A Grubu Beta Hemolitik Streptokokların Hızlı Tanısı İçin LAMP Tabanlı Yöntem ile Boğaz Kültürünün Karşılaştırılması

Transkript

1 1

2 Türkiye Halk Sağlığı Kurumu A Grubu Beta Hemolitik Streptokokların Hızlı Tanısı İçin LAMP Tabanlı Yöntem ile Boğaz Kültürünün Karşılaştırılması Meral Turan 1, Gökhan Gözel 1, Selin Nar Ötgün 1, Sinem Bedir 1, Hakan Hedef 1, Selçuk Kılıç 1,2 1 Türkiye Halk Sağlığı Kurumu, Mikrobiyoloji Referans Laboratuvarları, Ankara 2 Sağlık Bilimleri Üniversitesi, İstanbul tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji AD, İstanbul 2

3 GAS Tonsillofarenjit; Laboratuvar Tanı Kültür Hızlı antijen testi Moleküler Altın Standart saate sonuç Lateks Partikül Aglütinasyon ELISA, Optic immunoassay (OIA), Hasta başı hızlı test (LFA, Strip) Hızlı (<60 dk) Kültüre eşit veya yüksek duyarlılık Kültür HAT PCR Duyarlılık %90-95 %65-90 >%95 Özgüllük >%95 >%99 3

4 Kültür HAT PCR Zaman alıcı Düşük duyarlılık Cihaz bağımlılığı Maliyet Amaç GAS için moleküler tabanlı tanı kitinin geliştirilmesi Hedefler Hızlı Basit Kolay uygulanabilir Güvenilir Ucuz Tek bir cihaz ve aşamada; LAMP DNA eldesi isotermal Nükleik PCR reaksiyonunun tek bir döngüde gerçekleştirilmesi Asid Çoğaltma İstenildiği anda numune çalışılması (random access) Gerçek zamanlı bulanıklık/floresans izlemi (Görsel tanımlama) 4

5 LAMP Spiral Aracılı İzotermal Çoğaltma Hedef Bölge Materyal-Yöntem (1) Streptolysin B (speb) geni DNA izolasyonu PCR inhibitörü bloklayıcı peptit kompleksi (12 dk) Isı (95 C de 5 dk) Sistemler Düşük maliyetli Cihaz Geliştirilmesi Isıtıcı ve okuyucu sistem Sistem 1: Tek ısı bloğu ile (95 ve 65 C de) DNA eldesi ve amplifikasyonun okuyucu ile değerlendirilmesi Sistem 2: Görsel değerlendirme 5

6 Materyal-Yöntem (2) - LAMP Validasyon Analitik Duyarlılık - Saptama Limiti (LOD) ÖZGÜLLÜK (n= 24 bakteri) [ kob/ml] RSKK NCTC Simüle örnek GAS kob/ml içeren klinik örnek (n=50) 1. S.agalactiae, S.dysgalactiae, S.pneumoniae, S.mutans 2. S.epidermidis, A.haemolyticum, S.aureus, H.influenzae, C.pseudodiphtheriticum, C.diphtheria, N.meningitidis, N.pharyngitis, M.catarrhalis, E.coli, 3. GAS içermeyen klinik örnek (n=50) 6

7 Halk Türkiye Sağlığı Halk Genel Sağlığı Müdürlüğü Kurumu Modifiye Centor Kriteri (puan 2-3) 869 sürüntü Materyal-Yöntem (3) Doğrulama C İstenildiği anda numune yükleme Floresans ölçüm Görsel değerlendirme (Hidroksi naftol Blue) 7

8 Materyal-Yöntem (4) - LAMP Çalışması Rxn 25 µl 1. GspSSD DNA Polimeraz (Sarmal yer değiştirme aktivitesi) 2. SybrGreen LAMP 1. Floresans ölçümü (gerçek zamanlı ve ürünlerin erime eğrisi analizleri ) 2. Hidroksinaftol mavisi (HNB) boyası ile görsel değerlendirme 8

9 LAMP GAS (n=8) BULGULAR Kültür GAS dışı & Diğer Bakteriler (24 bakteri 28 örnek ) Simüle Örnek Sürüntü Sonuç Pozitif Negatif Pozitif Saptama Sınırı <10 Negatif 10* (100) 9

10 LAMP BULGULAR-(2) KÜLTÜR Pozitif Negatif Toplam Pozitif Negatif Toplam Duyarlılık Özgüllük Doğruluk PPV NPV Prevalans %99.2 %98.4 %98.5 %91.4 % Doğruluk = /869 PPV (pozitif sonucun kestirim değeri) = 128/140 NPV (negatif sonucun kestirim değeri) = 728/729 Prevalans = 128/869 10

11 Bulgular-(3): Görsel Değenlendirme SYBR Green ve (GspM 2.0 LF DNA polimeraz) 1. SYBR Green içermeyen örnekler 2. SYBR Green içeren örnekler 3. UV-transillüminatör SYBR içeren 11

12 BULGULAR-(4): Yöntem karşılaştırması Saptama Sınırı PCR Kültür Boğaz Sürüntüsü Test Süresi (dk) Test Maliyeti Cihaz Dezavantaj RT- PCR 240 > dk Lab. kullanımı LAMP 1 10 (Floresans) 100 (Görsel) <25 dk # Lab, Aile Hekimliği Muayenehane? 12

13 Amaç Hedefler Hedefler ve Gelinen Nokta Hızlı (<20 dk), basit ve güvenilir Yerli kit ve cihaz geliştirmek Poliklinik ortamında test olanağı sunulması Basit, hızlı ve ucuz bir yöntem geliştirilmesi Tek bir cihazde ve tek bir aşamada testin yapılması Analitik özellikleri yüksek, Uzun raf ömrü olan reajenler Görsel değerlendirilebilen, basit, ucuz ve güvenilir yöntem Yerli cihaz geliştirilmesi (İstenildiğinde numune yükleme) Toplam test süresinin 15 dakikaya indirilmesi - Ekstraksiyon (5 dk) + Amplifikasyon (10 dk) PATENT

14 Analitik Epidemiyoloji Sonuç & Yorum ÖZETLE Kolay (Deneyimli personel gereksinimi yok) Liyofilize reajenler (24 ay raf ömrü) İstenildiği anda numune yüklenebilmesi Yüksek duyarlılık ve özgüllük Düşük saptama eşiği ( CFU/eküvyon) Hızlı (<25 dk) Ucuz (3 $/test ve cihaz <1500 $) Antibiyotik Kullanım oranının azaltılması Kullanım kolaylığı Değerlendirme kolaylığı (görsel) Cihaz gereksinimini ortadan kaldırma potansiyeli Cihaz istenirse mobil telefona yazılım geliştirilmesi Yaygın kullanım potansiyeli 14