BMM 101 BİYOMEDİKAL MÜHENDİSLİĞİNE GİRİŞ BİYONANOTEKNOLOJİ MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK

Transkript

1 BMM 101 BİYOMEDİKAL MÜHENDİSLİĞİNE GİRİŞ Doç. Dr. Birsen Can Demirdöğen BİYONANOTEKNOLOJİ MOLEKÜLER BİYOLOJİ VE GENETİK

2 İnsan fizyolojisi biyomedikal mühendisliğini diğer mühendislik formlarından ayıran temel noktadır. Tarih boyunca, fizyoloji alanındaki anlayışımızdaki gelişmeler, yeni biyomedikal mühendislik teknolojilerinin ortaya çıkmasına yol açmıştır Yeni ortaya çıkan hastalıklar, fizyoloji alanındaki yeni buluşlar, gelişen bilim ve teknoloji ve insan sağlığı için devamlı var olan talep, biyomedikal mühendislerinin çözmesi için yeni sorunlar/problemler getirmektir.

3 FİZYOLOJİNİN TANIMI Fizyoloji terimi, Yunanca physis 'doğa ve logos 'bilim kelimelerinden oluşmaktadır. "Canlıların hücre, doku ve organlarının görevlerini ve bu görevlerin nasıl yerine getirildiğini inceleyen bilim dalıdır. Fizyoloji Anatomi Anatomi: Vücudu oluşturan ve belirli görevleri üstlenen organ ve oluşumların yerini ve yapısını inceler. Fizyoloji: Canlı vücudunun ve bu vücudu oluşturan organ, doku ve hücrelerin işlevlerini inceler. Fonksiyonel (NEDEN) Mekanistik yaklaşım (NASIL) 3

4 Günümüzde kalıtımın biyokimyasal temellerinden ve moleküler biyolojiden başlayarak, hayvanlardaki davranış özelliklerine varana kadar geniş bir araştırma alanı fizyoloji terminin kapsamına girmiştir

5 Biyonanoteknoloji (Bionanotechnology): nanoteknoloji ile biyolojinin kesiştiği araştırma alanıdır. Bu alandaki araştırmalar, modern tıp biliminin gelişmesine, hem tanı hem de tedavi alanlarında katkılar yapmaktadır. Diğer bir taraftan ise organik moleküllerin kullanımı ile nanoteknoloji alanındaki birçok problem için çözüm yolu olmaya adaydır.

6 BMM Ders Programı ve Biyonanoteknoloji: ** BMM 202 Hücre ve Moleküler Biyoloji BMM 430 Biyoteknoloji BMM 431 Biyonanoteknoloji BMM 424 Biyobenzeşim ve Biyotasarım BMM 481 Genetik Mühendisliği BMM 485 Biyokimya ve Biyoteknolojide Proteinler Zorunlu Seçmeli

7

8

9 Genetik ve Moleküler Biyolojide önemli adımlar 1665: Robert Hooke ( ) organizmaların hücrelerden yapıldığını buldu 1865: Gregor Mendel kalıtım kurallarının temellerini attı. Bezelyeler üzerinde çalıştı. Baskın ve çekinik genleri tanımladı. 1869: Friedrich Miescher DNA molekülünü ilk kez izole etti. (University of Tübingen, Almanya)

10 1900 : 20 amino asitin tamamının kimyasal yapısı bulundu. 1902: Walter Sutton kromozomların kalıtımdaki rolünü açığa çıkardı 1902 : Emil Hermann Fischer amino asitlerin bir araya gelerek proteinleri oluşturduğunu göstererek Nobel ödülünü kazandı. 1909: Danimarkalı botanikçi Wilhem Johannsen ilk kez Gen terimini kullandı 1911: Pheobus Aaron Theodore Lerene RNA yı buldu. 1938: Tütün mozaik virüsü kristal halde izole edildi

11 1941:George Beadle ve Edward Tatum genlerin proteinlerin üretilmesindeki rollerini ortaya çıkardılar. 1950: Edwin Chargaff Sitozin ile Guaninin ve Adeninin ile de Timinin eşleştiğini gösterdi. 1952: Hershey ve Chase DNA nın kalıtım materyali olduğunu gösterdiler

12 1953: James Watson ve Francis Crick DNA nın çift sarmal (double-helix ) moleküler yapısını açıkladılar Watson ve Crick in bu buluşu 1962 yılında Nobel ile ödüllendirildi

13

14 1958: Kornberg DNA polimeraz enzimini izole etti 1961: Niremberg tamamı urasilden oluşan RNA molekülü sentezledi 1961: Monod ve Jacob messenger RNA termini buldu 1966: Niremberg ve ark. her bir kodonun bir amino asiti kodladığını buldu. Genetik kod çözüldü! Bu çalışma 1968de Nobel ödülü kazandı

15 1970: Bir bakteride (Haemophilus influenzae, HindII) DNA yı kesen restriksiyon enzimleri keşfedildi (D.Nathans, W. Arberve H.O.Smith, 1978 Nobel Ödülü)

16 1972: P. Berg tarafından ilk rekombinant DNA molekülü yapıldı yılında Nobel ödülü kazandı 1977: W. Gilbert ve F. Sanger ve A. Maxam tarafından DNA zincir analiz metodu geliştirildi. Bu buluş 1980 yılında Nobel ödülü kazandı

17

18 1976: İlk genetik mühendisliği şirketi Genentech rekombinant insulin molekülü ile pazara çıktı! 1983: K.B.Mullis ve arkadaşları tarafından PCR metodu geliştirildi yılında bu buluşa Nobel ödülü verildi Bu metod istenen DNA dizisini bulup 1-2 saat içinde milyonlarca kopyasını yapabiliyor!!

19

20 1983: Bir hastalığa neden olan gen ilk kez tanımlandı. 1990: Watson ve arkadaşları İnsan Genom Projesini ve bazı önemli organizmaların genom projesini başlattı. ABD, İngiltere, Japonya, Almanya, Fransa katıldı 1990: İnsanda ilk gen terapisi denemesini French Anderson gerçekleştirdi.

21 1995: İki bakterinin genom projeleri tamamlandı. 1996: Maya (S. cerevisiae) genom projesi tamamlandı. 1997: Ian Wilmuth tarafından Dolly klonlandı 1998: İnsan genomundaki bireyler arası çeşitliliğin haritasının çıkarılma projesi başlatıldı. SNP Konsorsiyum kuruldu ve gen bazlı tedavi ve teşhis konusunda yeni sayfalar açacağına inanılan insan genomunun SNP haritası çıkarıldı. Şu anki verilere göre insan genomunda 10 milyon kadar SNP tanımlanmıştır (300 nükleotitte bir) SNP nedir??

22 2000: Mart 2000 tarihinde ABD Başkanı Clinton ve İngiltere Başbakanı Blair genom projesi verilerinin kamuouyuna bütünüyle açık olacağını bildirdiler. 2001: Ulusal İnsan Genom Araştırma Enstitüsü ve Celera Genomics tarafından insan genom analizi ilk sonuçları açıklandı. 2003: Genomun %99.99 kesin olarak tamamlandı. 2006: Miyeloid hücreleri etkileyen bir hastalığı olan iki yetişkin gen terapi ile başarılı bir şekilde tedavi edildi.

23 İNSAN GENOM PROJESİ 1990 yılında başladı. Amacı, insan genomundaki gen kodlayan bölgelerin nükleotit dizisinin belirlenmesi İlk sonuçlar 2001 yılında yayınlandı yılında güncellendi ve tamamlandı (gen kodlayan bölgelerin yaklaşık %99 unu kapsadığına inanılıyor) Organizmaların tüm özellikleri genler tarafından kontrol edilir. Bireylerin genetik materyallerinin tümüne genom denir.

24 GENOM İnsan genomu 23 çift kromozomdan oluşur (haploid sayı) Her insanın genomu kendine özeldir (tek yumurta ikizleri dahil) Bunun nedeni, her gen için farklı varyasyonlar taşımamızdır 24

25 GENOM Bir organizmanın bir hücresindeki genetik materyalin tamamı İnsanın genomu ile C.elegans ın (yuvarlak solucan) genomunu karşılaştıralım. Genom boyutu haploid kromozom sayısına göre verilir İnsan genom boyutu 3.2 x 10 9 baz çifti gen 25

26 Bir hücredeki 46 kromozomda toplam 6,4 milyar baz çifti var Bir hücrenin içindeki DNA nın toplam uzunluğu ne kadardır? Kaç mikron veya cm veya metre?? Tüm vücudumuzdaki toplam DNA nın uzunluğu??? 1 nükleotid 3.4 Angstrom. Bir hücrede toplam 6x10 9 baz çifti var. Bir hücredeki toplam DNA uzunluğu 3.4 x 6 x 10 9 = 20 x 10 9 Angstrom = 2 metre. Toplam hücremiz var. Bu hücrelerdeki DNA ların toplam uzunluğu: 2 x m Dünya güneş uzaklığı= km yani vücudumuzdaki toplam DNA açılıp uç uca eklense buradan 70 kez güneşe gidip gelinebilir!!!! 26

27 İnsanda civarı tür protein vardır. Bu durumda kaç tane genimiz vardır? Başlangıçta civarı genimiz olduğu düşünülüyordu. İnsan genom projesi sonuçları gelmeye başladıkça bu sayı düştü Şu anki verilere göre ila arasında genimiz var. (Son verilere göre ) Bu nasıl olabiliyor? GEN nedir? işlevsel bir gen ürününün sentezi için gerekli tüm nükleik asit dizisi mrna trna rrna mikrorna protein

28 Gen İfadesi

29 İnsanlarda bulunan protein kodlayan genlerin sayısı solucan ve meyve sineğindekinden çok da fazla değildir. İnsanlardaki kompleks yapı ve daha fazla sayıdaki protein nasıl ortaya çıkıyor? Alternatif splice, post-translasyonel modifikasyonlar, RNA editing

30 İnsanda ila arasında olduğu düşünülen işlevsel genler genomun % 5 inden daha az bir kısmını kapsar. ( % 2 civarı) Kodlayan mrna Protein DNA ~ %1.5 %98den fazla Fonksiyonel RNAlar: trna rrna mirna Fonksiyonel Kodlamayan Düzenleyici diziler: replikasyon orijini, promoter, enhansır, sentromer, telomer Bilinen fonksiyonu yok (transpozonlar, vs) 30

31 DNA dizisini öğrenmek ne işimize yarar? * Mutasyonların belirlenmesi * Polimorfizmlerin belirlenmesi * Polimorfizmlerin hastalık riski açısından değerlendirilmesi * Hastalık genlerinin belirlenmesi * Transpozon dizilerinin belirlenmesi * DNA parmakizi analizleri * Klonlama * Gen terapisi

32 Polimorfizm Polimorfizm = poli (çok) + form (biçim) Mutasyondan ne farkı var? Mutasyon DNA daki herhangi bir kalıcı değişikliktir. Polimorfizm ise popülasyonda yaygın görülen DNA sekans değişiklikleridir. Polimorfizm olarak tanımlanması için bir değişikliğin toplumda %1 veya daha yüksek frekansta görülmesi gerekir. %1 den az görülüyorsa, mutasyondur. Doğrudan hastalıklara yol açan DNA sekans varyatları toplumda az görünür, neden? DNA da görülebilecek varyasyon türleri : Baz çifti değişikliği (SNP) Delesyon (çıkma) Bir veya daha fazla baz çiftinin insersiyonu (girme) VNTR (variable number tandem repeat) Kromozomun yapısında değişiklik

33 Tek Nükleotit Polimorfizmi (single nucleotide polymorphism; SNP) Tek nükleotit polimorfizmi (SNP) genomdaki belli bir pozisyondaki bir nükloetitin (A,T,C,or G) toplumda yaygın görülen nükleotiten farklı olmasıdır. Tüm insan genomunda (3.2 milyar nükleotit) 10 milyon civarı SNP olduğu tespit edilmiştir (İnsan Genom Projesi) SNP ler DNA nın hem gen kodlayan bölgelerinde, hem de kodlamayan bölgelerinde bulunabilir. Birçok SNP nin ciddi bir etkisi bulunmayabilir. Ancak genlerde bulunan bazı SNP ler bu genlerin kodladığı proteinde değişikliğe yol açabilir. (her nükleotit, 3 nükelotitten oluşan bir kodonun parçasıdır. Kodonlar, amino asitleri belirler; protein sentezi sırasında hangi amino asitin ekleneceğini belirler) Dolayısı ile bir nükleotit değiştiğinde kodladığı amino asit de değişebilir. Proteinin yapısındaki bir amino asit olması gerekenden farklı olursa, o proteinin yapısı ve fonksiyonu da değişebilir.

