AML de Genetik Testlerin Klinik Kullanıma Katkısı

Transkript

1 AML de Genetik Testlerin Klinik Kullanıma Katkısı Dr Deniz YILMAZ KARAPINAR Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Çocuk Hematoloji BD XI. Ulusal Pediatrik Hematoloji Kongresi 4. Mayıs. 2017, İzmir

2 AML de Genetik Bulguların Klinikte Kullanımı 1. Tanı anında risk sınıflaması 2. Remisyon izlemi/ MRD 3. Ailesel MDS/AML de riskli bireyin belirlenmesi 4. Hedefe yönelik tedavi

3 Çocukluk AML nde genetik değişiklikler Sitogenetik bozukluk %80 (+) Prognoza etkili MLL (%21) Diğer %25 %21 %25 %17 OS %3 %8 t(8;21) %12 %12 CN %17 EFS İnv (16) %12 %11 t(6;9) %2.5 t(6;9) %2.5AML BFM 2004 %2.5 t(7;12) %3 t(15;17) %8

4 AML de önemli Moleküler ve Genetik Bozukluklar Tip I mutasyonlar Kontrolsüz çoğalma Sinyal iletim yolaklarında yer alan genlerin mutasyonuyla aktive olurlar FLT3, KIT, N-RAS, K-RAS, PTPN11, Tip II mutasyonlar Farklılaşmayı bozar, t(8;21), inv16, t(15;17), 11q23, NPM1, CEBPA mut t(1;22), t(7;12), t(11,12), NUP98/NSD1 Epigenetik düzenleyicilerdeki mutasyonlar, EZH2, ASXL1, IDH1, IDH2 ve DNMT3A, hem matürasyon arresti hem de proliferatif kapasiteye katkıda bulunur.

5 N Sitogenetik (+) AML li çocuklarda Shiba, GCC 2013 BFM AML 2004 BFM AML 2004

6 C-KİT, RAS mut prognoza etkili değil Klein C.J Clin Oncol BFM AML 2004 BFM AML 2004 Sano, IJH 2012

7 AML Protokollerinde Risk Sınıflaması COG AAML0531 MRC15 BFM AML 2012 Standart risk: İnv(!6), t(16;16), t(15;17), t (8;21), NPM1, CEBPAdm, t(1;11), 1. İnd sonrası 28.g Kİ blast<%20 Orta risk: Diğerleri Yüksek risk: t(4,11), t(5;11)/nup98/nsd1, t(10;11), t(6;11), t(6,9), t(7;12), der12p, monozomi7, monozomi 5, 5q del, abn 3q, t(9,22),kompleks karyotip, FLT3/ITD-WT, 2. İnd sonrası (42. g) blast>%5

8 AML de kullanılan genetik testler Konvansiyonel sitogenetik FISH Moleküler genetik Array-CGH MLPA PCR tabanlı yöntemler Dizi Analizi Sanger NGS WGS Çözünürlük

9 Sitogenetik Lösemide kromozom anomalilerinin saptanmasında mutlak gerekli Sayısal ve yapısal bzk gösteren karyotip analizi Ancak gözle, ışık mikroskobunda görülebilen değişiklikler farkedilir >3 milyon baz değişimi En az 20 metafaz sayılmalı Zaman alır Kişisel deneyim önemlidir Translokasyonlar Delesyon Hipo/ hiperdiploidi Kompleks karyotip

10

11 Sayısal anomaliler Anormal karyotip %78 Sayısal anomaliler %40 Hipodiploidi (n=43-45) %8 Büyük yaşta, erkek, FABM2, t(8;21)(q22;q22) + sex kromozom kaybı Daha düşük EFS ve OS (%40) Hiperdiploid, (n=48-65) %11 En sık kr kazanımı +8, +21, +19 ve +6 Erken başlangıç, kız, AMKL Damgaard S, Genes, Chromosomes & Cancer 2014; 53: Sex ch kaybı t(8;21)aml de oldukça sık, risk artmıyor N=916 t(8;21) AML del (9q) (%11.3) tam remisyon (p:0.01) +4 (%2.3) relaps ve OS (p<0.01) Klein C.J Clin Oncol Dec 20;33(36):

12 Monozomal Karyotip AML 2 otozomal monozomi veya tek otozomal monozomi+ ek yapısal anomaliler AML de %8 (ALL de % 5) İleri yaş ile ilişkili (median 9 yıl) Kötü prognozla birlikte Kümülatif relaps riski İndüksiyon yanıtı iyi olursa tam remisyon şansı %80 Erişkinde prognoz çok kötü

13 Monozomal karyotip AML %19.3 Normal %35.3 iyi, %43.7 orta, %21 yüksek risk grubu Kompleks karyotip %18.5 Otozomal monozomi %9.2 Tek otozomal monozomi %7.6 2 otozomal monozomi %1.7 Tüm hastalar Transplant uygulanan hastalar Japon Lösemi Grubu, 2016

14 Genotype- outcome correlations in pediatric AML: The impact of a monosomal karyotype in trial AML BFM 2004 N=642 AML, sitogenetik analiz EFS MK(n=22) %23 (p: ) MK monozomi7 hariç (n=16) %28 (p:0.0081) CK, MK hariç (n=47) %47 (p: 0.46) CK, MK (+) (n=12) %25 (p: 0.024) HK(n=37) HK, t(8;21) hariç (n=16) HK, MK (n=10) İzole trizomi 8 (n=16) %44 (p:0.3) %9 (p<0.0001) %10 (p<0.0001) %25 (p:0.009) Total %53.2 Monozomal karyotip varlığı yeni bağımsız bir risk faktörüdür Rasche M. Leukemia 2017

15 FISH Moleküler sitogenetik Karyotipik anomalilerin saptanmasında Uygulaması kolay Çok hızlı Hassas Bazı durumlarda daha güvenilir Mozaisizm tanısı, rezolüsyon yüksekliği avantaj > baz delesyon > baz dublikasyon değişiklikleri gösterir

16 Kromozomal DNA veya RNA nın hücre yapısı bozulmaksızın incelenebilmesi yöntemin en önemli özelliklerinden birisidir.

17 Problar çok önemli Centromerik Prob a satellit tekrar probları Anöploidi tanısı Tüm kromozom probu Yeni düzenlemelerin tanısı Lokus spesifik prob Mikrodelesyon tanısı Subtelomerik prob İdiopatik mental retardasyonlarda kriptik delesyon Telomerik prob Telomerlerdeki delesyon,translokasyon, inversiyon

18 Translokasyon Probları-Dual Color/Single Fusion

19 Translokasyon Probları-Dual Color/Dual Fusion

20 Translokasyon Probları- Break apart Probları

21

22

23 FISH sitogenetik yerine kullanılabilir mi? FISH hematolojik malignitelerde pek çok avantajına rağmen sadece bilinen anomalileri belirleyebildiği için hiçbir zaman klasik sitogenetik yerine geçebilecek bir tanı yöntemi değildir. FISH, hedeflenen gen bölgesine, kromozomlara, anomaliye yönelik ve tanı koymaya yardımcı bir tekniktir

24 PCR Temel mekanizma yüksek sıcaklıkta yapısı bozulmayan bir DNA polimeraz kullanılarak,bir Thermo Cycler (Isı Düzenleyici) yardımıyla DNA replikasyonunu in vitro ortamda tekrarlanması sonucu DNA nın çoğaltılmasını sağlamaktır. DNA mut, inv, translokasyon, delesyonları belirler PML-RARA t(15;17)(q22;q12) AML1-ETO t(8;21)(q22;q22) inv(16)(p13;q22) BCR-ABL t(9;22)(q34;q11) Titrasyon izlemi yapılabilir baz üzeri değişiklikler

25 Real time online PCR Fluorens molekülleri kullanarak PCR da amplifikasyon esnasında ürün direk olarak ölçülür Kalitatif ve kantitatif analiz analiz yapılır

26

27 Sitogenetik ve FISH uygulandıysa PCR ilk tanıda gerekli mi?

28 Dizi Analizi Baz düzeyinde dizinin ortaya konması Sanger Hastalık öntanımız var Sorumlu gen tanımlanmış Tanıyı doğrulamak amacıyla NPM1, CEBPA, c-kit FLT3/ITD, D835Y, D835H, del836, WT1

29 Next Generation Sequencing Tanımlanamayan bir klinik Çok sayıda nedenin düşünüldüğü ayırıcı tanı yapılacak klinik Milyonlarca kısa okuma dizileri belirlenir Bilgisayarlı sistemde art arda getirilir

30 DNA parçalanır Parçalara adaptör eklenir Farklı tekniklerle PCR uygulanır Emulsion PCR Bridge PCR Floresan işaretli nukleotidlerle enzimatik uzatılma yapılır Görüntülü array de dizi ortaya konur WGS: Tüm genom dizi analizi WES: Tüm ekzonların dizi analizi

31 454 pyrosequencing Illumina Genome Analyzer AB SOLiD HeliScope

32

33 İyi t(8;21), t(15;17) İnv(16)/ t(16;16) t(1;11),npm1 CEBPadm EFS OS Kötü Monozomi 7, Monozomi 5, t(4;11), t(5;11), t(6;11), t(10;11), t(6;9), inv (3),t(7;12), der12p, t(9;22), Kompleks karyotip, WT1mut /FLT-ITD 9. Türk Pediatrik Hematoloji Kongresi, 28 Mayıs 2013,Van

34 AML Protokolü AIE ADxE Genetik 28. Gün PR: Kİ morf/fcm %20 blast 42. Gün PR: Kİ morf/fcm %5 blast Standart risk Orta risk Yüksek risk inv 16 t(15;17) t(8,21) t(1;11) CEBPA dm NPM1 Diğer genetik özellikler t(4,11), t(5;11)/nup98/nsd1, t(6;11), t(6,9), t(7;12), der12p, monozomi7, monozomi 5, 5q del, abn 3q, t(9,22), FLT3/ITD-WT KİT: MSD, MRD, MUD AI 28g PR HAM HAM HAM ham AI AI 42g PR AI 42g PR HAE ham ham ham DxFLAG IDAFLAG FLAG Devam HAE HAE Devam Devam 9. Türk Pediatrik Hematoloji Kongresi, 28 Mayıs 2013,Van

35