BĠY 4008 GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠNE GĠRĠġ. Doç. Dr. Nurettin YÖREK

Transkript

1 BĠY 4008 GENETĠK MÜHENDĠSLĠĞĠNE GĠRĠġ Doç. Dr. Nurettin YÖREK

2 DNA ile çalıģırken göz önünde bulundurmanız gereken temel özellikler: DNA basit bir moleküldür. Gerçekten! Sadece A, T, C ve G nükleotidlerini içerir. Bu ne demektir? AraĢtırma yaparken önceden tahmin edebilmek demektir. DNA negatif yüklüdür. Elektronların büyük bir çoğunluğu oksijen gruplarının etrafında dolanırlar. DNA çok sayıda halka yapısına sahiptir. Pi orbitali gibi Ģeyleri ya da polar ve nonpolar bağlar arasındaki farkı hatırlıyor musunuz? Asıl konu Ģudur ki; halka yapıları oldukça hidrofobiktir.

3 DNA çok dayanıklı bir moleküldür. Örnek tüpünüzü düģürdünüz mü? Muhtemelen bir sorun yoktur. Hafta sonu boyunca oda ısısında bıraktınız mı? Sorun değil. Genellikle çalıģılması en kolay olan biyolojik makromoleküldür. DNA çalışmaları pek çok ihtiyaç gerektirir. Bu molekülle ne çalıģtığınıza bağlı olarak bir çok Ģeye sahip olmalısınız. Bu sey bir prosedür ya da spesifik bir enzim yada techizat olabilir.

4 UNUTMAYIN!!! Bazı genel kurallar bütün DNA deneylerinde geçerlidir Deneyi iyi bilmek. BaĢka bir Ģekilde söylemek gerekirse, prosedürünüzün kimyasını bilmeniz gerekir. Bu, dikkat derecenizi ölçmeye yarar ve etkinliğinizi yansıtır. Örneğinizi olabildiği kadar saf elde edin. ġunu aklınızdan çıkarmayın: Herhangi bir safsızlık birçok soruna davetiye çıkarır. Eğer kontaminasyonunuz varsa takip eden aģamalarınızda kötü sonuçlar elde edebilir hatta örneğinizi bile kaybedebilirsiniz. DNA nükleazları sevmez ve nükleazlar her yerdedir. Mümkün olduğunca her zaman dikkatli ve nazik olun. Deneyleri yaparken dikkatli olun. Örneğin, her Ģeyi soğukta tutun çünkü enzimler fizyolojik sıcaklıklarında daha çok aktiftir (soğuk buz kullanın). Eldiven giyin. DNA yı hızlı vorteklemeyin ya da kuvvetli bir Ģekilde pipetaj yapmayın. Mutlaka önlük giyin. Lab. da birģeyler yemeyin...

5 Molekülünüzün özelliklerini çok iyi bilin. Molekülünüze herhangi bir uygulama yaparken bilinçli olmanız lazım. Örneğin, genomik DNA plazmid DNA sından PCR ürününden ya da EST fragmentinden farklıdır. Gerçekten ihtiyacınız olan malzemelerin miktarlarını dikkatlice düşünün. Küçük miktarlarla çalıģmak genellikle daha kolaydır ve DNA çalıģmalarında miktarlar hep çok küçüktür. Yani eğer biliyorsanız, çok fazlasına ihtiyacınız yoktur, o miktar yeterlidir.

6 GENOMİK DNA: Ne ve Neden? Genomik DNA nedir? Aslında anlaģılmaz bir terim gibidir fakat bir hücredeki, organeldeki ve/veya virüsteki bütün genleri içeren DNA örneği demektir. Genomik DNA büyüktür, komplekstir ve sulu ortamlarda visköz görünür.

