Biyoteknolojik Potansiyel Olarak Anaerobik Funguslar: Kültüre Alınmaları ve Morfolojileri

Transkript

1 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 Biyoteknolojik Potansiyel Olarak Anaerobik Funguslar: Kültüre Alınmaları ve Morfolojileri Emin ÖZKÖSE M. Sait EKİNCİ İsmail AKYOL K.S.Ü. Ziraat Fakültesi, Zootekni Bölümü, Kahramanmaraş. ÖZET Biyoteknolojik uygulamalarda sıkça kullanılan bir çok enzimin üretim kaynağı olan anaerobik funguslar gerek ruminantların ve gerekse tek mideli herbivorların birçoğunun sindirim sisteminde simbiyotik olarak yaşarlar. Konakçı hayvanın funguslar için uygun sıcaklık, anaerobik ortam ve besin kaynağı sağlamasına karşılık funguslar konakçı hayvan tarafından alınan bitkilerin hücre duvarlarındaki polisakkaritleri sellobiyoz ve glikoza çevirerek simbiyotik halkayı tamamlarlar. Orpin tarafından keşiflerinden bu yana 6 cins içerisinde 18 tür tanımlanmıştır. Neocallimastix, Piromyces ve Caecomyces cinsleri monosentrik, Orpinomyces, Anaeromyces ve Cyllamyces cinsleri ise polisentrik yaşam gösterirler. Normal yaşamları için anaerobik ortama ihtiyaç duyan bu organizmalar gastrik yıkımın gerçekleştiği abomasumdan sonraki bölümde kist veya bir çeşit memnospor oluşturarak dışkı içerisinde uzun süreli yaşama imkanı bulurlar. Durağan kültürlerde fungusun, yaklaşık bir yıla yakın canlılık gösterebilmesini sağlayan sporların keşfiyle, anaerobik funguslar tarafından memnospor üretimi tespit edilmiştir. Anahtar Kelimeler: Anaerobik Fungus, Neocallimastigales, Biyoteknoloji Anaerobic Fungi As Biotechnological Potential: Culture Conditions And Morphology ABSTRACT Anaerobic fungi, which produce different enzymes used in range of biotechnological applications, inhabit the gastro-intestinal tract of ruminants and the most non-ruminant herbivores. Host animals provide nutrient and anaerobic environment whilst anaerobic fungi are involved in biodegradation of plant particles ingested by the host animals. Since their first identification by Orpin, 6 genera and 18 species have been characterized so far. While Neocallimastix, Piromyces and Caecomyces are monocentric fungi, species of the genera Orpinomyces, Anaeromyces and Cyllamyces show polycentric development. Although they are strictly anaerobic, they could be isolated from the digesta of gastro-intestinal tract and faeces after long-term aeration. More recently spore production by some polycentric isolates proposed to be member of the genus Anaeromyces, which enhance their survival in batch culture, was reported. Key Words: Anaerobic Fungi, Neocallimastigales, Biotechnology GİRİŞ Dünyada en yaygın organik bileşikler durumunda olan selüloz, hemiselüloz, pektin ve lignin bitki hücre duvarlarında bir araya gelerek bitkiye hem yapısal sağlamlığı hem de herbivorlar tarafından sindirilmeye karşı dayanıklılığı

2 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 kazandırırlar. Bu nedenle tek mideli herbivorlar tarafından sindirilme oranları % 50 yi bulmamaktadır. Ruminantlar tarafından daha yüksek oranlarda parçalanmaları ise rumenin zengin mikroflorası sayesinde olmaktadır. Çünkü ruminantlarda bitki hücre duvarlarının yıkımı genel olarak rumende gerçekleşir ve bu yıkımda gerek protozoa (Coleman, 1978), gerek bakteriler (Pettipher ve Latham, 1979) ve gerekse funguslar (Orpin, 1977) etkin bir şekilde rol alırlar. Bu nedenle son 50 yıl içerisinde herbivorların sindirim sistemindeki mikroorganizmalar ve özellikle rumen mikrobiyal ekosistemi hakkındaki bilgiler hızlı bir şekilde artmıştır. Fakat sindirim sisteminin protozoa ve özellikle bakterileri kültüre alınmaları ile ileri düzeyde karakterize edilmelerine rağmen 3. grup organizmalar olan fungusların önemi ancak son 25 yıl içerisinde anlaşılmıştır. Bakterilerin aksine fungusların anaerobik olarak yaşayamayacakları görüşünün (Foster, 1949) Orpin in (1975) daha önce protozoa olduğu sanılan kamçılı hücrelerin aslında zorunlu anaerobik fungusların zoosporları olduğunu göstermesiyle çürütülmüş ve bu tarihten itibaren anaerobik funguslar üzerindeki çalışmalar yoğunlaşmıştır li yılların ortalarından itibaren yapılan bu çalışmaların ışığı altında anaerobik fungusların gerek ruminant ve gerekse diğer memeli herbivorların sindirim sistemlerindeki varlıkları ve bitkilerin daha yüksek oranlarda sindirimine olan katkıları konusunda şüphe kalmamıştır. Bu çalışmada herbivorların sindirim sistemindeki mikrofloranın önemli bir grubunu teşkil eden anaerobik fungusların kültüre alınmaları, yaşam döngüleri taksonomik pozisyonları ve morfolojik yapıları konusundaki bilgilerin derlenmesi amaçlanmıştır. Anaerobik Teknikler ve Besi Yerleri Rumen mikrobiyolojisine ait günümüzde kullanılan birçok anaerobik teknik ve besi yeri Hungate (1969) veya bu yöntemin biraz daha geliştirilmişi olan Bryant (1972) metoduna dayanmaktadır. Anaerobik fungusların yetiştirilmelerinde genel olarak Hungate tüpleri (12 X 124 mm) veya 100 ml lik serum şişeleri kullanılmaktadır. Bu şişelere yaklaşık % oranında besi yeri konur ve kalan boşluk ya % 100 CO 2 veya % CO 2 : % N 2 ile doldurulur. Şişelerin ağızları hızlı bir şekilde lastik kapaklarla kapatılarak 121 o C de 15 dakika sterilize edilir. Funguslar için optimum inkübasyon sıcaklığı 39 o C dir ve 33 o C nin altında ve 41 o C nin üzerindeki sıcaklıklarda bitkiler üzerinde kist oluşturmamaktadırlar (Lowe ve ark., 1987a). Besi yerlerinde eriyebilir hazır enerji kaynakları (glikoz, ksiloz veya sellobiyoz) kullanıldığında durağan kültürlerin inkübe süreleri 1-3 gün; aksi halde selüloz veya buğday samanı gibi enerji kaynağı kullanıldığında ise 4-7 gün arasında değişmektedir. Bu inkübe sürelerinden sonra funguslar mutlaka yeni besi yerlerine transfer edilmelidirler. Çünkü, inkübasyon süresinin son dönemlerinde fermantasyonun son ürünleri olan özellikle uçucu yağ asitleri açığa çıkar ve ortamın ph sı düşer. ph nın fungusların yaşamı için uygun değerlerin dışına çıkmasıyla fungal yaşam önlenmektedir (Joblin ve Naylor, 1993). Bu nedenle funguslar belli bir büyüme oranına ulaştıktan sonra yeni besi yerlerine transfer edilmelidirler. Anaerobik fungusların besi yerlerinde temel olarak rumen sıvısı, 6 farklı mikromakro mineral madde ve glikoz, selüloz, buğday samanı gibi enerji kaynağı kullanılır (Orpin, 1975). Anaerobik funguslar rumen sıvısı içermeyen besi

3 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 yerlerinde de yetişebilmektedirler (Lowe ve ark., 1985). Besi yerlerinin ph ları NaHCO 3 veya fosfat tampon çözeltileri ile e ayarlanır. Bütün besi yerleri L- sistein HCl ve oksitlenmeyi kontrol amacıyla resazurin içerir. Eğer katı besi yerleri planlanıyorsa besi yerlerine % oranında agar katmak yeterlidir. Bu besi yerleri anaerobik şartlar altında hazırlanır ve besi kaplarına bu şartlar dahilinde dökülür. Fungusların izolasyonu amaç edildiği takdirde besi yerlerini bakterilerden arındırmak amacıyla amfisilin, penisilin, kloromfenikol veya setreptomisin gibi antibiyotiklerin eklenmesi gerekir (Orpin, 1975; Akin ve Benner, 1988). Durağan Kültürlerde Gelişimin Belirlenmesi Bakterilerin özellikle çözünebilir enerji kaynakları üzerinde ve sıvı kültürlerde gelişimini belirlemek amacıyla optik yoğunluğu ölçme metodu uzun yıllardan beri kullanılmaktadır. Fakat misel oluşturan veya bitki parçaları üzerinde yaşayan mikroorganizmaların gelişimlerini tayin etmede bu yöntem sağlıklı sonuç vermemektedir. Bu nedenle anaerobik fungusların büyümelerini belirlemede genel olarak durağan kültürlerde besin maddesinin kuru ağırlık kaybının ölçülmesi veya çözünebilir durumdaki bir - birkaç son ürünün tayini kullanılmaktadır (Mounfort ve ark., 1982; Akin ve ark., 1983; Lowe ve ark., 1987b). Kullanılan bu yöntemlerin hem uzun zaman alması, hem sağlıklı sonuç alabilmek için çok sayıda tekerrüre ihtiyaç olması, hem de özellikle yıkım ürünlerinin az miktarda olduğu ilk dönemlerdeki gelişimin belirlenememesi gibi problemleri vardır. Bu problemler durağan kültürdeki fermantasyon sonucu açığa çıkan gazın ölçülmesiyle (Menke ve ark., 1979) kısmen çözülmüş ve bu metot Theodorou ve arkadaşlarının (1994) gaz basıncını %0.1-2 (25 o C de) duyarlılıkta ölçen Pressure Transducer aletini kullanmalarıyla oldukça basit, hızlı ve duyarlı hale gelmiştir. Keşifleri Gerek mayalar ve gerekse aerobik fungusların rumendeki varlıkları ve bunların rumende herhangi bir fonksiyonu olmayan ve hayvanlar tarafından alınan besin maddeleri vasıtasıyla rumende geçici olarak bulundukları uzun zamandan beri bilinmektedir (Clarke ve Di Menna, 1961). Rumen mikroflorasının diğer iki önemli grubunu teşkil eden protozoa ve bakterilere nazaran anaerobik fungusların keşfi çok daha sonra gerçekleşmiştir. Bunun en önemli sebeplerinden biri mikrobiyolojistlerin yaptıkları araştırmalarda rumen içeriğini süzerek sadece rumen sıvısını kullanmaları ve dolayısıyla anaerobik fungusların tutunduğu bitki parçacıklarını gözlem dışı bırakmalarıdır (Bauchop, 1983). Diğer bir neden ise funguslarla bakteriler arasındaki en önemli farkın fungusların anaerobik ortamlarda yaşayamayacağı görüşünün (Foster, 1949) o yıllarda hakim olmasıdır. Bugün anaerobik fungus olarak bildiğimiz organizmaların ilk defa gözlemlenmesi geçtiğimiz yüzyılın başlarına dayanır. Bu organizmalar ilk defa Liebetanz (1910) ve Braune (1913) tarafından sırasıyla Sphaeromonas communis ve Callimastix frontalis adlarıyla kayıtlara geçirilmiş fakat o dönemde bu organizmaların kamçılı protozoa oldukları düşünülmüştür. Anaerobik fungusların rumendeki varlıkları ve dolayısıyla keşifleri Orpin in (1974; 1975) yaptığı çalışmalar sonucu gerçekleşmiş ve Neocallimastix frontalis adıyla taksonomideki yerini almıştır. Orpin (1975) tarafından ilk defa tanımlanmalarından bu yana 13

4 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 monosentrik (tek bir üreme bölgesi olan), 5 polisentrik (birden fazla üreme bölgesi olan) tür, 6 farklı cins altında karakterize edilmiş ve sınıflandırılmıştır (Tablo 1). Tablo 1. Anaerobik fungusların cins ve türleri ile bazı morfolojik özellikleri (Orpin, 1994). Bazı cins ve türlerin isimleri zamanla değiştirilmiştir. Tablo içindeki isimler fungusların en son isimlerini gösterirken dipnotta ilk isimleri yer almaktadır. Cins NEOCALLIMASTIX Piromyces Caecomyces Orpinomyces Anaeromyces Cyllamyces Tür FRONTALIS patriciarum 1 hurleyensis variabilis communis 2 dumbonicus 6 mae rhizinflatus 6 spiralis minutus citronii communis 4 equi joyonii 5 intercalaris mucronatus elegans 3 aberensis İzole kaynağı KOYUN Koyun Koyun sığır koyun fil at as keçi geyik at koyun at koyun sığır koyun sığır sığır Poly- Monosentrik Kamçı sayısı Monosentrik Çok Monosentrik Çok Monosentrik Çok Monosentrik Çok Polisentrik Çok Polisentrik Çok Polisentrik Tek Polisentrik Tek Polisentrik Tek Rizoid tipi Küresel Küresel Küresel 1 : Neocallimastix frontalis 2 : Piromonas communis 4 : Sphaeromonas communis 5 : Neocallimastix joyonii 3 : Ruminomyces elegans 6 : dumbonica & rhizinflata RUMENDE KOLONİZASYONLARI VE HAYVANLAR ARASINDA GEÇİŞLERİ Yeni doğmuş ruminantların sindirim sistemi özellikle selülolitik mikroorganizmaları içermez, buna karşın ana besin kaynağı olarak sadece süt bulunduğundan rumen mikroflorasına Lactobacillus ve