İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İzolasyon, İdame ve Farklılaşma (diferansiyasyon)

Transkript

1 İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İzolasyon, İdame ve Farklılaşma (diferansiyasyon) Kürşad TÜRKŞEN Ottawa Sağlık Araştırma Enstitüsü Ottawa Hastanesi, Ottawa, Ontario, Canada Özet In vitro olarak çok sayıda hücre serilerine farklılaşma kapasitesine sahip pluripotent insan embriyonik kök (iek) hücrelerinin izolasyonu rejeneratif tıp alanında büyük heyecan ve ümit uyandırmıştır. Fakat elimizdeki insan embriyonik kök hücre serilerinin in vitro fertilizasyon laboratuarlarındaki artık embriyolardan izole edilmiş olması, kök hücre araştırıcıları ve araştırmalarına şüpheyle bakılmasına neden olmuştur. Tik ve politik tartışmalara rağmen, farklı hücre hatlarını çalışmaya yönelik yöntem ve protokoller gelişmektedir. Dahası, istenen hücre hattı yönünde farklılaşmayı sağlayabilmek için spesifik büyüme faktörleri kombinasyonlarını, hücre-hücre ve hücre-ekstrasellüler matriks indüksiyon sistemlerini kullanan stratejiler araştırılmaktadır. Fakat kendini-yenileme ve farklılaşmayı kontrol eden mekanizmaların belirlenmesine büyük ihtiyaç duyulmaktadır ve insan embriyonik kök hücrelerinin gelecekteki potansiyel kullanımları için yeni saflaştırma protokolleri geliştirilmelidir. Bilimsel ve politik engellerin üstesinden gelindikten sonra, insan embriyonik kök hücre alanının yanık travması ve diyabetik ayak yaraları gibi belli hastalıklarda ve aynı zamanda Parkinson hastalığı, Tip 1 diyabet, romatoid artrit ve myokard enfarktüsü gibi dejeneratif hastalıklarda önemli farklılıklar yaratacağı öngörülmektedir. Bu giriş bölümünde insan kök hücre farklılaştırma (diferansiyasyon) protokollerindeki yenilikleri gözden geçrip kök hücre araştırmalarındaki bazı gündemdeki sorunları tartışacağız. Anahtar Kelimeler: Embriyonik kök (EK) hücreler; insan embriyonik kök (iek) hücreleri; embriyonik cisimcikler (ECler); pluripotent; farklılaşma (diferansiasyon); in vitro diferansiyasyon; hücre tedavisi; derivasyon; kendini-yenileme; pluripotens. 1. Giriş Embriyonik kök (EK) hücreleri iki çok önemli özelliğe sahiptirler ve bu özellikler sayesinde rejeneratif tıbbın odak noktası haline gelmişlerdir: (1) kendini-yenileme süreci ile farklılaşmaksızın prolifere olma becerisi (2) farklılaşma için indüklendiklerinde özelleşmiş hücre türleri oluşturma potansiyeli (1). Kök hücre biyologlarının uzun zamandan beri hedefledikleri konulardan biri sahip olacakları bir kültür sistemi sayesinde sürekli büyüyen bir kök hücre populasyonundan in vitro olarak farklılaşmış öncül hücre oluşturma becerisini kullanarak kök hücre/çok erken progenitor potansiyel konusunu çalışabilmekti (2,3). Böylelikle programlanmış hücre hattı ve farklılaşmanın başlayabilmesi için gerekli olan moleküler mekanizmaların da kapsamlı bir incelemesi yapılabilecektir. EK hücrelerinin daha fazla bulunabilmesi ve kullanılabilmesi sayesinde, bu alanda kazanımlar elde edilmiştir. 20 yıl önce, 3,5 günlük fare blastosistlerinin iç hücre kütlesinden (IHK) ilk EK hücreler türetilmiştir (4,5). Lösemi inhibitör faktör (LIF) varlığında uygun bir besleyici fibroblast tabakaya yerleştirildiklerinde, EK prolifere olur ve sonsuza kadar pluripotent kalır (4,5). Ayrıca immortal kök hücrelerin in vitro olarak manipüle edilebildikleri de gösterilmiştir, böylelikle hem erken gelişimi çalışma fırsatı yaratılmış, hem de in vivo olarak türetilmiş progenitor (öncü) hücrelerin hücre hattı potansiyelleri değerlendirilmiştir (6,7). Bu öncü çalışmalardan beri fare EK hücreleri programlandırımış hücre hattı ve in vitro progresyonu incele- 9