34 Bu nedenle polimorfizmler insanları bazı hastalıklara karşı yatkın hale getirebilmektedir. Polimorfizmler insanların ilaçlara,ve çevresel toksinlere karşı verdikleri tepkiyi de etkilemektedir. Nasıl? İlaç metabolize eden enzimler de protein yapısındadır... SNP : tek nükleotit polimorfizmi Nasıl tespit edilebilir?

35 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction - PCR) PCR (polimeraz zincir reaksiyonu) laboratuvar ortamında sentetik primerler kullanılarak DNA daki istenen bölgelerin kopyalarının sentezlenmesidir

36 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction - PCR)

37 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction - PCR) Hücre içinde DNA nın kendini eşlemesi işleminin benzeri lab da gerçekleştirilerek istenen bölgelerin koyası çok sayıda sentezlenerek elde edilir. Gerekli olanlar: genomik DNA DNA polimeraz enzimi (bunun için Taq DNA polimeraz kullanılır Neden?) Primerler (çoğaltılmak istenen DNA bölgesine özel olarak sentezlenmiş kısa oligonükleotitler) dntp ler Mg+2, tampon çözeltiler PCR cihazı Basamaklar: 1-denatürasyon: yüksek sıcaklıkta DNA çift zincirinin açılması (94 C) 2-annealing (yapışma) : ısı düşürüldüğünde (~54-60 C) primerlerin genomik DNA üzerindeki çoğaltmak istenilen bölgeye komplementer baz çiftleri oluşturarak bağlanması 3-uzama : ısının 72 C ye yükseltilmesi ile DNA polimeraz enziminin primerin ucuna nükleotitleri genomik DNA daki nükleotit dizisine komplementer olacak şekilde birer birer eklemesi Bu döngü kez tekrarlanır

38 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction - PCR) Kullanım alanları: Mutasyon ve polimorfizm tespiti Bakteri virüs tespiti GDO tespiti Gen klonlanması için genin kopyalanması DNA parmakizi

39 PCR ile polimorfizm tespiti İlgili gen PCR ile kopyalanır Polimorfizm olup olmadığını tespit etmek için sekanslanabilir (nükleotit dizisi belirlenir) Nükleotit dizisi dolaylı olarak anlaşılmaya çalışılabilir (RFLP yöntemi ile) RFLP (restriction fragement length polymorphism) analizi RE enzimler (restriksiyon endonükleaz enzimler) PCR ürününü kesip kesmediğine göre kişinin genotipi belirlenir

40 RFLP yöntemi ile polimorfizm belirlenmesi tekniği PON1 MET bp PCR product PON1 LEU CATG GTAC CTTG GAAC 3 5 Nla III 5 3 CATG GATC CTTG GAAC bp 66 bp 106 bp 66 bp 172 bp Homozygous PON1 MET 55 heterozygote Homozygous PON1 LEU 55

41 DNA PARMAKİZİ Babalık davaları ve adli araştırmalarda bireyleri belirlemek için kullanılır Her bireyde kromozomun farklı yerlerindeki minisatellitlerin tekrar sayıları özeldir M: mother C: child F1: father 1 F2: father 2

42 Yüksek sıklıkta tekrarlanan diziler Satellit (uydu) DNA (Basit dizili DNA) Kısa dizilerin kusursuz (veya kusursuza yakın) tekrarları Diziler bç arasında olabilir Çoğu uydu DNA, spesifik kromozomal konumlarda yoğunlaşmıştır. Sentromer ve telomer gibi spesifik bölgelerde lokalize olmuşlardır. Mikrosatellit ve mini satellit olmak üzere 2 grup altında incelenebilir MİKROSATELLİT : tekrarlar 1-13 bç (genellikle 1-4 bç) 150 kez civarında ardışık tekrarlanır En yaygın mikrosatellit (CA)n n sayısı bireyler arasında farklılık gösterir (5 ile 50 arası)

43 MİNİSATELLİTLER (mini uydular) (Değişken sayıda ardışık tekrarlar : variable number tandem repeats (VNTR) bç uzunluğunda bir dizinin kez tekrarı Genlerin içinde veya arasında yer alabilir GACTGCCCGAGACTGCCCGAGACTGCCCGAGACTGCCCGAGACTGCCCGA Her bir spesifik bölgedeki tekrar sayıları kişiler arasında farklılık gösterir!!!

44 DNA PARMAKİZİ Öncelikle PCR yöntemi ile satellit taşıyan bölgelerin kopyası sentezlenir PCR sonucunda elde edilen DNA parçalarının uzunlukları tespit edilerek kişinin kaç tane satellit tekrarı taşıdığı anlaşılır

45 DNA PARMAKİZİ PCR sonucunda elde edilen DNA parçalarının uzunluklarını tespit ederek kişinin kaç tane satellit tekrarı taşıdığını anlayabiliriz DNA parçasının uzunluğunu nasıl belirleriz?

46 Rekombinant DNA teknolojisi ve DNA klonlaması İki farklı türden gelen DNA nın birleştirilmesi Ve bir vektörün içine yerleştirilmesi Vektör olarak plazmidler kullanılır

47

48 DNA kütüphanesi Protein ekspresyonu insulin, büyüme hormonu, aşılar Transgenik hayvanlar fabrika!! Transgenik bitkiler pest direnci, kuraklık direnci

49

50 Orta Ölçekli Tekrarlar-Serpiştirilmiş tekrarlar Yer değiştirebilen (Hareketli) DNA elementleri (TRANSPOZONLAR) Hareketli (mobil) DNA parçalarıdır Bu diziler kopyalanır ve genomda başka bir yere yerleşirler (transpozisyon) Bu DNA ların hareketli olmasının organizma için ne önemi vardır? Serpiştirilmiş tekrarlardır İnsan DNA sının % 45 ini oluşturur!!! Prokaryotlarda da vardır

51 İlk kez 1940 lı yıllarda Barbara McClintock tarafından keşfedilmiştir McClintock mısırlarla yaptığı deneylerde mısır tanelerinin fenotipini değiştirecek şekilde genlerin içine ve dışına hareket edebilen genetik yapılar tanımlamıştır 1983 yılında bu çalışması Nobel ödülüne layık görülmüştür

52 Transpozonların genomda organizma için gerekli bir işlevi yok Sadece kendilerini devam ettirmeye çalışıyorlar Francis Crick bunlara bencil DNA adını vermiştir Kendi devamlılıklarını öyle güzel sağlamışlardır ki, insan genomunun %45ini oluştururlar Transpozonların etkileri: * Hareketli eleman hareket ederken bazen bitişiğindeki geni de hareket ettirir Eğer transpozon bir genin içine girerse o genin fonksiyonunu bozarak.sonunda fenotipik olarak gözlenen bir probleme neden olabilir. Örn. Tümör baskılayıcı genin içine transpozon girerse olursa ne olur?? Neyse ki Transpozisyon nadir gerçekleşir * İnsanlarda germ hattında transpozisyon oluşma sıklığı 8 kişide birdir. * Genomumuzun çoğu (%98,5) kodlama yapmadığından çoğu transpozisyonun tehlikeli bir etkisi yoktur

53 İnsan transpozonlarının çoğu işlevsiz/inaktif görünmektedir. Eğer transpozonlar bir genin içine girerse genin işlevini bozarak hastalığa yol açabilir, bu nedenle insan genetiği açısından mutajenik potansiyele sahiptirler Yakın zamanda bir transpozon hareket halinde yakalanmıştır!! Yakalanan hareketli transpozon örneği: Hemofili hastası bir erkek çocukta kan pıhtılaşma faktörü VIII i kodlayan genin 2 yerinde LINE ler tespit edildi Bu gen X kromozomu üzerinde taşınır LINE dizisi bu çocuğa annesindeki X kromozomundan gelmemişti!! (annesinin X kromozomunda bu LINE dizileri yoktu) Ancak annenin 22. kromozomunda LINE dizileri bulundu Annede gamet oluşumu sırasında LINE 22. kromozomdan X kromozomuna sıçramış olmalı ** yakalanan 2. hareketli transpozon örneği LINE lerin insan distrofin geni içine girmesi Duchenne kas distrofisine yol açmıştır