Streptococcus gibi laktik asit bakterileri hakimdir (Hobson ve Wallace, 1982). Fonty ve ark. (1987) tarafından yapılan çalışmada anaerobik funguslar (Neocallimastix cinsine ait) ilk kez kuzular 8 günlük iken gözlemlenmiştir. Diğer bir çalışmada ise anaerobik funguslar taze kuzu dışkısından hayvan 5 haftalık, buzağı dışkısından ise hayvan 4 haftalık iken ilk kez izole edilebilmiştir (Theodorou ve ark., 1993). Protozoa ve bakterilerin yetişkin hayvanlardan yavrulara geçişi ya emzirmeyle, ya salyayla veya ortak kullanılan su vasıtasıyla geçtiği düşünülmektedir. Çünkü geviş getirme esnasında bol miktarda rumen içeriği ağza taşınmakta ve burada

5 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 kaldığı süre içerisinde rumen mikroorganizmaları salya ile temas etmektedir (Hobson, 1971). Anaerobik fungusların ise herbivorlar arasında gerek salya gerekse yeme bulaşmış olan dışkı yoluyla transfer oldukları ileri sürülmektedir (Lowe ve ark., 1987c; Milne ve ark., 1989). Theodorou ve ark. (1990) kurumuş dışkıdan 10 ay sonra anaerobik fungusları izole etmeleri bu düşünceyi destekler durumdadır. Davies ve ark. (1993) anaerobik fungusları rumen, omasum, abomasum, ince bağırsak, sekum ve kalın bağırsaktan izole etmişlerdir. Bulunan bu sonuçlar anaerobik fungusların ağızdan anüse kadar ruminantların tüm sindirim kanalında ve dışkıda bulunabileceklerini göstermektedir. Yaşam Döngüsü Genel olarak anaerobik fungusların rumendeki yaşam süreleri, rumen sıvısı içerisinde serbest halde yüzen zoospor ve rumendeki bitki parçalarına tutunmuş vaziyetteki dallanmış formlarını içerir. Laboratuar şartlarında da gözlemlenen bu iki yaşam devresi toplam olarak saat sürmektedir (Lowe ve ark., 1987b; Ozkose ve ark., 2001). Anaerobik funguslar ilk defa Orpin (1975) tarafından keşfedilmesinden sonra uzun yıllar sadece yukarıda bahsedilen iki yasam formuna sahip oldukları düşünülmekteydi. Ancak Milne ve ark. (1989) ile Theodorou ve ark. (1990) anaerobik fungusları dışkıdan izole etmeleri bu mikroorganizmaların üçüncü bir yaşam devresini yani oksijene ve değişik sıcaklıklara dayanıklı oldukları spor veya kist devrelerini (Davies ve ark., 1993) ortaya koymuştur (Şekil 1). Fakat funguslar rumen içerisindeki gerek bitki parçaları üzerindeki vejetatif yaşamları ve gerekse zoospor dönemlerinde oksijene oldukça hassastırlar (Orpin, 1977). Serbest haldeki zoospor Dışkıda kist veya spor Besin maddesi üzerindeki dönem Şekil 1. Anaerobik funguslarin yaşam dönemleri (Davies ve ark., 1993). Sürekli oklar normal yaşam halkasını gösterirken, kesikli oklar dışkıdaki oksijene dayanıklı alternatif halkayı göstermektedir. Zoosporlar, spor kesesinden boşaldıktan sonra genel olarak rumen sıvısında birkaç saat yüzerler ve bu arada rumendeki bitki parçalarına tutunurlar. Zoosporlar taze bitki parçalarına tutunmalarından hemen önce çoğunlukla kamçılarını kaybederler (Heath ve ark., 1986). Oluşan bu kistler bitki hücre duvarlarını yıkarak hücre içinde rizoidleri filizlendirirler. Böylece vejetatif büyüme dönemi başlamış olur. Bu dönemle birlikte çekirdeğin (nukleus) nükleer bölünme ile çoğalması sonucu spor kesesi içerisinde çok sayıda zoosporun oluşumu söz konusu olur. Yaşam döngülerinin saatinde rizoidler misel oluşturmaya başlarlar ve bu sırada spor kesesi oldukça gelişmiş durumdadır (Munn, 1994). Anaeromyces, Orpinomyces, Piromyces ve Neocallimastix cinslerinin rizoidleri yüksek oranlarda

