DEZENKON HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı nın H1N1 Domuz Gribi Virüsüne karşı Virusidal Test Sonuç Raporu

Transkript

1 DEZENKON HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı nın H1N1 Domuz Gribi Virüsüne karşı Virusidal Test Sonuç Raporu ANTİMİKROBİYAL MADDELERİ ARAŞTIRMA GELİŞTİRME VE TEST LABORATUAR HİZMETLERİ TİC. LTD. ŞTİ. Karadeniz Teknik Üniversitesi Trabzon TEKNOKENT Üniversite Mahallesi, Eski Orman Fidanlığı Yanı No.86 Trabzon, tarafından Dezenkon Kimya Tem. Tur. İnş. San. Ve Tic. A.Ş. için hazırlanmıştır. MART 201 TRABZON

2 İÇİNDEKİLER 1. GENEL ÇALIŞMA BİLGİLERİ 1.1. Genel 1.2. Test Maddesinin Tanımı 1.3. Çalışma Tarihleri 1.. Sonuçların Özeti 2. YÖNTEMLER 2.1. Virüs 2.2. Virusidal test sisteminde kullanılan hücreler 2.3. Test Maddesinin Hazırlanması 2.. Süspansiyon Testi Virusidal Test Virus Geri Kazanım Sitotoksisite Testi 2... Nötralizasyon Etkinlik Testi 2.5. Yüzey Testi Virusidal Test Virus Geri Kazanım Sitotoksisite Testi Nötralizasyon Etkinlik Testi 2.6. Veri Analizi Titrelerin Hesaplanması Log Azalmasının Hesaplanması 2.7. Çalışma Kabul Kriterleri 3. SONUÇLAR 3.1. Virusidal Süspansiyon Test Sonuçları 3.2. Virusidal Yüzey Test Sonuçları. ÇALIŞMANIN KAYITLARININ SAKLANMASI.1. Kayıtların Saklanması.2. Test Maddesinin Saklanması 5. KAYNAKLAR

3 1. GENEL ÇALIŞMA BİLGİLERİ 1.1. Genel Çalışma Adı: DEZENKON HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı nın Virusidal Etkinliği Proje Numarası: VT-010 Protokol Numarası: ANTİMİKROP.H1N1.1 Test Yeri: Antimikrop Test Laboratuvarı (ANTİMİKROP ANTİMİKROBİYAL MADDELERİ ARAŞTIRMA GELİŞTİRME VE TEST LABORATUAR HİZMETLERİ TİC. LTD. ŞTİ.) Karadeniz Teknik Üniversitesi Trabzon Teknoloji Geliştirme Bölgesi Yönetici A.Ş Merkez Binası. Trabzon 1.2. TEST MADDESİNİN TANIMI Test Maddesinin Adı: Dezenkon HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı Parti/Seri(ler): 1 adet ışık geçirmeyen ağzı kapalı plastik şişede test maddesi Test Maddesinin Tanımlanması: Test maddesinin, içerik, stabilite, çözünürlük, saklama vs. bakımından karakterizasyonu tedarikçinin sorumluluğudur ÇALIŞMA TARİHLERİ Numunenin Alındığı Tarih: 03 Şubat 201 Deney Başlangıç Tarihi: 28 Şubat 201 Çalışma Tamamlanma Tarihi: 09 Mart SONUÇLARIN ÖZETİ Test Maddesi: Dezenkon HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı Kullanılan yoğunluk: Steril sert suda % 10 sulandırması Virüs: İnfluenza A (H1N1) Pandemik Domuz Gribi Virusu Maruz Kalma Süresi: 5 dakika Maruz Kalma Sıcaklığı: Oda sıcaklığı (22-2 C) Etkinlik Sonucu: Dezenkon HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı steril sert suda % 10 sulandırılmış şekliyle çalışma raporunda belirtilen test kriterlerini karşılamış olup Pandemik Domuz Gribi etkeni İnfluenza A (H1N1) virüsünü 5 dakika içerisinde etkisizleştirmektedir.