2 TÜRKŞEN K. İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İzolasyon, İdame ve Farklılaşma (diferansiyasyon) mek için harika bir model sistem oluşturmuşlardır (8). EK hücrelerinin besleyici tabakadan ayrılmaları agregasyonu ve basit ya da kistik embriyoid cisimciklere (EC) farklılaşmayın indükler. Basit EC de EK hücrelerinin çevresinde bir endodermal hücre tabakası bulunmaktadır. Kistik EC de ise ek bir kolumnar ektoderm benzeri hücre tabakası sıvı dolu bir boşluğu çevreler, bunlar morfolojik olarak 6 ila 8 günlük silindir aşamasındaki embriyolara benzerler. Mezoderm (braküri, aktivin), endoderm (kollajen tip IV) ve ektoderm (α-fötoprotein) için markerlerin ekspresyonu kistik EC de her üç germ tabakasından da hücrenin bulunduğuna işaret eder. Bu aşamada uygun indükleyici ajan kullanıldığında farklı hücre hatt yolları boyunca farklılaşma mümkündür. Kullanılan kültür koşullarına bağlı olarak, fare EK hücrelerinin epidermal hücreler, tip II alveoler epitelyal hücreler, telensefalik prekürsörler, osteoblastlar ve kardiyomyositler de dahil olmak üzere değişik yönlere farklılaşabildikleri gösterilmiştir (9 14). Oluşturulan ilk insan embriyonik kök (iek) hücresi 1998 yılında bir in vitro fertilizasyon (IVF) kliniğinde kullanılmayan zigotlardan izole edilmiştir (15). Bu ve bunu izleyen çalışmalarda fare EK hücrelerinde olduğu gibi insan EK hücrelerinde de farklılaşma olmadan kendini-yenileme becerisi ve pluripotent bir yapı olduğu gözlenmiştir (16 18). Bu özellikler rejeneratif tıbbın geleceği ve genel anlamda medikal araştırmalar için büyük ümitler vaat etmektedir. Bu bölümde insan embriyonik kök hücre araştırmalarındaki son gelişmeleri ele alacağız. 2. İnsan embriyonik kök hücre türetilmesinde yeni ufuklar Kısır çiftlerin üremelerine yardımcı olan IVF klinikleri çok sayıda insan embriyonik kök hücre serilerinin elde edilmesi için bir kaynak oluşturmuştur. Bu kliniklerde, gebelik amacıyla transfer edilmeyen kültürlenmiş zigotların ya daha ileriki bir tarihte transfer için dondurulması ya da hastaların isteği üzerine imha edilmesi sık rastlanan uygulamalardır. İlk insan embryonik kök hücreleri immünocerrahi yoluyla 6 günlük blastosist evresindeki embriyonun dış trofektoderminin kompleman aracılı olarak uzaklaştırılması ve intakt bir ICM bırakılmasıyla elde edilmiştir. Daha sonra bu ICM gamma radyasyonuyla ışınlanmış ormitomisin-c ile muamele edilmiş fare embriyonik fibroblastlarına (FEF) ekilmiş ve yüksek serum konsantrasyonlarında kültürlenerek günler sonra EK hücre kolonileri elde edilmiştir (15,18). O tarihten bu yana farklı varyasyonlar değerlendirilmiştir, bunlar arasında 8 günlük blastosistlerden insan embriyonik kök hücrelerinin izole edilmesi (19) veya insan morulasından EK hücre serileri elde etmenin fizibilitesinin denenmesi de vardır (20). Şimdiye kadar, Ulusal Sağlık enstitüsü kayıt sisteminde araştırmacıların kullanımı için 19 adet normal hücre serisi (bkz gov/research/registry/) vardır. Ek olarak, özel fonların desteğiyle farklı genetik anormalliklere sahip insan embriyonik kök hücre serileri repertuarı oluşturulmuş ve genetik anormalliklerde hücresel süreçlerdeki birincil bozukluları inceleyebilmek için sınırsız bir hastalıklı hücre kaynağı elde edilmiştir. Genetik bozukluklar için insan kök hücre serileri transfer amacıyla kullanılamayan embriyolardan ve IVF de sık kullanılan bir uygulama olan preimplantasyon genetik incelemede mutant olduğu belirlenen embriyolardan elde edilmiştir. Genetik bozukluğa sahip 18 insan embriyonik kök hücre serisi mevcuttur: bunlar arasında adrenolökodistrofi, Duchenne ve Becker müsküler distrofileri, Fanconi anemisi, komplementasyon grup A, frajil-x sendromu, Huntington hastalığı (üç seri), Marfan sendromu, miyotonik distrofi (iki seri), nörofibromatosis tip I (beş seri) ve thalassemia (iki seri) bulunur (21). 3. İnsan embriyonik kök hücre kültürlenmesindeki zorluklar Geleneksel olarak insan embriyonik kök hücrelerinin oluşturulmasının ve idamesinin çok zor olduğu bilinmektedir. Günümüzde, iek hücre manipülasyonu zorluğunu korumakta zor kültürleme becerilerinin edinilmesini gerektirmektedir; fakat gelişmekte olan protokoller kullanışlı ve başarılabilirdir. Örneğin, iek hücreleri için hem mekanik hem enzimatik transfer yöntemleri kullanılsa da, başlangıçta iek hücrelerinin idamesi için mekanik transfer yöntemi mutlak gerekli görülmüştür. Mekanik transfer zor ve zaman alan bir uygulamadır, uygulamada tercih edilmesinin nedeni emzimatik yöntemin kullanımında (ör: tripsin) yaşanan güçlüklerdir, bu yöntem kullanıldığı zaman iek hücrelerinin tek-hücre süspansiyonu şeklinde ekilmesi fare EK hücrelerinin aksine problemlidir. Tek-hücre süspansiyonu şeklindeki iek hücre pasajlarının fizibilitesinin kötü olması, farklılaşmamış iek hücrelerinin hücre dansite değişikliklerine hassas olduğunu, gerek iek-iek, gerekse iek-ecm (ekstrasellüler matriks) arası 10