7 Neden genomik DNA elde ediyoruz? Profilleme/Fingerprinting: Kan/sperm örneklerini karģılaģtırmak adli bilimlerde kullanılan bir metottur. Yeni bir gen klonlamaya ilk adım

8 Karakterizasyon/Tanımlama. Temel araģtırmada birçok örnek vardır. Mesela transgenik/knockout bir organizma yapıyorsunuz ve modifikasyonun gerçekleģip gerçekleģmediğini kontrol etmeniz gerekir. Ġlginç bir fenotip elde ettiniz ve daha derine bakmak istiyorsunuz. Gen ifadesi ve regülasyonunu araştırmak

9 Genomik DNA izolasyonu : Hücre lizizi Hücreleri hazırlayın. Soğukta tutun. Herhangi bir fiziksel Ģart gerekirse sağlayın. Örnek olarak oldukça sert bir doku ile (mısır bitkisi gibi) çalıģıyorsanız. Ġçerisinde sıvı azot bulunan havan ve havan tokmağı kullanacaksınız. Akılda tutmanızda yarar vardır; bu aģama hücreleri lizise etmekten ziyade, bitki hücrelerinin duvarlarını yıkmaya yöneliktir ve böylece hücreler serbest kalır. Sonra hücre içinde bulunan DNA yı almak için hücreleri lizis edin. Devam eden iģlemlerde DNA ya daha rahat ulaģırsınız.

10 Hücreleri Ģunlarla lizise edin: Tris (tamponlama maddesi ph 6-8) EDTA DNase aktivitesi için gerekli kofaktörler olan divalent katyonları Ģelatlar (nükleazları kapatma yolu) NaCl fizyolojik Ģartlarda (genellikle mm olması gerekir). Bütün molekülleri mutlu (özellikle de proteinaz K yı) eder ve istenmeyen çökelmeleri önler. SDS, iyonik deterjandır. Membranları yıkma iģleminde iyidir. Genel denatüre edicidir (enzim aktivitesini inhibe eder). DNA çok dayanıklı olduğu için SDS muamelesinden etkilenmez. Not: Bitki materyali ile çalıģırken SDS in yerini çok yaygın bir deterjan olan Sarkosyl alır. SDS ile aynı Ģekilde davranır. Proteinaz K, serin proteaz (55 C de iyi çalıģır). Çok etkili olduğu için ve SDS ya da diğer denatüre edici ajanlara karģı (üre gibi) hassas olmadığı için kullanılır. Proteinaz K DNA ya bağlı olan proteinleri (ökromatin yapısındaki/histonlar vb) parçalayarak DNA nın serbest kalmasını sağlar. Taze olarak kullanılması en iyisidir (oldukça önemlidir bu aģama).

11 Ġnkübasyon süresi genellikle en az bir saattir. Bazı prosedürler daha uzun sürer (kullanılan materyale göre değiģir örneğin birçok prosedür 16 saatten fazla gece boyu inkübasyon süresi kullanır). Lizis prosedürünün birçok çeģidi olduğunu anlamak çok önemlidir. Bazısı daha hızlı, bazısı daha etkin, bazısı daha pahallı, bazısı belirli Ģartlarda çalıģır. SDS/proteinaz K oldukça standart bir yöntemdir.

12 DNA extraksiyonu (Fenol/kloroform ile) Dikkat!!!! Fenol oldukça tehlikelidir. Yanıcıdır. (bir zamanlar birinin bana söylediği gibi eğer vücudunun %5 ni kaplarsa, ölürsün) Ancak biz mantıklı miktarlarda ve çekerbaca içerisinde kullandığımız için sorun olmayacaktır. Eğer üzerinize dökülürse paniklemeyin. Hemen soğuk su ile durulayın. Fenol, genellikle bir tamponla doyurulur. (hazır olarak aldığınızda ya da kendiniz hazırladığınızda iki faz içerdiğini görürsünüz. Üst faz tamponun fazlasıdır, alt faz ise tamponla doyurulmuģ fenoldür.) Bu ph için önemlidirsizin saflaģtırma iģleminiz için nötral ph da fenol gerekilidir. (asidik ph, DNA fenol içinde çözülür hale geleceği için iyi değildir.) Aynı zamanda doygunluk da önemlidir çünkü bu herhangi bir sulu çözelti (örn.su) eklendiğinde, onun da kendi sıvı tabakasını yaratacağı anlamına gelmektedir.

