DENİZ ve AKARSULARDAKİ KİRLİLİĞİN KARADENİZ'DEKİ EKONOMİK DEĞERİ YÜKSEK BALIKLARIN STOK ve ÜREMESİ ÜZERİNE OLAN ETKİSİNİN BELİRLENMESİ

Transkript

1 T. C. TARIM ve KÖYİŞLERİ BAKANLIĞI TARIMSAL ARAŞTIRMALAR GENEL MÜDÜRLÜĞÜ DENİZ ve AKARSULARDAKİ KİRLİLİĞİN KARADENİZ'DEKİ EKONOMİK DEĞERİ YÜKSEK BALIKLARIN STOK ve ÜREMESİ ÜZERİNE OLAN ETKİSİNİN BELİRLENMESİ PROJE SONUÇ RAPORU TAGEM / HAYSÜD /98/12/02/00 Yürütücü Kuruluşlar : Trabzon Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsü Orta Doğu Teknik Üniversitesi, Biyoloji Bölümü Prof. Dr. Mesude İŞCAN, Prof. Dr. İnci TOGAN ve İlyas TABAK (Proje Liderleri) Dr. Cevdet UĞUZ, Dr. Ayşe ERGÜVEN, Yıldız EROĞLU, Dr. Mustafa ZENGİN Muammer AKTAŞ ve Bayram ZENGİN Haziran 2001

2

3 ÖZET Deniz ve Akarsularda Kirliliğin Karadeniz deki Ekonomik Değeri Yüksek Balıkların Stok ve Üremesi Üzerine Olan Etkisinin Belirlenmesi Alkilfenol ethoxylate bileşikleri deterjanlarda, boyalarda, pestisidlerde ve plastik eşyalarda kullanılan katkı maddeleridir. Bu bileşiklerin dünyadaki toplam üretim miktarının % 60 dan fazlası kanalizasyon ve endüstriyel atıklarla sularda toplanmaktadır. Alkilfenol bileşikleri sularda alkilfenol türevlerine dönüşmektedir. Bu türevlerin balıklar üzerinde östrojenik etkileri vardır ve bundan dolayı balıkların hormonal dengesinde ve üremesinde ciddi bozukluklara neden olmaktadır. Kadmiyum ise balıklar için toksik ve endokrine sistemi bozucu bir madde olup, endüstriyel atıklarla sulara karışmaktadır. Tatlı ve tuzlu su balıkçılığımızda önemli bir yer tutan Karadeniz Bölgesine has balık stoklarımızın çevre kirliliğine bağlı olarak gittikçe azaldığı gözlenmektedir. Araştırmalarımızda, balık stoklarımız için ciddi bir tehdit oluşturan alkilfenol türevleri ve kadmiyumun, Karadeniz Bölgesindeki akarsularımızda kirlilik oranları, ekotoksikolojik çalışmalarla belirlenecektir. Bunun için, kanalizasyon ve endüstriyel atıkların yoğun olduğu Trabzon daki akarsular ve deniz kıyılarımızdan, su, sediment ve balık örnekleri alınarak, ODTÜ Biyoloji Bölümü nde alkilfenol; Trabzon Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsü nde ise kadmiyumun kirlilik seviyeleri ölçülecektir. Alkilfenol ölçümünde HPLC ve gaz kromatografileri, kadmiyum ölçümünde ise atomik absorbsiyon spektrofotometresi kullanılacaktır. Araştırma bölgelerindeki balık yoğunluğu tespit edilecektir. Balık doku ve organlarında histopatolojik incelemeler yapılarak, kirliliğin balık sağlığına ve üreme organlarına verdiği tahribat araştırılacaktır. Sağlanabilecek ek ödeneğe bağlı olarak, balık doku ve organlarındaki enzim seviyeleri, RFLP, vitellin miktarı ve DNA/RNA oranının tespiti gibi detaylı araştırmalar da yapılabilecektir. ANAHTAR KELİMELER: Alkilfenol, kadmiyum, östrojen, ekotoksikoloji, DNA/RNA oranı, enzim aktivitesi, vitellin 3

4 ABSTRACT A Research on the Effects of Sea and Fresh Water Pollution on the Stocks and Reproduction of Economically Valuable Fishes in the Black Sea Region. Alkylphenol ethoxylate compounds are used as additive substances of detergents, paints, pesticides, plastic materials...etc. The production rate of these compounds is over 300,000 tons per year and more than 60% of this amount accumulates in waters via sewerage and industrial wastes. In water, alkylphenol compounds transform into alkylphenol derivatives. These derivatives have estrogenic effects on fishes and cause serious abnormalities in their reproductive and hormonal systems. Cadmium is also toxic for fishes and it harms their endocrine systems. Cadmium is carried to water by industrial wastes. A decrease due to water pollution is observed in the population of fishes which are unique to Black Sea region and vital to both freshwater and sea fishery. Our ecotoxicologic researches aim to detect the pollution caused by the alkylphenol derivatives and cadmium in the streams of Black Sea region. Sediment, fish and water samples will be collected from the streams and coats of Trabzon where sewage and industrial pollution is high. The pollution level of alkylphenol will be measured at the METU Biology Department whereas that of cadmium will be measured at Trabzon Fisheries Central Research Institute. HPLC and gas chromotography will be used for the detection of alkylphenols and atomic absorbtion spectrophotometry will be used for the detection of cadmium. Fish organs and tissues will be examined in order to detect harms of pollution on fish health and gonads. More detailed researches such as the measurements of enzyme levels, RFLP, amount of vitelline and DNA/RNA ratios in fish organs and tissues will be possible depending on the extra appropriations that might be provided. KEYWORDS: alkylphenol, cadmium, estrogene, ecotoxicology, DNA/RNA ratio, enzyme activity, vitelline 4