4 2. YÖNTEMLER 2.1. Virüs: Bu çalışmada kullanılan Influenza A (H1N1) virusu, Domuz Gribi Pandemisi sırasında izole edilen saha suşudur (A/Trabzon/01/2009). Hemaglutinasyon gen dizini kısmi olarak belirlenmiş ve yayınlanmıştır (Gen Bankası Accession No: GU991379). MDCK (Madin Darby Canine Kidney) hücre kültüründe sitopatik etki ve plak oluşturan izolat yüksek titrelerde çoğaltılarak -80 C de saklanmıştır Virusidal test sisteminde kullanılan hücreler: MDCK hücreleri C de, %5 CO 2 ve nemli bir ortamda pasajlanarak master stok olarak saklanmış; T75 hücre kültür kaplarında % 10 Fetal Dana Serumu (FBS), penisilin/streptomisin içeren Eagle s Minimum Essential Medium (EMEM) besi yeri kullanılarak çoğaltılmıştır. Virusidal etkinlik testi için hücreler 96 kuyucuklu pleytlere ekilerek kullanılmıştır Test Maddesinin Hazırlanması: Dezenkon HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı filtre ile sterilize edilmiş Dünya Sağlık Örgütü nün tarif ettiği standart sert su içerisinde % 10 oranında seyreltilerek test edilmiştir. 2.. Süspansiyon Testi: Özet olarak; yüksek titrede virus içeren sıvı bir ortama virusidal etkinliği test edilecek dezenfektandan ilave edilerek belli süre beklenilmesi ve daha sonra ortamdan alınan örneklerde virus varlığını/yokluğunu tespitine dayanan bir test sistemidir. Dezenkon HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı) virusidal amaçla süspansiyon test aşamaları şu şekildedir: Virusidal Test (VT): Test maddesinin kullanıldığı durumdur: Yapılan işlemler sırası ile; Virus süspansiyonu (TCID 50: 6.5X10 7 /ml) steril kapaklı 5ml plastik bijoux içerisine yerleştirildi Üzerine test maddesi ( % 10) eklendi. 5 dakika beklenip ortama sert su ilave edildi. Karışım kısa bir süre vortekslendi Test maddesinin daha sonraki aşamada kullanılan hücre kültür sistemine toksik etkisini azaltma/gidermek amacıyla elde edilen süspansiyon nötralizasyon için kromatografi kolonundan Kolondan elde edilen eluat % 0.1 BSA, 2 µg/ml TPCK ile muamele edilmiş Her bir sulandırmadan 96-kuyucuklu hücre kültür kaplarında hazırlanmış MDCK hücrelerine ( kuyucuk/sulandırma) eklendi. 72 saat 37 0 C, % 5 CO2 ortamda bekletildi.