13 Fenol-kloroform saflaģtırma yöntemi diferansiyel (kademeli) çözünürlük prensibine bağlı olarak çalıģmaktadır. 1. Lizat üzerine eģit hacimde fenol/kloroform/izoamil alkol (genellikle hacimsel olarak 24:23:1 oranında hazırlanır) eklenir. Fenol- organik çözücü/ nükleik asitler çözünmez. Bundan dolayı, DNA/RNA sulu faz içinde çözünmüģ halde kalır. Lipidler ve polisakkaritler tercihen fenol fazına geçerler. Proteinler de seçici olarak fenol çözeltisine geçerler. 2. Ayrıca fenol bir denatüre edici olarak davranır, proteinler denatüre olarak çökelek oluģtururlar ve ara fazda toplanırlar. 3. Kloroform, fenolle genel olarak benzer özelliklere sahiptir (çözücü özellikleri), ayrıca sulu ve organik fazlar arasındaki dayanıklı olmayan bağları stabilize eder. Izoamil alkol de ara fazın stabilizasyonuna katkı sağlar ve aynı zamanda kabarcık oluģumunun önlenmesine yardım eder.

14 Genellikle bu basamak 2 ya da 3 kez tekrarlanır. Daha fazla tekrar edilmesi, örneği daha temiz hale getirir (her tekrarda ara fazın daha temiz hale geldiğini gözlemleyebilirsiniz). Bu prosedür oldukça güvenilirdir ve DNA verimi fazladır. Bu nedenle halen laboratuvarların çoğunda kullanılmaktadır.

15 Genomik DNA İzolasyonu: DNA nın çöktürülmesi Alkol ve Tuz ile Çöktürme Hacmin yarısı kadar amonyum asetat ekleyin. Neden? Etanol varlığında DNA nın çökmesine yardımcı olur. NaCl de kullanılabilir, ya da tamamen bu basamağı atlayabilirsiniz (DNA konsantrasyonuna bağlı olarak) Tuz DNA nın negatif yükünün nötralize olmasına yardım eder (böylece çözücü moleküllerden ayrılır- bu durumda çözücü sudur). Tuz aynı zamanda su ile etkileģime girerek DNA nın çözünürlüğünü zayıflatır. Bu salting out olarak bilinir. %100 lük etanol kullanılır. Etanol su kadar iyi bir çözücü değildir. %65 den daha çok etanol içeren çözeltilerde DNA çözünmez. Ancak etanolle çöktürmenin etkinliği çok sayıda etkene bağlıdır: sıcaklık, zaman, DNA miktarı. Çöktürme basamağı için izopropanol de kullanılabilir. Bu çözücü için de RNA da stabil kalabilir (seçici çöktürme). Bu nedenle bazen bu amaçla da kullanılır. %50 den daha çok izopropanol varlığında DNA çökelti halinde kalır. Cam bir pastör pipeti ya da çubuk kullanılarak DNA dikkatlice dıģarı alınır. %70 etanolle muamele edilir ve TE çözeltisi içerisinde çözülür. Cam pipet kullanmak hız kazandırır. %70 etanol yıkamasıyla ortamda bulunan fazla tuz uzaklaģtırılır. ALTERNATĠF. Bazı laboratuvarlarda DNA santrifüj edilerek çöktürülür. Bu az miktarda DNA nın olduğu durumlarda daha etkili sonuç verir. Ancak %70 etanol ile pellet yine yıkanır ve örnek tekrar spin edilir.

16

17 DNA Miktar Tayinine (Kantitasyon) Genel BakıĢ Kantitasyon, miktarın tayin edilmesidir Niçin kantitasyon yapılır? Kantitasyon yöntemleri Spektrofotometre Slot Blot (Quantiblot) Microplak okuyucu Real Time PCR

18 DNA Kantitasyonu DNA izolasyonunu takiben, DNA konsantrasyonunun ve diğer maddelerin varlığının belirlenmesi amacıyla yapılır. Örneğimde ne kadar DNA var? Kantitasyon ekstraksiyonun baģarısı hakkında ipucu verir. Neden önemli? STR bölgelerinin ya da mtdna nın amplifikasyonu örneğin içerdiği DNA miktarından etkilenir.

19 DNA Kantitasyonu Kantitasyonun temel nedeni: Çoğu PCR yöntemi DNA yeterli düzeydeyse en iyi sonucu verir. DNA ekstraksiyonun çok az olması: DNA amplifikasyonunda baģarısızlık Allel drop out (tamamlanmamıģ amplifikasyon) ile sonuçlanır DNA ekstraksiyonunun çok fazla olması: Amplifiye STR pikleri ölçüm alanını aģar PCR inhibitörlerinin artması

20

21

22

23 DNA saflığı Saflık belirlemede 260/280 nm sonucuna bakılır. Saf bir DNA 260/280=1.8 olmalıdır. 260/280>1.8 ise RNA kontaminasyonu 260/280< 1.8 ise protein kontaminasyonu

24 DNA Miktar Tayini Spektorfotometrik okumalar: UV absorbansı kullanılarak DNA/RNA miktarı ve saflığı belirlenebilir. Halkalı yapılar UV dalga boylarını absorbe edebilir. Ancak pek çok molekül halkalı yapı içerir (nükleik asitler, proteinler, organikler, deterjanlar, lipidler, ve liste sürer...) Hem DNA hem de RNA halkalı yapıları yaklaģık 260 nm de güçlü absorbans verir. Proteinler, bazı amino asitler fenilalanin, triptofan ve tirozin 280 nm de maksimum absorbans verir. Alt çizgi tuz taneciklerinin miktarı ile iliģkilidir. Kaba hesapla, pek çok sey UV absorblar. Aynı zamanda ph a oldukça duyarlıdır, bu nedenle sulandırmada kullanılan TE tamponu ile spektrofotometre kalibre edilmelidir. 260nm deki absorbansın 280nm deki absorbansa oranıyla saflık değeri elde edilebilir DNA = A260/A280 yaklaşık 1.8 RNA= A260/A280 yaklaşık 2.0 Bunlar saflaģtırma ürünleri için iyi sonuçlardır ve aynı zamanda iyi kantitasyon değerine de sahip olacaktır (OD değerlerini DNA miktarına çevirirken 260 nm de ölçülen DNA için katsayı 50ug/ml, RNA için 40ug/ml dir).

25 DNA Kantitasyonu Spektrofotometre: DNA UV ıģığını 260nm de absorblar Daha çok DNA = Daha çok absorbans Ġnsan DNA sına özgül değildir

26

27 DNA Kantitasyonu Ayrıca DNA miktarını belirlemek için genellikle DNA miktarıyla iliģkili olarak yapıya bağlanan Etidyum bromür ve sybr green boyaları da kullanılır. Daha güçlü bir yöntemdir, ancak daha pahalıdır. Etidyum bromürle boyanmıģ bir jelde bant yoğunlukları karģıklaģtırılarak DNA fragmentlerinin kantitasyonu yapılabilir, ölçü olarak bir marker kullanılır. DNA agaroz jelde ayrılır Etidyum bromür ile boyanır (çift zincirli DNA gerekli) Ġnsan DNA sına özgül değil

28 DNA Kantitasyonu Mikroplak okuyucu: Picogreen interkalasyon yapan bir boyadır. Çift zincirli DNA da baz çiftleri arasına bağlanır, floresansı arttırır. Floresan miktarı çözeltideki DNA miktarı ile iliģkilidir.

29 DNA Kantitasyonu Mikroplak okuyucu: