İYONİK ÇEVRENİN ENZİM-ULTRAFİLTRASYON MEMBRAN ARAYÜZEY ETKİLEŞİMLERİNE ETKİSİ

Transkript

1 İYONİK ÇEVRENİN ENZİM-ULTRAFİLTRASYON MEMBRAN ARAYÜZEY ETKİLEŞİMLERİNE ETKİSİ Sema SALGIN *, Serpil TAKAÇ **, H.Tunçer ÖZDAMAR ** * Cumhuriyet Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Kimya Mühendisliği Bölümü Sivas ** Ankara Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Kimya Mühendisliği Bölümü Tandoğan Ankara ÖZET 100 kda polietersülfon (PES) ultrafiltrasyon membranlara serin alkali proteazın (SAP) adsorpsiyonu, enzimin fermentasyon ile üretim ph ı olan 7.14 de ve fermentasyon ortamında bulunan (NH 4 ) 2 HPO 4, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4,CaCl 2 ile sağlanan farklı iyonik gerilimlerde 25 o C sıcaklık ve 200dk -1 karıştırma hızında gerçekleştirilmiştir. Adsorpsiyon izoterminin lineer olduğu, SAP ın PES membranlara adsorpsiyonunda iyonların davranışlarının Hofmeister serilerine uygunluk gösterdiği ve proteinlerin çözünürlüğünü azaltan anyonların membranlara adsorpsiyonu arttırdığı belirlenmiştir. Akım potansiyeli ölçüm yöntemine göre membranların zeta potansiyellerinin çalışılan tüm koşullar için negatif olduğu bulunmuştur. Protein-membran etkileşimleri sonucu membran yüzeyinde meydana gelen değişimler FTIR- ATR analizleri ile belirlenmiş ve membran yüzeyinde protein adsorpsiyonunun bir göstergesi olan amid I bandı şiddetinin adsorpsiyonun fazla olduğu iyonik çevrede fazla olduğu gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler : İyonik gerilim; Protein-membran etkileşimleri; Serin alkali proteaz 1. GİRİŞ Biyoteknolojik proseslerde proteinlerin/enzimlerin ayırılması ve deriştirilmesi amacıyla kullanılan ultrafiltrasyon (UF) işlemlerinde membran yüzeyine ve gözeneklerine adsorplanan biyomoleküller, membran ile ve kendi aralarında farklı mekanizmalarla ara yüzey etkileşimleri oluştururlar. Bu etkileşimler, membranda ayırma etkinliğinin azalmasına neden olan membran kirliliği mekanizmasının aydınlatılması ve aktivitesi korunarak üretim ortamından ayırılması gereken enzimin yapısal özelliklerindeki değişimlerin belirlenmesi için önemlidir. Kolloidal özellik gösteren protein/enzimlerin iyonik çevresi ve bu ortamda membranının kazandığı yük değeri gibi fizikokimyasal özellikler ile elektrostatik, hidrofobik ve van der Waals kuvvetleri gibi ara yüzey kuvvetlerinin sebep olduğu etkileşimleri kontrol etmek mümkündür. Enzimlerin fermentasyon ortamları, çeşitli iyonları ve istenilen ürün beraberinde protein, amino asit gibi bileşenleri de içeren kompleks ortamlardır. Bu çalışmada, serin alkali proteaz (SAP) enziminin, üretim ortamından ayırılması sırasında meydana gelen kirliliğe temel oluşturmak amacıyla SAP ın üretim ortamındaki iyonların membran kirliliğine etkisi enzimin polietersülfon (PES) UF membranlara adsorpsiyonu ile incelenmiştir. Üretim ortamında membranın yükü/zeta potansiyeli bulunarak ortamdaki iyonların enzim ile membran arasındaki arayüzey etkileşimlerine etkisi belirlenmiştir. Adsorpsiyon sonucu membran yüzeyinde meydana gelen yapısal değişimler ise FTIR-ATR ile incelenmiştir. 2. DENEYSEL 2.1. Adsorpsiyon Deneyleri