5 2..2. Virus Geri Kazanım (VGKK): Virus içeren ortama test maddesi yerine sert su ilave edildiği durum olup teorik olarak ortamda bulunan virusun belli bir süre sonra minimum kayıpla tekrar elde edilebildiğini kanıtlamak için yapılmıştır. Yapılan işlemler sırası ile; Virus süspansiyonu (TCID 50: 6.5X10 7 /ml) steril kapaklı 5ml plastik bijoux içerisine yerleştirildi Test maddesi miktarında sert su eklendi. 5 dakika beklenip ortama ilave sert su ilave edildi. Karışım kısa bir süre vortekslendi Test maddesinin kullanıldığı sistemde yapıldığı gibi kromatografi kolonundan Kolondan elde edilen eluat % 0.1 BSA, 2 µg/ml TPCK ile muamele edilmiş Tripsin içeren MEM kullanılarak 10 ar kat sulandırıldı ( ) Her bir sulandırmadan 96-kuyucuklu hücre kültür kaplarında hazırlanmış MDCK hücrelerine 0.1 ml/kuyucuk ( kuyucuk/sulandırma) olacak şekilde eklendi. 72 saat 37 0 C, % 5 CO2 ortamda bekletildi Sitotoksisite Testi (STT): Virusidal test sisteminde kullanılan test maddesinin hücreler üzerine toksik etkisinin belirlenmesi durumudur: Yapılan işlemler sırası ile; Steril kapaklı 5ml plastik bijoux içerisine test maddesi (% 10) yerleştirildi Virus yerine sert su ilave edildi. Karışım kısa bir süre vortekslendi Test maddesinin kullanıldığı sistemde yapıldığı gibi kromatografi kolonundan Kolondan elde edilen eluat % 0.1 BSA, 2 µg/ml TPCK ile muamele edilmiş Her bir sulandırmadan 96-kuyucuklu hücre kültür kaplarında hazırlanmış MDCK hücrelerine 0.1 ml/kuyucuk ( kuyucuk/sulandırma) olacak şekilde eklendi. 72 saat 37 0 C, % 5 CO2 ortamda bekletildi Nötralizasyon Etkinlik Testi (NET): Sitotoksisite test sisteminde tarif edildiği gibi kromatografi kolonundan geçirilen test maddesinin kalıntı olarak etken madde içermediğini kanıtlamak için yapılan testtir. Burada kolondan elde edilen eluatın her bir 10 katlık sulandırması düşük titreli virus ile karıştırılıp hücre kültürüne ekilir. Test maddesinin nötralize edildiğinin göstergesi olarak inkübasyon süresi sonunda virusun üremesi beklenir. Yapılan işlemler sırası ile; Steril kapaklı 5ml plastik bijoux içerisine test maddesi (% 10 ) yerleştirildi Üzerine sert su ilave edildi. Karışım kısa bir süre vortekslendi.

6 Test maddesinin kullanıldığı sistemde yapıldığı gibi kromatografi kolonundan 2... Kolondan elde edilen eluat % 0.1 BSA, 2 µg/ml TPCK ile muamele edilmiş Her bir sulandırma üzerine eşit oranda düşük titrede (600 TCID 50 /ml) virus ilave edildi. 5 dakika oda ısısında beklendi Virus ile muamele edilen her bir sulandırmadan 96-kuyucuklu hücre kültür kaplarında hazırlanmış MDCK hücrelerine 0.1 ml/kuyucuk ( kuyucuk/ sulandırma) olacak şekilde eklendi. 72 saat 37 0 C, % 5 CO2 ortamda bekletildi Yüzey Testi: Özet olarak; virus ile kirletilen belirli bir alanın virusidal etkinliği test edilecek dezenfektana belli sürelerle maruz bırakılmasından ortamdan alınan örneklerde virus varlığını tespit etmeye dayanan test sistemidir. Test maddesinin (Dezenkon HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı) virusidal amaçla yüzey test aşamaları şu şekildedir: Virusidal Test (VT): Test maddesinin kullanıldığı durumdur: Yapılan işlemler sırası ile; Steril cam petri tabağının iç yüzey tabanında belirlenen 28 cm 2 lik alana virus süspansiyonu (TCID 50: 6.5X10 7 /ml) ince film halinde yayıldı: Oda ısısında gözle görülür şekilde kuruyana kadar (ortalama 20 dakika) bekletildi Kurumuş film tabakası üzerine test maddesi (% 10) yayıldı. 5 dakika beklenip cam yüzey kazınarak süspansiyon elde edildi Test maddesinin daha sonraki aşamada kullanılan hücre kültür sistemine toksik etkisini azaltma/gidermek amacıyla elde edilen süspansiyon nötralizasyon için kromatografi kolonundan Kolondan elde edilen eluat % 0.1 BSA, 2 µg/ml TPCK ile muamele edilmiş Her bir sulandırmadan 96-kuyucuklu hücre kültür kaplarında hazırlanmış MDCK hücrelerine 0.1 ml/kuyucuk ( kuyucuk/sulandırma) olacak şekilde eklendi. 72 saat 37 0 C, % 5 CO2 ortamda bekletildi Virus Geri Kazanım (VGKK): Virus ile kirletilen yüzeyin test maddesi yerine sert su ile muamele edildiği durum olup teorik olarak ortama ilave edilmiş virusun minimum kayıpla tekrar elde edilebildiğini kanıtlamak için yapılmıştır. Yapılan işlemler sırası ile;

