INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus

Transkript

1 INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus KOD: FRI INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus v6 de p 1/9 Türkçe Üretici: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belgium Tel BTW BE RPR Gent Dağıtıcı: Fujirebio Europe N.V. Tel Fax customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel Fax germany@fujirebio-europe.com Fujirebio France SARL Tel Fax france@fujirebio-europe.com 0459 Fujirebio Italia S.r.l. Tel Fax italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel Fax spain@fujirebio-europe.com Vurgulanan değişiklikleri not edin. AVRUPA GR IS LT RO SK TR LI MT EE AVRUPA-dışı US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

2 80617 INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus / v6 de / KOD: FRI10743 p 2/9 İÇİNDEKİLER Kullanım amacı...2 Test prensibi...2 Reaktifler...3 Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları....3 Gerekli ama sağlanmayan malzemeler...3 Güvenlik ve Çevre Koşulları...4 Örnek toplama,hazırlama ve saklama...4 DNA ekstraksiyonu...4 PCR mix in hazırlanması...4 PCR cycling...5 Uyarılar ve önlemler...5 Test prosedürü...5 Sonuçlar...7 Görselleştirme...7 Onaylama...7 Prosedür sınırlamaları...7 Test performansı...8 Uygulama aralığı...8 Kesinlik...8 Lisanslar...9 Ticari markalar...9 Kullanılan Semboller Üretici In vitro diagnostik medikal ürün Parti kodu Katalog numarası Tarafından kullanım Kullanım talimatlarına bakın Sıcaklık sınırlaması Amplification kit Amplification buffer LiPA Taq Primer solution DRB1 Primer solution DRB1*03,11,13,14 Kullanım amacı INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus kit, in vitro kullanım için, insan lökosit antijeni (HLA) DRB1 lokusunun 2. ekzonunun nükleik asit amplifikasyonu için tasarlanmıştır. Söz konusu reaksiyon, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) vasıtasıyla gerçekleştirilir. Test prensibi INNO-LiPA HLA-DRB1 stribiyle kombinasyon halinde kullanılan INNO-LiPA DRB1 Amplification, HLA-DRB1 allellerinin allel grup seviyesinde tiplendirmesini yapmak için taasarlanmıştır. Ancak, bazı belirsizlikler devam etmektedir. En sık karşılaşılan belirsizlikleri yani DRB1 * 03,11,13 ve / veya 14 alleli içeren belirsizlikleri gidermek için HLA-DRB1 * 03,11,13,14 amplifikasyonu eklenmiştir. PCR

3 80617 INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus / v6 de / KOD: FRI10743 p 3/9 ile amplifiye edilecek olan DNA örneği, aşırı miktarda deoksinükleosid 5'-trifosfat (dntp), biyotinlenmiş primerler ve termostabil DNA polimeraz içeren bir reaktif karışımına eklenir. HLA- DRB1 primerleri, DRB1 lokusunun 2. ekzonunu amplifiye etmek için tasarlanmıştır Primer bağlanma alanında uyumsuz olan ve bu nedenle HLADRB1 primerleriyle amplifiye edilmeyen HLA-DRB1 allelleri, INNOLiPA HLADRB1 Plus tiplendirme tablosu ile kullanılmak üzere kullanım kılavuzunda listelenmiştir. INNO-LiPA HLA-DRB1 Plus tipleme tablosunun kullanım kılavuzundalistelenenler hariç spesifik HLA-DRB1*03,11,13,14 primerleri tüm DRB1*03, DRB1*11, DRB1*13 ve DRB1*14 allelerinin ekzon 2 sini amplifiye edecektir. Ayrıca, HLA-DRB1*03,11,13,14 primerleri DRB1*0820 allelinin ekzon 2 sini amplifiye edecektir. Isıtma ile, DNA sarmalının iki iplikçiği, hedef sekansları primere maruz bırakmak üzere ayrılır (denatürasyon). Bu primerler, hedef sekansı kuşatan bölgeleri tamamlar. Bu nedenle, belirli bir sıcaklığa soğutulduktan sonra, primerler hedef bölgeye bağlanır (bağlanma). Başka bir sıcaklıkta ve dntp'leri kullanarak, termostabil DNA polimeraz bağlanmış primerleri hedef şablon boyunca uzatır (uzatma). Böylelikle, bir denatürasyon, bağlanma ve uzatma döngüsünden sonra şablon sekansın iki tam biyotinlenmiş kopyası üretilir. Bir çok döngüden sonra, hedef sekansın çok