5 2. GİRİŞ Direkt ve indirekt olarak, denizdeki canlı kaynaklara ve insan sağlığına zarar verebilecek, balıkçılık dahil denizdeki faaliyetleri engelleyebilecek, deniz suyunun çeşitli kullanımlar için kalitesini bozabilecek ve zarafetini azaltabilecek her madde ve enerjinin insanlar tarafından denize verilmesi; deniz kirliliği olarak tanımlanmıştır. Sularımız, endüstri ve kanalizasyon atıklarıyla gün geçtikçe kirlenmektedir. Çağımızda hızlı endüstrileşme ve kentleşme, yoğun tarımsal uygulamalar bir çok çevre sorununu da birlikte getirmektedir.havası ve suyu kirlenmemiş, toprağı bozulmamış sağlıklı bir çevre 21. asırda yaşayan insanlığın en büyük isteğidir. Suların kirlenmesi doğal güzellikleri ve reaksiyon alanlarını bozar, deniz ürünleri için huzursuz bir ortam yaratır. Kirlenme bilhassa görme, koklama ve dokunma duyularını bozar. Ülkemizde iç sular ve denizlerdeki su ürünleri stoku günden güne azalmaktadır. Bunun büyük bir nedeni kirlenmedir. Su kirlenmesi burada yaşayan canlıların üreme ve gelişmelerini ortadan kaldırmakta, insan sağlığına zararlı olmakta, suların kalitesini bozarak çeşitli amaçla kullanılmasını zorlaştırmaktadır. Karadeniz'de kirlenme daha ziyade hızlı kentleşme ve sanayileşmenin görüldüğü bölgeler etrafında yoğunlaşmaktadır. Bölgemizde bulunan sanayi tesisleri atıkları ve evsel atıklar arıtma yapılmaksızın denize verilmektedir. Ayrıca tarımsal ilaçlar yağmur sularıyla derelere ve denizlere karışmakta ve kirlenmeye sebep olmaktadır. Projenin amacı; Üç tarafı denizlerle çevrili olan ülkemiz, akarsular, irili ufaklı göller ve göletlerle geniş su ürünleri potansiyeline sahiptir. Bu nedenle su ürünlerini artırma yoluna gidilmelidir. Ekotoksikolojik araştırmalar gelişmiş ülkelerde çok yaygın ve kapsamlı olarak yapılmaktadır. Son yıllarda, Avrupa ve Amerika da bilim adamları ve araştırma kurumlarının üzerinde en çok çalıştıkları konulardan birisi de endokrin sistemi bozucu (endocrin disrupter ) olarak adlandırılan toksik maddelerin çevreye verdiği veya verebileceği tahribatın araştırılmasıdır. Endokrin sistemi bozucu etkiye sahip bu maddeler, hormon benzeri olduğundan, canlıların normal fizyolojilerinde hormonal bozukluklara neden olmaktadır. Balıkların cinsiyetleri hormonlarla çok kolay değiştirilebildiğinden, östrojenik etkiye sahip

6 alkilfenol gibi maddelerin, balık populasyonlarının devamı ve korunması için ciddi bir tehlike yaratabileceği düşünülmektedir. Östrojenik alkilfenol türevleri, sadece dişi populasyonlarının ortaya çıkmasına neden olarak, balıkların üremesini tamamen durdurabilir vebalık stoklarının kaybolmasına neden olabilir. Kadmiyumun öldürücü olmayan dozları da balıklardaki aromataz enzimini inhibe ederek, genetik olarak dişi olan balıklarda östrojen sentezlenmesini durdurup, sadece erkek populasyonların ortaya çıkmasına neden olabilir ve yine balık stoklarının kaybolmalarına sebep olabilir. Ayrıca kadmiyumun balıkların üremelerini azaltıcı etkileri de bilinmektedir. Balık türlerinin insanlar tarafından besin olarak tüketilmesi ve balık yan ürünlerinin yemlerde sıkça kullanılması yoluyla sonuçta bu zararlı maddelerin insanlara ulaşması neticesinde bir alkilfenol türevi olan nonilfenolün meme kanserine, kadmiyumun kemiklerin kolay kırılabilir hal almasına yol açan Itai Itai hastalığına ve immunolojik bozukluklara neden olduğu bilinmektedir. Bu yönüyle konu insan sağlığı açısından da son derece önemlidir AMAÇ: Alkilfenol ve kadmiyumun neden olduğu kirlilik saptanacak, bu kirliliğin su ürünlerine olan biyolojik yansıması belirlenecek ve bu maddelerin canlı organizmadaki etkilerinin biyokimyasal ve moleküler mekanizmaları açıklığa kavuşturulacaktır. Bu maddelerin kirliliğine bağlı olarak, üreme organlarında ( testis ve ovaryumlarda ) anormal oluşumlar görülmesi beklenmektedir. bu değişiklikler ile kirlilik miktarları arasında korelasyon saptanması, su ürünlerini tehdit eden kirlilik seviyelerinin belirlenmesini sağlayacaktır. Endokrin sisteme zarar veren bu maddelerin hem çevreye, hem de insan sağlığına etkilerinin incelenip, bu etkinin ekonomik boyutunun araştırılmasına ve bu zararlı etkilerin azaltılması için çalışmalar yapılmasına yardımcı olacak bilgiler elde edilecektir KAPSAM: Bu proje özet bölümünde de bahsedildiği gibi, alkilfenol ve kadmiyumun, balıkçılığımızda en önemli paya sahip Karadeniz Bölgesi nde gerek deniz ve gerekse akarsu 6