7 Steril cam petri tabağının iç yüzey tabanında belirlenen 28 cm 2 lik alana virus süspansiyonu (TCID 50: 6.5X10 7 /ml) ince film halinde yayıldı: Oda ısısında gözle görülür şekilde kuruyana kadar (ortalama 20 dakika) bekletildi Kurumuş film tabakası üzerine test maddesi yerine sert su yayıldı. 5 dakika beklenip cam yüzey kazınarak süspansiyon elde edildi Test maddesinin kullanıldığı sistemde yapıldığı gibi kromatografi kolonundan Kolondan elde edilen eluat % 0.1 BSA, 2 µg/ml TPCK ile muamele edilmiş Tripsin içeren MEM kullanılarak 10 ar kat sulandırıldı ( ) Her bir sulandırmadan 96-kuyucuklu hücre kültür kaplarında hazırlanmış MDCK hücrelerine 0.1 ml/kuyucuk ( kuyucuk/sulandırma) olacak şekilde eklendi. 72 saat 37 0 C, % 5 CO2 ortamda bekletildi Sitotoksisite Testi (STT): Virusidal test sisteminde kullanılan test maddesinin hücreler üzerine toksik etkisinin belirlenmesi durumudur: Yapılan işlemler sırası ile; Steril cam petri tabağının iç yüzey tabanında belirlenen 28 cm 2 lik alana % 1 lik test maddesi yayıldı. 5 dakika beklenip cam yüzey kazınarak süspansiyon elde edildi Test maddesinin kullanıldığı sistemde yapıldığı gibi kromatografi kolonundan Kolondan elde edilen eluat % 0.1 BSA, 2 µg/ml TPCK ile muamele edilmiş Her bir sulandırmadan 96-kuyucuklu hücre kültür kaplarında hazırlanmış MDCK hücrelerine 0.1 ml/kuyucuk ( kuyucuk/sulandırma) olacak şekilde eklendi. 72 saat 37 0 C, % 5 CO2 ortamda bekletildi Nötralizasyon Etkinlik Testi (NET): Sitotoksisite test sisteminde kromatografi kolonundan geçirilen test maddesinin kalıntı olarak etken madde içermediğini kanıtlamak için yapılan testtir. Burada kolondan elde edilen eluatın her bir 10 katlık sulandırması düşük titreli virus ile karıştırılıp hücre kültürüne ekilir. Test maddesinin nötralize edildiğinin göstergesi olarak inkübasyon süresi sonunda virusun üremesi beklenir. Yapılan işlemler sırası ile; Steril cam petri tabağının iç yüzey tabanında belirlenen 28 cm 2 lik alana % 1 lik test maddesi eklendi. 5 dakika beklenip cam yüzey kazınarak süspansiyon elde edildi Test maddesinin kullanıldığı sistemde yapıldığı gibi kromatografi kolonundan