sayıda biyotinlenmiş kopyası elde edilir. Reaktifler Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları. - Reaktifler, bulaşıcı DNA'nın herhangi bir kaynağından, özellikle de amplifiye DNA ürünlerinden izole edilmiş olarak saklanmalıdır /-15 C de tutulursa, açılmış ve açılmamış ve orijinal şişelerde saklanan, reaktifler kitin son kullanma tarihine kadar stabildir. Ancak, ilk kullanımdan sonra reaktiflerin (LİPA - Taq hariç) porsiyonlanması ve -25/-15 C de saklanması tavsiye edilir (en fazla 4 kez dondurma/ çözme işlemi yapılabilir). - Son kullanım tarihi geçmiş kitin reaktiflerini kullanmayın. - Kit reaktiflerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler, istikrarsızlık veya bozulma belirtisi olabilir. Sağlanan Reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Amplification buffer 1 x 0,3 ml Bütün dntp leri ve koruyucu olarak 0.05% NaN3 içerir. Kullanmadan önce tamamen çözün ve C ye getirin. Primer solution DRB1 1 x 0,3 ml Biyotinlenmiş primerler, MgCl2, ve koruyucu olarak %0.05 NaN3 içerir. Kullanmadan önce MgCl2 tamamen çözünmesini sağlayın ve C ye getirin. Primer solution DRB1*03,11,13,14 1 x 0,07 ml Biyotinlenmiş primerler, MgCl2, ve koruyucu olarak %0.05 NaN3 içerir. Kullanmadan önce MgCl2 tamamen çözünmesini sağlayın ve C ye getirin. LiPA Taq 1 x 0,035 ml Taq DNA polimeraz (3 U/µL) ve koruyucu olarak %0.05 NaN3 içerir. Kullanım öncesinde -25/-15 C de muhafaza edin. Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - DNA ekstraksiyonu için materyaller. - Tek kullanımlık eldiven. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli).

4 80617 INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus / v6 de / KOD: FRI10743 p 4/9 - Steril mikrotüpler. - Mikrotüp rakları. - Mikrotüp santrifüjü. - DNA thermal cycler ve ekipmanları. - Dağıtım için ayarlanabilir pipetler 1-20 µl, µl ve µl. - Otoklavlanmış distile su. Güvenlik ve Çevre Koşulları Potansiyel olarak tehlikeli bileşenler hakkında bilgi edinmek için lütfen Güvenlik Bilgi Formuna (SDS) ve ürün etiketine bakın. En yeni SDS versiyonu te mevcuttur. Tehlike İfadeleri EUH210 Güvenlik bilgi formu istek üzerine temin edilebilir. - Bu test, sadece eğitimli personel tarafından yapılmalıdır. - Amplification buffer, primer solution HLA-DRB1, primer solution HLA-DRB1*03,11,13,14 ve LiPA Taq, koruyucu olarak sodyum azid içerir. Toksik gaz oluşumunu engellemek için sodyum azid ile asitleri temas ettirmeyin. Sıhhi tesisatta patlayıcı kurşun veya bakır azid oluşumunu önlemek için, sodyum azid içeren solüsyonların atılmasından sonra atık kanallarını su ile iyice yıkayın. - Örnekler, her zaman potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. - Kişisel koruyucu ekipmanların kullanılması gereklidir: Tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar ile çalışılırken, eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atık, kurumun atık imha etme esaslarına göre işleme tabii tutulmalıdır. Ayrıca tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnek toplama,hazırlama ve saklama DNA ekstraksiyonu Genel olarak kullanılan salting-out DNA ekstraksiyon yöntemi veya spin kolonları esasına dayanan yöntemler, asit sitrat dekstroz (ACD) veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile antikoagüle edilmiş tam kan örneğinden genomik DNA hazırlamak için kullanılabilir. DNA numunelerini, -25/-15 C de saklayın. Ekstrakte edilmiş DNA nın konsantrasyonu 0.02 µg/µl olmalıdır. Saflığı (A260nm/A280nm) 1.5 olmalıdır. Yüksek saflıkta DNA elde edildiğinde, PCR karışımı alt sınırına yakın DNA konsantrasyonları kullanın. NOT: Sağlanmayan reaktifler. PCR mix in hazırlanması Her bileşen eklenmeli ve doğru miktarda kullanılmalıdır. Çok fazla ya da çok az örnek veya reaktif kullanımı, spesifik olmayan amplifikasyona, hatta amplifikasyonun gerçekleşmemesine neden olabilir.

