Mikobakteri İzolasyonu için BBL Prepared Plated Media

Transkript

1 Mikobakteri İzolasyonu için BBL Prepared Plated Media Middlebrook // Agar, Middlebrook // Selective Agar, Middlebrook // Selective Agar JAA Ekin sonundaki sembol açıklamalarına bakın. 2003/08 Türkçe KULLANIM AMACI Bu besiyerleri klinik ve klinik olmayan örneklerden mikobakteri, özellikle Mycobacterium tuberculosis, izolasyonu ve gelişimi için kalitatif prosedürlerde kullanılmaktadır. Middlebrook // Agar iki bölmeli I Plate (I Plak) kutular iki örneğin inokülasyonuna olanak tanıtan iki kısma ayrılmış bir besiyeri içerir. Middlebrook // Selective Agar (Seçici Agar) ikili plakları, karışık flora içeren örneklerden mikobakteri geri kazanımı için biri orta düzeyde seçici ve biri yüksek düzeyde seçici olan iki besiyeri sunar. Middlebrook Agar, bölmenin tabanında Roma rakamıyla I kalıbı ile ayrılmış kısımda bulunur. Selective Agar II işaretli kısımda bulunur. Middlebrook // Selective Agar ikili plaklar, biri orta düzeyde seçici ve birisi yüksek düzeyde seçici iki besiyeri sunar. Middlebrook Agar, bölmenin tabanında I işareti olan kısımda bulunur. Selective Agar II işaretli kısımda bulunur. ÖZET VE AÇIKLAMA Middlebrook Agar, Middlebrook ve Cohn un in vitro olarak tüberkül basilinin erken gelişimini desteklemek ve ilaç duyarlılık testinin daha yaygın olarak uygulanmasını sağlamak için geliştirdiği oleik asit-albümin agar için geliştirilmiş bir formülasyona dayanır. 1-3 Daha basit kimyasal formülasyonu sebebiyle, mikobakteriyel türlerin gelişimi için yaygın olarak kullanılan yumurta bazlı besiyerinden daha az kontaminant gelişimi riski taşır. 4 Middlebrook Agar, Cohn ve ekibi tarafından Agar a kazein hidrolizat eklenmesi ile geliştirilmiştir. 5 Agar, Agar veya diğer yaygın kullanımlı besiyerleri üzerinde zayıf gelişen (veya hiç gelişmeyen) güç üreyen, ilaca dirençli M. tuberculosis suşlarının gelişimini destekler. 5,6 Agar, Agar ın dört anti mikrobiyal ajan eklenmesi ile değiştirilmiş bir formudur: polimiksin B, karbenisilin, amfoterisin B ve trimetoprim laktat. Mitchison ve ark., besiyerini ilk olarak dekontaminasyon prosedürleri ihtiyacını azaltmak amacıyla geliştirmiştir. 7 Kontamine edici organizmaların gelişimini azaltmak için kullanılan alkalin ajanların bazı mikobakteri türlerini inhibe ettiğini görmüşlerdir. McClatchy, Mitchinson ve ark., tarafından kullanılan besiyerini mikobakteri için daha az inhibe edici yapmak amacıyla karbenisilin konsantrasyonunu azaltmayı önermiştir. 8 PROSEDÜR İLKELERİ Middlebrook Agar, mikobakteri türlerinin gelişimini destekleyen gerekli besinleri sağlamak için oleik asit-albümin ile zenginleştirilmiş, gliserol, dekstroz ve inorganik bileşikleri içeren tanımlanmış bir besiyeridir. Katalaz, besiyerinde bulunma ihtimali olan zehirli peroksitleri parçalar. Malakit yeşili kontamine edici bakterilerin kısmi inhibisyonunu sağlamak için inhibitör ajan olarak rol alır. Middlebrook Agar, güç üreyen M. tuberculosis suşlarının gelişimini artırmak için kazeinin pankreatik dijesti ile zenginleştirilmiş Agar dan oluşur. Agara antimikrobiyal ajanların eklenmesi karışık flora içeren örneklerden mikobakteri geri kazanımını artırır. 6 Polimiksin B, Pseudomonas dahil (fakat Proteus türleri hariç) çoğu gram-negatif basil türünü seçici olarak inhibe eden bir polipeptid antibiyotiktir. 9 Karbenisilin, diğer antimikrobiyal ajanlara dirençli Escherichia coli suşlarını içeren gram-pozitif ve gram-negatif bakterilere karşı etkili bir yarı sentetik penisilindir. 9 Amfoterisin B, antifungal bir antibiyotiktir; trimetoprim laktat ise Proteus türleri de dahil olmak üzere gram-pozitif ve gram-negatif bakterileri inhibe eden sentetik bir antimikrobiyal ajandır. REAKTİFLER Middlebrook Agar 1 Litre Saf Su için Yaklaşık Formül* Magnezyum Sülfat... 