8 Kolondan elde edilen eluat % 0.1 BSA, 2 µg/ml TPCK ile muamele edilmiş Her bir sulandırma üzerine eşit oranda düşük titrede (600 TCID 50 /ml) virus ilave edildi. 5 dakika oda ısısında beklendi Virus ile muamele edilen her bir sulandırmadan 96-kuyucuklu hücre kültür kaplarında hazırlanmış MDCK hücrelerine 0.1 ml/kuyucuk ( kuyucuk/sulandırma) olacak şekilde eklendi. 72 saat 37 0 C, % 5 CO2 ortamda bekletildi VERİ ANALİZİ Titrelerin Hesaplanması: Virus ve sitotoksisite titreleri, Spearman-Karber yöntemiyle hesaplandı. Hücre kültürünün % 50 sini enfekte eden doz (TCID 50 ) ve Hücre kültürünün % 50 sine toksik olan doz (CC 50 ) -log 10 olarak ifade edilmiştir. Virus sitopatik etki değerlendirmesi her bir test kuyucuğundan alınan örneklerde Hemaglutinasyon (HA) ile de doğrulanmıştır Log Azalmasının Hesaplanması: Başlangıç (T0) virus miktarında test maddesinin 5 dakikalık (T5) uygulanması ile gerçekleşen azalma: TCID 50 T0 - TCID 50 T5 sonucu olarak alınmıştır ÇALIŞMA KABUL KRİTERLERİ Virus Geri Kazanım (VGKK) testinde en az log 10 enfektivitenin geri kazanılması, Sitotoksisite (ST) test çalışmasında, Virus Geri Kazanım (VGKK) testinde sitotoksik düzeyin ötesinde en az 3-log azalmanın ortaya konması, Nötralizasyon Etkinlik (NET) testinde enfektivite yönünden pozitif olmasını, Virusidal test (VT) sisteminde T0-T5 farkının en az log 10 olması,

9 3. SONUÇLAR 3.1. Virusidal Süspansiyon Test: Sıvı içerisinde yüksek titrede virus içeren ortama % 1 oranında seyreltilmiş Dezenkon HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı ilave edilmesi çalışmasında elde edilen sonuçlar Tablo 1 de gösterilmiştir. Tablo 1. Dezenkon HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı nın virusidal süspansiyon testinde pandemik influenza (H1N1domuz gribi) virusuna karşı virusidal etkisi Seyreltme Virus Virusidal Virus Geri Nötralizan Sitotoksisite Hücre (- Log 10) Test (VT) Kazanım Etkinlik Testi (STT) Testi (VGKK) (NET) TCID 50 Log 10 (6.00) 1.5 (6.0) Log 10 azalma 1.5 % azalma % (+) = test virus pozitif (0)= test virus negatif

10 3.2. Virusidal Yüzey Test: Belirli bir yüzey alanında kurutulmuş film tabakası olarak yüksek titrede virus içeren ortama % 10 oranında seyreltilmiş Dezenkon HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı ilave edilmesi çalışmasında elde edilen sonuçlar Tablo 2 de gösterilmiştir. Tablo 2. Dezenkon HNS (AgNPS) Antibakteriyel Yer ve Yüzey Dezenfektanı nın virusidal yüzey testinde pandemik influenza (H1N1domuz gribi) virusuna karşı virusidal etkisi Seyreltme Virus Virusidal Virus Geri Nötralizan Sitotoksisite Hücre (- Log 10) Test (VT) Kazanım Etkinlik Testi (STT) Testi (VGKK) (NET) TCID 50 Log 10 (6.00) 1.5 (6.00) Log 10 azalma 1.5 % azalma % (+) = test virus pozitif (0) = test virus negatif

11 . ÇALIŞMANIN KAYITLARININ SAKLANMASI.1. Kayıtların Saklanması: Bu çalışma için özel olarak geliştirilen tüm orijinal ham veriler, Antimikrop Test Laboratuvarında arşivlenecektir. Bu orijinal veriler, yalnız bunlarla sınırlı olmamak üzere aşağıdaki bilgileri içerir: Defterler, veri formları ve hesaplamalar, elle yazılmış tüm ham veriler ile son çalışma raporunun onaylı kopyası..2. Test Maddesinin Saklanması: Çalışma tamamlandıktan sonra, test maddesi, tedarikçi tarafından onaylanan protokole göre atılacaktır. Test maddesinin bir örneğinin saklanması Dezenkon Kimya Tem. Tur. İnş. San. Ve Tic. A.Ş. nin sorumluluğundadır. 5. KAYNAKLAR 5.1. ASTM E : Standard Test Method for Efficacy of Antimicrobial Agents Against Viruses in Suspension 5.2. ASTM E : Standard Test Method for Efficacy of Virucidal Agents Intended for Inanimate Environmental Surfaces