3 İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İzolasyon, İdame ve Farklılaşma (diferansiyasyon) TÜRKŞEN K. ya da iek-besleyici hücre arası hücre-hücre etkileşimlerinin iek hücre sinyallemesi ve sağ kalımı açısından kritik öneme sahip olduğunu göstermektedir. Fakat, tek-hücre süspansiyonu oluşturmadan, tip IV kollajenaz kullanarak gerçekleştirilen başarılı enzimatik transfer tekniği ile farklılaşmamış disosiye iek hücrelerinin etkin transferine imkan tanıdığı, benzer öbek boyutlarındaki iek hücrelerinin yeni bir besleyici tabakaya aktarılabildiği gösterilmiştir (18,23), mekanik transferde ise farklı boyutlardaki hücre öbekleri bir mikropipet ile çekildikten sonra transfer edilmektedir (15,18). Enzimatik yolla elde edilen benzer boyuttaki iek hücre öbeklerinin güzelliği, bireysel kolonilerin farklılaşmamış hücrelerden türetilmesidir, oysa daha büyük iek hücre öbeklerini mekanik olarak ekerken hem farklılaşmış hem de farklılaşmamış hücrelerin pasajlanması olasılığı vardır. iek hücrelerinin pasajı için bir kombinasyon tekniğinin kullanılmasıyla enzim muamelesi öncesinde manuel seleksiyonla farklılaşmış koloniler pasajdan ayrıştırılarak toplu üretim yapılabilir (24,25) Besleyici tabaka ve iek için alternatifler İnsan embriyonik kök hücrelerinin başarıyla türetilmesi ve idamesinde kullanılan protokoller fare EK hücreleri üzerinde yıllarca süren çalışmalara dayanır. Fare hücrelerinin LIF varlığında mitotik olarak inaktive edilen MEF üzerinde pluripotent kaldıkları gösterilmiştir (1). Fare eşdeğerlerinde olduğu gibi, insan embriyonik kök hücreleri de farklılaşmamış pluripotent durumlarını muhafaza edebilmek için MEF e gereksinim gösterirler, fakat ayrıca LIF e bağımlıdırlar (26). Besleyicisiz kültür sitemlerinde koşullandırılmış ortam olarak dolaylı ya da dolaysız besleyici tabakaya olan gereksinim iek hücrelerinin kullanımına ciddi kısıtlamalar getirmiştir, çünkü farelerin farklı patojenler barındırdıkları bilinmektedir. Bu patojenler arasında mürin lösemi virüsü de dahil olmak üzere endojen retrovirüsler özel öneme sahiptirler. Bazı suşların patojenik (ör: lösemik) etkilere neden oldukları bilinmektedir ve ksenotropik, politropik, ve amfotrofik mürin lösemi virüslerinin insan hücrelerini enfekte etme yeteneğinde oldukları iyi bilinmektedir. Fakat, yakın dönemdeki çalışmalar in vitro olarak insan embriyonik kök hücrelerinin enfeksiyonlarının gözlenmediğini göstermektedir (27). Öte yandan, MEF besleyici tabaka kullanımı yönündeki uygulamalar iek hücrelerini N-glukolilnöraminik asit (Neu5Gc) ile kontamine etmektedir, bu insanlarda doğal antikorları bulunan insan dışı hücre yüzey sialik asididir, Neu5Gc ile kontamine olan insan embriyonik kök hücrelerinin yabancı olarak algılandıkları ve insan antikorları tarafından saldırıya uğratıldıkları gözlemlenmiştir. O zaman şöyle bir öngörüde bulunulabilir, MEF ten türetilen veya MEF üzerinde idame ettirilen insan embriyonik kök hücrelerinin terapötik transplantasyonları rejeksiyonla sonlanacaktır (28). Bu engeli aşabilmek için tüm insan dışı ürünleri bertaraf etme gerekliliği mevcuttur. Çok yakın geçmişte bu klinik engeli aşabilmek için, insandan türetilmiş besleyici hücreler araştırılmıştır. Örneğin, mitotik olarak inaktive edilmiş insan kemik iliği stroma hücreleri (29) ve yeni doğanlarda sünnetten sonra elde edilen sünnet derisi hücreleri insan embriyonik kök hücreleri için besleyici tabaka olarak kullanılmak üzere tanımlanmıştır. İnsan embriyonik kök hücrelerinin kendiliğinden farklılaşmasından elde edilen fibroblast benzeri hücreleri kullanan yenilikçi bir yaklaşım da rapor edilmiştir (31), böylelikle yeni bir besleyici sistem elde edilmiştir. İnsan embriyonik kök hücrelerinin izogenisitesi ve onlardan türetilen fibroblastlar mikrosatellit analizle doğrulanmış ve insan embriyonik kök hücre kökenli fibroblastlarının yapısı spesifik markerlerin ekspresyonu ile belirlenmiştir. Bu besleyici sistem; spesifik markerların ekspresyonu, ciddi kombine immün yetmezliği olan (SCID) farelere enjekte edilmesi sonrasında teratomların oluşması ve in vitro farklılaşma ile farklılaşmış ektodermal, endodermal ve mezodermal hücrelere