2 SAP enziminin (MA=27.5kDa, pi=9) UF membranlara statik adsorpsiyon deneyleri, hidrofob yapıdaki polietersülfon (PES, MWCO=100 kda) membranlar kullanılarak 25 o C sabit sıcaklıkta 200 dk -1 karıştırma hızında orbital karıştırıcı kullanılarak, 150 ml hacimli kesikli sistemlerde, mg/ml derişim aralığındaki enzim çözeltileri ile gerçekleştirilmiştir. SAP ın r-bacillus licheniformis den üretim ortamında bulunan NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4, (NH 4 ) 2 HPO 4, KH 2 PO 4 ve CaCl 2 ün [1] membran kirliliğine tek tek ve birlikte etkisi enzimin üretim ph ında (=7.14) incelenmiş ve 10 dakika aralıklarla sıvı fazdaki enzim derişimleri izlenerek çözeltideki enzim miktarındaki azalmanın sabit bir seviyeye ulaşması -dengeye gelmesi- ile deneyler sonlandırılmıştır. Membrana adsorplanan protein miktarı kütle korunum denkleminden bulunarak çözeltideki protein denge derişimine karşı grafiğe geçirilmiş ve adsorpsiyon izotermleri oluşturulmuştur. Deneylerde kullanılan tüm çözeltiler deiyonize su (Milli-Q Plus, Millipore) ile hazırlanmış ve membranlar adsorpsiyon işleminden önce bir gece deiyonize su içinde bekletilerek üretimden gelen safsızlıklar uzaklaştırılmıştır Protein Analizi SAP derişimi λ=275 nm dalga boyunda spektroskopik olarak (UV 160-A Shimadzu) belirlenmiştir. Dalga boyu belirlenmesi için BSA çözeltisinin λ= nm aralığında dalga boyu taraması yapılarak spektrumu alınmış ve maksimum absorbans veren dalga boyu (λ=275 nm) seçilmiştir Akım Potansiyeli Ölçüm Yöntemi Membran ile protein arasındaki elektrostatik etkileşimlerin belirlenmesi amacıyla, membranların farklı iyonik çevrelerdeki zeta potansiyelleri (ζ), Ag/AgCl referans elektrotlar kullanılarak tasarlanmış olan [2] akışlı bir sistemde -sabit bir basınç değerinde elektrik potansiyelindeki değişimin gözlenmesi temeline dayalı- akım potansiyelleri ölçülerek Helmholtz-Smoluchowski eşitliği (Eşt.1) [3] ile hesaplanmıştır. de d P ε oε rζ = ηλ o (1) 2.4. FTIR-ATR Ölçümleri Kullanılmamış ve proteinle kirletilmiş PES membranların yüzey yapısında meydana gelen değişimlerin belirlenmesinde FTIR spektrofotometresi (MIDAC) kullanılmıştır. Kurutulmuş membranların, ZnSe kristali kullanılarak kristal ve örnek arasındaki ışın yansımaları sonucunda ışının örnek içinde ilerlerken verdiği absorpsiyon bantlarındaki azalmanın izlenmesi temeline dayalı FTIR-ATR spektrumları alınmıştır. 3. SONUÇLAR 3.1. SAP ın 100 kda PES Membranlara Adsorpsiyonu SAP ın PES membranlara adsorpsiyonu, lineer adsorpsiyon izotermine uygun olarak, en yüksekten en düşüğe doğru sırası ile (NH 4 ) 2 HPO 4, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4, CaCl 2 ve tüm bileşenleri içeren çözeltilerde gerçekleşmiştir (Şekil 1). Her iyonun varlığında elde edilen adsorpsiyon izoterm denklemleri Çizelge 1 de verilmiştir. Fermentasyon ortam ph değeri (=7.14) SAP ın izoelektrik noktasının (pi=9) altında bir değer olduğu için, enzim her çözeltide pozitif yüklüdür. Ancak proteinin yük değeri ve hidrofob

3 özelliği ortamın iyonik geriliminden etkileneceği için, iyonların arayüzey etkileşimlerindeki rolü hem membran hem de protein üzerine olmaktadır. Her iyonun protein ve membranın yük değeri üzerine etkisi farklı olduğu için arayüzey etkileşimleri de farklılık göstermiştir. SAP ın üretim ortamı bileşenlerinin varlığında membranlara adsorpsiyonu proteinlerin çökmesinde etkili olan anyon ve katyonların sıralamasını veren Hofmeister serisine [4] uygunluk göstermiştir. q, mgprotein/gmembran NH4HPO4 KH2PO4 Na2HPO4-NaH2PO4 CaCl2 Tüm bileşenler 1 0 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 C*,g/L Şekil 1. SAP ın 100 kda PES Membranlara Üretim Ortamındaki Bileşenlerin Varlığında Adsorpsiyon İzotermleri Çizelge 1. SAP Üretim Ortamı Bileşenleri Varlığında Enzimin 100 kda PES Membranlara Adsorpsiyonunda Denge İzoterm Denklemleri Bileşen İzoterm denklemi R 2 (NH 4 ) 2 HPO 4 q=8.66c* 0.99 KH 2 PO 4 q=7.61c* 0.99 NaH 2 PO 4 -Na 2 HPO 4 q=6.54c* 0.99 CaCl 2 q=3.98c* 0.99 Tüm bileşenler q=3.36c* SAP Adsorpsiyonu Sonucunda Membran Yapısında Meydana Gelen Değişimler Sentetik olarak oluşturulan SAP enzim üretim ortamında bulunan iyonların, PES membranlara adsorpsiyonuna etkileri incelendikten sonra, bu iyonların varlığında kirlenen membranların yüzey yapısındaki değişimler FTIR-ATR analizleri ile belirlenmiş ve her durumda membran yüzeyinde protein adsorpsiyonunun bir kanıtı olan amid I piki (1650cm -1 ) gözlenmiştir. Adsorpsiyonun fazla olduğu (NH 4 ) 2 HPO 4 ortamında amid I pikinin şiddeti fazla, adsorpsiyonun sırası ile azaldığı KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4, CaCl 2 ve tüm bileşenleri içeren çözeltilerde, amid I pikinin şiddeti gittikçe azalmıştır. Şekil 2 ve 3 de örnek olarak (NH 4 ) 2 HPO 4 ve KH 2 PO 4 ortamlarındaki PES spektrumları verilmiştir.

4 Şekil 2. Co=1 mg/ml SAP Derişiminde, ph=7.14 ve (NH 4 ) 2 HPO 4 Ortamında Temiz ve Kirli PES Membranın FTIR-ATR Spektrumu Şekil 3. Co=1 mg/ml SAP Derişiminde, ph=7.14 ve KH 2 PO 4 Ortamında Temiz ve Kirli PES Membranın FTIR-ATR Spektrumu 3.3. İyonik Çevrenin 100 kda PES Membranların Zeta Potansiyelleri Üzerine Etkisi SAP üretim ortamında bulunan iyonların membran kirliliği üzerine etkilerini açıklamak amacıyla 100 kda PES membranların zeta potansiyelleri, iyonların ((NH 4 ) 2 HPO 4, KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4,CaCl 2 ) ayrı ayrı ve hepsinin birlikte olduğu -adsorpsiyon deneylerinin yapıldığı koşullarda- farklı iyonik çevreler yaratılarak akım potansiyeli ölçüm yöntemine göre belirlenmiştir. Çizelge 2 de çözeltilerin iletkenlik değerleri (Λ) ve iyonik gerilimleri (I); temiz ve adsorpsiyon sonucu kirlenmiş PES membranların hesaplanan zeta potansiyelleri (ζ) yer almaktadır.

5 Çizelge 2. İyonik Çevrenin 100 kda PES Membranların Elektrokinetik Özellikleri Üzerine Etkileri Bileşen Λ,µS/cm I, M ζ temiz, V ζ kirli, V (NH 4 ) 2 HPO KH 2 PO NaH 2 PO Na 2 HPO 4 CaCl Tüm bileşenler Membranlar, farklı iyonik çevrelerde anyonların tercihli adsorpsiyonu nedeniyle negatif yük değeri/zeta potansiyeli kazanmışlardır. (NH 4 ) 2 HPO 4 ortamında membranın zeta potansiyeli mutlak değeri en yüksek değerdedir. Dolayısıyla negatif yüklü membran ile pozitif yüklü enzim arasındaki elektrostatik çekim kuvvetleri oldukça güçlü olduğu için bu koşulda SAP adsorpsiyonu en fazla olmuştur. KH 2 PO 4, Na 2 HPO 4 -NaH 2 PO 4, CaCl 2 ve tüm bileşenleri içeren çözeltilerdeki membran zeta potansiyelleri gittikçe azalmıştır; bu sıralama adsorpsiyon deney sonuçları ile uyumludur. Adsorpsiyon deneylerinde izoelektrik noktanın altındaki ph değerinde çalışıldığı için negatif yüklü membran ile pozitif yüklü enzim arasındaki elektrostatik çekme kuvvetlerinin büyüklüğünü membran zeta potansiyeli belirlemektedir; bu değerin yüksek olduğu ortamda etkileşim enerjileri de fazladır. Çizelge 2 de yer alan kirli membranların zeta potansiyellerindeki işaret değişimi, membran yüzeyine pozitif yüklü enzimin adsorplandığını göstermektedir. SEMBOLLER C * E P q η ζ Λ ε o ε r Sıvı faz SAP denge derişimi Akım potansiyeli Basınç farkı Membranda SAP denge derişimi Viskozite Zeta potansiyeli Ortam iletkenliği Ortam geçirgenliği Ortam dielektrik sabiti TEŞEKKÜR Bu çalışma TÜBİTAK (MİSAG-225) ve Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri ( ) tarafından desteklenmiştir. KAYNAKLAR 1. Çalık P, Bilir E, Çalık G, Özdamar, T.H. Bioreactor Operation Parameters as Tools for Metabolic Regulations in Fermentation Processes: Influence of ph Conditions, Chem. Eng. Sci., 58 (3-6), , Salgın, S., Protein-Membran Etkileşimleri ve Proteinlerin Membran Sistemlerde Ayırılması, Doktora Tezi, Ankara Üniversitesi, Burns, D.B. and Zydney, A.L., Effect of Solution ph on Protein Transport Through Ultrafiltration Membranes, Biotechnol. Bioeng., 64, 27-37, Leontidis, E., Hofmeister Anion Effects on Surfactant Self-Asemmbly and the Formtion of Mesoporopus Solids, Curr. Op.in Colloids and Interfaces Sci., 81-91, 2002.

6