7 bazında hangi derecede kirlilik yarattığını araştırmak üzere hazırlanmıştır. Bu proje alanında dünyadaki araştırmalar çok yenidir. Avrupa ve Amerika da yapılan çalışmalarda, alkilfenol bileşiklerinin, nehirlerde ve hatta içme sularında birikme oranı ölçülmüştür. Ölçülen miktarlar mikromolar seviyelerine kadar ulaşmaktadır.bu konsantrasyondaki alkilfenol bileşikleri balıklara in vivo ve in vitro koşullarda uygulanıp, etkileri araştırılmıştır. Alkilfenol bileşiklerinin, alabalıklarda östrojenik bir etkiye sahip olduğu ortaya konmuştur. Ayrıca, alkilfenol türevi olan nonilfenolün insanlarda meme kanserine yol açtığı elde edilen bulgular arasındadır. Bu maddelerin insan sağlığını tehdit etmesinden dolayı, alkilfenol türevleri üzerindeki tıbbi araştırmalar da yoğunluk kazanmaktadır. Ülkemizde bu konuda hiçbir araştırma yapılmamıştır. Kadmiyum üzerinde ise yurdumuzda ve yurt dışında daha önceden yapılan araştırmalar vardır. Ancak araştırmalar daha çok, sularda kadmiyumun öldürücü toksik dozlarının bulunup bulunmadığı yönünde yoğunlaşmıştır. Kadmiyum miktarı eğer öldürücü toksik dozun altında ise normal kabul edilmiştir. Son zamanlarda yapılan incelemeler ise, kadmiyumun öldürücü olmayan dozlarının da, su ürünlerini tehdit ettiğini ortaya koymuştur. Elde edilen bu bilgiler doğrultusunda, adı geçen kirlilik parametrelerinin belirlenmesi gerekliliği ortaya çıkmış ve Türkiye de ilk olacak bu çalışma planlanmıştır. Bu çalışmada sağlanacak ödenek miktarına bağlı olarak önce Trabzon ve civarında (yakın çevre olması nedeniyle) akarsu ve deniz ortamlarından örnekler (su, sediment, balık) alınıp, bu örneklerde alkilfenol türevleri ve kadmiyum ölçümleri yapılacak, çıkan sonuçlar proje çalışmaları sırasında ayrıca yürütülecek olan stok yoğunluğu tespiti çalışmaları neticesinde elde edilen veriler göz önüne alınarak bir korelasyon saptanması yoluna gidilecektir. Bu aşamada kirletilmiş bölgelerdeki yoğun nutrient varlığı nedeni ile stok yoğunluğu referans olarak seçilen kirletilmemiş bölgelere nazaran büyük çıkabilir. Ancak histopatolojik çalışmaların sonuçları su ürünlerinin sağlıklı üreme ortamlarının özellikleri konusunda açık bilgiler vereceğinden, kirliliğe duyarlı ve kirliliğe daha dayanıklı türler üzerinde gözlenebilecek stok yoğunluğu farklarını baz alarak korelasyon saptamak daha gerçekçi olacaktır. Projenin planlanması aşamasında akla gelen ilk sorunlardan biri Türkiye de ilk kez çalışılacak olan alkilfenol kirliliğinin doğru örnekleme zamanının seçilmesi idi. Projenin oldukça ayrıntılı ve hassas analizlere ihtiyaç duyması, hem finansman, hem de personel açısından yeterli destek bulabilme şartına direkt bağlı olmak kaydıyla, kirlenmenin mevsimsel 7

