Transkript

1 TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Kuzeydoğu ve Güneydoğu Anadolu Bölgelerinde Mavidil Enfeksiyonunun Epidemiyolojisi Doç.Dr.Taner KARAOĞLU Başlama Tarihi: Bitiş Tarihi: Rapor Tarihi: Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara

2 RAPOR FORMATI Bilgisayarda 12 punto büyüklüğünde karakterler ile, tercihan "Times New Roman" stili kullanılarak yazılacak ve aşağıdaki kesimlerden (alt kesimler de dahildir) oluşacaktır. I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri II. Amaç ve Kapsam III. Materyal ve Yöntem IV. Analiz ve Bulgular V. Sonuç ve Öneriler VI. Kaynaklar VII. Ekler a) Mali Bilanço ve Açıklamaları b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve İlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar (varsa Kesim III'de yer almayan analiz ayrıntıları) d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar) (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler (Altyapı Projeleri için uygulanmaz) NOT :Verilen kesin rapor bir (1) nüsha olarak ciltsiz şekilde verilecek, kesin rapor Komisyon onayından sonra ciltlenerek bir kopyasının yer aldığı CD ile birlikte sunulacaktır. Kesin raporda proje sonuçlarını içeren, ISI nın SCI veya SSCI veya AHCI dizinleri kapsamında ve diğer uluslar arası dizinlerce taranan hakemli dergilerde yayınlanmış makaleler, III. Materyal ve Yöntem ve IV. Analiz ve Bulgular bölümleri yerine kabul edilir. 2

3 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Projenin adı: Kuzeydoğu ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinde Mavidil enfeksiyonunun epidemiyolojisi. Projenin Özeti: Mavidil virus enfeksiyonu, sokucu sineklerle nakledilen, evcil ve bazı yabani ruminantlarda konjesyon, ödem ve hemorajiler ile karakterize, döl veriminde azalma, abort ve konjenital malformasyonlar nedeniyle önemli ekonomik kayıplara neden olan bir enfeksiyondur. Mavidil enfeksiyonunun etkeni Reoviridae familyasının, Orbivirus genusunda, Bluetongue virus grup içinde sınıflandırılmış olup virusun 24 serotipi vardır. Hastalığın epidemiyolojisinde rezervuar, vektör ve iklim önemli faktörler olarak rol oynamakta, en önemli rezervuar olarak görülen sığırlar hastalığa nadiren yakalanmakta, koyunlarda 30 gün süren vireminin, sığırlarda 100 gün sürmesi rezervuar olarak sığırları ön plana çıkartmaktadır. Sığırlardaki vireminin uzun olmasının hem enfeksiyonun naklinde, hem de vektörün aktif olmadığı kış aylarında etkenin bir sonraki sezona aktarılmasında önemli rol oynadığı belirtilmektedir. Ruminantların mavidil virus enfeksiyonu dünyanın tropikal ve subtropikal bölgelerinin çoğunda görülmekte, hastalığın bulaşmasında vektör olarak rol oynayan Clucoides türü insectler bu bölgelerde yaygın olarak bulunmaktadır. Mavidil enfeksiyonu ülkemizde de yaygın olarak görülmektedir. Mavi dil enfeksiyonunda bilinen 24 serotipi arasında düşük düzeyde çapraz nötralizasyonun olması, enfeksiyondan korunma ve mücadelede en büyük engeli oluşturmakta, enfeksiyonun çıktığı mihraklarda koruyucu aşılamadan başarılı sonuç alınabilmesi için enfeksiyonu oluşturan serotipe spesifik aşının uygulanmasını gerekli kılmaktadır. Sığırlar, enfeksiyonun bulaştırılmasında önemli bir rezervuar olarak rol aldığı ve kanlarındaki enfeksiyon etkenini bir sonraki döneme kadar taşıyabildikleri düşünüldüğünde, bu hayvanların kanlarından virus izolasyon çalışması ile birlikte, bir sonraki enfeksiyon sezonundan önce serotip spesifik aşı üretimi hazırlıkları için zaman kazandıracak erken uyarı sistemi olarak değerlendirilebilecektir. Projenin ilk basamağı olarak Kuzeydoğu Anadolu ve Güneydoğu Anadolu bölgelerinde yerleşik 2 şer kamu işletmesinde bulunan sığırlardan yapılan örneklemelerde 3

4 enfeksiyonun seroprevalansını araştırmak ve her iki bölgede enfeksiyonun seroprevalansının daha düşük tespit edildiği birer kamu işletmesinde Mavidil seronegatif bireylerden oluşan Nöbetçi sürü oluşturmak planlanmıştır. Sözkonusu nöbetçi sürülerin oluşturulması amacıyla Kazımkarabekir (Iğdır), Alparslan (Muş), Ceylanpınar (Ş.Urfa) ve Sultansuyu (Malatya) Tarım İşletmelerindeki sığırlardan yararlanıldı. Her işletmede bulunan sığırların yaklaşık 500 er adedinden alınan kan örnekleri competative ELISA testine tabi tutularak mavidil spesifik antikor varlığı yönünden araştırıldı ve çalışma alanı, her iki coğrafi bölgede birer kamu işletmesine indirgenerek Kuzeydoğu Anadolu Bölgesinde bir ve Güneydoğu Anadolu Bölgesinde 1 olmak üzere toplam 2 Tarım İşletmesinde sürdürüldü. Söz konusu iki Tarım İşletmesinde yaklaşık 100 er mavidil seronegatif sığırdan oluşan Nöbetçi sürüler oluşturuldu. Bu sürüler 1 yıl süresince birer aylık periyotlar ile örneklendi. Mavidil spesifik antikor tespiti yönünden competative ELISA testleri ile kontrol edilen ve serokonverte olan bireylerin kan örnekleri antigen capture ELISA testine tabi tutularak virus varlığı araştırıldı. Antijen capture ELISA sonunda viral antijen saptanamamış olmasına karşın, ETY nda 2 hayvanın kan örneği pozitif ve bu hayvanların kan örnekleri PCR pozitif olarak tespit edildi. Ayrıca aynı işletmede serokonversiyon gösteren hayvanların kan örneğinin BT-4, BT-9 ve BT-16 için yapılan SN 50 test sonuçları, örnekleme zamanında (Şubat Aralık 2007) işletmede BT-9 sirkülasyonunu ortaya koydu. Projenin İngilizce Adı: Epidemiology of Bluetongue infection in norteast and southeast Anatolia. Projenin İngilizce özeti: Bluetongue virus infection is an arboviral disease, which infects domestic and wild ruminants. It is characterized by oedema and hemorrhages, especially in reproductory system of both female and male animals. It causes economic losses associated with decrease in fertility problems, aborts and congenital malformation (Murphy et al., 1999). Bluetongue virus a member of orbivirus genus within the family Reoviridae has 24 serotypes (Gibbs and Greiner, 1994; Gorman, 1990; Roy, 2002). In the epidemiology of the infection reservoir, vector and climate are the important factors. The most important reservoir is cattle which rarely show symptoms (Gibbs and Greiner, 1994; Gorman,1990). The viremia period is 30 days in sheep, however it is 100 days in cattle, which distinguishes cattle as an 4

5 important reservoir. The importance of long viremia period in cattle has a role both in transmission throughout and to the next season, while the vector is inactive in winter (Goldsmith et al., 1975; Luedke et al., 1977) Ruminants bluetongue virus infection is endemic in tropical and subtropical countries, which is also the appropriate climate for the Culicoides vectors life cycle (Gibbs and Greiner, 1994; Hawkes 1996) BTV infection is also very common in Turkey. The isolation of the virus for the first time and the isolates serotypical identification will differ this project from the other seroprevalance projects. There is no cross neutralization between 24 serotypes and that is the biggest problem for prevention and control. For the success of the prophylactic immunization serotype spesific vaccine should be used. As described in the project plan, since cattle serve as reservoir and can carry the virus to the next season in their circulatory system, virus isolation from these animals blood samples will be time-saving to prepare a serotype spesific vaccine and also will be an early warning/detection system for the next season s serotypes. This project s first step is to determine the seroprevalance in Northeast and Southeast Anatolian regions by selecting 2 local governmental herds per region. After selecting one low prevalance herd from each region, a sentinel herd will be conformed from seronegative individuals. The herds in Kazım Karabekir(Iğdır), Alparslan(Muş), Ceylanpınar (Ş.Urfa) and Sultansuyu (Malatya) will be tested to conform these guardian herds. (The written permission from these local governmental herds are taken from agricultural business general management and shown in appendix.) 500 blood samples from each herd are tested by competative ELISA and Bluetongue spesific antibody determination is performed. Subsequently, project area will be limited to one herd per each of these geographical regions according to the low prevalance. Project will be continued on these two herds. About 80 bluetongue seronegative individuals will be selected to conform the guardian herds. These herds will be sampled every month during a year and will be controlled by competative ELISA for bluetongue spesific antibody. Seroconverted individuals blood samples will be tested by antigen capture ELISA and the process of the virus isolation will be started. The positive blood samples in Antigen capture ELISA test will be inoculated in Embriyonated hens eggs intravascularly. Following the incubation, homogenates of eggs will be inoculated into BHK-21 and Vero cell lines. Cell culture adopted virus isolates titres will be increased and will be identified by neutralization test using serotype spesific sera. 5

6 II. Amaç ve Kapsam Araştırmanın temel amacını, Kuzeydoğu ve Güneydoğu Anadolu Bölgelerinde mavidil seronegatif bireylerden oluşturulan nöbetçi sürüler yardımıyla mavidil virus serotiplerinin invazyonlarının erken tanısına olanak sağlayacak bir uyarı sisteminin kurulması oluşturmaktadır. Bu amaçla her iki bölgede kurulacak nöbetçi sürülerin 1 yıl boyunca birer aylık periyotlarla rutin serolojik ve virolojik kontrolleri yapıldı. Mavidil yönünden seronegatif olarak tespit edilen ve periyodik olarak aylık serolojik takibe alınan sığırların kanlarında tespit edilen serokonversiyon ile birlikte (sığır kanında enfeksiyon etkeninin 100 gün e kadar bulunabildiği bilgisinden yola çıkarak) enfeksiyonu meydana getiren virusun izolasyonu ve serotipik identifikasyonu amaçlanmıştır. Araştırma sonucunda, her iki bölgede enfeksiyona sebep olan mavidil virus serotiplerinin tanımlanmasını takiben etkin ve koruyucu bir aşılamanın yapılabilmesi ve enfeksiyondan korunmak için enfeksiyona sebep olan virusun serotipine spesifik aşı üretiminin gerçekleştirilmesi amacıyla ilgili kurumların bilgilendirilmesi bu projenin en önemli amacını oluşturmuş, aynı zamanda ülke hayvancılığına ve ekonomisine önemli bir katlıda bulunulması hedeflenmiştir. Araştırmanın yapıldığı bölgelerde bulunan sığırlara uygulanacak taramalar sonucunda enfeksiyonun seroprevalansına yönelik veriler elde edilmesi ve nöbetçi sürülerin oluşturulduğu kamu işletmelerinde enfeksiyonun sürü içinde döngüsünün ortaya konulması değerli bir epidemiyolojik veri olarak değerlendirilmiştir. Gerek coğrafi ve gerekse iklim özellikleri sebebiyle Mavidil enfeksiyonunun yüksek seroprevalans ile seyretmesi, sözkonusu enfeksiyonun sokucu sineklerle uzak mesafelere taşınabilmesi sebebiyle körfezden esen rüzgarlarla komşu ülkelerden farklı serotiplerin girme olasılığının bulunması ve bu bölgelerde mavidil enfeksiyonuna sebep olan serotip veya serotipler hakkında verilerin yetersizliği bu bölgede çalışma ihtiyacının doğmasına neden olmuştur. Özellikle Güneydoğu Anadolu bölgesinin Atatürk barajı ile sulu tarım olanağına kavuşması bölge ekolojik dengesinin eskiye oranla oldukça değişmesine neden olmuştur. Bu değişiklik içinde en çarpıcı etkiye sahip olanların başında değişik patojenlere vektörlük yapabilme yeteneğinde olan sokucu sinek populasyonlarındaki zenginlik ve/veya çeşitlilik gelmektedir. Benzer durum kuzeydoğu Anadolu bölgesi için de kısmen benzerlik göstermektedir. Diğer taraftan mavidil gibi önemli ekonomik kayıplara neden olabilen viral enfeksiyonlar için bu bölgelerdeki sınır komşularımızda ciddi bir belirsizlik hakimdir. 6

7 Seronegatif bireylerden oluşturulmuş Duyarlı nöbetçi sürülerin periyodik olarak izlenmesi esasına dayanan ve model olarak değerlendirilebilecek böyle bir çalışma ile olası enfeksiyonların ülkemiz açısından trajik olabilecek noktalara ulaşmadan tespit edilebilmesi ve gelecekte benzer uygulamaların daha geniş alanlarda ve farklı enfeksiyonlara karşı uygulanabilirliğine öncülük yapacağı kaçınılmaz bir gerçektir. Mavidil enfeksiyonuna neden olan virusun 24 serotipi bulunması ve serotipler arasında çapraz reaksiyonun düşük düzeyde olması söz konusu enfeksiyon ile mücadelede en büyük engeli oluşturmaktadır. Ülkemizde mavidil enfeksiyonunun tespitine yönelik çeşitli serolojik çalışmalar mevcuttur. Enfeksiyonun yüksek seroprevalans ile seyretmesi, bu güne kadar ülkemizde tespit edilmiş serotip 2,4,9 ve 16 dan başka serotiplerin de olabileceğini akla getirmektedir. Ancak bugün için ülkemizde sadece mavidil serotip 4 e karşı monovalan koruyucu aşılama uygulanmaktadır. Hastalığın çıktığı mihraklara koruyucu amaçla uygulanan aşılamalardan, (serotipler arasında çapraz nötralizasyon düşük düzeyde ve sınırlı olması sebebiyle) farklı bir serotiple meydana gelmiş enfeksiyonlarda başarılı sonuç alınamamaktadır. Araştırma sonucunda, her iki bölgede enfeksiyona sebep olan mavidil virus serotiplerinin tanımlanmasını takiben etkin ve koruyucu bir aşılamanın yapılabilmesi ve enfeksiyondan korunmak için enfeksiyona sebep olan virusun serotipine spesifik aşı üretiminin gerçekleştirilmesi amacıyla ilgili kurumların bilgilendirilmesi bu projenin en önemli amacını oluşturmuş, aynı zamanda ülke hayvancılığına ve ekonomisine önemli bir katlıda bulunulması hedeflenmiştir. Bu çalışma sonucunda elde edilen veriler ile sözkonusu bölgelerde mavidil enfeksiyonunu oluşturan dominant serotip/serotiplerin tespiti ile bundan sonraki aşılama ve enfeksiyondan korunma çalışmalarına temel oluşturacak düzeyde değerli veriler ortaya konulmuştur. Enfeksiyonun sürü içinde döngüsünün tespiti ise korunma ve kontrol çalışmalarını güçlendirecek nitelikte olup ileri düzeydeki epidemiyolojik çalışmalara temel oluşturması beklenmektedir. III. Materyal ve yöntem: Araştırmada örneklenen hayvanlar: Araştırmaya, Kuzeydoğu ve Güneydoğu Anadolu Bölgelerinde yer alan 4 Tarım İşletmesindeki (Alparslan/Muş, Kazım Karabekir/Iğdır, Ceylanpınar/Ş.Urfa, Sultansuyu/ Malatya) sığırların seroprevalanslarının belirlenmesiyle başlanıldı. 7

8 Bu amaçla araştırma kapsamındaki dört kamu işletmesinin her birinden 500 er adet sığırdan kan serumu örnekleri alındı. Örneklemelerin yapıldığı kamu işletmelerinde enfeksiyonun seroprevalansı saptanarak her iki bölgede birer işletmede yaklaşık 100 er mavidil seronegatif sığırdan oluşturulan nöbetçi sürüler belirlendi. Competitive ELISA testi: Gerek araştırmanın başlatıldığı 4 Tarım İşletmesindeki sığırların Mavidil enfeksiyonu seroprevalansının belirlenmesinde ve gerekse çalışma alanı 2 tarım İşletmesinde nöbetçi sürüleri oluşturan bireylerin birer aylık rutin kontrollerine indirgendiğinde söz konusu enfeksiyonun antikor varlığını tespit etmek amacıyla Competitive ELISA testinden yararlanıldı. Ag Capture ELISA testi: Nöbetçi sürüleri oluşturan bireylerin kan serumlarında serokonversiyonun tespit edilmesiyle bu hayvanların kan örneklerinde virus varlığını tespit etmek amacıyla Ag Capture ELISA testi uygulandı. ETY na inokulasyon: Seronegatif olarak nöbetçi sürüyü oluşturan ve daha sonra kan serumlarında mavidil spesifik antikorları tespit edilen bireylerin EDTA lı kan örnekleri 9 günlük emriyolu tavuk yumurtalarının yumurta sarısına inokule edildi. İnokulasyondan 48 saat sonra görülen patolojik değişiklikler değerlendirildi. Hücre kültürü inokulasyonu: ETY inokulasyonu sonrasında embriyoda patolojik değişiklik görülenlerin embriyo ekstratları hazırlandı ve Vero hücre kültürlerine inokule edildi. Nötralizasyon ve SN 50 Testi: Serokonversiyon tespit edilen nöbetçi sürüleri oluşturan bireylerin farklı dönemlerdeki kan serumlarına mavidil tip 4,9 ve 16 ya karşı çapraz nötralizasyon testi yapıldı. Sözkonusu seropozitif bireylerin kan serumlarına ayrıca SN 50 testi yapılarak antikor titreleri belirlendi. 8

9 RT-PCR testi: Gerek ETY nda patolojik değişiklik oluşturan bireylerin kan numunelerine ve gerekse embriyo ekstratlarına, mavidil virusu nükleik asit varlığını tespit etmek amacıyla RT- PCR testi uygulandı. Defibrine kan örneklerinde BTV varlığının tespiti amacıyla segment 10 a yönlendirilmiş jenerik primerler kullanılarak Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) tekniği kullanıldı. Kan örneklerinden viral RNA (vrna) izolasyonu gerçekleştirildikten sonra vrna lara özgül cdna sentezlenmesi (RT işlemi) gerçekleştirildi. Bunun için kullanılan protokol (öngörülen reaksiyon bileşimi ve termal çevirim şartları) aşağıda sunuldur; BTV RNA 3 µl dntp 1 µl Random hegzamer 1 µl 5X Reaksiyon Tamponu 2 µl MMLV Reverse Transkriptaz 0,5 µl DEPC su 2,5 µl Toplam 10 µl İlk basamakta ikincil RNA yapılarının denatürasyonu için 75 C de 5-10 dakika süreyle yapılan termal muamele sonrasında reaksiyon tamponu MMLV-RT ve dntp içeren ikinci karışım reaksiyona dahil edilerek 37 C de 1 saat süreyle cdna sentezi gerçekleştirildi. Elde edilen cdna lar takip eden basamakta kalıp olarak kullanılmak suretiyle, 10. segment (S10) içinden dizayn edilen ve tüm BTV serotiplerini tanıyan (jenerik) primerler kullanılarak in vitro olarak çoğaltıldı. PCR için kullanılan reaksiyon karışımı aşağıda sunuldu; cdna 3 µl Taq DNA Pol 0,5 µl dntp 1 µl Primer-F 0,8 µl Primer-R 0,8 µl 10x Reaksiyon Tamponu 3 µl MgCl 2 2,4 µl DNAse free su 18,5 µl Toplam 30 µl 9

10 Örnekler bu reaksiyon karışımı içinde 96 C de 4 dakika ön denatürasyona tabi tutulduktan sonra 40 döngü olacak şekilde 56 C de 50 sn bağlanma, 72 C de 1 dk uzaman ve 95 C de 50 sn denaturasyon amaçlı ısı basamakları uygulandı. Kırk döngünün tamamlanmasından sonra nihai uzama için 72 C de 10 dakika süreyle reaksiyon sonlandırıldı. PCR işleminde kullanılan primer dizinleri ve elde edilmesi beklenen ürün büyüklüğü aşağıda sunuldu. Primer Kodu Primer dizini (5-3 ) BTV-Gen F TGC TAT CCG GGC TGA TCC AA BTV-Gen R TAG CGC CGC GTA CCC TCC Ürün Büyüklüğü (bp) Spesifite 822 Generik PCR amplifikasyonu sonrasında elde edilmesi hedeflenen DNA ürünleri, etidyum bromid içeren agaroz jelde elektroforeze tabi tutulduktan sonra UV-transilluminatör de görüntülendi. 10

11 IV. Analiz ve Bulgular: Competitive ELISA testi: Kuzeydoğu ve Güneydoğu Anadolu Bölgesinde yer alan ve nöbetçi sürülerin seçiminin yapılacağı Kazımkarabekir Tarım İşletmesi/Iğdır, Alparslan Tarım İşletmesi/Muş, Sultansuyu Tarım İşletmesi/Malatya, Ceylanpınar Tarım İşletmesi/Ş.Urfa sığırlarından tesadüfi örneklemeler yapılarak kan serumları toplandı (Tablo 1). Tablo 1. İşletmelerden genel tarama amaçlı toplanan serum miktarları İşletme adı Örneklenen hayvan sayısı Seropozitif hayvan sayısı Seroprevalans % Kazımkarabekir Tİ Alparslan Tİ Sultansuyu Tİ Ceylanpınar Tİ T O P L A M Elde edilen toplam 1440 serum örneğine Mavidil virusa karşı oluşan spesifik antikor varlığını tespit etmek amacıyla Competitive ELISA testi uygulandı. Söz konusu test, mavidil virusunun 24 serotipine karşı oluşabilen, tip spesifik antikorları tespit edebilen bir testti. Competative ELISA testi sonucunda söz konusu işletmelerde mavidil enfeksiyonunun seroprevalansı; K.Karabekir Tİ. nde % 1.21 (6/495), Alparslan Tİ. nde % 12.3 (40/324), Sultansuyu Tİ. nde 0.48 (1/206) ve Ceylanpınar Tİ. nde % (146/415) olarak tespit edildi (Grafik 1.). Grafik 1. İşletmelerin Aralık 2006 itibarıyla Mavidil enfeksiyonuna karşı seroprevalansları Seroprevalans (%) ,3 IV-2. Elde edilen veriler ışığında kuzeydoğu (40/324) Anadolu bölgesinde Kazımkarabekir ,21 (6/495) 0,48 (1/206) 35,18 (146/415) K.Karabekir Alparslan 11 Sultansuyu Ceylanpınar Tİ.

12 Elde edilen veriler ışığında Kuzeydoğu Anadolu Bölgesinde Kazımkarabekir Tarım İşletmesi ve Güneydoğu Anadolu Bölgesinde Ceylanpınar Tarım İşletmesi projenin bundan sonraki çalışmalarında nöbetçi (kontrol) sürü oluşturmak amacıyla tercih edildi. Her iki Tarım İşletmesinde de seronegatif olarak belirlenen ve yaşları örnekleme tarihi itibarıyla 6 ay ila 18 ay arasında değişen Kazımkarabekir Tarım İşletmesinde 114 (Tablo 2), Ceylanpınar Tarım İşletmesinde 101 adet seronegatif sığır projenin nöbetçi sürüsü olarak belirlendi (Tablo 3). Kazımkarabekir Tarım İşletmesinde kasım 2006 tarihinde örneklenen ve seronegatif olarak tespit edilen hayvanlardan seçilerek nöbetçi sürü olarak belirlenen 114 adet sığır, aralık 2006, 2007 yılının şubat, mart, mayıs, haziran, ağustos, eylül, ekim, kasım, aralık aylarında ve son olarak 2008 ocak ayında örneklenerek bir yıl boyunca 11 kez örneklemeye tabi tutuldu (Tablo 2). Her örneklemede elde edilen kan serumlarına mavidil virus spesifik antikor varlığını tespit etmek amacıyla competative ELISA testi uygulandı. Seronegatif olarak saha çalışmasına aralık 2006 yılında başlanılan ve ocak 2008 yılına kadar 11 kez örneklenen ve nöbetçi sürüyü oluşturan 114 bireyin hiç birisinde, hiçbir örnekleme döneminde serokonversiyon gözlenmedi (Tablo 2). Ceylanpınar Tarım İşletmesinde kasım 2006 tarihinde yapılan genel örneklemede seronegatif olarak tespit edilen ve yaşları örnekleme tarihi itibarıyla 6-18 ay arasında değişen toplam 101 birey nöbetçi sürüyü oluşturmak için seçildi. Söz konusu bireylerin saha örneklemeleri aralık 2006, 2007 yılının şubat, mart, nisan, haziran, temmuz, ağustos, eylül, kasım, aralık aylarında ve son olarak 2008 yılının ocak ayında örneklenerek yıl boyunca toplam 11 kez numune alındı (Tablo 3). Ceylanpınar Tarım İşletmesinde 101 adet seronegatif sığır ile başlayan saha çalışmasının, haziran 2007 örneklemesine gidildiğinde işletme yönetiminin tasarrufu sonucu 35 hayvanın satılmak veya kesilmek suretiyle sürüden ayrıldığı bilgisi ile karşılaşıldı. Nöbetçi sürüden ayrılan 35 sığır yerine yenilerinin katılması yönünde işletme yönetimi ile yapılan görüşmeler sonunda Tablo 3 de sunulan sıra no aralığındaki sığırlar temmuz 2007 ve daha sonraki aylık rutin örneklemelere dahil edildiler. Örneklemeye sonradan katılan sığırlar da ilk katılanlar gibi kasım 2006 itibarıyla 6-18 ay yaş aralığındaydılar ve bu tarih itibarıyla seronegatif olarak belirlenmişlerdi. Sürüye söz konusu 2. grubun katılımı ile bu hayvanlar da temmuz 2007 tarihinden itibaren yapılan örneklemelere ilave edildiler. Ceylanpınar tarım işletmesinde kasım 2006 tarihi itibarıyla oluşturulan ve 1 yıl içinde 11 örneklemesi yapılan nöbetçi sürüyü oluşturan bireylerin 12

13 örnekleme zamanları ve her örneklemede mavidil virus spesifik antikorların varlığını tespit etmek amacıyla yapılan competitive ELISA testi sonuçları Tablo 3 de sunuldu. Proje boyunca toplam 11 kez örneklenen ve elde edilen her örneğe yapılan competative ELISA testi sonucunda nöbetçi sürüyü kasım 2006 tarihinden itibaren oluşturan 1. grup içinde 19 bireyin, temmuz 2007 tarihinden itibaren nöbetçi sürüye katılan 2. grup hayvanların ise 13 adedinin kan örneklerinde serokonversiyon tespit edildi (Tablo 4). Seronegatif olarak nöbetçi sürüye ayrılan ve örnekleme periyotları içinde serokonversiyon gösteren toplam 32 hayvanın örnekleme zamanları ve competative ELISA testi sonuçları ile BT spesifik antikor yönünden kan serumu değişiklikleri Tablo 4 de sunuldu. Ag Capture ELISA testi: Aylık periyodik örneklemelerde competative ELISA testi ile seropozitif bulunan bireylerin EDTA lı kan örnekleri antijen capture ELISA testi ne tabi tutuldu. Serokonversiyon gösteren bireylerin hiçbirinin EDTA lı kan örneğinde antijen capture ELISA testinde antijen tespit edilemedi. ETY inokulasyonu: Serokonversiyon gösteren bireylerin EDTA lı kan örneklerinde antijen capture ELISA testi ile antijen varlığı tespit edilememiş olmasına karşın bu bireylerin EDTA lı kan örneklerinden embriyolu tavuk yumurtalarının yumurta sarısına ekimler yapıldı ve patolojik değişimlerin oluşması beklendi. Bu amaçla yumurta inkubatöründe uygun ısı ve nem altında tutulan döllü yumurtaların yumurta sarılarına seropozitif bireylerin EDTA lı kan örneklerinden inokulasyon yapıldı. İnokulasyonu takiben uygun şartlarda inkube edilen embriyolarda patolojik değişiklikler takip edildi. Söz konusu inokulasyonlar sonucunda 636 kulak no lu (Tablo 4, sıra no:7) ve 313 kulak no lu (Tablo 4, sıra no:22) bireylere ait örneklerin inokule edildiği embriyolarda hiperemi ile birlikte gelişme geriliği gözlendi (Resim 1). Hücre kültürü inokulasyonu: Söz konusu embriyolardan elde edilen ekstraktların Vero hücre kültürlerine inokulasyonu sonucu hücre kültürlerinde virus izolasyon çalışması denendi ancak virus izole edilemedi. 13

14 Nötralizasyon ve SN 50 Testi: Ceylanpınar Tarım İşletmesi nöbetçi sürüsü içinde serokonversiyon gösteren bireylerin kan serumlarına mavidil-4, mavidil-9 ve mavidil-16 serotiplerine karşı çapraz nötralizasyon testi yapıldı. Bir yıl boyunca yapılan 11 örneklemede kanlarında uzun süre antikor tespit edilen bireylerden en az süre ile antikor taşıyan bireye doğru sıralama yapıldı ve Tablo 5 de sunuldu. Tablo 5 de aynı zamanda serokonversiyon gösteren bireylerin hangi örnekleme döneminde hangi mavidil spesifik antikorları içerdiği de gösterildi. Serokonversiyon gösteren 32 adet bireyin kan serumlarına BT-4, BT-9, BT-16 ya karşı yapılan çapraz nötralizasyon sonucunda 28 sığırın kan serumunda BT-4, BT-9 ve BT- 16 ya karşı, 2 sığırın kan serumunda BT-9 ve BT-16 ya karşı ve 1 sığırın kan serumunda sadece BT-9 a karşı spesifik mavidil antikoruna rastlandı (Tablo 6). Tablo 6 da, Ceylanpınar Tarım İşletmesi nöbetçi sürüsünde serokonversiyon gösteren bireylerden bazılarının çeşitli örnekleme dönemlerinde elde edilen kan serumlarına, BT-4, BT-9 ve BT-16 ya karşı yapılan SN 50 testi sonuçları Tablo 7 de gösterildi. Tablo 6 ve Tablo 7 verilerine göre yapılan mavidil serotipleri arasında düşük düzeyde çapraz nötralizasyonun söz konusu olduğu göz önünde bulundurulduğunda bölgede dominant olarak sirküle olan tipin BT-9 olduğu kanaatine varıldı. İşletmelerin çalışma sonrası seroprevalansı: Bir yıl boyunca toplam 11 kez örneklenen Kazımkarabekir ve Ceylanpınar Tarım İşletmelerinin söz konusu enfeksiyona karşı sürü bazında seroprevalansının çalışma sonunda belirlenmesi için tesadüfi örnekleme ile alınan kan serumlarına competitive ELISA testi uygulandı. Kasım 2006 da sürü seroprevalansları bilinen söz konusu işletmelerin çalışma sonrasındaki (mart 2008) seroprevalansları belirlenerek Tablo 8 de ve Grafik 2 de sunuldu. RT-PCR: Serokonversiyon gösteren sığırların kan örneklerinin ETY, yumurta sarısına yapılan inokulasyonları sonrasında, embriyoda mavidil için tanımlanan bulguları gösteren bireylerin (636 ve 313 nolu hayvanlar) kan örneklerine uygulanan RT-PCR da viral nükleik asit saptandı. Söz konusu 636 ve 313 no lu embriyolarda oluşan patolojik değişikliklerin virolojik çalışma amacıyla desteklenmesi için uygulanan RT-PCR da ise viral nükleik asit tespit edilemedi. 14

15 V- SONUÇ VE ÖNERİLER Mavidil, sokucu sinekler ile nakledilen, evcil ve bazı yabani ruminantların konjesyon, ödem ve hemoraji ile karakterize, abort ve konjenital malformasyonlar nedeni ile önemli ekonomik kayıplara neden olan bir enfeksiyondur. Gerek coğrafi ve gerekse iklim özellikleri sebebiyle Mavidil enfeksiyonunun yüksek seroprevalans ile seyretmesi, sözkonusu enfeksiyonun sokucu sineklerle uzak mesafelere taşınabilmesi sebebiyle körfezden esen rüzgarlarla komşu ülkelerden farklı serotiplerin girme olasılığının bulunması ve bu bölgelerde mavidil enfeksiyonuna sebep olan serotip veya serotipler hakkında verilerin yetersizliği bu bölgede çalışma ihtiyacını hissettirmiştir. Bu sebeple projenin çalışma alanı olarak kuzeydoğu ve güneydoğu Anadolu bölgesi seçilmiştir. Özellikle Güneydoğu Anadolu bölgesinin Atatürk barajı ile sulu tarım olanağına kavuşması bölge ekolojik dengesinin eskiye oranla oldukça değişmesine neden olmuştur. Bu değişiklik içinde en çarpıcı etkiye sahip olanların başında değişik patojenlere vektörlük yapabilme yeteneğinde olan sokucu sinek populasyonlarındaki zenginlik ve/veya çeşitlilik gelmektedir. Benzer durum Kuzeydoğu Anadolu bölgesi için de kısmen benzerlik göstermektedir. Diğer taraftan mavidil gibi önemli ekonomik kayıplara neden olabilen viral enfeksiyonlar için bu bölgelerdeki sınır komşularımızda ciddi bir belirsizlik hakimdir. Bu gereksinimlerden yola çıkarak Kuzeydoğu ve Güneydoğu Anadolu bölgesinde 2 şer Tarım İşletmesi hedef olarak belirlendi. Her iki bölgeden örneklenen ikişer işletmeden seroprevalansın daha düşük olduğu işletme o bölgedeki nöbetçi sürülerin oluşturulacağı işletmeyi belirleyecekti. Bu amaçla Kuzeydoğu Anadolu Bölgesinde Kazımkarabekir (Iğdır) ve Alparslan (Muş) Tarım İşletmelerinde tesadüfi örnekleme yapılmak suretiyle sürü prevalansını belirlemeye yönelik ön çalışma yapıldı. Bu çalışma sonucunda Kazımkarabekir Tarım İşletmesinde mavidil enfeksiyonunun seroprevalansı % 1,21, Alparslan Tarım İşletmesinde mavidil enfeksiyonunun seroprevalansı % 12,3 olarak tespit edildi ve çalışmanın aylık rutin örneklemelerinin Kazımkarabekir Tarım İşletmesinde oluşturulacak nöbetçi sürülerde yapılmasına karar verildi. Güneydoğu Anadolu bölgesinde ise Sultansuyu (Malatya) ve Ceylanpınar (Ş.Urfa) tarım işletmeleri hedef işletmeler olarak düşünüldü ve her iki işletmede yapılan tesadüfi örneklemelerde Sultansuyu Tarım İşletmesinde mavidil enfeksiyonu seroprevalansı % 0,48 olarak belirlenirken bu oran Ceylanpınar Tarım İşletmesinde % 35,18 olarak tespit edildi. Nöbetçi sürülerin kendi bölgesi içinde seroprevalansı daha düşük olan işletmede oluşturulması planlanmasına karşın Ceylanpınar 15

16 Tarım İşletmesinde hayvan populasyonunun çok daha fazla olması ve söz konusu işletmenin mavidil enfeksiyonundan çok daha fazla muzdarip olması güneydoğu Anadolu da nöbetçi sürünün Ceylanpınar Tarım İşletmesinde oluşturulmasına sebep oldu. Yapılan ön çalışma ve taramalar sonucunda gerek Kuzeydoğu ve gerekse Güneydoğu Anadoluda söz konusu enfeksiyonun varlığı serolojik olarak çeşitli oranlarda bulunmaktaydı. Çalışmanın ikinci ayağını Kuzeydoğu Anadolu Bölgesinde Kazımkarabekir ve Güneydoğu Anadolu bölgesinde Ceylanpınar Tarım İşletmesinde birer nöbetçi sürünün (seronegatif-duyarlı) belirlenmesi oluşturuyordu. Genel tarama ile seronegatif olduğu tespit edilen ve yaşları 6-18 ay arasında değişen, Kazımkarabekir Tarım İşletmesinde 114, Ceylanpınar Tarım İşletmesinde aynı yaş grubunda 101 seronegatif-duyarlı hayvan tespit edilerek işaretlendi. Her iki işletmedeki nöbetçi sürülerin örneklemelerine aralık 2006 yılında başlandı. Örneklemelerin başlaması ile birlikte saha çalışmasının zorluğu ve beklenmedik gelişmeler ile karşılaşıldı. Bunlardan biri ve en önemlisi işletme personelinin uygun olduğu dönemlerde örneklemelere gidilmesiydi ki bu durum örneklemeler arasında eşit sürelerin olmasına en büyük engeldi. Diğer beklenmedik durum ise Ceylanpınar Tarım İşletmesinde nöbetçi sürüyü oluşturan 101 bireyden 35 adedinin işletme yönetimi tasarrufu sonucu kesilmesi veya satılması sebebiyle sürüden çıkartılmış olmasıydı. Kazımkarabekir Tarım İşletmesindeki nöbetçi sürüyü oluşturan bireylerden 5 adedi kesilmişti ancak bu rakam göz ardı edilebilecek bir orandaydı. Ceylanpınar Tarım İşletmesindeki bu durumla haziran 2007 örneklemesine gidildiğinde karşı karşıya kalındı. Bunun üzerine temmuz 2007 örneklemesinden itibaren nöbetçi sürüye, sürüden çıkan bireyler yerine 70 adet birey daha katıldı ki bu 70 birey, kasım 2006 tarihindeki genel taramada seronegatif olarak tespit edilen ve örnekleme tarihi itibarıyla 6-18 ay arasındaki bireylerdi. Saha çalışmasının bir diğer zor yanı nöbetçi sürüyü oluşturan seronegatif ve genç bireylerin işletme içinde farklı sürüler içinde yer almasıydı. Bu durum bazı örneklemelerde nöbetçi sürüyü oluşturan bazı bireylerin bulunamamasına neden oldu. Yine özellikle Ceylanpınar Tarım İşletmesi arazisinin çok büyük olması ve hayvanların meraya çıkması örnekleme anında bazı bireylere ulaşılmasını olanaksız kıldı. Tüm bu zorluklara rağmen proje kapsamı dahilinde her iki işletmeden de Aralık 2006-Ocak 2008 döneminde 11 kez örnekleme yapıldı. Örnekleme zamanları ve her örneklemede nöbetçi sürüyü oluşturan bireylerin kan serumlarına yapılan competitive ELISA testi sonuçları Tablo 2 ve Tablo 3 de sunuldu. Kazımkarabekir Tarım İşletmesinde nöbetçi sürüyü oluşturan hayvanların hiçbirisinde, hiçbir örnekleme döneminde serokonversiyon görülmedi. Seronegatif olarak örnekleme programına alınan bireylerin hepsi (örneklenebilenler) yine seronegatif olarak 16

17 programı tamamladılar. Ancak Ceylanpınar tarım işletmesi nöbetçi sürüsünü oluşturan bireylerde farklı zamanlarda serokonversiyon gözlendi (Tablo 3). Aralık 2006 da aylık-rutin örneklemeye başlandı ve ilk serokonversiyon vakaları tespit edildi. Örnekleme tarihlerine bakıldığında (Tablo 3) Şubat ayından itibaren çeşitli sayılarda bireyler kan serumlarında mavidil antikoru taşımaya başladılar ve oluşan antikorların kan serumlarında kaldığı süre çeşitli bireylerde farklılıklar gösterdi. Kan serumunda mavidil antikorlarının varlığını tespit etmek amacıyla kompetitive ELISA testi kullanıldı ve bu test mavidil virusunun 24 serotipine karşı oluşan spesifik nötralizan antikorların hepsini tanımaktaydı. Bu sayede kan serumunda herhangi bir mavidil serotipine karşı oluşan spesifik nötralizan antikor varlığı araştırmada kullanılan kompetitive ELISA testi ile tespit edilebildi. Seronegatif-duyarlı bireylerin kan serumlarında antikor varlığının şubat ayında tespit edilmeye başlanması, özellikle küresel ısınmanın yol açtığı iklim değişiklikleriyle birlikte sivrisinek populasyonlarının da yaşam siklusunda (özellikle tropik ve subtropik bölgelerde) değişikliklere neden olduğu şeklinde yorumlandı. Sığırların mavidil enfeksiyonunda rezervuar hayvan olarak kabul edilmesinin yanında yaşam siklusuna devam eden sivrisineklerin enfeksiyonun esas konakçısı olan koyunlar için de büyük tehdit oluşturduğu ve bu tehditin uzun süre ortadan kalkmadığı yorumuna neden olmaktadır. Serokonversiyon gösteren her bireyin o dönem için alınan EDTA lı kan örneğini antijen capture ELISA testi ne tabi tutuldu. Sığırların kanlarında virusun enfektif olarak 100 güne kadar kalabildiği bilgisi doğrultusunda antijen tespit etmek amacıyla yapılan antijen capture ELISA testlerinin hiç birinde mavidil antijenine rastlanmadı. Serokonversiyon gösteren hiçbir bireyin kan EDTA lı kan örneğinde antijen capture ELISA testi ile antijen tespit edilememesi enfektif virusun kanda yakalanamadığı, bu süreç içinde spesifik nötralizan antikorların oluştuğu ihtimalini düşündürürken diğer düşündürdüğü konu testin duyarlılığı yönündedir. Söz konusu antijen capture ELISA testinin Tarım Bakanlığa bağlı bazı teşhis laboratuvarlarında da kullanılıyor olması testin duyarlılığına yönelik soru işaretlerini bir noktada ortadan kaldırdığı düşünülmektedir. Antijen capture ELISA testinde pozitif olarak tespit edilen kan örnekleri embriyolu tavuk yumurtasına inokule edilerek virus izolasyonu planlanmış olmasına karşın bu testte virus tespit edilememesine karşın serokonversiyon gösteren bireylerin EDTA lı kan örnekleri embriyolu tavuk yumurtalarına inokule edilerek virus izolasyonu denemesine tabi tutuldu. Tüm inokulasyonlar içinde 636 ve 313 kulak no lu bireylerin (Tablo 4) EDTA lı kan örneklerinin inokule edildiği embriyolarda hiperemi ve büyüme geriliği gibi bazı patolojik belirtiler görüldü (Resim 1a-b-c). Ancak söz konusu embriyo ektratlarının Vero hücre kültürüne yapılan kör pasajları sonrasında hücre kültüründe virus izole edilemedi. Ancak bir 17

18 yıl boyunca yapılan 11 örnekleme sonunda toplam 32 hayvanın kan tablosunda mavidil antikorlarının varlığı yönünde değişiklikler saptandı (Tablo 4). Projenin asıl amacı bölgede sirküle olan mavidil serotiplerinin belirlenmesi ve ilgili kurumlara bilgi verilmek suretiyle erken önlem almaya ve mevcut serotipe yönelik aşı hazırlık çalışmalarına bilimsel verilerle hizmet etmekti. Bu amaçla toplam 11 örneklemede kan serumunda mavidil antikoru tespit edilen 32 bireyin çeşitli örneklemelerdeki numuneleri mavidil 4, mavidil 9 ve mavidil 16 için çapraz nötralizasyon testine tabi tutuldu (Tablo 5). Söz konusu tablo da bireyler kan serumunda mavidil antikorunu en uzun süre bulundurandan en az bulundurana doğru sıralandı. Toplam 32 bireyin 28 adedinde mavidil 4,9 ve 16 serotiplerine, 3 adedinin mavidil 9 ve 16 serotiplerini ve 1 adedinin de sadece mavidil 9 serotip spesifik nötralizan antikor taşıdığı tespit edildi (Tablo 6). Bu veriler karşısında tablo Tablo 5 ve Tablo 6 da gösterilen ve örnekleme dönemlerinde kan serumlarında serokonversiyon tespit edilen bazı bireylerin kan serumlarına (bazı örneklemelere) antikor titrelerini belirlemek amacıyla BT-4, BT-9 ve BT- 16 ya karşı SN 50 testi yapıldı. Elde edilen sonuçlar (Tablo 7) BT-9 a karşı oluşan antikor titrelerinin çok daha yüksek olduğunu ve bu antikorların BT-4 ve BT-16 ile çapraz reaksiyon verdiği sonucunu doğurdu. Yine bu bulgular bölgede sirküle olan dominant BT serotipinin 9 olduğuna dair önemli veri olarak değerlendirldi. Özellikle sadece mavidil serotip 4 e karşı aşılamanın yapıldığı ülkemizde söz konusu enfeksiyonun ekonomik kaybının en aza indirgenebilmesi için, bölgesel olarak belirlenen dominant mavidil virusuna spesifik aşıların yapılması, ikili (iki serotipi içeren) hatta üçlü (üç serotipi içeren) aşıların hazırlanması ve bu bölgede uygulanması enfeksiyondan korunmada en etkili yol olarak görülmektedir. Proje başlangıcı olan kasım 2006 tarihi itibarıyla Kazımkarabekir ve Ceylanpınar Tarım İşletmelerinde sürü genelinde mavidil enfeksiyonunun seroprevalansı sırasıyla % 1,21 ve % 38,18 olarak tespit edilmişti. Projenin sonlandığı mart 2008 tarihi itibarıyla her iki işletmede enfeksiyonun sürü genelinde seroprevalansına bakıldığında (tablo 7, grafik 2); Kazımkarabekir tarım işletmesinde seroprevalans geçen süreç içinde % 1,21 den % 2,76 ya çıkmış, Ceylanpınar tarım işletmesinde ise %38,18 den % 11,5 a düşmüştür. Bu veriler geçen süreç içinde küresel ısınma ile birlikte özellikle tropik ve subtropik bölgelerin daha kuraklaşmaya başlamasıyla sivrisinek populasyonu için yaşam koşulları açısından daha olumsuz bir gelişme gösterdiği ve bu sebeple seroprevalansın düşük çıktığı, buna karşın kuzeydoğu Anadolu da seroprevalansın yükseldiği, bunda da iklim değişikliklerinin temel rol oynadığı görüşü ağır basmaktadır. 18

19 Çalışma boyunca elde edilen veriler, projenin amacına uygun verilerden ibarettir ve bölgede sirküle olan mavidil serotipleri hakkında bilgi vermektedir. Araştırma sonucunda, bölgede enfeksiyona sebep olan mavidil virus serotiplerinin tanımlanmasını takiben etkin ve koruyucu bir aşılamanın yapılabilmesi ve enfeksiyondan korunmak için enfeksiyon sebep olan virusun serotipine spesifik aşı üretiminin gerçekleştirilmesi amacıyla ilgili kurumların bilgilendirilecek olması bu projenin en önemli amacına ulaştığını, aynı zamanda ülke hayvancılığına ve ekonomisine önemli bir katlıda bulunacağını düşündürmektedir. 19

20 VI. Kaynaklar Burgu, İ., Urman, H. K., Akça, Y., Yonguç, A. Mellor, P. S., Hamblıng, C.(1992): Serologic survey and vector surveillance for bluetongue in southern Turkey. In: Bluetongue, African Horse Sickness and Related Orbivirusus. Ed.: T. E. Walton, B. I. Osburn, Crs. Press Inc., Boca Raton, Fla. p.: Ertürk, A. (1994). Çeşitli serumlarda (koyun, keçi, sığır) mavidil antikorlarının agar-jel presipitasyon testi ile araştırılması. Etlik Vet. Mikrobiol. Derg., 7(5); Gibbs, E.P. and Greiner, E.C.(1994):The epidemiology of bluetongue. Comparative Immunology, Microbiology and Infectious Disease, 17: Goldsmit,L., Barzilai,E., Tarmor, A. (1975): The comparative sensitivity of sheep and chicken embrios to bluetongue virus and observations on viremia in experimentally infected sheep. Aust Vet J., 51(4): Gorman,B.M. (1990): The bluetongue viruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 162:1-19. Hassan,A. (1992): Status of Bluetongue in the Middle East and asia. In: bluetongue, African Horse sickness and related orbiviruses.ed.: T.E. Walton, B.I. Osburn, Crs. Press. Inc., Fla., p.: Hawkes, R.A. (1996): The Global distrubution of bluetongue. Proceeding of the first Southeast Asia and Pasific Regional Bluetongue Symposium. Kunming, August 22-24, P.: Hazıroğlu, R. (1987). Buzağılarda hydranencephalie olgularında patolojik-anotomik bulgular. Doktora Tezi. A. Ü. Sağl. Bilm. Enst. Ankara. Hourrigan, J.L., Klingsporn, A.J. (1975): Epizootiology of Bluetongue: The situation in The United State of America. Aust Vet J., 51(4): Luedke A.J., Jochim, M.M., Jones;r:h. (1977): Bluetongue in cattle: effects of clucoides variipennis- transmitted bluetongue virus on pregnant heifers and their calves. Am J Vet Res., 38(11): Mellor, P.S., Jennings, D.M., Hambling, C., Burgu, I., Urman, H.K, Akça, Y., Hazıroğlu, R., Alkan, F., Yonguç, A.D., Özkul,A., Eren, H. (1995): Control of Akabane disease and surveillance of bluetongue and ephemeral fever. United Nations Development Programme, Food and Agriculture Organization of the United Nations, Rome. Mellor, P.S., Wittmann, E.J. (2002): Bluetongue virus in the mediterranean basin Vet. J. 164(1): Mertens,P.P.C. (1999): Orbiviruses and Coltiviruses. In: Encyclopedia of Virology. Ed: A. Granoff, R.G., Webster, Vol 2, harcourt sience and Technology Company, Academic Press, San Diego Calif. USA. P.:

21 Murphy,F.A., Gibbs,J.E.P., Horzineck, C.M., Studdent, M.J. (1999): Veterinary Virology, 3 th Edition, Raven Press Ltd. New York, USA. Özgünlük, İ. (2003) : Güneydoğu Anadolu bölgesi (GAP) kapsamındaki bölgede sığırlarda Mavidil, Akabane ve İberaki enfeksiyonlarının seroepidemiyolojisi. Ank Üniv Sağl Bil Enstitüsü, Doktora tezi. Roy, P. (2002): Orbivirus. Ed: C.D. Tidona, G.Darai. The Springer İndex of viruses. Springer- Verlag. Berlin, Germany. P.: Sellers, R.F. (1975): Bluetongue in Cyprus. Aust. Vet. J., 51(4): Urman, H. K., Milli, Ü., Mert, N., Berkin, S., Kahraman, M. M., Yüce, H., Avvuran, H. (1979): Türkiye de buzağılarda konjenital epizootik arthrogriphosis ve dranencephalie olayları. A. Ü. Vet. Fak. Derg., 26: Yıldırım, Y. (2003): Kuzeydoğu Anadolu bölgesindeki sığırlarda Mavidil, IBR, PI-3, EBL ve BVD enfeksiyonlarının seroprevalansı. Ank Üniv Sağl Bil Enstitüsü, Doktora tezi. Yonguç, A. D., Taylor, W. P., Csonton, L., Worrall, E. (1982). Bluetongue in western Turkey. Veterinery Record, 111: VII. Ekler Mali Bilanço ve Açıklamaları Söz konusu projenin ,00 YTL olan bütçesi, proje teklifinde öngörüldüğü şekilde ihtiyaç duyulan sarf malzemelerinin alımına uygun olarak değerlendirilmiş, ilişikte birer örneği sunulan, ihtiyaç formlarında belirtilen sarf malzemeleri ve ihale sonunda alıma esas teşkil eden fiyatlar ekte sunulmuştur. 21