5 80617 INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus / v6 de / KOD: FRI10743 p 5/9 PCR cycling INNO-LİPA HLA- DRB1 Amp Plus için doğru sıcaklık profili seçilmelidir. Uyarılar ve önlemler - DNA kontaminasyonundan kaçınmak için, pre-ve post-amplifikasyon adımları arasında maksimum fiziksel ayrım önerilir: ayrı odalarda çalışma, ayrı pipetler ve diğer laboratuvar malzemeleri ile ayrı laboratuvar önlük ve eldiveni kullanma (ve onların stoğu), iyi laboratuar uygulamaları için alınabilecek minimum önlemlerdir. Kit, herhangi bir kontamine edici DNA kaynağından, özellikle de amplifiye DNA ürünlerinden izole edilmelidir. Ayrıca reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan da kaçınılmalıdır. - Post amplifikasyon odasından, pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüş yapmayın. - Amplifikasyon işlemi için, otoklavlanmış tüpler ve pipet uçları kullanılmalıdır. Pamuk tamponlu pipet uçları önerilir. Her bir porsiyonlanmış örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. - Bileşenleri aynı lot numarasına sahip olmadığı sürece, farklı kitlerin reaktiflerini karıştırmayın. - Çözündükten sonra, amplification buffer ve primer solution vorteksleyin ve bütün reaktifleri özellikle LİPA-Taq ı aşağı yukarı çevirierek karıştırın. Test prosedürü - DRB1 allelleri ekzon 2'sinin amplifikasyonuna yönelik bu protokol; MicroAmp PCR tüpleri (0.2 ml) ve GeneAmp PCR System 9700 thermal cyclers ve LiPA Taq kullanılarak optimal amplifikasyonun yapılması için tasarlanmıştır. Bu protokol çoğu ticari termal cycler türü için kullanılabilir, ancak cycler üreticisi tarafından belirtilen bazı modifikasyonların yapılması gerekebilir. - Kullanmadan önce, bu protokolün laboratuarınızda kullanılan termal cycler ile uyumlu olup olmadığını bakın. Terhermal cycler ı kullanmadan önce, kalibre edildiğinden emin olun. - Spesifik olmayan amplifikasyonlar sonuçları bozabilir,engellemek için gerekli önlemleri alın: Pipetleme adımlarını, buz üzerinde ve gecikmeden gerçekleştirin. Numuneleri yerleştirmeden önce termal cycler'in ısıtma bloğunu önceden ısıtın (96 C) ve hemen sonra cycling işlemine başlayın. 1. Her bir genomik DNA yı TE tampon içinde µg/µl arasında bir konsantrasyona dilüe edin. 2. Hazırlanacak şişelerin sayısını (N) aşağıdaki gibi belirleyin: N = DNA numune sayısı + 1 (Negatif kontrol; DNA sız) + 1. Pamuk-filtreli pipet uçları kullanarak otoklavlanmış1.5 ml lik tüplerde bir master mix hazırlayın: DRB1 ve DRB1*03,11,13,14 amplifikasyon için (N x 24 µl) otoklavlanmış distile su + (N x 10 µl) Amplification buffer + (N x 10 µl) Primer solution DRB1 VEYA DRB1*03,11,13,14 + (N x 1 µl) LiPA-Taq (N x 3 U)

6 80617 INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus / v6 de / KOD: FRI10743 p 6/9 Bu amplifikasyon karışımının toplam hacmi (N x 45 µl ) dir. Kısa süre vorteksleyin ve 45 µl master mix i (N-1) otoklavlanmış amplifikasyon tüplerine porsiyonlayın μl ( μg) genomik DNA prepaatını ekleyin. Negatif kontrol tüpüne 5 µl distile su ( DNA sız ) ekleyin. NOT: Vortekslemeyin veya karıştırmayın. Amplifikasyon karışımının tüpün tabanında olup olmadığını kontrol edin. 4. Örnekleri önceden ısıtılmış ve kalibrasyonu yapılmış termal bloğa yerleştirin (thermal cycler üreticisi tarafından sağlanan talimatlara bakın). HLA-DRB1 amplifikasyonu (PCR protokol I veya PCR protokol II) için tasarlanmış amplifikasyon programını veya HLA-DRB1*03,11,13,14 amplifikasyonu (PCR protokol I) için tasarlanmış programı başlatın. NOT: PCR protokol I Adım Sıcaklık Süre ± 0.75 C 1 Denatürasyon 96 C 5 min 2 Denatürasyon 96 C 30 sn. Döngüyü tekrarla 3 Primer bağlanması 64 C 50 sn adımlar 4 Primer uzaması 72 C 50 sn. 5 kez 5 Denatürasyon 96 C 30 sn. Döngüyü tekrarlayın 6 Primer bağlanması 62 C 50 sn adımlar 7 Primer uzaması 72 C 50 sn. 5 kez 8 Denatürasyon 96 C 30 sn. Döngüyü tekrarlayın 9 Primer bağlanması 60 C 50 sn adımlar 10 Primer uzaması 72 C 50 sn. 10 kez 11 Denatürasyon 96 C 30 sn. Döngüyü tekrarlayın 12 Primer bağlanması 55 C 50 sn adımlar 13 Primer uzaması 72 C 50 sn. 15 kez 14 uzatma 72 C 10 dk. PCR protokol II Adım Sıcaklık Süre ± 0.75 C 1 Denatürasyon 95 C 5 dk 2 Denatürasyon 95 C 20 sn. Döngüyü tekrarlayın 3 Primer bağlanması 58 C 20 sn. adım 2-4, 4 Primer uzaması 72 C 20 sn. 35 kez 5 uzatma 72 C 10 dk. PCR protokolü I aşağıdakiler için tasarlanmıştır: INNO-LiPA HLA-A; B; Bw4; C; DRB1; DRB1*03,11,13,14 amplifikasyonları. PCR protokolü II aşağıdakiler için tasarlanmıştır: INNO-LiPA HLA-DRB1; DRB ; 86G; 86V; DQB1 amplifikasyonları. 5. Amplifikasyon sürecinden sonra, numuneleri derhal INNO-LiPA HLA-DRB 1 plus test stripleri ile kullanın veya -25/-15 C de saklayın.

