Uğur TATLI Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı Tez DanıĢmanı Doç. Dr. Ziya Gökalp CEYLAN

Transkript

1 ERZURUM DA SATIġA SUNULAN ENDÜSTRĠYEL YOĞURTLARDA MELAMĠN VARLIĞININ ARAġTIRILMASI Uğur TATLI Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı Tez DanıĢmanı Doç. Dr. Ziya Gökalp CEYLAN Yüksek Lisans Tezi

2 T.C. ATATÜRK ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ ERZURUM DA SATIġA SUNULAN ENDÜSTRĠYEL YOĞURTLARDA MELAMĠN VARLIĞININ ARAġTIRILMASI Uğur TATLI GIDA HĠJYENĠ VE TEKNOLOJĠSĠ ANABĠLĠM DALI Yüksek Lisans Tezi Tez DanıĢmanı Doç. Dr. Ziya Gökalp CEYLAN ERZURUM 2013

3

4 ĠÇĠNDEKĠLER TEġEKKÜR... IV ÖZET... V ABSTRACT... VI SĠMGELER VE KISALTMALAR... VII ġekġller DĠZĠNĠ... IX TABLOLAR DĠZĠNĠ... X 1. GĠRĠġ GENEL BĠLGĠLER Yoğurdun Tanımı ve Tarihçesi Türkiye de Yoğurt Türkiye de Yoğurt Üzerine Yapılan Araştırmalar Melamin Melamin in Kimyasal Özellikleri Melamin in Toksikolojik Özellikleri Melamin in Gıda Varlığı Melamin Teşhis Metotları MATERYAL VE METOT Materyal Metot Kimyasal Analizler Melamin Tespiti Yüzde Titrasyon Asitlik Oranı ph Değeri Kuru Madde Oranı Yağsız Kuru Madde Oranının Belirlenmesi I

5 Yağ Oranı Nişasta Tespiti Jelatin Tespiti Kül Oranı Protein Oranı Mikrobiyolojik Analizler Dilüsyon hazırlama Toplam Aerobik Mezofilik Bakteri Sayısı Enterobacteriaceae Sayısı Maya ve Küf Sayısı Lactobacillus bulgaricus Sayısı Streptococcus thermophilus Sayısı BULGULAR Kimyasal Analiz Bulguları Melamin Konsantrasyonu Yüzde Titrasyon Asitlik Oranı ph Değeri Kuru Madde Oranı Yağsız Kuru Madde Oranı Yağ Oranı Nişasta Varlığı Jelatin Varlığı Kül Oranı Protein Oranı Mikrobiyolojik Analiz Bulguları II

6 Toplam Aerobik Mezofilik Bakteri Sayısı Enterobacteriaceae Sayısı Maya ve Küf Sayısı Lactobacillus bulgaricus Sayısı Streptococcus thermophilus Sayısı TARTIġMA SONUÇ VE ÖNERĠLER KAYNAKLAR EKLER EK-1. ÖZGEÇMĠġ EK-2. ETĠK KURUL ONAY FORMU III

7 TEġEKKÜR Çalışma konumun seçilmesinden sonuçlanmasına kadar olan bütün aşamalarda bilgilerini ve desteğini esirgemeyen, üstün özverisiyle çalışmanın sonuçlanması için herdaim yanımızda olan danışman hocam Sayın Doç. Dr. Ziya Gökalp CEYLAN a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Çalışmalarım sırasında her türlü destekleriyle yanımda olan Gıda Hijyeni ve Teknolojisi Anabilim Dalı nda görev yapan arkadaşım Sevda URÇAR a ve kıymetli kardeşim Adem TOK a çok teşekkür ederim. Hayatımın her döneminde sevgisini ve desteğini hep yanımda hissettiğim eşime sonsuz minnet ve teşekkür ediyorum, yaşantımızın renkleri kızlarım Gül Sena ve Melike Beyza ma da sevgilerimi sunuyorum. Uğur TATLI IV

8 ÖZET Erzurum da SatıĢa Sunulan Endüstriyel Yoğurtlarda Melamin Varlığının AraĢtırılması Amaç. Melamin organik bir bileşiktir. Eser miktarlarda insanlarda toksik olmadığı ve tolere edilebilir günlük alım miktarı (TDI) vücut ağırlığının kg'ı başına 0.5 mg olduğu belirtilmiştir. Gıdalarda, özellikle süt ve süt ürünlerinde protein değerinin tağşiş yoluyla yüksek gösterilmesi amacıyla melamin bulunduğu bildirilmiştir. Bu çalışmada, Erzurum ili piyasasında satışa sunulan endüstriyel yoğurtlarda melamin varlığının araştırılması yapılarak yoğurtların bazı kimyasal ve mikrobiyolojik özellikleri incelenmiştir. Materyal ve Metot. Erzurum ili piyasasından toplanan 17 adet endüstriyel yoğurt örneği bazı kimyasal ve mikrobiyolojik özellikleri yönünden iki tekerrürlü olarak incelenmiştir. Örneklerde melamin varlığı ELISA yöntemi kullanılarak ölçülmüştür. Bulgular. Örneklerin hiç birinde saptanabilir düzeyde melamin varlığına rastlanmamıştır. Araştırmanın kimyasal ve mikrobiyolojik analiz bulguları ortalama değerleri: titrasyon asitliği % 1.180, ph 4.23, toplam kuru madde % , % yağsız kuru madde 11.5, yağ 3.6, kül 0.918, protein bulunmuştur, nişasta ve jelatin tespit edilememiştir. Toplam aerobik mezofilik bakteri; log kob/g, Enterobacteriaceae; log kob/g, Maya ve küf; log kob/g, Lactobacillus bulgaricus; log kob/g ve Streptococcus thermophilus; log kob/g olarak bulunmuştur. Sonuç. Örneklerde melamin tespit edilememesi tağşiş amaçlı bir üretim olmadığını göstermiştir. Ancak mikrobiyolojik analiz sonuçlarından bazı örneklerin üretim, paketleme ve transferinde hijyen koşullarına yeterince dikkat edilmediği düşünülmüştür. Anahtar Kelimeler: ELISA, Melamin, Yoğurt. V

9 ABSTRACT Investigation of Industrial Yogurt Melamine Sold In Erzurum Aim. Melamine is an organic compound. In trace amounts in humans are not toxic and tolerable daily intake (TDI) of 0.5 mg per kg of body weight indicated. Foods, especially milk and dairy products containing melamine has been reported to show a high level of protein through adulteration. In this study, offered for sale in the province of Erzurum market investigation of the existence of industrial yoghurt made of melamine, chemical and microbiological properties of yoghurt were examined. Material and method. Samples collected from 17 different industrial yogurt market in the province of Erzurum, some chemical and microbiological properties were investigated in terms of two replications. The presence of melamine samples were measured using an ELISA method. Results. The presence of detectable levels of melamine were found in any of the samples. Average values of chemical and microbiological analysis of the research findings: titratable acidity % 1.180, ph 4.23, % dry matter , % fat-free dry matter 11.5, fat 3.6, ash 0.918, protein was 4.579, starch and gelatin could not be detected. Total aerobic mesophilic bacteria; log cfu/g, Enterobacteriaceae; log cfu/g, Yeast and mold; log cfu/g, Lactobacillus bulgaricus; log cfu/g and Streptococcus thermophilus; log cfu/g respectively. Conclusion. Melamine-purpose production is found on the samples showed that adulteration. However, some of the results of microbiological analysis of samples of production, packaging, and attention is not given enough thought to the transfer of hygiene. Keywords: ELISA, Melamine, Yoghurt. VI

10 SĠMGELER VE KISALTMALAR Asit-Hg(NO3)2 DAD ELISA g GC H 2 SO 4 HACCP HCl HPLC INFOSAN : Civa nitrit : Diyot dizi dedektörü : Enzyme-linked immunosorbent assay : Gram : Gas chromatography : Sülfürik asit : Hazard Analysis Critical Control Point : Hidroklorik asit : High performance liquid chromatography : International Food Safety Authorities Network (Uluslararası Gıda Güvenliği Yetkililer Ağı) IUPAC : International Union of Pure and Applied Chemistry (Uluslararası Temel ve Uygulamalı Kimya Birliği) kg KM kob/g kob/ml LA LC : Kilogram : Kuru madde : Koloni oluşturan birim/gram : Koloni oluşturan birim/mililitre : Laktik asit derecesi : Liquid chromatography µg : Mikrogram mg ml MRS MS : Miligram : Mililitre : deman Rogosa Sharpe : Tek kademeli bir kütle spektrometrisi VII

11 MS/MS N NaOH NPN PCA PEHSU : Tandem kütle spektrometrisi : Azot : Sodyum hidroksit : Non protein nitrogen : Plate Count Agar : Pediatric Environmental Health Specialty Units (Çocuk Çevre Sağlığı Uzmanlık Birimleri) ppb ppm RB Rpm SH ST TAMB TDI TGK TS US FDA : Milyar kısımda 1 kısım : Milyon kısımda 1 kısım : Rose Bengal : Rapid per minute : Soxhlet-henkel derecesi : Streptococcus thermophilus : Toplam aerobik mezofilik bakteri : Tolere edilebilir günlük alım miktarı : Türk Gıda Kodeksi : Türk Standartları : United States Food and Drug Administration (Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi) UV VRBD WHO YKM : Ultraviyole : Violet Red Bile Dekstroz : World Health Organization (Dünya Sağlık Örğütü) : Yağsız kuru madde VIII

12 ġekġller DĠZĠNĠ ġekil No Sayfa No ġekil 3.1. Yoğurt örneklerinde melamin varlığı hesaplamak ve belirlemek için kullanılan kalibrasyon grafiği ġekil 4.1. Örneklerin titrasyon asitlik (%) oranlarına ait frekans dağılımı ġekil 4.2. Örneklerin ph değerlerine ait frekans dağılımı ġekil 4.3. Örneklerin yüzde kuru madde oranlarına ait frekans dağılımı ġekil 4.4. Örneklerin yağsız kuru madde oranlarına ait frekans dağılımı ġekil 4.5. Örneklerin yağ oranlarına ait frekans dağılımı ġekil 4.6. Örneklerin kül oranlarına ait frekans dağılımı ġekil 4.7. Örneklerin protein oranlarına ait frekans dağılımı ġekil 4.8. Örneklerin toplam aerobik mezofilik bakteri sayısına ait frekans dağılımı ġekil 4.9. Örneklerin Enterobacteriaceae sayısına ait frekans dağılımı ġekil Örneklerin maya ve küf sayısına ait frekans dağılımı ġekil Örneklerin Lactobacillus bulgaricus sayısına ait frekans dağılımı ġekil Örneklerin Streptococcus thermophilus sayısına ait frekans dağılımı IX

13 TABLOLAR DĠZĠNĠ Tablo No Sayfa No Tablo 2.1. Fermente Sütler Tebliği Mikrobiyolojik Limitler... 6 Tablo 2.2. Fermente Sütler Tebliği Yoğurta Ait Değerler... 7 Tablo 2.3. Fermente Sütler Tebliği Yoğurt İçin Yağ Oranları... 7 Tablo 2.4. Yoğurt Standardı Yoğurdun Kimyasal Özellikleri... 8 Tablo 2.5. Yoğurt Standardı Yoğurdun Mikrobiyolojik Özellikleri... 8 Tablo 2.6. Süt ve Süt Ürünleri İthalat ve Üretim Projeksiyonu... 9 Tablo 3.1. Kalibrasyon Grafiğinden Çıkarılan Formül Tablo 3.2. Mikrobiyolojik Analizlerde Kullanılan Besiyerleri ve İnkübasyon Koşulları Tablo 4.1. Yoğurt Örnekleri Mikrobiyolojik Analiz Bulguları X

14 1. GĠRĠġ Yoğurt üretiminin temelinde çok çabuk bozulabilen sütün daha uzun süre muhafaza edilmesi fikri yatmaktadır. Süte göre çok daha uzun süre dayanabilen yoğurt, ülkemiz süt ürünleri tüketiminin çok büyük bir kısmını oluşturmaktadır 1. Yapılan çalışmalar sonucu yoğurt gibi fermente süt ürünlerinin insan sağlığı üzerine olumlu etkide bulundukları belirlenmiştir 2. Özellikle sütün protein içeriğinin artması, yoğurdun konsistensini iyileştirmekte ve dolayısıyla kıvamlı bir ürün elde edilmektedir. Toplam kurumadde içeriği sütün titrasyon asitliğinin artmasına ve koagulasyon süresinin azalmasına neden olmaktadır 3. Yoğurt üretiminin en kritik işlem basamaklarından birisi kullanılacak sütün toplam kurumadde içeriğinin artırılmasıdır. Kurumadde standardizasyonunda çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Bunlardan biri de süt tozu ilavesidir. Yağlı ya da yağsız süttozu katılarak sütün kurumaddesinin artırılması küçük ve orta ölçekli yoğurt üretiminde en yaygın olarak kullanılan yöntemlerden birisidir. Süt tozu ilavesiyle kurumadde artarken konsistens iyileşmekte, viskozite artmakta ve serum ayrılması azalmaktadır 3, 4. Yoğurt üretiminde süt tozu ilavesi ile kuru madde içeriğinin artırılması, yatırım maliyetinin azlığından dolayı yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Yoğurt sütüne katılacak süt tozu miktarının en az % 1, en çok % 6 oranında olması önerilmektedir 5. Çin de bebek maması üreticisi olan büyük firmalardan birisinin mamullerinde melamin krizi ile birlikte yapılan incelemelerde yüksek oranlarda melamin katkısı bulunmuştur 6. Bu mamalar süttozu menşeli üretilmiştir. Bu sektörde oluşan panik ile protein değerlerini tağşiş yolu yükseltilmiş sütlerden üretilmiş süttozları başta 3. Dünya ülkeleri olmak üzere birçok yere çok ucuz fiyatlarda normal süttozu şeklinde ihraç edilmiştir 6. 1

15 Gıda ve gıda maddelerine protein miktarını artırmak için melamin katılması, bu maddelerin protein içeriğini tespit etmek için kullanılan Kjeldahl ve/veya Dumas yöntemlerinin aminoasitlerde ve proteinlerde bulunan azotun varlığını nicel olarak belirlediği, ancak bunun yanında melamin gibi diğer birçok protein tabiatında olmayan moleküllerde bulunan azotun da ölçüldüğü bildirilmiştir yılında Çin de başlayan, ardından önce ABD ve sonrasında tüm dünyada panik ortamı oluşturan melamin krizi, tağşiş amaçlı süte melamin katılması ve süttozu formunda yeryüzüne ihracı ile olmuştur. Bu çalışma ülkemizde üretilmiş yoğurtlarda melamin kontaminasyonunu araştırmak üzere yapılmıştır. 2

16 2. GENEL BĠLGĠLER 2.1. Yoğurdun Tanımı ve Tarihçesi Türk Gıda Kodeksi Fermente Süt Ürünleri Tebliği ne göre yoğurt; fermantasyonda spesifik olarak Streptococcus thermophilus ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus un simbiyotik kültürlerinin kullanıldığı fermente süt ürünü olarak tanımlanmaktadır 8. Türk Standartları Enstitüsü Yoğurt Standard ında (TS 1330) ise yoğurt; inek sütü (TS 1018), koyun sütü (TS 11044), manda sütü (TS11045), keçi sütü (TS 11046) veya karışımlarının pastörize edilmesi veya pastörize sütün (TS 1019) gerektiğinde süt tozu ilavesiyle (TS 1329) homojenize edilip veya edilmeden Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ve Streptococcus thermophilus dan oluşan yoğurt kültürünün ilave edilmesi ve Yoğurt Yapım Kuralları Standardına (TS 10935) uygun işlemlerden sonra elde edilen mamuldür 9. Yoğurt üretiminin ilk defa ne zaman, nerede, kimler tarafından ve nasıl gerçekleştirildiği henüz tam olarak bilinmemektedir. Bu konuda birçok görüş olmasına karşın, yoğurdun çok eski çağlardan beri Orta Asya kavimleri ile İskitlerin temel tüketim maddeleri arasında yer aldığı, Ural Dağı etekleri ile Karadeniz ve Hazar Denizi arasında kalan bölgede Türkler tarafından tüketildiği bilinmektedir 5. Yoğurdun başlangıçta göçebe Türk kabileler tarafından, hayvan derilerinde saklanan sütün doğal olarak ekşimesi ve pıhtılaşması sonucu oluşan pıhtıdan zamanla geliştirildiği sanılmaktadır. Yoğurt kelimesi öz Türkçe'dir; doğu Türkçe'sinde bugünkü mana ve şekilde kullanıldığına ilişkin bilgiler, 1064 yılında Balasagunlu Yusuf Hacip'in Kudatku-Bilik ve 1066 yılında da Kaşgarlı Mahmud'un Divan-ı-lügat-it- Türk adlı eserlerinde mevcuttur. Yoğurdun yayılışı Türklerin göçleriyle birlikte olmuştur. Yoğurt Türkler tarafından önce Orta-Doğu ve Anadolu'ya daha sonra da, 16. yy'da, Avrupa'ya 3

17 tanıtılmıştır. Ancak Avrupa'da yaygınlaşması, yılları arasında Louis Pasteur Enstitüsü direktörlüğünü yapan Nobel ödüllü (1908) Rus bakteriyolog Ilya Metchnikoffun, 1910'da Ömrün Uzatılması (The Prolongation of Life) adlı eserinde yoğurdun insan sağlığı üzerine olumlu etkilerine ilişkin ileri sürdüğü teoriyle (Theory of Longevity) sağlanmıştır. Bir Bulgar olan Dr. M. Grigoroff un, 19. yy'ın sonunda Cenevre'de, Bulgaristan'da üretilen yoğurtta yaptığı incelemelerde bulduğu bakteriye Bacterium bulgaricum (L. delbrueckii ssp. bulgaricus) adını vermiş olması, yoğurdun Bulgar ürünü olarak tanıtılmasına yol açmıştır. Birçok kaynak yoğurdun ilk defa göçebe Türk kavimleri tarafından eski çağda kullanıldığına işaret etmektedir ve yaygın olan düşünceye göre yoğurt bir Türk buluşudur ve Türklerin milli bir yiyeceği olarak kabul edilmektedir 5, 10(s.75), yy da bilim ve teknolojideki hızlı ilerlemelerin bir sonucu olarak yoğurdun endüstriyel boyutta üretimi gerçekleştirilmektedir. Böylece geleneksel kalıpların dışına çıkılmış, daha hızlı ve standart üretim aşamasına gelinmiştir. Endüstriyel yoğurt yapımı ile kalitesi kontrol edilebilen hijyenik kurallara uygun, yüksek besleyici değere sahip yoğurdu elde etmek mümkün olmuştur 5, 10(s.78). Starter kültürlerin kullanıldığı kontrollü fermantasyon yöntemlerinin henüz uygulanmadığı yıllarda fermente süt ürünleri doğal fermantasyonla üretilmiştir. Ancak doğal fermantasyon gerek son ürünün mikrobiyolojik kalitesi ve gerekse üründe istenmeyen bazı kusurların ortaya çıkması açısından güvenilir bir fermantasyon yöntemi olmaması sebebiyle terk edilmeye yüz tutmuştur. Fermantasyonda kullanılan starter kültürlerin metabolizması ve aktiviteleri ile ilgili çalışmalar arttıkça starter kültür kullanımı ile kontrollü koşullar altında üretim yaygınlaşmıştır. Bu durum fermantasyon sanayiinde standart kalitede ürünlerin daha ekonomik koşullarda üretilmesine olanak tanımıştır 12. 4

18 Fermente bir süt ürünü olan yoğurt protein kalitesinin, kalsiyum ve kuru madde içeriğinin yüksek ve sindiriminin kolay olması yanı sıra sindirim sistemini düzenlemesi, yüksek besleyici değere sahip besin elementlerini (karbonhidrat, protein, yağ, kalsiyum, fosfor v.b) içermesi nedeniyle tüketimi en fazla olan süt ürünlerindendir 10(s.75), 13. Yoğurtta laktik asit bakterilerinin immün sistemi (bağışıklık sistemi) stimüle ettiği, immunoglobulin A ve gama interferon üretimini desteklediği, bu durumun insan vücudunun patojenlere karşı direncini ve antitümör aktivitesini artırdığı bildirilmektedir 12. Türk toplumu yüzyıllardan beri yoğurdu hem güvenilir bir yiyecek, hem de sağlığı koruyucu, çeşitli hastalıkları rahatsızlıkları giderici bir ilaç olarak kabul etmiştir Türkiye de Yoğurt Uzun yıllardan beri halkımız tarafından sevilerek ve fazla miktarlarda tüketilen yoğurt Türkiye de en fazla bilinen fermente süt ürünüdür. Türkiye'de yılda üretilen tahmini yoğurt miktarı 1.3 milyon tondur. Bunun yüzde 20'sini ticari markalı olanlar, geri kalanını (% 80) da evde yapılan ve açık satılan yoğurtlar oluşturmaktadır 5, 10(s.75-76). Türk Gıda Kodeksi Fermente Sütler Tebliği nde; süt proteini (ağırlıkça %) en az 3.0, titrasyon asitliği (laktik asit olarak ağırlıkça %) en az 0.6, en fazla 1.5, süt yağı (ağırlıkça %) en fazla 15, tam yağlı yoğurt süt yağı % 3.8, yarım yağlı yoğurtta süt yağı % 2 > ile % 1.5 arası, yağsız yoğurtta süt yağı % 0.5 şeklinde yer almaktadır, etikette belirtilen toplam ilave mikroorganizma (starter kültürlere ilave olarak eklenen diğer starter ve/veya yan kültürler) (kob/g) en az 10 6, toplam spesifik mikroorganizma (kob/g) en az 10 7, maya (kob/g) bulunmamalıdır 8. Yoğurt Standart ında 5 numuneden hiçbirinde koliform bakteri sınırı 10 adet/g ı geçmemesi, yoğurdun bir gramında 100 den çok maya ve küf olmaması bildirilmiştir. Yağ % (m/m) tam yağlı en az 3.8, yağlı en az 3, yarım yağlı en az 1.5, az yağlı en çok 5

19 1.5, yağsız en çok 0.15, yağsız kuru madde % (m/m) en az 12, protein % (m/m) en az 3, titre edilebilir asitlik (lâktik asit cinsinden) % (m/m) en az 0.6 en çok 1.6 olarak belirtilmiştir 9, 15. Aşağıdaki tablolarda ülkemizde yoğurt için uygulanan mikrobiyolojik ve kimyasal kriterler verilmiştir. Bu değerler yoğurtta bulunmasına izin verilen maksimum mikroorganizma ya da mikroorganizmaların izin verilen düzeylerini ve içermesi gerekli kimyasal madde düzeylerini göstermektedir. Fermente Süt Ürünleri Tebliği nde yoğurt için belirlenmiş mikrobiyolojik değerler Tablo 2.1 de, kimyasal değerler Tablo 2.2 ve 2.3 de gösterilmiştir 8. Tablo 2.1. Fermente Sütler Tebliği Mikrobiyolojik Limitler Ürün Mikroorganizmalar Numune alma planı Limitler (1) n c m M Koliform bakteriler (2) Yoğurt Maya (probiyotik kullanılanlar hariç) Küf E. coli (2) 5 0 <3 (1) : Aksi belirtilmedikçe limit kob/g-ml olarak değerlendirilir. (2) : EMS (En Muhtemel Sayı) yöntemi n: Partiden, bağımsız ve rasgele seçilen numune sayısını, c: m ve M arasında olmasına izin verilen maksimum numune sayısını (M değeri taşıyabilecek en fazla numune sayısını) m: (n-c) sayıdaki numunede bulunabilecek en fazla mikrobiyolojik değeri, M: c sayıdaki numunenin bu değeri aşması halinde uygunsuz olup kabul edilemez olduğunu gösteren mikroorganizma sayısını 6

20 Tablo 2.2. Fermente Sütler Tebliği Yoğurta Ait Değerler Yoğurt Süt Proteini* (Ağırlıkça %) En az 3.0 Süt yağı (Ağırlıkça %) En fazla 15 Titrasyon asitliği (Laktik asit olarak ağırlıkça %) En az 0.6 En fazla 1.5 Etanol (% hacim/ağırlık) - Toplam Spesifik Mikroorganizma (kob/g) En az 10 7 Etikette Belirtilen Toplam İlave Mikroorganizma (kob/g) ** En az 10 6 Mayalar (kob/g) - * Süt Proteini; Kjeldahl metodu ile belirlenen toplam azot miktarı x 6.38 ** Bu Tebliğ kapsamında yer alan ürünlerin üretiminde bu tebliğin tanımlar başlıklı 4 üncü maddesinde belirtilen starter kültürlere ilave olarak eklenen diğer starter ve/veya yan kültürler Tablo 2.3. Fermente Sütler Tebliği Yoğurt İçin Yağ Oranları Yağ Oranı Tam yağlı yoğurt süt yağı % 3.8 Yarım yağlı yoğurt % 2 > süt yağı % 1.5 Yağsız yoğurt süt yağı % 0.5 %... yağlı yoğurt Tam yağlı, yarım yağlı ve yağsız yoğurt sınıfları dışında kalan süt yağı Yoğurt Standardı nda yoğurt için mikrobiyolojik değerler Tablo 2.4 de, kimyasal değerler Tablo 2.5 de gösterilmiştir 9, 15. 7

21 Tablo 2.4. Yoğurt Standardı Yoğurdun Kimyasal Özellikleri Değerler Özellik Yağ, % (m/m) Tam yağlı Yağlı Yarım yağlı Az yağlı Yağsız en az en az en az en çok en çok Yağsız kuru madde, % (m/m), en az Protein, % (m/m), en az Titre edilebilir asitlik (Lâktik asit cinsinden), % (m/m) en az en çok Tablo 2.5. Yoğurt Standardı Yoğurdun Mikrobiyolojik Özellikleri Özellikler N C m M Koliform bakteri* E. coli* 5 0 <3 - Maya (kob/g)** x x 10 2 Küf (kob/g)** x x 10 2 N = Analize alınacak deney numunesi sayısı c = (M) değerinin bulunabileceği en yüksek deney numune sayısı m = (n - c) sayısındaki deney numunesinde bulunabilecek en üst sınır M= (c) sayıdaki deney numunesinde bulunabilecek en üst sınır * En muhtemel sayı tablosuna göre (adet/g) ** kob: koloni oluşturan birim Ülkemizde yoğurt arz ve talebi birbirine eşit olup ithalat ve ihracatları yok kabul edilmektedir. Süt sanayiinde yoğurt ve süttozunun arz talep ilişkili olarak iç piyasadaki üretimi ve ithalat verileri Tablo 2.6 da sunulmuştur 16. 8

22 Tablo 2.6. Süt ve Süt Ürünleri İthalat ve Üretim Projeksiyonu (1000 Ton) ÜRÜN Yıllar Yıllık ArtıĢ Oranı (%) Yoğurt Üretim İthalat Süttozu Üretim İthalat Kaynak: TEAE hesaplamaları. Türkiye ye nereden ve nasıl geldiği belli olmayan başta süttozu, tereyağı olmak üzere birçok süt ürünü ve üretimde kullanılan çeşitli katkı maddeleri ithal edildiği bildirilmiştir Türkiye de Yoğurt Üzerine Yapılan AraĢtırmalar Atasoy ve ark. 17 yaptıkları bir çalışmada Şanlıurfa ilinde üretilen ve satışa sunulan yoğurtların bazı mikrobiyolojik özeliklerini incelemiştir. İncelenen 20 adet yoğurt örneklerinde en düşük 5.50x10 5 kob g -1, en yüksek 2.40x10 7 kob g -1 ve ortalama 5.33x10 6 kob g -1 toplam aerobik mezofilik bakteri (TAMB) sayıları bulunmuştur. İncelenen yoğurt örneklerinin ortalama maya ve küf sayısı 9.98x10 5 adet g -1 olarak belirlenmiştir. Duru ve ark. 18 Ankara piyasasında satılan 20 adet yoğurt örneği ile yaptıkları çalışmada; yoğurtların % 55 'inde küf ve maya sayısı 1x10 5 /g den çok, bazı örneklerde ise sayılamayacak kadar çok olduğu bulunmuştur. Öz 19 tarafından Konya da tüketime sunulan yoğurtlar üzerinde yapılan çalışmada numunelerin koliform grubu mikroorganizma sayısı ortalama 1.2x10 2 /g olarak saptanmıştır. Yoğurt numunelerinin % 94 ünde koliform grubu mikroorganizmaya rastlanılmamıştır. Numunelerin % 16'sının maya ve küf içermediği, % 84'ünün ise 3.3x10 2 /g 3.0x10 7 /g maya ve küf sayısı içerdiği belirlenmiştir. 9

23 Koçhisarlı ve Ergül 20 Ankara piyasasında satılan, yoğurt üreten 15 firmadan 120 adet yoğurt örneğinde yaptıkları bir çalışmada örneklerin maya ve küf bakımından % 100 'ünün maya ve küf içerdiğini bulmuştur. Buna karşılık örneklerin % 40'ında maya ve küf sayısı 100/g ü geçmemiştir. Bazı örneklerde ise sayılamayacak kadar çok maya ve küf saptanmıştır. Hisoğlu 11 Ağrı ilinde tüketime sunulan yoğurtların kalitesi üzerine yaptığı bir çalışmada, bölgesel mandıralarda üretilen yoğurtların maya ve küf sayısı en az <1,00 log kob/g, en çok 4.48 log kob/g ve ortalama 1.46±1.58 log kob/g olarak belirlenmiştir. Modern işletmelerde üretilen yoğurtlarında ise maya ve küf sayısı en az <1.00 log kob/g, en çok 2.40 log kob/g ve ortalama 0.66±0.70 log kob/g olarak belirlenmiştir. Tayar ve ark. 21 Bursa da tüketilen 20 farklı firmadan 60 adet yoğurt örneği ile yaptıkları bir çalışmada, 12 firmada maya ve küf kontaminasyonuna rastlanılmış, en az 4.2x10 3 en çok 8.4x10 4 sonuçları elde edilmiştir. Türkoğlu ve ark. 22 yaptıkları bir çalışmada Şanlıurfa ilinde satışa sunulan 20 adet yoğurdu bazı kalite özelikleri yönünden incelemiştir. Örneklerin değerleri; ph en düşük 3.31, en yüksek 4.16 ortalama 3.68, titrasyon asitliği oranı (% laktik asit cinsinden) en düşük % 0.98, en yüksek % 1.56, ortalama % 1.25, kurumadde oranları en düşük % 9.30 en yüksek % 13.03, ortalama % 10.86, yağsız kurumadde oranları en düşük % 6.41, en yüksek % 9.83, ortalama % 7.93, protein en düşük 2.24, en yüksek 5.44, ortalama % 3.38, kül oranları en düşük % 0.59, en yüksek % 0.85, ortalama % 0.74, yağ oranı en düşük % 1.40 en yüksek % 3.85 ortalama % 2.93 olarak saptanmıştır. Öz 19 Konya da tüketime sunulan yoğurtlar üzerinde yapılan bu araştırmada; numunelerde saptanan toplam kuru madde oranı ortalaması % 15.88, yağ oranı ortalaması % 3.84, yağsız kuru madde oranı ortalaması % 12.04, asidite oranı (laktik asit cinsinden) ortalama % 1.44, ph değerleri ortalaması 4.03 olarak bulunmuştur. 10

24 Tayar ve ark. 21 Bursa da üretim yapan 20 farklı firmadan 60 adet yoğurt örneği ile yaptıkları bir çalışmada; numunelerin toplam kuru madde oranı ortalama % 16.46±0.37, yağsız kurumadde oranı ortalama % 13.18±0.38, yağ oranı ortalama 3.28±0.14, asidite oranı (%LA) ortalama % 1.39±0,06 bulunmuştur. Kırdar ve Gün 23 Burdur da endürstriyel yoğurtlarda yaptığı bir çalışmada; numunelerde toplam kurumadde oranı % , yağ oranı % , protein oranı % , asitlik oranı ise (%L.A.) % arasında olduğu bulunmuştur. Koçhisarlı ve Ergül 20 Ankara piyasasında satılan, 15 firmadan 120 adet yoğurt örneklerinde yaptıkları bir çalışmada; kurumadde oranı % , yağ oranı % , yağsız kurumadde oranı % , asitlik değeri SH arasında değiştiği bulunmuştur. Hisoğlu 11 Ağrı ilinde tüketime sunulan yoğurtların kalitesi üzerine yaptığı bir çalışmada kurumadde oranı bölgesel mandıralarda üretilen yoğurtlarda en az % 10.37, en çok % ve ortalama % 15.03±1.82 olarak, modern işletmelerde üretilen yoğurtların kurumadde oranı en az % 12.90, en çok % ve ortalama % 16.67±0.96 olarak tespit edilmiştir. Yağ oranı bölgesel mandıralarda üretilen yoğurtlarda en az % 2.40, en çok %3.80 ve ortalama % 3.11±0.33 olarak, modern işletmelerde üretilen yoğurtların en az % 2.80, en çok %4.70 ve ortalama % 3.91±0.35 olarak tespit edilmiştir. Yağsız kurumadde oranı bölgesel mandıralarda üretilen yoğurtların en az % 7.45, en çok % ve ortalama % 11.92±1.84 olarak, modern işletmelerde üretilen yoğurtlarda en az % 9.10, en çok % ve ortalama % 12.75±0.91 olarak tespit edilmiştir. Protein oranı bölgesel mandıralarda üretilen yoğurtlarda en az % 3.17, en çok % 5.38 ve ortalama % 4.33±0.48 olarak, modern işletmelerde üretilen yoğurtlarda en az % 3.87, en çok % 6.75 ve ortalama % 4.79±0.52 olarak tespit edilmiştir. Titre edilebilir asitlik oranı bölgesel mandıralarda üretilen yoğurtlarda en az % 0.77 LA, en çok %

25 LA ve ortalama % 1.39±0.26 LA olarak, modern işletmelerde üretilen yoğurtlarda en az % 0.70 LA, en çok % 1.84 LA ve ortalama % 1.28±0.23 LA olarak tespit edilmiştir Melamin Melamin in Kimyasal Özellikleri Moleküler formül; (C 3 H 6 N 6 ), IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry-Chemical nomenclature) ismi; 1,3,5-triazin -2,4,6-triamin, Molar kütle g / mol. Melaminin % 66 oranında azot içerdiği belirtilmiştir 24, 25. Melamin organik bir bileşiktir. Alman kimyager Justus von Liebig tarafından 1834'te sentezlenen melamin, formaldehitle birleştirildiğinde ısı ile sertleşen, çok dayanıklı bir plastik (melamin reçinesi) meydana getirmekte ve ev aletleri (mutfak gereçleri, cihazlar, aydınlatma vs), gübreler, mutfak tezgâhları, yangın geciktiriciler, yapıştırıcılar, kumaşlar ve kuru-silinebilir plakalar (beyaz tahtalar) gibi malzemelerin üretiminde kullanılmaktadır. Reçinelerden gıda üretimi sırasında gıda ile temas olsa da genellikle gıdalarda iz miktarlarda melamin mevcuttur. Gıdalarda eser miktarlarda bulunabilen melaminin bu seviyesi insan sağlığı için herhangi bir risk teşkil etmediği belirtilmiştir Melamin 1950 ve 1960 larda yapısındaki yüksek azot içeriğinden dolayı gübre olarak kullanılmıştır. Sonraları melaminin gübre olarak oldukça pahalı olduğu ve yerine daha ekonomik azot kaynakları tercih edilmiştir 26. Melamin yüksek oranda azot içerdiği için 1958 'den itibaren büyükbaş hayvan yemlerinde protein olmayan azot (NPN-non protein nitrogen) kaynağı olarak kullanılmış, 1978 'de yasaklanmasına karar verilmiştir

26 Melamin in Toksikolojik Özellikleri İnsanlarda ağız yoluyla alınan melamin toksisitesi ile ilgili çalışma yoktur. Toksisite verilerine esas olarak koyun, kedi, köpek, fare ve sıçan çalışmaları gelmektedir. En endişe verici olanı renal toksisitedir. Ciltte, gözlerde doğrudan temas sonucu ve inhalasyon ile solunum yollarında tahrişe neden olduğu bulunmuştur 24, 28. Melaminin oral yoldan yenmesi mesane kanseri, üreme hasarları, mesane ya da böbrek taşlarına, böbrek yetmezliğine neden olabilir yılında yapılan bir çalışmada, bir yıl boyunca melamin ile kontamine besinlerle beslenen köpeklerin % 3 ünde aşağıdaki değişiklikler olduğunu bildirilmiştir. Vücut ağırlığında azalma, melamin kristalüri, idrarda protein ve gizli kan bulunmuştur. Yine 1953 yılında koyunlar üzerinde yapılan bir çalışma ile akut böbrek toksisitesi gösterilmiştir. 100g oral dozda melamin verilen tüm koyunların öldüğü, azaltılarak oral verilenlerde böbrek toksisiteleri gözlenmiştir. Melaminin düşük dozlarda toksik olmadığı bildirilmiştir. Ancak Amerikan Veteriner Laboratuar Teşhis Derneği tarafından yaptırılan bir araştırma da siyanürik asit ile birleştiğinde, çözünmeyen kristaller oluşturarak böbrek taşlarına neden olmakta; özellikle bebekler ve küçük çocuklar gibi hassas bireylerde böbrek yetmezliği sonucunda ölüme yol açabilmektedir. Yetişkinlerde, melamin sadece çok yüksek konsantrasyonlarda tehlike yaratmakta olduğu bu nedenle kronik toksisite potansiyeli olduğunu belirtilmiştir 24, 25, 28. Hayvanlarda yapılan çalışmalarda melaminin üremeye olumsuz etkisinin olduğu, kanser ve böbrek yetmezliğine yol açabildiği bildirilmiştir Melamin in Gıdadaki Varlığı Süt ve süt ürünlerine azot (N) üzerinden protein değeri ölçümlerinin yüksek gösterilmesi amacıyla % 66 oranında azot içeren melamin tağşiş yoluyla katılmış ve bu ürünlerden özellikle melaminli süt tozu ile hazırlanmış bebek mamalarının kullanımı 13

27 sonucu bebek ölümleri ve binlercesinin hastalanması sonucunda Çin kaynaklı melamin krizi ortaya çıkmıştır. Melamin katkılı sütlerden hazırlanmış olan süttozları başta bebek mamaları olmak üzere birçok ürüne süt kaynağı olarak katılmıştır. Hatta bu süttozlarının Çin den diğer ülkelere ihracatı yapıldığı da doğrulanmıştır. Etkilenen bütün çocukların sağlık sorunlarının başlamasından önce yaklaşık 3 ila 6 ay içerisinde melamin kontamine ürünlerle bir teması olmuştur. ABD, Çin başta olmak üzere geniş perspektifte gıdalarda melamin kalıntısı üzerine tespit araştırmaları yapılmıştır. Çin Ulusal Denetim Kurumu, içlerinde süttozu ve süt ürünlerinin de bulunduğu birçok marka ve ürün üzerinde ülke çapında melamin varlığı araştırması yapılmış ve mg/kg arasında değişen yüksek melamin içeriği tespit edilmiştir. Çin de en büyük bebek maması üreticilerinden olan bir firma ürünlerinde ise g/kg oranlı melamin varlığı tespit edilmiştir 28, 30. Çin de iki şirket Bangladeş, Burundi, Myanmar, Gabon ve Yemen'e ürünlerini ihraç ettiklerini doğrularken, bu ihraç ürünlerinde kontaminasyon varlığı doğrulanmamıştır. Çin bu ürünleri geri talep etmiştir. WHO durumu izlemek için Çin Sağlık Bakanlığı ile yakın iletişimde bulunmuş, WHO aynı zamanda Uluslararası Gıda Güvenliği Yetkilileri Ağı (INFOSAN) yoluyla üye ülkeler durum hakkında bilgilendirilmiştir. INFOSAN özellikle Çin den potansiyel olarak kontamine ürünleri ithal etmiş beş ülkeyi uyarmıştır 30. Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi (US FDA), 2007 yılında evcil hayvanlarda yaşanan ölümlü gıda olaylarından sonra ön risk değerlendirmesi yaparak melamin ve yapısal analogları ilişkin geçici güvenlik / risk değerlendirmesi yayınlamıştır. Buna göre melamin vücut ağırlığının kilogramı başına 0.63 mg günlük tolere edilebilir (TDI) alım açıklanmıştır

28 Amerika Birleşik Devletleri Gıda ve İlaç İdaresi, Kanada Sağlık Bakanlığı ve Avrupa Gıda Güvenliği Otoritesi tarafından Çin süt ürünleri ve süt içeren diğer ürünler (bebek mamaları dahil) için yeni bir risk değerlendirmesi gerçekleştirilmiş 2008 de yayınlanmıştır. Bu açıklamada, tolere edilebilir günlük alım miktarı (TDI) vücut ağırlığının kg'ı başına 0.5 mg olduğu belirtilmiştir yılında ABD de FDA nın yaptığı denetimler sonucunda 89 bebek mamasından sadece bir tanesinde ppb melamin varlığı tespit edilmiştir 32. Schoder 33 Tanzanya da 2008 yılında yaptıkları bir araştırmada piyasadan toplanan 49 adet süttozu örneği incelenmiştir. İncelenen süt tozu örneklerinden 3 ünde mg/kg aralığında değişen konsantrasyonlarda melamin varlığı tespit edilmiştir yılında Kanada da yapılan bir araştırmada piyasadan 94 bebek maması toplanmış bunlardan 71 tanesinde ng/g arasında değişen oranlarda (ortalama 16 ng/g) melamin varlığı tespit edilmiştir. Bulunan melamin değerlerinin Dünya Sağlık Örgütü nün önerdiği toksikolojik referans değeriyle karşılaştırıldığında düşük seviyelerde bulunması Kanada'da piyasadan alınan bebek mamalarında, bir sağlık riski teşkil etmediğini belirtilmiştir 34. Kanada Tıp Birliği Dergisi nde (Canadian Medical Association Journal) yayınlanan bir çalışma, Melamin e maruz kalmanın uzun vadede ciddi sağlık sorunlarına yol açabileceğini, bu etkilerin gözlenebilmesi için etkilenen çocukların yakından izlenmesi gerektiğini ortaya koymuştur. Yapılan incelemede, 7933 çocuğun 48 inde böbrek taşı ve böbrek şişliği sorunları gözlendiği, bir, üç ve altı aylık dönemlerde izlenen çocukların % 12 sinde böbrek anomalisinin sürdüğü gözlemlenmiştir

29 Yayınlanan bir çalışmada, melamin maruziyetinin arttığı çocuklarda üriner sistem taş hastalığı sıklığı rapor edilmiş, melaminle kontamine mama tüketimi beslenme yoluyla böbrek taşı oluşumuna sebep olduğu belirtilmiştir 36, yılında LanZhou üniversitesinde yapılan bir çalışmada melamin türevlerinden olan ammeline vücutta ürik asit oluşumuna ve böbrek yetmezliğine yol açabileceği vurgulanmıştır 38. Sichuan Üniversitesinde Wang ve ark. 39 yaptığı bir çalışmada melamin bulaşmış süt ürünleri kullanan çocuklarda üriner taşlarla melamin ilişkisi incelenmiştir. Melamin bulaşmış süt ürünleri kullanan çocuklarda, üriner sistem taşlarının küçük çocuklarda daha sık ve daha yoksul ailelerin çocuklarının daha şiddetli olduğu bulunmuştur. Zhengzhou Üniversitesinde Wen ve ark. 40 tarafından 195 bebek ve küçük çocuklarda melamin ile ilişkili üriner taşların klinik seyir ile birlikte izlenmesi araştırması yapılmış; konservatif tedavinin rezidüel melamin ile ilgili üriner taşlar bulunan olgularda yüksek bir etkinlik gösterdiğini ve melamin bulaşmış süttozu ile beslenmiş, vücut ağırlığı diğerlerine nazaran büyük bebeklerin erken tedavi ile klinikleri hafif seyirli olduğu incelenmiş ve böbrek ve mesane üzerinde belirgin bir etki göstermediği bildirilmiştir. Çin Shenzhen Nanshan hastanesi Nefroloji Bölümünde Zhu ve ark. 41 melamin ile kontamine süt tozu nedenli pediatrik böbrek taşı konservatif tedavi araştırılmış, melamine maruz kalma süresi uzun olan hastalarda Nefrolitiazis oluşumu yüksek seviyede ilişkili bulunmuştur. Melamin ile bulaşım olmuş hastalarda normal böbrek fonksiyonu var olması, ciddi klinik semptomları olmayan hastalarda konservatif tedavi yaklaşımı ile taş oluşumu ve sağlık riskleri çözülebilir bulunmuştur. Vücut sağlığı konusunda melamin ile bulaşma ya da etkilenmede bebekler neden yüksek risk grubunda oldukları üzerine PEHSU tarafından yayınlanan bültende; 16

30 bebeklerin kontamine mamaları birincil besin kaynağı olarak tüketebildikleri görülmüştür. Daha büyük çocuklar ve yetişkinlerin vücut ağırlığı yönünden melamin ile kontamine gıdalardan tüketimi vücut ağırlığı yönü ile birim başına daha az melamin tüketimi yani düşük dozda alımı riskin düşmesine sebep görülmüştür. Bebek idrar yolları; lümen, tübüller ve kan damarları küçük olması hasebiyle tübüler ve idrar yolu duvarlarının tahrişi daha kolay olabilir. Bu risk ile orantılı olarak idrar kanallarının taşlar tarafından kolay tıkanması ve ürolitler sonucunda idrar ile kan damarlarının daha fazla sıkıştırma gözlemlenmiştir. Prematüre bebekler arasında gözlenmiş olan ve böbrek hastalık riski olarak tanımlanan Çin salgını PEHSU nun bu açıklamayı yapmasına neden olmuştur. Bebeklerde büyük çocuklar ve erişkinlere göre daha düşük glomerüler filtrasyon hızı olduğu bildirilmiştir. Bu nedenle co-kristalize kristalleri ile predispozan (zemin hazırlayıcı) faktörler birlikte tübüllerin aracılığıyla idrar akışını azaltabildiği açıklanmıştır. Ürik asit büyük çocuklarda ve erişkinlere göre bebeklerde çok daha yüksek bir hızda idrarla atıldığı bildirilmiştir Melamin TeĢhis Metotları Melamin gıdada rutin olarak analiz edilen bir madde değildir, ancak 2007 de baş gösteren süt ve süt kökenli ürünlerden kaynaklı melamin krizi ile beraber bu maddenin analiz edilmesi ihtiyacı doğmuştur. Dünya Sağlık Örgütü melamin ve türevlerinin gıdalarda ve/veya yemlerdeki katkılarını kantitatif olarak tespit etmek amacıyla önerdiği analiz yöntemleri 2009 da bir bültenle yayınlanmıştır. WHO tarafından yayınlanan bülten ile halen kullanılmakta olan yöntemler, bunların ticari varyasyonları ve ölçüm hassasiyetleri bildirilmiştir. Analizler yüksek performanslı, hassas algılama ve seçicilik ilkeleri ile çalışmaktadır. Ölçüm metotları özetle yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC), gaz kromatografisi (GC), tandem kütle spektrometrisi (MS / MS), tek kademeli bir kütle spektrometrisi (MS), diyot dizi dedektörü (DAD), ultraviyole emme 17

31 (UV) yöntemleri ve bu yöntemlerin birleştirilmesi ile çok daha etkili yöntemler oluşturulup kullanılabilmektedir. Enzim-linked immunosorbent assay (ELISA) yöntemi rutinde düşük numune konsantrasyonları tespitinde kullanılabilir. Ölçüm metotlarının kullanım hassasiyetleri; GC-MS/MS; Süt, süt tozu ve diğer süt ürünlerinde melamin tespit sınırı 50 ppb, HPLC/UV; süt ve süt ürünü dahil birçok farklı gıdada 25 ppb seviyesine kadar melamin ve türevlerinin tespiti, LC/MS; hayvan yemi ve ette melamin 10 ppb düzeyinde tespiti, LC/MS-MS; dokularda 1.7 ppb, gıdalarda melamin kalıntısı 25 ppb, süt tozlu bebek maması için 200 ppb ölçülebilir aralıklar kullanılabilmektedir. GC/MS; farklı tür numunelerde melamin tespit sınırı 2 ppm. Eliza metodunda süt, süt tozu ve diğer süt ürünlerinde kantitatif ölçülebilir melamin süt için ppm, süt tozu için ppm dir ELISA hızlı ve pratik olması yanında yüksek bir alt yapı yatırımına ihtiyaç hissetmeden yüksek analitik hassasiyet ve verimlilik sağlamasıyla melamin analizinde tercih edilen bir yöntemdir. Süt ve süt ürünlerinde melamin varlığının ELISA yöntemi kullanılarak incelendiği araştırmalar bulunmaktadır 33,

32 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Erzurum ili piyasasında satışa sunulan endüstriyel yoğurtlardan Mayıs 2010 Temmuz 2010 tarihleri arasında, 17 adet markalı yoğurt örneği orijinal ambalajında alınarak soğuk zincir altında laboratuvara getirilmiş ve aynı gün mikrobiyolojik analizleri (Toplam aerobik mezofilik bakteri sayısı, Enterobacteriaceae sayısı, maya ve küf sayısı, Lactobacillus bulgaricus sayısı, Streptococcus thermophilus sayısının belirlenmesi), ph, titrasyon asitliği, yağ, nişasta, jelatin analizleri yapılmıştır. Örneklerin protein kül ve melamin içeriklerini belirlemek için derin dondurucuda saklanmış (-18±1 o C) ve bir hafta içinde bu analizlerde tamamlanmıştır. Araştırma 2 tekerrürlü olarak gerçekleştirilmiş ve toplam 34 adet örnek incelenmiştir Metot Kimyasal Analizler Endüstriyel yoğurt örneklerinde; melamin kontaminasyonu, yüzde titrasyon asitlik, ph, kuru madde, yağ, nişasta, jelatin, kül, protein değerleri araştırılmıştır Melamin Tespiti Yoğurt numunelerinde melamin varlığının tespiti için ticari ELISA kit kullanılmış (CusabioBiotech Co., LTD) ve analiz bu üretici firma tarafından belirtilen yöntem modifiye edilerek gerçekleştirmiştir 48. Ticari firma tarafından belirtilen analiz metoduna göre 1 g yoğurt örneği 10 ml dilüsyon (% 60 metanol / distile su) çözeltisiyle dilüe edildikten sonra bir dakika vorteks ile homojenize edilmiş ve 5 dakika dinlendirilmiştir. Ardından rpm de santrifüjlendikten sonra supernatan şırınga yardımıyla 0.2 µm filtreden (Acronis Syringe Filter, PALL Life Sciences) geçirilmiştir, elde edilen süzüntü yoğurt örneği için çalışma numunesi olarak kullanılmıştır. ELISA plate üzerine okuma sırasına göre ilk 5 19

33 kuyucuğa konsantrasyonları artan sıralamalı ticari standartlar, ardından yoğurt örnekleri ve sonrasında tekrar standartlar 50 µl oranında, ardından blank kuyucuklara 100 µl sample dilüent konulmuştur. Bu işlemden sonra blank hariç tüm kuyucuklara HRP- Melamine working solüsyonundan 50 µl pipet ile karıştırılarak eklenmiştir. Ardından 1 dakika süreyle yavaşça plate mix yapılmış ve kuyucukların yüzeyi parafilm ile kapatılarak 30 dakika 37 o C de inkübe edilmiştir. İnkübasyonun ardından plate kuyucukları multi pipet kullanarak 200 µl Wash Buffer solüsyonu ile her biri 5 kez olacak şekilde 5 defa yıkama işlemine tabi tutulmuş ve ardından plate ters çevrilerek kuyucuklar kurutma kâğıdı yardımı ile kurutulmuştur. Ardından tüm kuyucuklara 90 µl TMB substrat eklendikten sonra karanlık ortam oluşturularak 20 dakika 37 o C de inkübe edilmiştir. Ardından tüm kuyucuklara 50 µl stop solüsyon eklenmiş ve renk değişiminin tam olması amacıyla plate hafifçe sallanarak mix işlemi yapılmıştır. Bu işlemin ardından plate 450 nm dalga boyuna ayarlanmış ELISA okuyucuda (Biotek ELX 800) okunarak absorban değerleri bulunmuştur. Standartlar için belirlenen absorbans değerleri kullanılarak kalibrasyon grafiği çıkarılmış (Şekil 3.1) ve bütün örneklerdeki melamin varlığı bu grafikten elde edilen formülle (Tablo 3.1) hesaplanmıştır. 20

34 ġekil 3.1. Yoğurt örneklerinde melamin varlığı hesaplamak ve belirlemek için kullanılan kalibrasyon grafiği (S= , r= ). Tablo 3.1. Kalibrasyon Grafiğinden Çıkarılan Formül. y=(a*b+c*x^d)/(b+x^d) a b c d Yüzde Titrasyon Asitlik Oranı Homojen hale getirilen yoğurt numunesinden 10 g tartılmış, üzerine distile sudan 90 ml ilave edilerek iyice homojen hale getirilmiştir. Üzerine % 2 lik fenolftalein indikatöründen üç damla damlatılmış ve 0.1N NaOH çözeltisi ile kaybolmayan hafif pembe renk oluşuncaya kadar titre edilmiştir. Sarf edilen 0.1N NaOH miktarı aşağıda 21

35 belirtilen formülde yerine konarak yüzde titrasyon asitlik oranı bulunmuştur 49(s ). Laktik asit (LA) sonucunu bir diğer titrasyon asitlik derecesi olan Soxhlet-Henkel derecesine çevirmek için ile çarpılması gerektiği bildirilmektedir 50(s.73). Harcanan 0.1N NaOH (ml) x % asitlik = X 100 Harcanan Yoğurt (g) ph Değeri Araştırmada kullanılan yoğurt örneklerinden 25 g alınarak 225 ml distile su eklenmiş iyice homojen edilmiştir. Homojenizat sıcaklığı 25 o C ye ayarlanarak ph değerleri ölçülmüştür. Tüm örneklerin ph değerleri ph metre kullanılarak (İnolab, WTW GmbH, Germany) ölçülmüştür Kuru Madde Oranı Bütün numuneler için önceden 105 C etüvde kurutulup, darası alınan kaplar içerisine yaklaşık 5 g örnek olacak şekilde tartılmış ve etüvde 105 C de sabit ağırlığa gelene dek kurutulmuştur. Kurutulan örnekler desikatör içine yerleştirilerek oda sıcaklığına getirilmiş ve tartımları yapılarak aşağıdaki formül kullanılarak yüzde kuru madde oranları hesaplanmıştır 49(s ). m 1 m % Kuru Madde = X 100 m 2 m m =Kabın darası m 1 =Kurutma sonrası örneklerin ağırlığı m 2 =Kurutma öncesi örneklerin ağırlığı Yağsız Kuru Madde Oranının Belirlenmesi Örneklerin yağsız kuru madde oranları hesaplama yoluyla belirlenmiştir. Yoğurtta yağsız kuru madde oranı, 1330 nolu Türk Standardı na göre kütlece en az % 22

36 12 olmalıdır 9, 49(s.244). YKMO = KMO - YO YKMO : Yüzde yağsız kuru madde oranı (g) KMO :Yüzde kuru madde oranı (g) YO : Yüzde yağ oranı (g) Yağ Oranı Yoğurt örnekleri yağ oranı tespiti Gerber metoduna göre yapılmıştır. Bu amaçla süt bütirometrelerine 10 ml (H 2 SO 4, % lik, d 20 = g/ml, Merck) asit konulmuştur. 30 g yoğurt örneği 30 ml distile su ile sulandırılarak karıştırılmış (1:1 oranında) ve bu örnekten 11 ml alınarak bütirometrede öncesinde konulan asit ile karıştırmadan üzerine yavaşça ilave edilmiştir. Son olarak üzerine 1 ml amil alkol (d g/ml, kaynama noktası 128 C) ilavesinden sonra ağzı tıpayla kapatılarak yavaş ve kontrollü olarak iyice karıştırılmış ve Gerber santrifüjünde (dakikadaki devri ve ısıtmalı santrifüj) 5 dakika süreyle tutulmuştur. Santrifüjden çıkarılan bütirometre iyice karıştırılarak 65 C lik su banyosunda 5 dakika tutulmuş, bütirometrede okunan değer 2 ile çarpılarak yağ oranı yüzde olarak bulunmuştur 49(s ) NiĢasta Tespiti Nişastanın iyot ile mavi renk oluşturması ve bu yolla yoğurt içerisinde nişasta varlığının ortaya çıkarılması prensibi ile çalışılarak tespit edilmiştir 49(s.249). Homojen hale getirilen yoğurt örneğinden 2-3 ml bir deney tüpü içerisine alınmış ve üzerine 2-3 ml damıtık su ilave edilerek iyice karıştırılmıştır. Homojen hale getirilen karışım üzerine 2-3 damla lugol çözeltisi eklenmiş, tüp karıştırılarak sonuç görünüme göre kaydedilmiştir 49(s.249). Mavi renk oluştuğu takdirde nişasta ilave edildiği sonucu varılır. Nişasta ilave edilmeyen örneklerde sarı renk meydana gelir 49(s.249). 23

37 Jelatin Tespiti 10 ml yoğurt örneği alınmış ve üzerine 10 ml Asit-Hg(NO 3 ) 2 çözeltisinden katılarak iyice karıştırılmıştır. Elde edilen karışımın üzerine 20 ml distile su katılarak yeniden karıştırıldıktan sonra 5 dakika bekletilmiş. Daha sonra süzgeç kâğıdından süzülmüş. Yoğurt içerisinde fazla miktarda jelatin varsa, filtrat berrak olmayıp, bulanık bir görünüm oluşur 49(s ). Süzüntüden 5 ml alınarak deney tüpüne aktarılmıştır. Üzerine 5 ml doymuş pikrik asit çözeltisi ilave edilerek iyice karıştırılmıştır. Deney tüpündeki renk ve görünüm durumu belirlenerek kaydedilmiştir 49(s ). Deney jelatinsiz olduğu bilinen bir yoğurt numunesiyle paralel olarak yapılır. Kontrol ve örneklerin deney tüplerinde görülen çökeltiler veya bulutlanmalar kıyaslanır 49(s ). Sarı bir çökelek meydana geldiği taktirde % 1 civarında jelatin olduğu kabul edilir. Daha az miktarda jelatin ilave edilmesi durumunda, deney tüpünde bulanık bir renk oluşur 49(s ). Kontrol tüpünde pikrik asitle sağlanan çökelek büyük kümeler halindedir, kolayca çöker, tüpün iç kenarları ve dibine yapışmaz. Tüp su ile yıkanarak kolayca temizlenir. Jelatin oranı % 0.1 ve daha az ise jelatin-pikrik asit çökeleği uzun süre süspansiyon halinde kalır, bir gece bekletildiğinde karakteristik yapışkan çökelek tüpün iç kenarlarına ve dip kısmına sıkıca yapışır ve temizlenmesi zordur 49(s ) Kül Oranı Bütün numuneler için önceden etüvde kurutulup, tartımı alınan porselen krozeler içerisine yaklaşık 5 g örnek alınmış, etüvde 105 C deki bir saat ön kurutmadan sonra 550 C deki kül fırınında sabit ağırlığa gelene kadar tutulmuştur. Sonra örnekler 24

38 desikatör içine yerleştirilerek oda sıcaklığına getirilmiştir ve tartımları yapılarak aşağıdaki formül kullanılarak yüzde kül oranları hesaplanmıştır 50(s.48-50). % Kül = [ (T3 -T1) : ( T2 - T1) ] X100 T1 = Kroze boş ağırlığı T2 =Kroze + Yoğurt ağırlığı T3 =Kül fırını sonunda Kroze + Yoğurt külü Protein Oranı Bütün numuneler protein oranı analizi Kjeldahl Yöntemi esas alınarak yapılmıştır. İyi bir şekilde karıştırılarak homojen hale getirilmiş süt örneğinden yaklaşık 3-4 g tartılmış, sonra 1 adet kjeldahl katalizör tableti eklenmiştir. Bunun üzerine 25 ml konsantrasyonu % lik yoğunluğu 1.84 g/cm 3 olan H 2 SO 4 ten konulup yakma düzeneğine yerleştirilmiştir. Yaklaşık 425 o C de yakma tüpü içerisindeki karışımın rengi berraklaştıktan sonra da 30 dakika daha devam ettirilmiştir. Yakma işleminden sonra karışım oda sıcaklığında soğutulmuş ve her yakma tüpü içerisine 50 ml distile su dikkatle ilave edilmiştir. Destilasyon cihazına tüp sıkıca yerleştirilmiştir. Cihazın yoğunlaştırılmış sıvı toplama tarafına daha önce içine 2-3 damla metilen mavisi+metilen kırmızısı konulmuş olan %4 lük Borik asitten 50 ml bir erlene konularak yerleştirilmiştir. Damıtma işlemi kjeldahl tüpündeki N miktarının %33 lük NaOH ve distile su ile borik asit kabına toplanması ile sonlanmıştır. Bu işlemden sonra erlen içinde elde edilen damıtık sıvı, 0.1 N HCl ile titre edilerek harcanan asit miktarı saptanmıştır. Aynı işlemler şahit numune olarak sıfır protein hesabı ile distile su ile yapılan çalışma için yapılarak bulunan değer aşağıdaki formülün uygulanması kullanılarak % azot oranı saptanmıştır. Bulunan toplam protein oranı, yoğurt için belirlenen azotun 6.38 faktörü ile çarpılmasıyla hesaplanmıştır 49(s , ). % Azot = [0.014 x N x (V1-V2) x 100] / M 25

39 N = Titrasyonda kullanılan HCI çözelti derişimi V1 = Numunenin titrasyonunda harcanan 0.1 N HCl oranı (ml) V2 = Şahit denemenin titrasyonunda harcanan 0.1 N HCl oranı (ml) M = Çalışılan örneğin tartım ağırlığı (g) Mikrobiyolojik Analizler Dilüsyon Hazırlama Her bir örnekten aseptik şartlar altında 25 g tartılarak 225 ml ringer solüsyon (¼ strength ringers solution, 2 tablet / 1 litre) ile birlikte steril Stomacher poşetine yerleştirilmiş ve 2 dakika (BagMixer 400 P Stomacher Cihazı) homojenize edilmiştir. Bu homojenizat kullanılarak 1/1x10 6 a kadar dilüsyonlar hazırlamış ve ekimler bu seri dilüsyonlar kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Mikrobiyolojik bakteri izolasyonu için Tablo 3.2'de gösterilen besiyerlerine dökme plak yöntemine göre ekim yapılmıştır. Tablo 3.2. Mikrobiyolojik Analizlerde Kullanılan Besiyerleri ve İnkübasyon Koşulları Aranan Mikroorganizma Toplam aerobik mezofilik bakteri Streptococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Enterobacteriaceae Maya ve küf İnkübasyon Koşulları Besiyeri Aerob / Sıcaklık Süre Anaerob Plate Count Agar (Merck) 30 C 72 saat Aerob ST agar (karışım halinde) 37 C 24 saat Aerob deman Rogosa Sharpe Agar (Merck) 45 C 72 saat Anaerob Violet Red Bile Dekstroz Agar (Merck) 37 C 48 saat Aerob Rose Bengal Chloramphenicol Agar 25 C 5 gün Aerob (Merck) 26