpb, tpa -o topol.tpr çıktı çalışma girdi dosyası: trr tpb tpa -x traj.xtc çıktı sıkıştırılmış trajektor -c confout.gro çıktı yapı dosyası: gro g96 pdb tpr vs. -e ener.edr çıktı enerji dosyası Diğer seçenekler: -nice sayı o nicelevel -deffnm kelime 0 tüm şeçenekler için dosya ismini ayarla -xvg enum xmgrace xvg formatında grafik çiz. -multi sayı 0 çoklu simulasyon paralel durumda Simülasyonun Hesaplanmasında Kullanılan Programlar ve Yönergeler İlk önce protein molekülü vmd programında açıldı ve yeniden koordinatları tekrar kaydedildi. Bunu yapmaktaki amaç; pdb dosyasının içince çok fazla proteine ait kullanılmayacak detaylı bilgi içerir ve vmd ile tekrar 35

43 kaydettiğimizde sadece hesaplamada kullanılacak veriler kalmaktadır. Daha sonra aşağıdaki kod yardımı ile moleküle ait topoloji dosyası, pozisyon germe ve sonrası için kullanılacak dosya oluşturulur. Komut satırına aşağıdaki kod yazıldığında bizden kuvvet alanı türünü seçmemizi isteyecektir. pdb2gmx f 3D4C. pdb o 3 D4C ilk. gro water spce S e l e c t the Force F i e l d : \ \ From / usr / l o c a l / gromacs / share / gromacs /top : 1 : AMBER03 f o r c e f i e l d (Duan et a l., J. Comp. Chem. 24, , 2003) 2 : AMBER94 f o r c e f i e l d ( C o r n e l l et a l., JACS 117, , 1995) 3 : AMBER96 f o r c e f i e l d ( Kollman et a l., Acc. Chem. Res. 29, , 1996) 4 : AMBER99 f o r c e f i e l d (Wang et a l., J. Comp. Chem. 21, , 2000) 5 : AMBER99SB f o r c e f i e l d ( Hornak et a l., P r o t e i n s 65, , 2006) 6 : AMBER99SB ILDN f o r c e f i e l d ( L i n d o r f f Larsen et a l. ) 7 : AMBERGS f o r c e f i e l d ( Garcia \& Sanbonmatsu, PNAS 99, , 2002) 8 : CHARMM27 a l l atom f o r c e f i e l d ( with CMAP) v e r s i o n : GROMOS96 43 a1 f o r c e f i e l d 1 0 : GROMOS96 43 a2 f o r c e f i e l d ( improved alkane d i h e d r a l s ) 1 1 : GROMOS96 45 a3 f o r c e f i e l d 36

44 ( Schuler JCC ) 1 2 : GROMOS96 53 a5 f o r c e f i e l d (JCC 2004 vol 25 pag 1656) 1 3 : GROMOS96 53 a6 f o r c e f i e l d (JCC 2004 vol 25 pag 1656) 1 4 : OPLS AA/L a l l atom f o r c e f i e l d (2001 aminoacid d i h e d r a l s ) 1 5 : [DEPRECATED] Encad a l l atom f o r c e f i e l d, using f u l l s o l v e n t charges 1 6 : [DEPRECATED] Encad a l l atom f o r c e f i e l d, using scaled down vacuum charges 1 7 : [DEPRECATED] Gromacs f o r c e f i e l d ( s e e manual ) 1 8 : [DEPRECATED] Gromacs f o r c e f i e l d with hydrogens f o r NMR 14 numaralı kuvvet alanı türü seçilmiştir. Bu işlem tamamlandıktan sonra, çözelti ortamının geometrik boyutlarını ayarlamak yapmak gerekir. Aşağıdaki kod ile protein sistemi kübik bir yapının içine konmuştur. e d i t c o n f f 3 D4C ilk. gro o 3D4C box. gro c d 1. 0 bt cubic Daha sonra aşağıdaki kod kullanılarak ortama saf su (spc216.gro) eklemesi yapılır ve çözelti ortamı hazırlanır. genbox cp 3D4C box. gr o c s p t o p o l. top spc216. g ro o 3 D4C solv. g ro İyon durumunu sıfırlamak gerekmektedir. Çünkü eğer net yük sıfır olamaz ise hem program uyarı vermekte hemde protein üzerindeki yükler simülasyon 37