7 80617 INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus / v6 de / KOD: FRI10743 p 7/9 NOT: Amplifiye edilmiş DNA ları, kullanılmamış amplifikasyon reaktifleri ile birlikte saklamayın. Sonuçlar Görselleştirme - Amplifiye ürün varlığı, % 2'lik agaroz jeli üzerinde kontrol edilebilir. - Oluk başına 10 µl amplifiye ürün koyun. HLA-DRB1 veya HLA-DRB1*03,11,13,14 amplifikasyonlarından elde edilen amplikon, 280 bp uzunluğunda tek bir bant olarak görünmelidir. NOT: DRB1 Primer solution, primer-dimerlerinin oluşumuna neden olabilecek bir primer setidir. Bu durum sonuçları etkilemeyecektir. - Dahili gözlemler, % 2 agaroz jeli üzerinde 10 μl amplifiye edilmiş ürün kontrol edildikten sonra ~ 280 bp uzunluğunda bir bant görünürse, LiPA tahlili ile yorumlanabilir bir sonuç verilmesi gerektiğini göstermiştir. Onaylama - Yapılan her aplifikasyon reaksiyonuna, en az bir pozitif ve bir negatif kontrol dahil edin. Herhangi bir yeni laboratuvar prosedüründe olduğu gibi, test prosedürünü doğru bir şekilde yerine getirildiğinden emin olunana kadar, pozitif ve negatif kontroller prosedürde kullanılmalıdır. Ekstradan bir pozitif kontrol kullanılması gerekiyorsa, bilinen bir pozitif numune kullanın. - Jelde negatif kontrol için pozitif bir bant elde edilirse; tüm çalışma geçersiz sayılmalı ve bütün test prosedür tekrar edilmelidir. Prosedür sınırlamaları - Bu ürün sadece amplifikasyon teknikleri üzerine iyi eğitimli personel tarafından çalışılmalıdır. - Polimeraz inhibasyonu (örneğin: heparin veya hemoglobin) testin tamamen başarısız olmasına neden olabilir. - Tek kullanımlık eldivenlerden gelebilecek pudranın veya sodyum hipokloritin, amplifikasyon üzerinde inhibe edici etkisi vardır. - DNA örneklerinin tekrarlanan dondurulup/çözülme işlemi, daha az verimli bir amplifikasyona neden olabilir. - HLA-DRB1 Plus primer pozisyonundaki DRB1 * 1130 alelinin anormal sekansı nedeniyle, bu alel için herhangi bir amplifikasyon beklenmez. - DRB1*1105, DRB*1122, DRB1*1130, DRB1*1317, DRB1*1404, DRB1*1410, DRB1*1411, DRB1*1415, DRB1*1428, DRB1*1431 ve DRB1*1446 alleleri hariç tüm HLA-DRB1*03,11,13,14 alleleri için DRB1*03,11,13,14 primer spesifiktir. Bu alleller, 5 'primerinin bulunduğu yerde bir anormal sekansa sahiptir ve DRB1 * 03,11,13,14 amplifikasyonuyla amplifiye edilmez. Allel DRB1*0820 de amplifiye olacaktır(*). - Allellerin tamamı için, primer bağlanma bölgesindeki sekans bilinmemektedir. Primer bölgedeki uyumsuzluk riskinin, primer başarısızlığı görülmediği için çok düşük olduğu düşünülmektedir. Buna rağmen, homozigot sonuçlarda allelik drop-out durumu göz önüne alınmalıdır. - İyi laboratuvar uygulamaları ve önceden belirtilen prosedürlerin dikkatli bir şekilde uygulanması, spesifik amplifikasyona olanak sağlar. (*) Ekim 2003 e kadar tanımlanan alleller.