0,05 g Ferrik Amonyum Sitrat... 0,04 g Sodyum Sitrat... 0,4 g Amonyum Sülfat... 0,5 g Monosodyum Glutamat... 0,5 g Disodyum Fosfat... 1,5 g Monopotasyum Fosfat... 1,5 g Agar... 13,5 g Piridoksin... 1,0 mg Çinko Sülfat... 1,0 mg Bakır Sülfat... 1,0 mg Biotin0... 0,5 mg Kalsiyum Klorür... 0,5 mg Malakit Yeşili... 0,25 mg OADC Zenginleştiricisi ,0 ml Gliserol... 5,0 ml *Performans kriterlerini karşılamak üzere gereken şekilde ayarlanmış ve/veya desteklenmiştir. 1

2 OADC Zenginleştiricisi 1 Litre Saf Su için Yaklaşık Formül* Sodyum Klorür... 8,5 g Sığır Albümini (Fraksiyon V)... 50,0 g Dekstroz... 20,0 g Katalaz... 0,03 g Oleik Asit... 0,6 ml *Performans kriterlerini karşılamak üzere gereken şekilde ayarlanmış ve/veya desteklenmiştir. Middlebrook Agar, 1,0 g/l kazeinin pankreatik dijestinin eklenmesi ile değiştirilen Middlebrook Agar dır. Selective Agar, 1 litre Middlebrook Agar a aşağıdaki antimikrobiyal ajanların eklenmesi ile hazırlanır: Polimiksin B birim Karbenisilin... 50,0 mg Amfoterisin B... 10,0 mg Trimetoprim Laktat... 20,0 mg Uyarılar ve Önlemler In vitro Diyagnostik Kullanım içindir Aşırı nem gözlenirse, tabanı dengeli bir kapak üzerinde ters çevirin ve inkübasyon esnasında plağın altı ve üstü arasında bir engel oluşmasını önlemek için havayla kurumasını sağlayın. Klinik örneklerde hepatit virüsü ve İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü de dahil olmak üzere patojenik mikroorganizmalar bulunabilir. Kan veya diğer vücut sıvılarıyla kontamine olan tüm öğelerle çalışılırken, Standart Önlemler ve kurumsal düzenlemeler takip edilmelidir. Hazır plakları, örnek kaplarını ve kontamine olmuş diğer malzemeleri atmadan önce otoklav yoluyla sterilize edin. Aside dirençli smearların hazırlanması gibi klinik örneklerin aerosol üretmeyen işlemleri sırasında Biyogüvenlik Seviyesi 2 uygulamaları ve prosedürleri, saklama ekipman ve tesisleri kullanılmalıdır. Aerosol üreten tüm aktiviteler, Sınıf I veya II biyolojik güvenlik kabininde gerçekleştirilmelidir. M. tuberculosis ve M. bovis kültürlerinin hazırlanması ve manipülasyonunda kullanılan laboratuvar faaliyetleri için Biyolojik Güvenlik Düzeyi 3 uygulamaları, izolasyon ekipmanları ve araçları gereklidir. Hayvan çalışmaları da özel prosedürler gerektirir. 12 Saklama Talimatları: Alındıktan sonra, plakları karanlıkta 2 ila 8 C de saklayın. Dondurmaktan ve fazla ısıtmaktan kaçının. Kullanıma hazır olana kadar açmayın. Işığa maruz bırakmayın. 2 ila 8 C de orijinal kaplı ambalajlarıyla saklanan hazırlanmış plaklar, kullanılmadan önce, son kullanma tarihine kadar inoküle edilebilir ve 8 haftaya kadar inkübe edilebilir. Ortamın inokülasyon öncesinde oda sıcaklığına gelmesini bekleyin. Ürünün Bozulması: Mikrobiyal kontaminasyon belirtileri, renk değişimi, kuruma, çatlama veya diğer bozulma belirtileri görmeniz halinde plakları kullanmayın. Bu besiyerlerinin doğrudan veya dolaylı güneş ışığına maruz kalmasının mikobakteri gelişimini inhibe eden formaldehit oluşumuna neden olduğu bildirilmiştir. 14 ÖRNEK TOPLAMA VE KULLANMA Örnek toplama ve işleme prosedürlerinin ayrıntıları için ilgili metinlere bakın. 4,6,15-17 PROSEDÜR Sağlanan malzemeler: Sıralandığı gibidir. Middlebrook // Agar, Middlebrook // Selective Agar veya Middlebrook // Selective Agar. Gerekli fakat sağlanmamış malzemeler: Bu prosedür için gerekli olan yardımcı kültür ortamları, reaktifler, kalite kontrol organizmaları ve laboratuvar ekipmanı. Test Prosedürü: Aseptik teknikleri uygulayın. Agar yüzeyi düz ve nemli olmalı fakat aşırı nemli olmamalıdır. Mikobakteriyel hastalığı olduğundan şüphe edilen hastalardan aseptik olarak alınan örnekler (cerrahi yolla çıkarılan doku, kapalı lezyonlardan alınan aspirasyonlar ve steril vücut sıvıları) doğrudan birincil izolasyon besiyerine inoküle edilebilir. Kontamine örnekler dijestiyon-dekontaminasyon prosedürüne tabi tutulmalıdır. 