8 şartlar nedeni ile ( tarımsal ilaçlamalar, yağış miktarı gibi ) yoğunlaştığı veya azaldığı, balıkların üreme faaliyetlerinin gerçekleştiği dönemler göz önüne alınarak yılda iki kez örnekleme yapılması öngörülmüştür. Alınan örneklerin analize hazırlanıp, analizlerin gerçekleştirilmesi süreleri parametrelere göre farklı ihtiyaçlar göstermektedir. Bazı parametrelerin 15 gün gibi kısa bir süre içerisinde analizlerinin bitirilmesi gerekliliği ve çok pahalı materyal sarf edilmesi, çalışılacak örnek sayısı konusunda da kısıtlamaya gidilmesine yol açmıştır. İstatistik olarak yorum yapabilmek için gerekli asgari örnek sayısına ulaşabilmek konusunda, çalışmalar başladıktan sonra ortaya çıkabilecek; metodun uygulanabilirliği, örneklerin zamanında ve uygun koşullarda analiz mahalline ulaştırılması gibi sorunlar da göz önüne alınarak proje süresinin kısa olduğu söylenebilir. Çalışmanın Türkiye de ilk kez yapılacağı düşünüldüğünde, hesaplanamayan başka sorunların varlığını da kabul ederek bu sürenin sonunda böyle bir çalışmanın eldeki imkanlarla ne dereceye kadar başarılabileceği konusunda fikir sahibi olmayı beklemekteyiz. Edinilecek tecrübelerin ışığında, ileride daha büyük finansman bulunduğu takdirde, proje süresi uzatılarak kapsam ve çalışma sahası genişletilebilir. 8

9 3. LİTERATÜR ÖZETİ Bu proje kapsamındaki araştırmalar dünyada çok yenidir. Özellikle endokrin sistemi bozucu maddeler olarak adlandırılan alkil fenol bileşiklerinin etkilerinin araştırılması, Amerika ve Avrupa da 1990 larda hız kazanmıştır. Sularda bu maddelerin ölçümleri, 0ngiltere ve ABD de yapılmıştır. Bu konuda en fazla çalışma İngiltere den Susan Jobling, John Sumpter ve arkadaşlarına aittir. Jobling, Sumpter ve arkadaşları, gerek in vitro gerekse in vivo yaptığı çalışmalarda, alkilfenol bileşiklerinin balıklar üzerinde östrojenik bir etkiye sahip olduğunu bulmuşlardır. Alkilfenol bileşiklerinin insan sağlığı için de bir tehdit olduğu yapılan tıbbi araştırmalarla ortaya konmuştur. Tıp alanında bir bilimsel dergi olan Environmental Health Perspective dergisinin 103. sayısı (suppl.7), tümüyle endokrin sistemi bozucu maddeler üzerinde yapılan araştırmalara ayrılmıştır. Bu maddeler arasında alkilfenol bileşikleri çok önemli bir yer tutmaktadır. Kadmiyum üzerinde yapılan araştırmalar çok daha eski olmakla birlikte, kadmiyumun endokrin sistemi bozucu etkiye sahip olduğuna ilişkin araştırmalar yenidir. Karadeniz'in Türkiye kıyılarında bulunan, evsel ve sanayi atıklarının deşarj bölgelerinde daha önceden yapılmış bir çalışma bulunmadığı için bir karşılaştırma yapmak mümkün olmamaktadır. Fakat Karadeniz'e kıyısı olan ülkelerin yapmış oldukları çalışmalar şunlardır; Romanya'nın yıllarında kıyı yüzey sularında yapmış olduğu çalışmalarda bakır miktarı mg/l arasında bulunmuştur (31). FAO 1990 kayıtlarına göre 1983 ve 1984 yıllarında Sakarya Nehrinden alınan su örneklerinde belirtilen bakır değerleri, her iki senede aynı olmak üzere mg/l arasında bulunmuştur. Yine aynı kayıtlara göre Tuna nehri sedimenti düşük konsantrasyonlarda ağır metal içerir. Örneğin; Bakır miktarı mg/l arasındadır (33). FAO 1990 kayıtlarına göre 1983 ve 1984 yıllarında (10) Sakarya Nehrinde sırasısıyla 1.73 ve 1.74 mg/l ve Yeşilırmak nehrinde sırasıyla ve 0.26 mg/l demir tespit edilmiştir. Yine aynı kayıtlara göre Tuna nehri sedimenti düşük konsantrasyonlarda demir içerir. Demir miktarı 3-7 mg/l arasındadır. FAO 1990 kayıtlarına göre (33) Karadeniz'de ortalama inorganik besleyici elementlerden nitrat azotu 1-10 m derinlikler arasında mg-at/l dir. Yine aynı kayıtlara göre Sakarya Nehrinde yapılan ölçümlerde nitrat azotu miktarı yıllarında 1.14 mg/l olarak