8 80617 INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus / v6 de / KOD: FRI10743 p 8/9 Referanslar: Marsh SG, Bodmer JG, Albert ED, Bodmer WF, Bontrop RE, Dupont B et al. Nomenclature for factors of the HLA system, Eur J Immunogenet 2001;28: IMGT/HLA Sequence Database. IMGT/HLA version reports Test performansı PCR protokol II ile kombinasyon halinde, DRB1 Primer solüsyonunun test performansı (DRB1; DRB ; 86G; 86V; DQB1) INNO-LiPA HLA-DRB1 rutin tiplendirme numuneleri üzerinde üç Avrupa ve iki Kuzey Amerika doku tiplendirme laboratuvarında değerlendirilmiştir. Çalışmada toplam 243 örnek INNO-LiPA HLA-DRB1 ile test edildi. Çalışma boyunca INNO-LiPA HLA DRB1 amplifikasyon hataları yoktur. PCR protokol I ile kombinasyon halinde, DRB1 Primer solüsyonunun test performansı (A; B; Bw4; C; DRB1; DRB1*03,11,13,14) PCR protokolleri I ve II arasındaki denkliği değerlendirmek için, her iki yöntem kullanılarak 42 numune kurum-içi test edildi. Bütün amplifikasyonlar başarılıydı PCR protokol I ile kombinasyon halinde, DRB1*03,11,13,14 Primer solüsyonunun test performansı (A; B; Bw4; C; DRB1; DRB1*03,11,13,14) INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus ın DRB1*03,11,13,14 Primer çözeltisinin performansı in-house ve iki Belçika doku tipleme laboratuarında değerlendirilmiştir. Toplamda 89 isimsiz numune analiz edilmiştir (50 örnek harici; 39 üreticide). DNA, taze(3 numune ACD antikoagülanlı; 39 u EDTA lı) veya donmuş (ACD antikoagülanlı 22 numune, EDTA lı 25 numune) tam kandan ekstrakte edilmiştir. Kullanılan ekstraksiyon yöntemleri, Puregene Blood Kit (Gentra Systems), QIAamp DNA Blood Mini Kit (Qiagen) veya in-house salting out metoduydu. DNA, -20 C de saklanmıştır. DNA nın saflığı (A260/A280)1,0 ve 2.2 arasında değişiyordu (82 numune). Saflık yedi numune için bilinmiyordu; aynı yöntemle ektrakte diğer örneklerin iyi kalitede olması nedeniyle bunlar da analize kabul edllmiştir. Ekstraksiyondan sonraki konsantrasyon μg/μl aralığındadır. DNA, amplifikasyondan önce paket prospektüsünde belirtildiği üzerev μg/μl aralığında dilüe edilmiştir. Bu değerlendirmede GeneAmp PCR Sistem PE-9600 thermal cycler kullanılmıştır. Bütün amplifikasyonlar ilk denemede başarılı olmuştur. Uygulama aralığı Dahili ve harici değerlendirmeler göstermiştir ki; başarılı uygulama aralığı μg/μl aralığındaki 5 μl ekstrakte edilmiş DNA dır. Kesinlik Testler arası, test içi ve kullanıcılar arası tekrarlanabilirlik, üretici tarafıdan değerlendirilmiştir. Bir numune, ikişer kez olmak üzere, 3 farklı döngü ve proses kullanılarak, her cycler için 2 çalışmada, amplifiye edilmiştir. Bu protokol iki farklı kullanıcı tarafından ikişer kez tekrar edilmiştir. Kayda değer bir farklılık gözlenmemiştir. Lotlar arası varyasyonlar, üretici tarafından bir örneği üçer kez olmak üzere, üç farklı primer grubu kullanılarak değerlendirilmiştir. Bütün PCR ürünleri %2 lik agaroz jel üzerinde kıyaslanabilir bir yoğunluk göstermişlerdir.

9 80617 INNO-LiPA HLA-DRB1 Amp Plus / v6 de / KOD: FRI10743 p 9/9 Lisanslar Bu ürünün satın alınması, satın alan kişiye, pakette tanımlanan patentli yönteme uygun olarak, insana ait in vitro teşhis için nükleik asit sekanslarının çoğaltılması için kullanım olanağı sağlar. Satın alma yoluyla kullanıma ilişkin bu özel kullanım hakkı dışındaki herhangi bir genel patent veya başka herhangi bir lisans verilmemektedir. Ticari markalar - INNO-LiPA, USA ve diğer ülkelerde, tescilli Fujirebio Europe N.V ticari markasıdır. - GeneAmp ve MicroAmp, Applied Biosystems, LLC tescilli ticari markalarıdır.