45 sonucuna etki etmektedir. Bunu yapmak için ions.mdp dosyası kullanılarak grompp programı çalıştırılır. grompp f o i o n s.mdp c 3 D4C solv. gro p t o p o l. top i o n s. tpr Bu işlem bittikten sonra artık sisteme iyon ekleyebiliriz. Ele alınan sistemde 10 miktarında negatif yük vardı. Nötürlemek için +10 luk pozitif yük eklemesi aşağıdaki kod ile yapılır. genion s i o n s. tpr o 3 D4C solv ions. gro p t o p o l. top pname NA nname CL np 10 Deniz suyunda NaCl oranı molar ve bu ortamı elde etmek için tuzlu su çalışmasında aşağıdaki kod kullanılmıştır. genion s i o n s. tpr o 3 D4C solv ions. gro p t o p o l. top pname NA nname CL n e u t r a l conc grompp programı minim.mdp dosyası kullanılarak enerji minimumlaştırma çalışması için gerekli verileri aşağıdaki kodla hazırlanır. grompp f minim.mdp c 3 D4C solv ions. gro p t o p o l. top o em. tpr Bu işlem tamamlandıktan sonra mdrun programı ile enerji minimumlaştırma hesabı başlatılır. mdrun v deffnm em Enerjinin davranışı görmek için aşağıdaki işlemin sonucunda, potential.xvg kodu kabuk programına yazılır. xmgrace g energy f em. edr o p o t e n t i a l. xvg 38

46 Enerji minimumlaştırma işlemleri tamamlandıktan sonra aşağıdaki işlemler ile su moleküllerinin protein yapısının arasına girmesini istenmeyen çakışmaları yok etmek için pozisyon zorlama hesaplaması tamamlanır. grompp f nvt.mdp c em. gro p t o p o l. top o nvt. tpr mdrun v deffnm nvt g energy f nvt. edr o temperature. xvg grompp f npt.mdp c nvt. gro t nvt. cpt p t o p o l. top o npt. tpr mdrun v deffnm npt g energy f npt. edr o p r e s s u r e. xvg g energy f npt. edr o d e n s i t y. xvg Bu işlemler bitiminde artık sistem moleküler dinamik hesaplamasına hazırdır ve aşagıdaki kodlar ile başlatılır. grompp f md.mdp c npt. gro t o md 1. tpr npt. cpt p t o p o l. top mdrun v deffnm md 1 39

47 Program çıktılarını analiz etmek için (dönme miktarı, RMSD) aşağıdaki işlemler yapılır. t r j c o n v s md 1. tpr f pbc mol ur compact md 1. xtc o md 1 nopbc. xtc g rms s md 1. tpr f md 1 nopbc. xtc o rmsd. xvg tu ns g g y r a t e s md 1. tpr f md 1 nopbc. xtc o gyrate. xvg 40

48 BÖLÜM 4 SONUÇLAR Simülasyon çalışmaları 3D4G kodlu protein üzerinde tamamlanmıştır. ZP3 yapısına ait diğer proteinler farklı çözünürlüklere sahiptir. Önce simülasyon çalışmaları saf su ortamında üç farklı sıcaklık ortamında tamamlanmıştır. Daha sonra çözelti ortamını deniz suyuna yakın oranda molar tuzlu ortam elde etmek için NaCl eklenmiştir. Yine bu derişimi değiştirilmiş çözeltideki proteinler üç farklı sıcaklık koşulunda simülasyonaları yapılmıştır. Tüm simülasyonlar tamamlandıktan sonra sonuçları analiz etmek için trjconv, g rms ve g gyrate programları kullanılarak proteinin sümülasyon sırasındaki hareketleri analiz edilmiştir. En uzun simülasyon süresi 20 nano saniye kadardır. Tuzlu ortamdaki sümülasyon süresi 10 ns olacak şekilde ayarlanmıştır. 4.1 Önçalışma Sonuçları Saf Su Ortamındaki Analizler Protein simülasyon çalışması üç farklı sıcaklık koşulunda (290K, 300K, 310K) gerçekleştirilmiştir. Sıcaklıklara ait değişim şekil 4.2 deki gibidir. 41

49 Potansiyel enerji (kj/mol) 1.3e e e e e e e+06 2e e Süre [ps] 290K 300K 310K Şekil 4.1: Potansiyel enerji değişimi. Sistem simülasyona hazırlanırken önce enerji minimumlaştırma işlemi yapılması gereklidir. Bu işlem sonucunda atomlar minimum enerji seviyelerine yerleşerek sistemin potansiyel enerjisini sabitlerler. İlk başta sistemdeki atomlara etkiyen kuvvet fazladır ve hareketler ani olur. Daha sonra sistemin potansiyel enerjisi gittikçe sabitleşmeye başlar ve bu şu demektir. Artık atomlar minumum enerjili pozisyonlarına yerleştiler ve dengeye ulaştılar. SIcaklIk (K) K K 310K Süre [ps] Şekil 4.2: Hesaplamalar üç farklı sıcaklık için yapılmıştır ve sistemin sıcaklığı hesaplamalar boyunca sabit kalması sağlanmıştır. Protein çözelti ortamına konduktan sonra bir ön hesaplama daha yapılması gerekmektedir. Bunun amacı çözelti atomlarının protein etrafında 42

50 veya içinde düzgün dağılmasını sağlamaktır. Bu hesaplama aşaması bittikten sonra sistemin yoğunluğuna ve basıncına bakabiliriz. Şekil 4.3 incelendiğinde sistemdeki yoğunluk farkı sıcaklık farkından kaynaklıdır. Tahmin edileceği gibi düşük sıcaklıkta yüksek sıcaklıktakine oranla daha yoğun bir ortam gözlenir. Şekil 4.4 incelendiğinde ise basınç değişiminde kayda değer bir fark görülmemiştir. Yogunluk (kg/m 3 ) Süre [ps] 290K 300K 310K Şekil 4.3: Üç farklı sıcaklık oranında yoğunluk değişimi. BasInç (bar) K 300K 310K Süre [ps] Şekil 4.4: Her üç farklı sistem için basınç değişimi birbirine çok yakındır. 43

51 4.1.2 Tuzlu Su Ortamındaki Analizler Potansiyel enerji (kj/mol) 1.2e e e e+06 2e e K 300K 310K 2.4e Süre [ps] Şekil 4.5: Tuzlu su ortamında potansiyel enerji değişimi. Tuzlu su ortamında sistemin minumum enerji seviyesine gelmesi normal önceki sisteme ögre daha uzun sürmüştür. Bu durum, tuz iyonlarının sistemi daha çok gerginleştirmesinden dolayıdır ve bu gerginliği minunmumlaştırmak için daha çok adım veya süre gereklidir. SIcaklIk (K) K K 310K Süre [ps] Şekil 4.6: Tuzlu su çözeltisinde sıcaklık değişimi. 44

52 Yogunluk (kg/m 3 ) K K 310K Süre [ps] Şekil 4.7: Tuzlu su çözelti ortamında yoğunluk değişimi. Şekil 4.7 teki yoğunluk değişimi şekil 4.3 teki sonuca göre daha yüksek gözükmektedir. Bunun nedeni su atomlarının yerine konana NaCl atomlarıdır. Çünkü NaCl atomlarının atom ağırlıkları suya göre daha fazladır. BasInç (bar) K K 310K Süre [ps] Şekil 4.8: Tuzlu su ortamında basınç değişimi. 45

53 RMSD Saf su Tuzlu su Süre [ps] Şekil 4.9: Farklı çözelti ortamında basınç değişimi (290K). Şekil 4.9 deki basınç davranışı izlendiğinde, çözelti ortamını değiştiğinde basınçtaki değişimin paralel olduğu gözlemlenmiştir ve kayda değer farklılık gözlemlenememiştir. 4.2 Genel Yapısal Analiz Yapının tümündeki değişiklikleri analiz etmek ve yorumlamak için dönme yarıçapı ve root mean square deviation (RMSD) iki kavramdan faydalanırız. Dönme ekseni, sistemdeki herbir atomun kütle merkezine ağırlıklı skaler uzunluklarıdır. Matematiksel ifadesi aşağıdaki gibidir. r gyration = r2.m m (4.1) RMSD iki yapı için aynı tür atomlar arasındaki mesafenin skaler ölçmede kullanılır ve aşağıdaki denklem ile ifade edilir. 1 RMSD = m i r i,1 r i,2 (4.2) M i 46

54 4.2.1 RMSD Davranışları RMSD Saf su Tuzlu su Süre [ps] Şekil 4.10: 290K sıcaklığında RMSD davranışı RMSD Saf su Tuzlu su Süre [ps] Şekil 4.11: 300K sıcaklığında RMSD davranışı. RMSD Süre [ps] Saf su Tuzlu su Şekil 4.12: 310K sıcaklığında RMSD davranışı. 47

55 Şekil 4.10,4.11 ve 4.12 deki grafikler incelendiğinde RMSD davranışındaki değişimde çözelti ortamı ve sıcaklık koşulları önemli değişimlere neden olmuştur. 290K sıcaklığında yapılan simülasyon çalışmasında tuzlu su ortamında bulunan proteinde RMSD davranışı saf su ortamına göre daha fazladır. Bu şu anlama gelmektedir. 290K sıcaklığındaki tuzlu suda bulunan proteinin aynı tür atomları arasındaki mesafenin değişimi saf sudaki ortama göre daha fazladır. 300K sıcaklığında yapılan çalışmaya baktığımızda her iki çözelti ortamında RMSD davranışı birbirine yakın olmuştur. Sıcaklık arttığında (310K) ise önceki RMSD davranışı ters değişim göstermiştir. Bir başka deyişle, sıcaklık arttığında, saf su içinde bulunan proteinde yapısal değişim (atomlar arasındaki mesafenin değişimi) tuzlu su ortamına göre daha fazla olmuştur. RMSD Süre [ns] 290K 300K 310K Şekil 4.13: Saf su ortamında farklı sıcaklıklarda RMSD davranışı. Şekil 4.13 grafik incelendiğinde, saf su ortamında bulunan protein için, sıcaklık artması RMSD değerinin artmasına neden olmuştur. Yüksek sıcaklıkta protein atomlarının arası düşük sıcaklığa göre daha fazla açılmıştır. Şekil 4.14 deki grafiğin davranışı izlendiğinde çözelti ortamına NaCl eklenmesi RMSD davranışının sıcaklık koşulundan daha az etkilendiği görülmüştür. Sıcaklığın değiştirilmesi saf sudaki duruma göre belirginlik 48

56 gösterememiştir aksine RMSD davranışı paralellik göstermiştir. RMSD K K 310K Süre [ns] Şekil 4.14: Tuzlu su ortamında farklı sıcaklıklarda RMSD davranışı Dönme Davranışı Protein molekülünün çözelti içinde farklı sıcaklıklardaki dönme davranışına baktığımızda, şekil 4.15, 4.16 ve 4.17 deki grafiklere baktığımızda belirgin davranışı görebilmek için sıcaklık farkının daha fazla olması veya simülasyon süresinin uzatılması daha iyi olabilir. Ama elde edilen grafiklere bakarak şu yorumları çıkarabiliriz: Düşük sıcaklıkta tuzlu su ortamında protein yapının saf sudaki ortama göre daha rahat dönme gerçekleştirdiği ve sıcaklık artınca bu durumun değişiklik gösterip tuzlu suda azalıp saf suda artış gösterdiği söylemek mümkündür. 49

57 Rg [nm] Saf su Tuzlu su Süre [ps] Şekil 4.15: 290K sıcaklığında dönme davranışı. Rg [nm] Saf su Tuzlu su Süre [ps] Şekil 4.16: 300K sıcaklığında dönme davranışı Rg [nm] Saf su Tuzlu su Süre [ps] Şekil 4.17: 310K sıcaklığında dönme davranışı. Ayrıca şekil 4.18 ve 4.19 deki verileri ele aldığımızda tuzlu su ortamının 50

58 protein molekülünün dönme davranışı konusunda sıcaklık farkı saf sudakine göre etkinliğini azaltmaktadır Rg [nm] K K 310K Süre [ps] Şekil 4.18: Saf su ortamında farklı sıcaklıklarda dönme davranışı. Rg [nm] K K 310K Süre [ps] Şekil 4.19: Tuzlu su ortamında farklı sıcaklıklarda dönme davranışı. 4.3 Protein Hareketleri Protein yapısının farklı sıcaklık ve ortamda yapmış olduğu dönme ve yapısal değişim hareketlerinin nano saniyelik görüntüleri ilerleyen alt başlıklarda resmedilmiştir. 51

59 K Saf Su Ortamı (a) t=0 ns (b) t=1 ns (c) t=2 ns (d) t=3 ns (e) t=4 ns (f) t=5 ns (g) t=6 ns (h) t=7 ns (i) t=8 ns 52

60 (j) t=9 ns (k) t=10 ns K Saf Su Ortamı (a) t=0 ns (b) t=1 ns (c) t=2 ns (d) t=3 ns (e) t=4 ns (f) t=5 ns 53

61 (g) t=6 ns (h) t=7 ns (i) t=8 ns (j) t=9 ns (k) t=10 ns K Saf Su Ortamı (a) t=0 ns (b) t=1 ns (c) t=2 ns 54

62 (d) t=3 ns (e) t=4 ns (f) t=5 ns (g) t=6 ns (h) t=7 ns (i) t=8 ns (j) t=9 ns (k) t=10 ns 55

63 K Tuzlu Su Ortamı (a) t=0 ns (b) t=1 ns (c) t=2 ns (d) t=3 ns (e) t=4 ns (f) t=5 ns 56

64 K Tuzlu Su Ortamı (a) t=0 ns (b) t=1 ns (c) t=2 ns (d) t=3 ns (e) t=4 ns (f) t=5 ns 57

65 K Tuzlu Su Ortamı (a) t=0 ns (b) t=1 ns (c) t=2 ns (d) t=3 ns (e) t=4 ns (f) t=5 ns 58

66 KAYNAKLAR [1] Şakir Erkoç, Lecture notes on simulations of many particle systems [2] Z. Wu, Lecture notes on computational structural biology. World Scientific Publishing, [3] Protein data bank. [4] T. Schlick, Molecular modelling and simulation: An interdisciplinary guide., vol. 21. Springer, [5] G. machine for Chemical Simulations, Gromacs. [6] W. Delano, Pymol. [7] Theoretical and computational biophysics group, Vmd - visual molecular dynamics. 59