10 bulunmuştur. Yeşilırmak ta 1984 yılında yapılan ölçümlerde nitrat azotu 0.53 mg/l olarak bulunmuştur. Kızılırmak ta 1983 yılında yapılan ölçümlerde nitrat azotu 1.69 mg/l, 1984 yılında ise 7.5 mg/l olarak bulunmuştur yılları arasında Dinyester Nehrinin akış hızının düşük olduğu kısımlardaki nitrat azotu miktarı mg/l den mg/l'ye yükselmektedir. FAO 1990 kayıtlarına göre (33) Karadeniz'de ortalama inorganik besleyici elementlerden amonyak azotu 1-10 m derinlikler arasında mg-at/l dir. Yine aynı kayıtlara göre Sakarya Nehrinde 1983 yılında yapılan analizlerde amonyak azotu 0.45 mg/l, 1984 yılında ise amonyak azotu 0.43 mg/l olarak bulunmuştur. Yeşilırmak ta 1983 yılında yapılan ölçümlerde amonyak azotu miktarı 0.31 mg/l olarak, 1984 yılında ise 0.26 mg/l olarak bulunmuştur. Kızılırmak ta 1983 yılında yapılan ölçümlerde amonyak azotu miktarı 0.41 mg/l olarak, 1984 yılında ise 0.49 mg/l olarak bulunmuştur. FAO 1990 kayıtlarına göre Sakarya Nehrinde 1983 yılında yapılan analizlerde askıdaki katı madde miktarı mg/l, 1984 yılında ise 605 mg/l olarak bulunmuştur. Yeşilırmak ta 1983 yılında yapılan ölçümlerde askıdaki katı madde miktarı 105 mg/l, 1984 yılında ise mg/l olarak bulunmuştur (10). Buradan da anlaşılıyor ki nehirlerin getirdiği askı yük, Karadeniz'i büyük ölçüde etkilemiştir. Tuğrul ve arkadaşlarının (35) yaptıkları bir çalışmada Karadeniz le ilgili olarak nitrat, fosfat ve hidrojen sülfür (H 2 S) değerlerinin su yoğunluğuna ( t) bağlı düşey dağılımlarını irdeleyerek, bu parametrelerin derinliğe değil t ye uyumlu olarak değiştiğini tespit etmişlerdir. 10

11 4. MATERYAL v e METOD 4.1. MATERYAL Laboratuar Cihazları Çalışmada kullanılan laboratuar cihazları ve bu cihazların teknik özellikleri Tablo 1 de verilmiştir. Tablo 1. Kullanılan laboratuar cihazları ve özellikleri. Cihazlar Su Analiz Cihazı Refraktometre Spektrofotometre Etüv Vibratör Arazi Tipi Soğutucu Santrifüj Saf Su Cihazı Manyetik Karıştırıcı Salinometre Özellikleri HORİBA marka U-7 ve U-10 model, elektrometrik yöntem ile anında fiziksel (sıcaklık, ph, elektriksel iletkenlik, bulanıklık, tuzluluk ve çözünmüş oksijen) ölçümler yapan arazi tipi dijital göstergeli bir cihazdır. Sudaki tuzluluğun anında ölçülmesinde kullanılan bir alettir. HACH marka DR/2000 model mg/l seviyesinde ölçüm yapan elektrikle ve şarj pilleriyle çalışabilen, arazi tipi bir cihazdır. Optik yöntemlerden Spektrofotometrik (moleküler absorpsiyon spektroskopisi) yöntem ile metallerin belli ph değerlerinde organik reaktiflerle meydana getirdikleri renkli komplekslerin suda çözünmeyen organik çözücülerle ekstraksiyonundan sonra, bilinen dalga boylarında spektrofotometrede tayini esasına dayanmaktadır. Bu cihazla, proje gereği alınan deniz suyu örneklerinde; amonyak azotu, nitrat azotu, nitrit azotu, fosfat, demir, bakır, klorofil-a, yağ ve deterjan parametrelerinin miktarları arazide tayin edilmiştir. ELEKTRO-MAG marka C aralığında ısıtma yapan bir cihazdır. ELEKTRO-MAG marka tüp karıştırıcısıdır. ELECTROLUX marka RC 1600 model, elektrikle ve arabanın aküsü ile çalışabilen arazi tipi bir cihazdır. Sıcaktan ve ışıktan korunması gereken su örnekleri ile kimyasal çözeltilerin taşınmasında kullanılmıştır. HETTİCH marka EBA 3S model bir cihazdır. KÖTTERMAN marka 1033 model, saatte 7 litre kapasiteli bir cihazdır. NÜVE marka MK 218 model, elektrikli manyetik karıştırıcı ve ısıtıcıdır. YSI model 33 S-C-T METER, pille çalışan mekanik bir cihazdır. Sıcaklık, tuzluluk ve iletkenlik ölçmektedir.