4 N-asetil-L-sistein-sodyum hidroksit (NALC-NaOH) çözeltisi, hafif fakat balgam örnekleri için etkili bir sindirim ve dekontaminasyon ajanı olarak tavsiye edilmektedir. Detaylı dekontaminasyon ve dijestiyon prosedürleri için, ilgili referanslara bakın. 4,6,15-17 İnokülasyonu takiben, plakları ışıktan koruyun ve ters çevrilmiş konumda (agar kısmı üstte) C de CO 2 ce zengin atmosferde 8 haftaya kadar inkübe edin. İnkübasyondan 5 ila 7 gün sonra ve sonrasında 8 hafta boyunca haftada bir defa agar yüzeyini incelemek için diseksiyon mikroskobu kullanın. 2

3 Kullanıcı Tarafından Kalite Kontrolü: 1. Plakları Ürünün Bozulması bölümünde anlatılan şekilde bozunma belirtisi açısından inceleyin. 2. Bilinen ve istenen reaksiyonlar üreten stabil kontrol organizmalarının saf kültürleriyle temsili plak örneklerini inoküle ederek, performansı kontrol edin. Aşağıdaki test suşları önerilmektedir: TEST SUŞU BESİYERİ BEKLENEN SONUÇLAR Mycobacterium tuberculosis H37Ra ATCC Mycobacterium kansasii, Grup I ATCC Mycobacterium scrofulaceum, Grup II ATCC Mycobacterium intracellulare, Grup III ATCC Mycobacterium fortuitum, Grup IV ATCC 6841 Escherichia coli ATCC İnhibisyon (kısmi ila tam) Candida albicans İnhibisyon (kısmi ila tam) ATCC Gerekli kalite kontrolleri ilgili yerel, resmi ve/veya federal düzenlemeler veya akreditasyon gerekliliklerine veya laboratuvarınızın standart Kalite Kontrol prosedürlerine uygun olarak gerçekleştirilmelidir. Kullanıcının, uygun Kalite Kontrol uygulamaları için ilgili NCCLS yönergelerine ve CLIA düzenlemelerine uyması önerilir. SONUÇLAR Yeterli inkübasyondan sonra, plaklar sürme yöntemi ile ekim yapılmış alanlarda izole koloniler ve ağır inokülasyon yapılan alanlarda birleşik gelişim göstermelidir. Mikobakteri kolonileri filamentöz uzantılar ile düz veya pürüzlüdür ve mikroskobik inceleme ile serpentin lifler veya diğer modeller şeklinde düzenlenmiş görünebilir. Bazı türler sarı ila kırmızı pigmentasyon oluşturur. M. tuberculosis tipik olarak serpentin liflerde düzenlenmiş parlak renkli pürüzlü koloniler oluşturur. Koloniler, gelişim düzenine bağlı olarak opak veya yarısaydam görünebilir. Bulguları doğrulamak için Gram boyama, biyokimyasal test ve diğer prosedürler gerçekleştirilmelidir. PROSEDÜRÜN KISITLI OLDUĞU ALANLAR Bu hazır plak besiyeri birincil izolasyonda kullanım için tasarlanmıştır. Birincil plak ile bazı tanı testleri gerçekleştirilebilir. Bununla birlikte, biyokimyasal testler ve serolojik prosedürler için saf bir kültür önerilmektedir. Daha fazla bilgi için ilgili referanslara bakın. 4,6,15-17 Bir örnekte potansiyel öneme sahip bütün organizmaları tespit etmek için tek bir örnek kullanımı nadiren yeterli olmaktadır. Özellikle, eğer örnekte çok sayıda organizma mevcutsa, seçici besiyerindeki ajanlar istenen türlerin bazı suşlarını inhibe edebilir veya inhibe etmek için tasarlandığı bir türün gelişmesine izin verebilir. Bu nedenle, seçici besiyerinde kültürü yapılan örneklere ilişkin ek bilgi elde etmek ve potansiyel patojenlerin geri kazanılmasını sağlamak için seçici olmayan besiyerinde kültürü yapılmalıdır. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Middlebrook // Selective Agar Piyasaya sürülmeden önce tüm Middlebrook // Selective Agar lotları belirli ürün özelliklerinin doğrulanması açısından test edilmiştir. Örnekler Mycobacterium fortuitum ATCC 6841, M. intracellulare ATCC 13950, M. kansasii ATCC 12478, M. scrofulaceum ATCC ve M. tuberculosis ATCC (nihai inokulumlar plak başına CFU verir) 7H9 broth süspansiyonlarının 0,01 ml si ile plağa yayılarak test edilmiştir. Agar örnekleri, Escherichia coli ATCC ve Candida albicans ATCC (nihai inokulumlar plak başına CFU verir) tuz çözeltilerinin 0,001 ml si ile inoküle edilmiştir. Plaklar 8 haftaya kadar CO 2 ce zengin atmosferde C de inkübe edilmiştir. Tüm mikobakteriler ile orta ile yoğun gelişme gözlenmiştir. Agarda E. coli ve C. albicans ile kısmi ila tam inhibisyon gözlenmiştir. TİCARİ TAKDİM ŞEKLİ Kat. No. Açıklama BBL Middlebrook // Agar, 20 li plak paketi BBL Middlebrook // Selective Agar, 20 li plak paketi BBL Middlebrook // Selective Agar 100 lü plak paketi 3

4 REFERANSLAR 1. Middlebrook, G., M.L. Cohn, W.E. Dye, Russell, Jr., and D. Levy, Microbiologic procedures of value in tuberculosis. Acta. Tuberc. Scand. 38: Middlebrook, G., M.L. Cohn, and W.B. Scheffer Studies on isoniazid and tubercle bacilli. III. The isolation, drugsusceptibility and catalase testing of tubercle bacilli from isoniazid-treated patients. Am. Rev. Tuberc. 70: Middlebrook, G., and M.L. Cohn Bacteriology of tuberculosis: laboratory methods. Am. J. Public Health. 48: Kent, P.T., and G.P. Kubica Public health mycobacteriology: a guide for the level III laboratory. USDHHS. Centers for Disease Control, Atlanta. 5. Cohn, M.L., R.F. Waggoner, and J.K. McClatchy The medium for the cultivation of mycobacteria. Am. Rev. Respir. Dis. 98: Nolte, F.S., and B. Metchock Mycobacterium, p In P.R. Murray, E.J. Baron, M.A. Pfaller, F.C. Tenover, and R.H. Yolken (ed.), Manual of clinical microbiology, 6th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 7. Mitchison, D.A., B.W. Allen, L. Carrol, J.M. Dickinson, and V.R. Aber A selective oleic acid albumin agar medium for tubercle bacilli. J. Med. Mycol. 5: McClatchy, J.K., R.F. Waggoner, W. Kanes, M.S. Cernich, and T.L. Bolton Isolation of mycobacteria from clinical specimens by use of a selective medium. Am. J. Clin. Pathol. 65: Garrod, L.P., and F. O Grady Antibiotic and chemotherapy, 3rd ed. Williams & Wilkins, Baltimore. 10. National Committee for Clinical Laboratory Standards Approved Guideline M29-A2. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections, 2nd ed. NCCLS, Wayne, Pa. 11. Garner, J.S Hospital Infection Control Practices Advisory Committee, U.S. Department of Health and Human Services, Centers for Disease Control and Prevention. Guideline for isolation precautions in hospitals. Infect. Control Hospital Epidemiol 17: U.S. Department of Health and Human Services Biosafety in microbiological and biomedical laboratories, HHS Publication (CDC), 4th ed. U.S. Government Printing Office, Washington, D.C. 13. Directive 2000/54/EC of the European Parliament and of the Council of 18 September 2000 on the protection of workers from risks related to exposure to biological agents at work (seventh individual directive within the meaning of Article 16(1) of Directive 89/391/EEC). Official Journal L262, 17/10/2000, p Milliner, R.A., K.D. Strottmeier, and G.P. Kubica Formaldehyde: a photothermal activated toxic substance produced in Middlebrook medium. Am. Rev. Respir. Dis. 99: Cernoch, P.L., R.K. Enns, M.A. Saubolle, and R.J. Wallace, Jr Cumitech 16A, Laboratory diagnosis of the mycobacterioses. Coordinating ed., R.S. Weissfeld. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 16. Forbes, B.A., D.F. Sahm, and A.S. Weissfeld Bailey & Scott s diagnostic microbiology, 10th ed. Mosby, Inc., St. Louis. 17. Isenberg, H.D. (ed.) Clinical microbiology procedures handbook, vol.ê1. American Society for Microbiology, Washington, D.C. 4

5 5