dönüşümü ile de gösterildiği üzere farklılaşmamış pluripotent iek hücrelerinin sürekli büyümesine olanak tanır. (31). iek hücrelerinin besleyici tabaka gereksinimlerini tamamen ortadan kaldırmak üzere çabalar gösterilmektedir. MEF-kökenli matris materyallerinin farklılaşmamış iek hücrelerinin idamesi üzerinde rollerinin olabileceğinin anlaşılmasıyla, matrigel veya laminin-kaplı plaklar gibi kolayca sterilize edilebilen ECM etkileri üzerine çalışmalar yapılmıştır (30). Fakat matrigel in kendisi hayvansal bir üründür ve komplikasyonlar arz eder. MEF ler tarafından üretilen hangi faktörlerin iek hücre idamesi için gerekli olduğu spesifik olarak bilinmemektedir. Fakat besleyici bir tabakanın olmaması durumunda, veya en azından MEF ile muamele edilmiş ortamlarda kendiliğinden ve rasgele farklılaşma sonucunda, iek hücre kolonileri içerisinde diferansiye hücrelerin heterojen populasyonları ortaya çıkar. Başlangıç deneyleri MEF besleyici tabakasının salgıladığı belirlenemeyen solubl faktörlerin insan embriyonik kök hücrelerinin farklılaşmamış durumlarının idame ettirilmesinde önemli bileşen- 11

4 TÜRKŞEN K. İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İzolasyon, İdame ve Farklılaşma (diferansiyasyon) ler olduklarını göstermiştir. İnsan neonatal fibroblastlarının koşullandırılmış ortamının iki-boyutlu sıvı kromatografi-tandem kitle spektrofotometrisi ve iki-boyutlu elektroforez bunu takiben flight tandem kitle spektrofotometrisinin matris destekli lazer dezobsiyon/iyonizasyon zamanının belirlenmesiyle insan embriyonik kök hücrelerinin idame aşamasındaki gereksinimleri konusunda bilgi edinilmiştir. Bu yaklaşımları kullanarak toplam 102 protein belirlenmiştir ve bunlar 15 fonksiyonel gruba ayrıştırılmıştır, bunların içerisinde hücre adezyonu, hücre proliferasyonu, sinyalleme, kemik morfogenetik proteinlerinin (BMP) inhibisyonu gibi olaylarda yer alan proteinler de vardır fakat bu faktörlerin analizine devam edilmelidir (32) Serum Bileşenleri ve Replasmanı İnsan embriyonik kök hücrelerinin idamesinde MEF leri elimine edebilmek için insan dışı serum ürünlerini uzaklaştırmak ve serum replasmanları bulmak gerekir..insan serumunun MEF yokluğunda farklılaşmamış iek hücrelerini idame ettirdiği gösterilmiştir (33). Serumsuz ortam koşullarını belirleme çabaları kapsamında, daha yeni protokollerde serumsuz bir alternatif olarak serum replasmanlarından (SR) yararlanılmaktadır (34); serum replasmanları kullanılarak pek çok seri başarıyla izole edilmiştir (35,36). Noggin ve bazik fibroblast büyüme faktörünün kombinasyonu (37), tek başına bazik fibroblast büyüme faktörü veya diğer faktörlerle birlikte kullanılarak (38,39) (ör: aktivin A) farklılaşmamış insan embriyonik kök hücreleri besleyici tabaka gereksinimi olmaksızın MEF li koşullandırılmış ortam ile tekrarlayan defalar pasajlanabilmektedir (40). Ayrıca, iek hücre serilerinin SR ortamı ve besleyici hücre olarak postnatal insan fibroblastları kullanılarak başarıyla türetilebilecekleri de gösterilmiştir. Inzunza ve ark (36) iki yeni iek hücre serisi türetmişlerdir (HS293 ve HS306) ve insan neonatal hücrelerini besleyici hücre olarak kullanarak ve SR ortamını da konvansiyonel fötal buzağı serumuna alternatif olarak kullanarak 10 erken hücre serisi elde etmişlerdir. HS293 ün pluripotensi in vivo olarak SCID farelerde teratom gelişmesi ile gösterilmiştir ayrıca HS293 ün karyotipi XY iken HS306 nın 46 XX tir. Bu ksenosuz ortamlara doğru atılan bir adımdır ve bu hücrelerin transplantasyonda kullanılmasını kolaylaştırır. Fakat büyük çabalara rağmen, iek hücrelerinin rutin idamesi için kullanılan modifiye protokoller optimalin altındadır ve kendiliğinden farklılaşma düzenli olarak gözlenmektedir. 4. İnsan embriyonik kök hücrelerinin özellikleri Blastosiste enjeksiyonu takiben, fare EK hücreleri germ line da dahil olmak üzere alloembriyonik germ tabakalarına entegre olabilirler. Pluripotenslerinin en iyi kanıtı allo-gözlemlenebilir dokularda EK hücre katkısıyla kimerik farelerin oluşumudur, ayrıca tamamen EK hücrelerinden köken alan canlı embriyoların oluşumudur (6). İnsan embriyonik kök hücre model sistemleri için bu türden deneyler imkansız olduğu için iek hücrelerinin pluripotensleri daha önce de belirtildiği gibi SCID farelere enjeksiyonu takiben teratom oluşumu ile gösterilmiştir (15,18). Teratomlar her üç germ tabakasının da temsiliyetinin gözlendiği hücresel bölgeler oluştururlar, bunlar arasında endoderm (barsak ve bez epiteli), mezoderm (kemik, düz ve çizgili kaslar) ve ektoderm (sinir epiteli ve çok katlı skuamöz epitel) (15,18) bulunur. Fare EK hücrelerinde olduğu gibi, insan EK hücreleri de iki özgün özellik sergilerler: kendiniyenileme kapasitesi ve öncü hücreler aracılığıyla nihai farklılaşmış somatik hücrelere farklılaşma yeteneği. Morfolojik olarak, insan EK hücreleri yüksek çekirdek-sitoplazma oranına sahiptirler, her hücrede tipik olarak bir ya da daha fazla belirgin çekirdekçik bulunur, bu özellikler ultrastrüktürel olarak tanımlanmıştır. Çok sayıda çalışmada insan EK hücre kültürlerinin farklılaşmamış durumları değerlendirilmiştir, bu çalışmalarda kullanılan değişkenler normal karyotip ve pluripotens markerleridir. Ayrıca yüksek seviyelerde telomeraz ekspresyonu yaptıkları gösterilmiştir, telomeraz kromozomların boyunun idame ettirilmesinden sorumlu bir ribonükleoproteindir. Özel markerleri yüksek düzeylerde eksprese ettikleri gösterilmiştir, bunlar SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60,TRA-1-81 ve alkalen fosfatazdır, fakat SSEA-1 ekspresyonu yapmazlar. İnsan EK hücrelerinde pluripotent fenotiplerini yansıtacak şekilde çok sayıda gen gösterilmiştir. Örneğin fare EK hücrelerinde olduğu gibi insan EK hücreleri de yüksek miktarlarda Oct-4 (bir germ-line transkripsiyon faktörü) ekspresyonu yaparlar, germ-line hariç mürin erişkin dokularının çoğunda ekspresyonun down-regülasyonu söz konusudur. Farklılaşmamış durumun idamesi için insan EK hücrelerinde Oct-4 ün rolünün korunması gerekse de, RNAi-zeminli hedeflemeyle Oct-4 ün devre dışı bırakılması insan embriyonik kök hücrelerini trofoblastlara farklılaşmaya zorlamıştır (41). Farklılaşmamış fare embriyonik kök hücrelerinde yüksek düzey ekspresyona sahip diğer genler tipik 12

5 İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İzolasyon, İdame ve Farklılaşma (diferansiyasyon) TÜRKŞEN K. olarak downregüle edilirler veya diferansiasyonda hücre hattı sınırlılığı gösterirler ki bu genler insan embriyonik kök hücrelerinde korunuyor gibi görünmektedir. Bu genler arasında Nanog (yakın dönemde tanımlanmış transkripsiyon faktörü içeren bir homeobox) Sox-2 (SRY bağlantılı HMG box a sahip bir transkripsiyon faktörü ) ve FGF-4, Rex-1 (bir zinc finger transkripsiyon faktörü) bulunur. Aralarında benzerlikler olsa da birikmekte olan verilere bakıldığında aslında fare ve insan embriyonik kök hücreleri arasında farklılıklar olduğu da anlaşılmaktadır. Bu bize insan hücrelerinde kendiniyenileme ve pluripotens için alternatif sinyalleyici yolaklar bulunduğunu düşündürmektedir (26). 5. İnsan embriyonik kök hücrelerinin transkriptom profillemesi İnsan embriyonik kök hücrelerinin bütün transkriptomik profilini belirlemeye ve bunların fare embriyonik kök hücreleriyle kaşılaştırmalı olarak türevlerini saptamaya yönelik çalışmalar sürdürülmektedir (42,43).Wei ve ark (43) bir mürin, iki insan EK hücre serisi kullanarak bunların moleküler özelliklerini massively parallel signature sequencing (MPSS) teknolojisi kullanarak belirlemeye çalışmaktadırlar. Her seriden iki milyonu aşkın tag sekanslanıp reverse transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ve mikroarrayler ile doğrulanmaktadır. Sonuçlar fare ve insan EK hücrelerinin küçük bir grup korunmuş genleri paylaştıklarını göstermektedir. Fakat LIF te, transforme edici büyüme faktörü-β Wnt, ve FGF sinyalleyici yolaklarda farklılıklar gösterilmiştir. Türler arasındaki önemli transkripsiyonel farklılıkların vurgulanmış olması göstermektedir ki fare EK hücre gelişiminde gelişimin erken aşamalarından itibaren devrede olan çeşitli sinyalleyici yolakların insan EK hücrelerine doğrudan birebir tercüme edilmesi mümkün değildir. Farklılaşmamış insan EK hücrelerinin transkriptomik profillemesinin farklılaşmış EK hücrelerininkiyle karşılaştırılması, insan EK hücrelerinin farklılaşma süreçlerinden sorumlu sinyalleyici yolakların anlaşılması için son derece önemlidir. Miura ve ark (26) farklılaşmamış (pasajlar 40 50) insan EK hücrelerinin (H1, H7 ve H9) besleyici-bulunmayan kültürlerinden RNA numuneleri kullanarak expressed sequenced tag enumeration ve MPSS yoluyla gen profillemesi yapmışlardır ve bunları aynı seriden farklışamış hücrelerle karşılaştırmışlardır. MPSS ve expressed sequenced tag scan analizi konkordans göstermiş ve kültürler pluripotent fazdan farklılaşmış duruma geçerlerken çok sayıda gen hızla değişmiştir. Ya up ya da down regulasyona uğrayan bir gen alt grubu seçilmiş ve bunların diferansiyel ekspresyonları bir dizi bağımsız yöntemle doğrulanmıştır Bu teknikler arasında daha ileri farklılaşmadan sonra reverse transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu ve immünhistokimya ile ekspresyonun kontrolü de bulunmaktadır. Bu analizde EK ve EC aşamalarına özgün markerlarla birlikte büyük olasılıkla farklılaşmayı düzenleyen sinyalleyici yolaklar da belirlenmiştir (26). 6. İnsan embriyonik kök hücrelerinin farklılaşması İnsan embriyonik kök hücre alanına gösterilen ilginin esas nedeni bu hücrelerin farklı hücre serilerine farklılaşabilme potansiyelleridir. Doğrudan transplantasyon-zeminli klinik tedaviler için spesifik hücre tipi gruplarının saflaştırılması aşamasında insan embriyonik kök hücreleri temel yapı taşı görevi yapacaklardır. Dahası aşikar sınırsız proliferasyon kapasiteleri sayesinde insan embriyonik kök hücreleri büyük-boyutta spesifik hücre türü üretiminde daha yararlı bir kaynak oluşturacaklardır. Erişkin kök hücre türleriyle kıyaslandıklarında ise bunların in vitro ortamda sınırlı proliferasyona sahip oldukları görülecektir. Fare embriyonik kök hücrelerinde olduğu gibi, insan embriyonik kök hücrelerinde de farklılaşma sürecinin ilk basamağı EC lerin oluşumudur. Fare ECleri suspansiyon kültürlerinde spesifik koşullar altında kendiliğinden oluşurlar ve çoklu hücre hatları oluştururlar ki bunlar erken embriyonunkilere benzer. Fakat farklılaşma kaotiktir, embriyodaki gibi bir ince kontrol altında olmayıp daha çok teratoma benzer. Mürin EC oluşturmanın kolaylığına rağmen, insan embriyonik kök hücrelerinin kültürlenmesi zorluk arz etmekte ve farklı araştırmacılar arasında farklı başarı oranlarından bahsedilmektedir. Yine de insan ECleri erken embriyonik gelişimin belli boyutlarını sergileyebilirler (44). Başarılı yöntemlerden biri insan embriyonik kök hücrelerinin kollajenaz veya tripsin muamelesi ile hücre disentegrasyonuna uğratılması ve süspansiyon kültüründe büyütülmesidir (44). Ayrıca, spesifik büyüme faktörlerinin kullanılması insan embriyonik kök hücre farklılaşmasını belirli germ tabakası eşdeğerlerine yönlendirmektedir (45). Ayrıca, EGF, FGF, retinoik asit, BMP-4, ve transforme edici büyüme faktörüβ muamelesi insan embriyonik kök hücrelerini indükleyerek hem mezodermal hem de ektodermal markerların ekspresyonunu sağlarken, aktivin-a ile muamele mezodermal türevlerinin ekspresyonuna yol açmaktadır (45). 13

6 TÜRKŞEN K. İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İzolasyon, İdame ve Farklılaşma (diferansiyasyon) 7. Özet Dünya genelinde insan embriyonik kök hücrelerini araştırma aracı olarak kullanan laboratuarların sayısı hızla artmaktadır ve bu hücrelerin değişik hücre serilerine farklılaşmaları için çok sayıda protokoller geliştirilmiştir. Fakat çözümlenmesi gereken pek çok güçlük vardır, insan kök hücrelerinin şaşırtıcı potansiyelleri meyve verme aşamasına gelmeden önce cevaplanması gereken sorular arasında insan kök hücre biyolojisinin temel kavramlarına yönelik kolay sorular da vardır. Çözümü gereken öncelikli konular listesinde: (1) insan embriyonik hücrelerinin belirlenen serilere farklılaşabilmeleri için gerekli spesifik kültür koşullarının tanımlanması; (2) farklılaşmamış insan embriyonik kök hücrelerinin teratom oluşturucu potansiyellerinin ortadan kaldırılması ve (3) immün tolerans kaygılarının çözümlenmesi bulunur. Bu zorlukların çözümleneceği ve yakın gelecekte insan embriyonik kök hücrelerinin potansiyellerinin gerçekleşeceği yönünde büyük bir iyimserlik mevcuttur Bu giriş bölümünün genel amacı insan embriyonik kök hücrelerinin spesifik hücre serilerine farklılaşma mekanizmalarına ilişkin güçlü bir in vitro model sistem olarak kullanımında ortaya çıkabilecek tartışmalı noktaları ve pratikteki bazı konuları gündeme getirmek özellikle de inanılmaz klinik potansiyellerini gözler önüne sermektir. Pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinin idamesini sağlayan moleküler mekanizmaların ve onların nihai olarak terapötik ajanlar olarak kullanılabilmelerini sağlayacak yönlendirilmiş farklılaşma mekanizmalarının anlaşılması anlamında belirgin gelişmeler kaydetmemiz gerekmektedir. Bilim dünyası çeşitli insan embriyonik kök hücre araştırmacılarının yayınlarını yakından izlemektedir, bunlar arasında bu bölümün yazılımına zahmetle hazırlamış oldukları protokolleri paylaşarak katkıda bulunanları da unutmamak gerekir. Dünya geleneksel tıp kavramları ve tıbbi uygulamaları anlamlı derecede farklılaştıracak olan insan embriyonik kök hücre alanındaki ilerlemeleri heyecanla beklemektedir. Teşekkür Araştırma çabalarımıza gösterdiği hevesli yaklaşım ve bizi hücre hattı konusuyla tanıştırdığı için Dr. Jane Aubin e müteşekkiriz. Kök hücre çalışmalarımız Kanada Sağlık Araştırmaları Enstitüsünün sağladığı fonlarla desteklenmektedir. Kaynaklar 1. Smith, A. G. (2001) Embryo-derived stem cells: of mice and men. Annu. Rev. CellDev. Biol. 17, Hall, P. A. and Watt, F. M. (1989) Stem cells: the generation and maintenance ofcellular diversity. Development 106, Watt, F. M. and Hogan, B. L. (2000) Out of Eden: stem cells and their niches.science 287, Evans, M. J. and Kaufman, M. H. (1981) Establishment in culture of pluripotentialcells from mouse embryos. Nature 292, Martin, G. R. (1981) Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryoscultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc. Natl. Acad.Sci. USA 78, Capecchi, M. R. (2005) Gene targeting in mice: functional analysis of the mammaliangenome for the twenty-first century. Nat. Rev. Genet. 6, Mansour, S. L., Thomas, K. R., and Capecchi, M. R. (1988) Disruption of theproto-oncogene int-2 in mouse embryo-derived stem cells: a general strategy fortargeting mutations to non-selectable genes. Nature 336, Downing, G. J. and Battey, J. F., Jr. (2004) Technical assessment of the first 20 yearsof research using mouse embryonic stem cell lines. Stem Cells 22, Coraux, C., Nawrocki-Raby, B., Hinnrasky, J., et al. (2005) Embryonic stem cellsgenerate airway epithelial tissue. Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 32, Kawaguchi, J., Mee, P. J., and Smith, A. G. (2005) Osteogenic and chondrogenicdifferentiation of embryonic stem cells in response to specific growth factors. Bone36, Troy, T. C. and Turksen, K. (2005) Commitment of embryonic stem cells to anepidermal cell fate and differentiation in vitro. Dev. Dyn. 232, Turksen, K. (2002) Embryonic Stem Cells: Methods and Protocols. Methods inmolecular Biology Series Vol Humana, Totowa NJ. 13. Watanabe, K., Kamiya, D., Nishiyama, A., et al. (2005) Directed differentiationof telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nat. Neurosci. 8, Yuasa, S., Itabashi, Y., Koshimizu, U., et al. (2005) Transient inhibition of BMPsignaling by Noggin induces cardiomyocyte differentiation of mouse embryonic stem cells. Nat. Biotechnol. 23, Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., et al. (1998) Embryonic stemcell lines derived from human blastocysts. Science 282, Pera, M. F., Reubinoff, B., and Trounson, A. (2000) Human embryonic stem cells.j. Cell. Sci. 113,

7 İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İzolasyon, İdame ve Farklılaşma (diferansiyasyon) TÜRKŞEN K. 17. Pera, M. F. and Trounson, A. O. (2004) Human embryonic stem cells: prospects fordevelopment. Development 131, Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., and Bongso, A. (2000)Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro.nat. Biotechnol. 18, Stojkovic, M., Lako, M., Stojkovic, P., et al. (2004) Derivation of humanembryonic stem cells from day- 8 blastocysts recovered after three-step in vitroculture. Stem Cells 22, Strelchenko, N., Verlinsky, O., Kukharenko, V., and Verlinsky, Y. (2004) Moruladerivedhuman embryonic stem cells. Reprod. Biomed. Online 9, Verlinsky, Y., Strelchenko, N., Kukharenko, V., et al. (2005) Human embryonic stem cell lines with genetic disorders. Reprod. Biomed. Online 10, Hwang, W. S., Roh, S. I., Lee, B. C., et al. (2005) Patient-Specific Embryonic StemCells Derived from Human SCNT Blastocysts. Science 308, Amit, M., Carpenter, M. K., Inokuma, M. S., et al. (2000) Clonally derived humanembryonic stem cell lines maintain pluripotency and proliferative potential for prolonged periods of culture. Dev. Biol. 227, Oh, S. K., Kim, H. S., Park, Y. B., et al. (2005) Methods for expansion of humanembryonic stem cells. Stem Cells 23, Schatten, G., Smith, J., Navara, C., Park, J. H., and Pedersen, R. (2005) Culture ofhuman embryonic stem cells. Nat. Methods 2, Miura, T., Luo, Y., Khrebtukova, I., et al. (2004) Monitoring early differentiationevents in human embryonic stem cells by massively parallel signature sequencingand expressed sequence tag scan. Stem Cells Dev. 13, Amit, M., Winkler, M. E., Menke, S., et al. (2005) No evidence for infection ofhuman embryonic stem cells by feeder cell-derived murine leukemia viruses. Stem Cells 23, Martin, M. J., Muotri, A., Gage, F., and Varki, A. (2005) Human embryonic stemcells express an immunogenic nonhuman sialic acid. Nat. Med. 11, Cheng, L., Hammond, H., Ye, Z., Zhan, X., and Dravid, G. (2003) Human adultmarrow cells support prolonged expansion of human embryonic stem cells in culture. Stem Cells 21, Amit, M., Margulets, V., Segev, H., Shariki, K., Laevsky, I., Coleman, R., anditskovitz-eldor, J. (2003) Human feeder layers for human embryonic stem cells.biol. Reprod. 68, Stojkovic, P., Lako, M., Stewart, R., et al. (2005) An autogeneic feeder cell system that efficiently supports growth of undifferentiated human embryonic stem cells. 32. Prowse, A. B., McQuade, L. R., Bryant, K. J., Van Dyk, D. D., Tuch, B. E., andgray, P. P. (2005) A proteome analysis of conditioned media from human neonatalfibroblasts used in the maintenance of human embryonic stem cells.proteomics 5, Stojkovic, P., Lako, M., Przyborski, S., et al. (2005) Human-serum matrix supportsundifferentiated growth of human embryonic stem cells. Stem Cells 34. Wang, L., Li, L., Menendez, P., Cerdan, C., and Bhatia, M. (2005) Human embryonicstem cells maintained in the absence of mouse embryonic fibroblasts orconditioned media are capable of hematopoietic development. Blood 105, Genbacev, O., Krtolica, A., Zdravkovic, T. et al. (2005) Serum-free derivation ofhuman embryonic stem cell lines on human placental fibroblast feeders. Fertil.Steril. 83, Inzunza, J., Gertow, K., Stromberg, M. A., et al. (2005) Derivation of humanembryonic stem cell lines in serum replacement medium using postnatal humanfibroblasts as feeder cells. Stem Cells 23, Wang, G., Zhang, H., Zhao, Y., et al. (2005) Noggin and bfgf cooperate tomaintain the pluripotency of human embryonic stem cells in the absence of feederlayers. Biochem. Biophys. Res. Commun. 330, Xu, C., Rosler, E., Jiang, J., et al. (2005) Basic fibroblast growth factor supportsundifferentiated human embryonic stem cell growth without conditioned medium.stem Cells 23, Xu, R. H., Peck, R. M., Li, D. S., Feng, X., Ludwig, T., and Thomson, J. A. (2005)Basic FGF and suppression of BMP signaling sustain undifferentiated proliferationof human ES cells. Nat. Methods 2, Beattie, G. M., Lopez, A. D., Bucay, N., et al. (2005) Activin A maintains pluripotencyof human embryonic stem cells in the absence of feeder layers. Stem Cells23, Zaehres, H., Lensch, M. W., Daheron, L., Stewart, S. A., Itskovitz-Eldor, J., anddaley, G. Q. (2005) Highefficiency RNA interference in human embryonic stemcells. Stem Cells 23, Rao, M. (2004) Conserved and divergent paths that regulate self-renewal in mouseand human embryonic stem cells. Dev. Biol. 275, Wei, C. L., Miura, T., Robson, P., et al. (2005) Transcriptome profiling of humanand murine ESCs identifies divergent paths required to maintain the stem cell state.stem Cells 23, Itskovitz-Eldor, J., Schuldiner, M., Karsenti, D., et al. (2000) Differentiation ofhuman embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonicgerm layers. Mol. Med. 6, Schuldiner, M., Yanuka, O., Itskovitz-Eldor, J., Melton, D. A., and Benvenisty, N.(2000) Effects of eight growth factors on the differentiation of cells derived fromhuman embryonic stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 11,307 11,