12 Av Araç ve Gereçleri Akarsu ortamındaki örneklemelerde iki değişik boyutta (5 ve 6.5 m çaplı) ve göz açıklığında (17 ve 22 mm) serpme ve özellikle küçük derelerde ve yan kollarda daha iyi performans gösteren Auseng marka, IG.00 Baujahr 11/84 tipinde, volt doğru akım elektrik üretebilen, akım şiddeti dört ayrı kademede ayarlanabilme özelliğinde olan ve sırtta taşınabilen elektroşok cihazı kullanılmıştır. Ayrıca örnekleme çalışmalarında 28, 32, 36 ve 40 mm göz açıklıklarına sahip 100 er metre uzunlukta 8 adet fanyasız, 17, 28 mm göz açıklıklarına sahip 100 m uzunlukta iki adet fanyalı olmak üzere, değişik özellikte kıyı uzatma ağları kullanılmıştır YÖNTEM Ölçülen parametreler Alkilfenoller: Suda ve sedimentde bulunması muhtemel alkilfenoller destilasyonla alınıp uygun koşullarda ve uygun kolon kullanılarak HPLC tekniğiyle ölçülecektir. Kadmiyum: Suda, sedimentde, askıdaki katı maddede, balık karaciğerinde ve balık gonatlarında bulunan kadmiyum, uygun ekstraksiyon ve çözme yöntemleri kullanılarak belirli hacme tamamlanmış çözeltiler haline getirilip atomik absorbsiyon spektrofotometresinde grafit fırın şartlarında ölçümleri yapılacaktır. Balık yoğunluğu: Akarsu ve deniz ortamında seçilen kirletilmiş ve temiz istasyonlarda CPUE tekniği kullanılarak tespit edilecektir. Histopatolojik incelemeler: Balık gonatlarından alınan örnekler cinsiyet ve yaş tespitleri de yapılarak Bouin s solusyonunda fix edilip daha sonra etil alkol çözeltisine alındıktan sonra parafin kullanılarak bloklar halinde dondurulup, mikrotomla kesilip, lamlar üzerine fixedilerek boyanıp mikroskop altında incelenecektir. Enzim aktivitesi : Balık kanında. DNA/RNA oranı : Balık kanında. 12

13 ÖRNEKLEME ÇALIŞMALARI Sakarya Nehri Üzerinde Örnekleme Sakarya nehri üzerinde 5-9 Temmuz 1999 tarihleri arsında, Şekil 1 de görüldüğü gibi 5 istasyondan su, sediman ve balık örnekleri alındı. Örneklemeye, ilk istasyon olarak seçilen, Seyitgazi, Seyitsuyu deresinden başlandı. İki litre su ve 0,5 kg sediman örneği alındı. Işığın alkilfenol üzerine olan etkisini ortadan kaldırmak için, örnekler renkli cam şişeler içerisinde +4ºC de saklandı. Ayrıca, su ve sediman örneklerinin mikrobiyal bozulmasını önlemek amacıyla örneklere % 10 oranında formaldehit ilave edildi. Örnekler; alkilfenol ölçümü için ODTÜ-Biyoloji, Cd ++ ölçümü için ise Trabzon Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsündeki laboratuarlara nakledildi. Şekil 1. Sakarya nehri ve Değirmendere üzerindeki örnekleme istasyonları. S 1, Seyitsuyu; S 2, Porsuk Çayı; S 3, Sarıcakaya; S 4, Pamukova; S 5, Karasu on Sakarya River. D 1, Su Ürünleri Yüksek Okulu Önü; D 2, Maçka; D 3, Esiroğlu; D 4, Sanayi Sitesi. 13

14 Balık örnekleri, dere ve nehirlerden elektroşok yöntemi ile toplandı. Balıkların karaciğeri ve gonadları ayrıldı. Gonadlar, Bouin s solüsyonu içerisinde 24 saat fiks edildikten (sabitleştirildikten) sonra musluk suyu ile yıkanarak % 70 etil alkol içersinde muhafaza edildi. Karaciğeri ve gonadı ayrılmış balık karkasları ve balık karaciğerleri etiketlenerek ayrı ayrı kilitli torbalarda sıvı azot içerisinde donduruldu. Şekil 1 de görüldüğü gibi, örneklemeler aynı yöntemlerle, Sakarya nehrinin aşağı bölgelerinden, sıra ile Porsuk Çayı, Sarıcakaya, Pamukova ve Karasu dan yapıldı Yalnızca Porsuk Çayı nda balık örneği alınamadı. Örnekleme esnasında suyun ph sı, çözünmüş oksijen miktarı (ÇO) ve sıcaklığı ölçüldü (Tablo 2). Tablo 2. Değirmendere ve Sakarya nehrinde su kalitesine ilişkin parametreler. Parametreler Çözünmüş O 2 (mg/l) Sakarya nehri Değirmendere S 1 S 2 S 3 S 4 S 5 D 1 D 2 D 3 D ph Sıcaklık (ºC) Değirmendere Üzerinde Örnekleme Şekil 1 de görüldüğü gibi Değirmenderesi üzerinde 4 istasyondan örnekleme yapıldı. Sakarya nehri üzerinde yapılan örnekleme yöntemi, Değirmenderesi üzerinde de aynen tekrarlandı. Örneklemeye, Değirmenderesinin en üst kısımlarından, Su Ürünleri Yüksek Okulu çevresinden başlandı. Daha sonra aşağıya doğru sırasıyla, Maçka çıkışından, Esiroğlu ve Değirmenderesinin Karadeniz'e döküldüğü yer olan, Sanayi Sitesi çevresinden su, sediman ve balık örnekleri alındı. Örnekler, daha önce anlatıldığı gibi muhafaza edildi. Yukarıda da belirtildiği gibi, örneklerin bir kısmı, alkilfenol ölçümü ve histoloji için ODTÜ-Biyoloji laboratuarlarına; kadmiyum ölçümü için de Trabzon Su Ürünleri Merkez Araştırma Enstitüsüne nakledildi. Laboratuarlarda, su ve sediman örnekleri +4 C de, doku örnekleri ise -22 C de ölçümlerin yapılacağı zamana kadar muhafaza edildi. Su ve sediman 14

15 örneklerinde alkilfenol ölçümlerine derhal başlandı. Bütün istasyonlardan alınan su ve sediman örneklerinin hepsinde ölçümler yapıldı. ALKİLFENOL ÖLÇÜMÜ Gerekli Materyal Shimadzu HPLC pompası (model LC-9A), spektrofotometresi (model UV-160A) ve integratörü (model CR-6A), Luna C18 HPLC (250 x 4.6 mm, 5 l) kolonu, C18 BOND ELUTE (100 mg/ml) oktadesil silika kartuşu ve HPLC kalitede metanol (Merck) kullanılmıştır. Ayrıca, alkilfenol türevleri olan 4-tert- bütilfenol, 4-tert- oktilfenol, 4- nonilfenol Aldrich firmasından temin edildi ve HPLC de alkilfenol ölçümü optimizasyonu için kullanıldı. HPLC de Standart Alkilfenol Ölçümü Standart alkilfenol türevleri etil alkol içerinde çözülerek stok solüsyonlar hazırlandı. 0,2203 gr nonilfenol; 0,206 gr oktilfenol; 0,150 gr bütilfenol; 100 ml etanol içerisinde çözülerek 10 mm stok solüsyonu hazırlandı. 1, 0.5, 0.1, 0.05 ve 0.05 mm solüsyonlar 10 mm stok solüsyonunun seyreltilmesi ile elde edildi. Örneğin, 1 mm elde etmek için 10 mm solüsyondan 100 l alınarak 900 l etanol içerisinde seyreltildi. Etanol içersinde hazırlanan solüsyonlarda, alkilfenol türevlerini birbirinden ayırmak özellikle oktilfenol ve nonilfenol bileşiklerini ayırmak mümkün olmadığından, solüsyonlar aynı yöntemle metanol içerisinde hazırlandı. Metanol içersinde hazırlanan solüsyonlarda nonilfenol ve oktilfenolü birbirinden ayırmak mümkün hale geldi. Alkilfenol bileşikleri değişik konsantrasyonlarda ölçülerek, her konsantrasyona denk düşen minimum peak alan değerleri tespit edildi. Lineer regresyon hesabı yapılmıştır ve regresyon eşitliği; bütilfenol için Y= x; nonilfenol için Y= x; oktilfenol için Y= x. Regresyon eşitlikleri istatisksel olarak anlamlıdır (p<0.01). Doku, sediman ve sularda ölçülen nonilfenol peak alanları, bu eşitlikteki X yerine yazılarak işlem yapıldığında, mm cinsinden alkilfenol miktarı bulunacaktır. Standart alkilfenol ölçümler için Luna C18 (İSOKRATİK) HPLC (4,6x250 mm, 5 µl) kolonu ile normal faz ve isokratik HPLC yöntemi kullanıldı (Ahel ve Giger, 1985). Solid ve polar olmayan faz oktadesil silika sıvı ve polar faz olarak da % 100 HPLC kalitede metanol 15

16 kullanıldı. HPLC de 0.2 ml/min akış hızında, değişik konsantrasyonlarda hazırlanan nonilfenol, oktilfenol ve bütilfenol standart çözeltileri kullanılarak, ölçüm koşulları optimize edildi (Ahel ve Giger, 1985; Marcomini ve arkadaşları, 1987)). Standart çözeltilerden ve özütleme (ekstraksiyon) işlemi tamamlanan, su ve sediman, ve doku örneklerinden HPLC'ye 25 l yüklenerek ölçümler yapıldı. Tablo 3. Standart alkilfenol konsantrasyonlarına göre HPLC de okunan peak değerleri Concent. (mm) Standart alkilfenol türevlerinin HPLC de verdikleri Peak değerleri Bütilfenol Nonilfenol Oktilfenol API peak alanı peak alanı peak alanı peak alanı g/ml mean SE n=2 g/ml mean SE n=2 g/ml mean SE n=2 mean SE n= Şekil 2, 3, 4, ve 5 te, standart alkilfenol türevleri olan nonilfenol (NP) ve oktilfenol (OP) nin, C18 oktadesil silika kolonundan tutulma zamanları 17, 23 ve 24 dakikadır. Bütilfenolün HPLC de verdiği peak ve kolonda tutulma zaman şekil 3 de, nonilfenolün Şekil 4 de ve okilfenolün ise Şekil 5 de görülmektedir. Bütilfenol, nonilfenol ve oktilfenol metanol içerisende çözünerek elde edilen karışımının HPL analizi ise Şekil 6 da görülmektedir. Şekil 6 da görüldüğü gibi nonilfenol ve oktilfenolün tutulma zamanı 23 ve 24. dakikada örtüşmektedir. Nonilfenol, oktilfenolden yaklaşık 30 saniye daha geç çıkmaktadır (Şekil 6). Ayrıca, standart alkilfenol türevlerinin ayrı ayrı ve birlikte ölçümlerinde görülen ve tutulma zamanı 37 dakika olan bir peak daha vardır ve bu peak alkilfenol ilintili indikatör olarak adlandırılmıştır (Şekil 2-5). 16

17 Şekil 2. HPLC de bütilfenol peaki. İsokratik ve normal faz HPLC yöntemi ile 0.5 mm (75 g/ml) standart 4-tert-butilfenol analizi. BP, butilfenol; API, alkylphenol ilintili indikatör. Şekil 3. HPLC de nonilfenol peaki. İsokratik ve normal faz HPLC yöntemi ile 0.5 mm (110 g/ml) standart 4-nonilfenol analizi. NP, nonylphenol; API, alkylphenol ilintili indikatör Şekil 4. HPLC deki Oktilfenol peaki. İsokratik ve normal faz HPLC de 0.5 mm (103 g/ml) standart 4-tert-oktilfenol analizi. OP, octylphenol; API, alkylphenol ilintili indikatör. 17

18 Şekil 5. Standart alkilfenol türevleri olan bütil, nonil ve oktilfenollerin HPLC de verdikleri peakler. 75 g/ml bütilfenol (BP); 110 g/ml nonilfenol (NP); 103 g/ml oktilfenol (OP) ün metanol içinde çözülmesinden sonra isokratik ve normal faz HPLC yöntemi ile ölçülmesi. API, alkilfenol ilintili indikatör. Alkilfenol türevleri olan bütil-, nonil- ve oktilfenol standartları HPLC de ölçüldüğü zaman, dakikalarda bir peak daha görülmektedir. Bu peak, alkilfenol türevleri HPLC ye ayrı ayrı yüklendiği zamanda da dakikalarda görülmektedir. Bu peak in etoksi ünitesi olduğu tahmin edilmektedir. Sularda Alkilfenol Özütlemesi Ölçüm için alkilfenol bileşiklerinin su örneklerinden özütlenip, HPLC çözücüsü içerisinde çözünebilir hale getirilmesi gerekmektedir. Bu nedenle, su örnekleri, C18 BOND ELUTE kartuşlarından filtre edildi. Su içerisinde bulunan, alkilfenol bileşikleri C18 kartuşlar içindeki oktadesil silika tarafından tutulmaktadır. Oktadesil silika tarafından tutulan alkilfenol bileşikleri metanol ile yıkandığı zaman, kartuşlardan serbest kalıp, metanol içerisine geçmektedir (Marcomini ve arkadaşları, 1987). Böylece, alkilfenol bileşikleri sulardan C18 BOND ELUT kartuşu ile ayrılıp, metanol içerisinde toplanarak ölçülecek hale getirilmektedir. Deiyonize su örneğine eklenen standart alkilfenol konsantrasyonları, istenilen oranda konsantre edilerek ölçülebilmektedir. Örneğin, 100 ml deiyonize su örneğindeki 10 M alkilfenol konsantrasyonu, C18 BOND ELUT kartuşundan geçirildikten sonra, kartuş 10 ml 18

19 metanol ile yıkanarak 10 defa konsantre edilmiş oldu. Böylece, deiyonize su içerisine konan 10 µm, yukarıda tarif edilen yöntemle 10 defa konsantre edilerek 100 µm konsantrasyona ulaşılmaktadır. C18 BOND ELUT kartuşu ile deiyonize sudan alkilfenolleri konsantre etme işlemindeki duyarlılık oranı oktilfenol ve nonilfenol için bütilfenolden daha fazladır (Şekil 6). Şekil 6. Su örneklerinden özütlenen standart bütil, oktil, ve nonilfenolün HPLC de verdiği peakler. BP, bütilfenol; NP, nonilfenol; OP, oktilfenol. Su örneklerinden 100 ml alınarak C18 BOND ELUT kartuşundan filtre edildi ve 10 ml metanol ile kartuş yıkanarak ekstraktsiyon (özütleme) yapıldı ve HPLC de metanol içindeki alkilfenol miktarı ölçüldü. Su örneklerinden alkilfenollerin ekstrakte edilebilirliğini test etmek için, 100 ml su örneğine 10 M alkilfenol türevi eklendi ve C18 BOND ELUT kartuşundan geçirildi. Daha sonra kartuş, 10 ml metanol ile yıkanarak, su örneğine konan 10 M, 10 defa konsantre edildi. Ancak, Sakarya nehri ve Değirmenderesinden alınan su örneklerinde, konsantre etme ya da suya konulan alkilfenol miktarını tekrar ekstrakte etme işlemi, deiyonize sudan ekstrakte etme işlemine oranla daha az duyarlı bulundu. C18 BOND ELUT ile sulardan alkilfenol ekstraksiyondan işleminden sonra, 100 M olması gereken konsantrasyonunun daha 19