6 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 dallanmalar gösterirken, Cyllamyces ve Caecomyces cinsleri çoğunlukla dallanmamış tek bir rizoid yapısına sahiptir. Gelişmiş durumdaki zoosporlar sporkesesi içerisindeki kese zarından ayrılırlar. Daha sonraki aşamada sporkesesi kamçının tam karsısındaki bir noktadan sindirilir ve zoosporlar serbest halde yüzmeye başlarlar (Munn, 1994; Ozkose ve ark., 2001). Böylece monosentrik bir fungusun yaşam döngüsü (Şekil 2) tamamlanmış olur. Şekil 2 Tipik bir monosentrik anaerobik fungusun yaşam döngüsü (Theodorou ve ark., 1996). Rakamlar (saat) yaşam döngüsünün evrelerini göstermektedir. Bu yaşam döngüsü monosentrik ve polisentrik funguslar için farklıdır. Monosentrik fungus için iki farklı üreme söz konusudur. Bu funguslarda ya kist oluşturmuş ve çekirdek içeren zoosporlar spor kesesi içerisinde gelişirler, yada nukleus zoospor dışına göç ederek orada spor kesesi oluşturur. Her iki halde de monosentrik funguslarda her bir birey için bir tek spor kesesi oluşur ve sadece spor kesesi çekirdek içerir. Oysa polisentrik funguslarda çekirdek kist oluşturmuş zoosporun dışına yani rizoidlere göç eder ve nükleer bölünmeyle her bir birey için fungusun değişik bölgelerinde birkaç tane spor kesesi şekillenir (Barr ve ark., 1989). Dolayısıyla, polisentrik funguslar çoğalmaları için zoosporlarının salınmasına ihtiyaç duymazlar. Böylece bu fungusların zoosporları nadiren gözlenebilmektedir. Morfolojik Yapılarına Göre Taksonomik Pozisyonları Morfolojik yapıları itibariyle Neocallimastix, Piromyces, Orpinomyces, ve Anaeromyces dallanmış rizoid yapısına sahip olduklarından oldukça sınırlı ve küresel rizoid yapısına sahip cinsler olan Caecomyces ve Cyllamyces cinslerinden oldukça faklıdırlar. Neocallimastix ve Piromyces monosentrik yaşam, Orpinomyces ve Anaeromyces cinsleri polisentrik yaşam halkasına sahiptirler. Neocallimastix ve Orpinomyces in zoosporları çok kamçılı (<4 kamçı) iken Piromyces ve Anaeromyces cinslerinin zoosporları tek kamçılıdır ( 4 kamçı). Küresel rizoid

7 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 yapısına sahip olan Cyllamyces ve Caecomyces cinsleri arasındaki farklılık ise Caecomyces cinslerine ait türler monosentrik, Cyllamyces cinsine ait bireyler ise polisentrik yaşam gösterirler. Anaerobik fungusların taksonomik pozisyonları 1975 yılında ilk defa gösterilmelerinden bu yana sürekli değişiklikler göstermiştir. Mikroorganizmalar içerisindeki bu grubun keşiflerinin oldukça yeni olması nedeniyle cins ve türlerin belirlenmesinde kullanılan kriterler henüz tam olarak kesinleşmemiş ve hala bir takım eleştirilere açık durumdadır (Ho ve Barr, 1995). Bugüne kadar yapılan taksonomik çalışmaların tamamında fungusların morfolojik karakterleri ve zoospor kesitlerinin elektron mikroskobuyla incelenmesi sonucu elde edilmiş olan veriler kullanılmıştır. Bu verilerin çevresel faktörlerden etkilenebiliyor olmaları (Heath, 1988) anaerobik fungusların sınıflandırılmalarında karşılaşılan problemin kaynağını teşkil etmektedir. Bilinen bütün anaerobik funguslar zoospor oluştururlar ve belirli bir hücre duvarına sahiptirler. Bu nedenle ilk kez Eumycota bölümünün Mastigomycotina alt bölümünde yer almışlardır. Heath ve ark. (1983) ile Barr (1988) tarafından fungusların Mastigomycotina alt bölümünün Chytridomycetes sınıfında yer aldıkları bildirilmiştir. Son yıllarda yapılan çalışmalar (Li ve Heath, 1992; Li ve ark., 1993) Chytridomycetes sınıfının bireyleri ile aerobik Spizellomycetales takımının birbirleriyle anaerobik funguslardan çok daha yakın olduklarını dolayısıyla anaerobik fungusların Spizellomycetales ten ziyade Neocallimasticales takımında yer almaları gerektiğini önermektedir. Öte yandan Munn (1994) anaerobik fungusların Spizellomycetales takımında değil Anaeromycetales takımında olmaları gerektiğini öne sürmüş fakat bu öneri kabul görmemiştir. Son yıllarda yapılan yukarıdaki çalışmaların ışığı altında anaerobik fungusların taksonomisi aşağıdaki şekilde belirlenmiştir. Alem: Filum: Sınıf: Takım: Familya: Cins: Tür: Fungi Chytridomyocota Chytridiomycetes Neocallimastigales Neocallimastigaceae Neocallimastix, Anaeromyces, Cyllamyces... frontalis, mucronatus, aberensis... Bugüne kadar çeşitli herbivorların sindirim sistemlerinin farklı bölgelerinden 6 cinse ait 18 türün belirlenmesine rağmen (Tablo 1) hala birçoğunun yeri ve diğerlerinden gerçekten farklı olup olmadıkları kesinlik kazanmamıştır. Örneğin, N. patriciarum ve N. variabilis in N. frontalis ile aynı oldukları ve N. hurleyensis in ayrı bir tür olup olmadığının sorgulanması gerekliliği belirtilmiştir (Ho ve Barr, 1995). A. elegans ile A. mucronatus un ve Ca. equi ile Ca. communis in birbirlerinden farklılığı tartışılır durumdadır (Ho ve Barr, 1995). Spor Üretimi Funguslar tarafından üretilen sporları zenospor (xenospore) ve memnospor olarak iki ana grupta toplamak mümkündür. Zoospor, conidia sporangiafor ve

8 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 basidiosporlar tarafından temsil edilen zenosporlar genel olarak kısa süreli yaşarlar ve yeni bir fungus oluşumu için uzaklara yayılırlar. Buna karşılık oospor, zygospor ve chalamydosporlarca temsil edilen memnosporlar orijinlerinden uzaklaşmazlar ve kötü çevre şartları esnasında fungusun gelecek generasyonu için hayat hakkı sağlarlar (Cooke ve Whipps, 1993). Bilinen bütün anaerobik funguslar zenospor (örneğin zoosporlar) üretirler ve bu konu detaylı olarak tanımlanmıştır. Fakat memnosporların anaerobik funguslar tarafından üretimlerinin gözlenmesi oldukça yenidir (Brookman ve ark., 2000; Ozkose, 2001). Memnosporlara benzer yapılar Ho ve ark. (1988) su mandalarının sindirim sisteminde, Wubah ve ark. (1991) ise laboratuarda durağan kültürlerde gözlemlemiş fakat bu araştırmalarda gözlemlenen yapılar gelecek generasyonda canlılık bulamamıştır. İlk defa sığırdan izole edilmiş olan Anaeromyces cinsine ait izolelerde gözlenmiş olan sporlar fungusun durağan kültürlerde buğday samanı üzerinde yetiştirildiklerinde maksimum 15 gün olan (Milne ve ark., 1989) canlılık süresini yaklaşık bir yıla kadar uzatmıştır (Ozkose, 2001). SONUÇ VE ÖNERİLER Rumenin ve tek mideli herbivorların sindirim sistemlerinde şu ana kadar keşfedilen funguslardan çok daha fazlasının keşfedilmeyi beklediği rumen mikrobiyolojistlerinin ortak görüşüdür. Dolayısıyla farklı türden herbivorların gerek dışkılarının gerekse sindirim sistemi içeriklerinin detaylı mikroskobik incelemeye tabi tutulmaları yeni fungusların kültüre alınmalarını sağlayacağı oldukça yüksek bir ihtimaldir. Bu arada sadece Anaeromyces cinsinde gözlenen memnospor üretiminin rumendeki diğer funguslar tarafından üretilip üretilmediğinin araştırılması gerekmektedir. İlk defa keşiflerinden buyana gerek taksonomideki yerleri gerekse isimleri defalarca değişiklik göstermiştir. Bu sorunu çözmek ve daha sağlam bir taksonomik yapının ortaya çıkmasını sağlamak amacıyla son yıllarda hızla yaygınlaşan moleküler biyoloji tekniklerinin kullanılması gerekmektedir. Anaerobik fungusların birincil ve ikincil ürünlerinin hayvan besleme ve biyoteknolojinin farklı dallarının hizmetine sunulması büyük önem arz etmektedir. Özellikle, ekonomik değere sahip enzimleri kodlayan genlerin izolasyonu ve bu genlerin farklı organizmalarda ekspresyonu ile seri şekilde üretilmeleri, üzerinde çalışılması gereken konulardır. KAYNAKLAR Akin, D.E. ve R. Benner, Degradation of polysaccharides and lignin by ruminal bacteria and fungi. Applied and Environmental Microbiology, 54: Akin, D.E., G.L.R. Gordon, J.P. Hogan, Rumen bacterial and fungal degradation of Digiteria pentzii grown with or without sulfur. Applied and Environmental Microbiology, 46: Barr, D.J.S., How modern systematic relates to the rumen fungi. BioSystems, 21: Barr, D.J.S., H. Kudo, K.D. Jakober, ve K.J. Cheng, Morphology and development of rumen fungi: Neocallimastix sp. Piromyces communis and

9 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 Orpinomyces bovis gen. nov., sp. nov. Canadian Journal of Botany, 67: Bauchop, T., The gut anaerobic fungi: Colonizers of dietry fibre. In: Fibre in Human and Animal Nutrition. (Ed. G. Wallace ve L. Bell), Royal Society of New Zealand, Wellington, pp Braune, R., Untersuchungen uber die in Wiederkauermayen vorkommenden Protozoen. Archive Protistenk, 32: Brookman, J.L., E. Ozkose, S. Rogers, A.P.J. Trinci, ve M.K. Theodorou, Identification of spores in the polycentric anaerobic gut fungi which enhance their ability to survive. FEMS Microbiology Ecology, 31: Bryant, M.P., Commentary on the Hungate technique for culture of anaerobic bacteria. Annals of Journal of Clinical Nutrition, 25: Clarke, R.T.J. ve M.E. Di Menna, Yeasts from the bovine rumen. Journal of General Microbiology, 25: Coleman, G.S., The metabolism of cellulose, glucose and starch by the rumen ciliate protozoa Eudiplodinium maggii. Journal of General Microbiology, 107: Cooke, R.C. ve J.M. Whipps, Ecophysiology of Fungi. Blackwell Scientific Publications. London. Davies, D.R., M.K. Theodorou, M.I. Lawrence ve A.P.J. Trinci, Distribution of anaerobic fungi in the digestive tract of cattle and their survival in faeces. Journal of General Microbiology, 139: Fonty, G., P.H. Gouet, J.P. Jouany, J. Snaud, Establishment of the microflora and anaerobic fungi in the rumen of lambs. Journal of General Microbiology, 133: Foster, J.W Chemical Activities of The Fungi. Academic Press, New York. Heath, I.B., Recommendations for future taxonomic studies of gut fungi. BioSystems, 21: Heath, I.B., T. Bauchop ve R.A. Skipp, Assignment of the rumen anaerobe Neocallimastix frontalis to the Spizellomycetales (Chytridiomycetes) on the basis of its polyflagellate zoospore ultrastructure. Canadian Journal of Botany, 61: Heath, I.B., S.G.W. Kaminsky ve T. Bauchop, Basal body loss during fungal zoospore encystment: Evidence against centriole autonomy. Journal of Cell Science, 83: Ho, Y. W., N. Abdullah ve S. Jalaludin, Colonization of Guinea grass by anaerobic rumen fungi in swamp buffalo and cattle. Animal Feed Science and Technology, 22: Ho, Y.W. ve D.J.S. Bar, Classification of anaerobic fungi from herbivores with emphasis on rumen fungi from Malaysia. Mycologia, 87: Hobson, P.N., Rumen microorganisms. Progress in Industrial Microbiology, 9: Hobson, P.N. ve R.J. Wallace, Microbial ecology and activities in the rumen, part 1. Critical Reviews in Microbiology, 9:

10 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 Hungate, R.E A roll tube method for the cultivation of strict anaerobes. In: Methods in Microbiology 3B (Ed. J.R. Norris, ve D.W. Ribbons) Academic Press, London, UK, pp Joblin, K.N. ve G.E. Naylor, Inhibition of the rumen anaerobic fungus Neocallimastix frontalis by fermentation products. Letters in Applied Microbiology, 16: Li, J. ve I.B. Heath, The phylogenetic relationships of the anaerobic chytridiomycetous gut fungi (Neocallimasticaceae) and the chytridiomycota. I. Cladistic analysis of rrna sequences. Canadian Journal of Botany, 70: Li, J., I.B. Heath, ve L. Packer, The phylogenetic relationships of the anaerobic chytridiomycetous gut fungi (Neocallimasticaceae) and the chytridiomycota. II. Cladistic analysis of structural data and description of the Neocallimasticales ord. nov. Canadian Journal of Botany, 71: Liebetanz, E., Die parasitichen protozoen des wiederkauermagens. Archüve Protistenk, 19: Lowe, S.E., M.K. Theodorou, A.P.J. Trinci ve R.B. Hespell, Growth of anaerobic rumen fungi on defined and semi-defined media lacking rumen fluid. Journal of General Microbiology, 131: Lowe, S.E., M.K. Theodorou ve A.P.J. Trinci, 1987a. Growth and fermentation of an anaerobic rumen fungus on various carbon sources and effect of temperature on development. Applied and Environmental Microbiology, 53: Lowe, S.E., G.W. Griffith, A. Milne, M.K. Theodorou ve A.P.J. Trinci, 1987b. Life cycle and growth kinetics of an anaerobic rumen fungus. Journal of General Microbiology, 133: Lowe, S.E., M.K. Theodorou ve A.P.J. Trinci, 1987c. Isolation of anaerobic fungi from saliva and faeces of sheep. Journal of General Microbiology, 133: Menke, K.H., L. Raab, A. Salewski, H. Steingass, D. Fritz ve W. Schneider, The estimation of digestibility and metabilazble energy content of ruminant feeding-stuffs from the gas production when they are incubated with rumen liquor in vitro. Journal of Agricultural Science, 93: Milne, A., M.K. Theodorou, M.G.J. Jordan, C. King-Spooner, ve AP.J. Trinci, Survival of anaerobic fungi in faeces, in saliva and in pure culture. Experimental Mycology, 13: Mounfort, D.O., R.A. Asher ve T. Bauchop, Fermentation of cellulose to methane and carbon dioxide by rumen anaerobic fungus in a triculture with methanobrevibacter sp. strain RA1 and Methanosarcina barkeri. Applied and Environmental Microbiology, 44: Munn, E.A The ultrastructure of anaerobic fungi. In: The Anaerobic Fungi. (Ed. C.G. Orpin ve D.O. Mountfort), Marcel Dekker, New York, USA, pp Orpin, C.G., The rumen flagellates Callimastix frontalis and Monas communis- zoospores of phycomycete fungi. Journal of Applied Bacteriology, 37: IX-X.

11 KSÜ Fen ve Mühendislik Dergisi 6(1) KSU J. Science and Engineering 6(1) 2003 Orpin, C.G Studies on the rumen flagellate Neocallimastix frontalis. Journal of General Microbiology, 91: Orpin, C.G The rumen flagellate Piromonas communis: its life history and invasion of plant material in the rumen. Journal of General Microbiology, 99: Orpin, C.G Anaerobic fungi: taxonomy, biology and distribution in nature. In: The Anaerobic Fungi. (Ed. C.G. Orpin ve D.O. Mountfort), Marcel Dekker, New York, pp Ozkose, E Morphology and molecular ecology of Anaerobic Fungi. PhD. Thesis, University of Wales Aberystwyth, U.K. Ozkose, E., B.J. Thomas, D.R. Davies, G.W. Griffith ve M.K. Theodorou, Cyllamyces aberensis gen. nov. sp. nov., a new anaerobic gut fungus with branched sporangiophores isolated from cattle. Canadian Journal of Botany, 79: Pettipher, G.L. ve M.J. Latham, Characteristics of enzyme produced by Ruminococcus flavefaciens which degrades plant cell walls. Journal of General Microbiology, 110: Theodorou, M.K., D.R. Davies, M.G.C. Jordon, A.P.J. Trinci ve C.G. Orpin, Comparison of anaerobic fungi in faeces and rumen digesta of newly born and adult ruminants. Mycological Research, 97: Theodorou, M.K., M.K. Gill, C. King-Spooner ve D.E. Beever, Enumeration of anaerobic chytridiomycetes as thallus forming units: a novel method for the quantification of fibrolytic fungal populations from the digestive tract ecosystem. Applied and Environmental Microbiology, 56: Theodorou, M.K., B.A. Williams, M.S. Dhanoa, A.B. McAllan ve J. France, A simple gas production method using a pressure transducer to determine fermentation kinetics of ruminant feeds. Animal Feed Science and Technology, 48: Theodorou, M.K., W.Y. Zhu, A. Rickers, B.B. Nielsen, K Gull ve A.P.J. Trinci, Biochemistry and ecology of anaerobic fungi. In: The Mycota: VI Human and Animal Relationship. (Ed. D.H. Howard ve J.D. Miller), Springer-Verlag, New York, pp Wubah, D.A., M.S. Fuller ve D.E. Akin, Resistant body formation in Neocallimastix sp., an anaerobic fungus from the rumen of the cow. Mycologia, 83: