İÇİNDEKİLER. ÖNSÖZ.. ÇİZELGELER DİZİNİ

Transkript

1 İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER. ÖZET. ABSTRACT.. ÖNSÖZ.. ÇİZELGELER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ.. SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... SAYFA NO 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Yurt İçinde Yapılan Çalışmalar Yurt Dışında Yapılan Çalışmalar 5 3. MATERYAL VE METOT Materyal Metot Ön çalışmalar ve genel prosedür Fungus kültürleri ve zigospor üretimi Zigospor süspansiyonlarının hazırlanması Çimlendirme ve veri kayıtları Sıcaklığın zigospor çimlenmesine etkisinin belirlenmesi Agar miktarının ve ışığın çimlenmeye etkisinin belirlenmesi Spor yaşı ve vernalizasyonun çimlenmeye etkisinin belirlenmesi Pre-inkübasyon kurutma işleminin çimlenmeye etkisinin belirlenmesi Çeşitli kimyasalların çimlenme oranına etkisinin belirlenmes BULGULAR VE TARTIŞMA Sıcaklığın zigospor çimlenmesine etkisi Agar miktarının ve ışığın çimlenmeye etkisi Spor yaşı ve vernalizasyonun çimlenmeye etkisi Pre-inkübasyon kurutma işleminin çimlenmeye etkisi Çeşitli kimyasalların zigospor çimlenmesine etkisi SONUÇ VE ÖNERİLER. 20 KAYNAKLAR.. 22 ÖZGEÇMİŞ.. 29 I II III IV V VI VII I

2 T.C. KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİTKİ KORUMA ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET Conidiobolus osmodes Drechsler (ARCYLİSTACEAE: ENTOMOPHTHORALES) ZİGOSPORLARININ ÇİMLENMESİNE PRE İNKÜBASYON VE İNKÜBASYON ŞARTLARININ ETKİSİ DANIŞMAN : Yrd.Doç.Dr. Mehmet Kubilay ER Yıl : 2007 Sayfa : 29 Jüri :Yrd.Doç.Dr. Mehmet Kubilay ER Doç.Dr. Hasan TUNAZ Doç.Dr. Ali Arda IŞIKBER Entomopatojen funguslar içerisinde Entomophthorales takımına ait türler doğal böcek populasyonları üzerinde bir baskı unsuru olarak sıklıkla etkinlik göstermektedir. Mikrobiyal mücadele uygulamalarındaki kullanımlarını sınırlayan faktörlerden birisi pratikte kullanılabilecek olumsuz şartlara dayanıklı spor formu olan dinlenme sporlarının çimlenmeleri için gerekli koşulların tam olarak bilinmemesidir. Bu çalışmada, bu fungus grubu içerisinde yer alan Conidiobolus osmodes Drechsler in zigosporlarının çimlenmesine bazı inkübasyon ve preinkübasyon şartlarının etkileri kontrollü şartlarda araştırılmıştır. Tüm denemeler tesadüf parselleri deneme düzenine uygun ve üç tekerrürlü olarak yürütülmüş olup çimlendirme için saf su agar ortamı kullanılmıştır. Çalışma sonuçlarına göre; (1) ortam sıcaklığının çimlenme üzerinde önemli bir faktör olduğu ve test edilen sıcaklıklar içerisinde 16 o C nin günde % 3.14 spor çimlenme hızı ile en uygun olduğu, (2) çimlenme ortamında bulunan agar miktarının çimlenmeyi etkilediği ve 46 günde %99.00 çimlenme ile % 1.5 agar miktarının uygun olduğu, (3) sürekli ışıklanma ortamında zigospor çimlenme oranının %11.33 oranına düştüğü, (4) çimlenme için vernalizasyona ihtiyaç bulunmadığı, vernalizasyon süresinin uzaması halinde (5 hafta) sporların deaktive olduğu, (5) yaşlı zigosporların ve inkübasyon öncesi kurutulan zigosporların çimlenme hızlarının daha yüksek ancak çimlenme sürelerinin daha uzun olduğu, (6) sitrik asit, oxalik asit, etil alkol ve Tween 80 in düşük miktarlarının bile çimlenme üzerinde olumsuz etki yarattığı bulunmuştur. Bu sonuçların Entomophthorales takımı ve en azından Conidiobolus cinsi içerisinde ne kadar geçerli olduğuna yönelik çalışmalara gereksinim bulunmaktadır. Anahtar Kelimeler: Etomopatojen fungus, mikrobiyal mücadele, zigospor çimlenmesi, çevre şartları II

3 UNIVERSITY OF KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF PLANT PROTECTION MSc THESIS ABSTRACT EFFECTS OF CERTAIN PRE-INCUBATION AND INCUBATION CONDITIONS ON THE ZYGOSPORE GERMINATION of Conidiobolus osmodes Drechsler (ARCYLİSTACEAE: ENTOMOPHTHORALES) Supervisor : Asist.Prof.Dr. Mehmet Kubilay ER Year : 2007 Pages : 29 Jury : Asist.Prof.Dr. Mehmet Kubilay ER Assos.Prof.Dr. Hasan TUNAZ Assos.Prof.Dr. Ali Arda IŞIKBER Amongst entomopathogenic fungi, entomophthoralean species are commonly effective on natural insect populations as a suppressing factor. One of limiting factors on their use in microbial control practices is insufficient knowledge of the conditions required for germination of their resting spores, the spores resistant to unfavorable conditions. In this study, effects of certain incubation and pre-incubation conditions on germination of Conidiobolus osmodes Drechsler zygospores were investigated in controlled conditions. All experiments were conducted according to complete randomized experimental design with three replications. Distilled water agar was used for germinating the spores. According to the results it is found that; (1) ambient temperature is an important factor on germination and amongst the tested temperatures, 16 o C is the most suitable with the germination rate of 3.14 % per day, (2) the amount of agar in the medium used for germination affects the germination and the best medium including 1.5 % agar supports % germination within 46 days, (3) zygospore germination is reduced to % under continues light conditions, (4) vernalisation is not required for germination and when it is prolonged (5 weeks) the spores are deactivated, (5) germination rate of older zygospores and those dried prior to incubation is higher but time required for their germination is longer, (6) even low amount of citric acid, oxalic acid, ethyl alcohol and Tween 80 has negative effect on germination. Further studies are required to understand the extend of validity of these results amongst species in Entomophthorales, especially those in the genus Conidiobolus. Key Words: Entomopathogenic fungi, microbial control, zygospor germination, environmental conditions III

4 ÖNSÖZ Entomophthorales takımına bağlı entomopatojen fungusların dinlenme sporlarının uygulamada kullanılabilmesi için öncelikle bu sporların çimlenmesine çevre şartlarının etkileri ortaya konulmalıdır. Bu çalışma ile Entomophthorales takımına bağlı olan Conidiobolus osmodes zigosporlarının çimlenmesine bazı pre-inkübasyon ve inkübasyon şartlarının etkileri araştırılmıştır. Yüksek lisans programı süresince yardımlarını esirgemeyen, çalışmalarım esnasında her türlü desteğini aldığım, her türlü özveriyi bana gösteren değerli hocam Yrd.Doç.Dr. Mehmet Kubilay ER e ve çalışmalarımda kullandığım kimyasalların temininde yardımcı olan hocam Yrd.Doç.Dr. Nihat TURSUN ve tezimi değerlendiren jüri üyeleri olan sayın hocalarım Doç.Dr. Hasan TUNAZ a ve Doç.Dr. Ali Arda IŞIKBER e, fungus kültürlerini temin eden Dr. R.A. HUMBER e teşekkürlerimi sunuyorum. Laboratuar çalışmalarında bana yardımcı olan değerli arkadaşlarım Zir.Yük.Müh. Cemil BENGİN, Zir.Yük.Müh. Mehvail SEYİTHANOĞLU na teşekkür ediyorum. Son olarak, yüksek lisans programı süresince ve hayatta beni her konuda destekleyen aileme ve her zaman sevgi ve desteğiyle yanımda olan sevgili eşim Cemile KARAN ADİN e gönülden teşekkürlerimi sunuyorum. Eylül 2007 KAHRAMANMARAŞ IV

5 ÇİZELGELER DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA NO Çizelge 1.1. Ruhsatlı olan fungus içerikli bazı mikrobiyal insektisitler.. 1 Çizelge 1.2. Doğal olarak böcek populasyonlarında epizootik oluşturan bazı Entomophthorales türleri. 2 Çizelge 4.1. Farklı yaşlardaki kültürlerden alınan ve soğuklamaya tabi tutulan Conidiobolus osmodes zigosporlarının çimlenmelerinin logit analiz sonuçları Çizelge 4.2. Farklı tuzlarla ve sürelerde inkübasyon öncesi kurutma işlemine tabi tutulan Conidiobolus osmodes zigosporlarının 45 günlük inkübasyon sonucunda ulaştıkları çimlenme oranları.. 17 Çizelge 4.3. Farklı tuzlarla ve sürelerde inkübasyon öncesi kurutma işlemine tabi tutulan Conidiobolus osmodes zigosporlarının çimlenmelerinin logit analiz sonuçları 18 Çizelge 4.4. Farklı kimyasalları içeren saf su agar ortamında Conidiobolus osmodes zigosporlarının 46 günlük inkübasyon sonucunda ulaştıkları çimlenme oranları. 19 V

6 ŞEKİLLER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA NO Şekil 3.1. Conidiobolus osmodes dinlenme sporları. 8 Şekil 4.1. Conidiobolus osmodes zigosporlarının farklı sıcaklıklardaki çimlenme hızları.. 12 Şekil 4.2. Conidiobolus osmodes zigosporlarının 16 o C sıcaklıkta zamana bağlı çimlenme eğrisi 13 Şekil 4.3. Farklı agar miktarlarında ve ışıkta Conidiobolus osmodes zigosporlarının zamana bağlı çimlenme eğrileri Şekil 4.4. Farklı yaşlardaki kültürlerden alınan ve soğuklamaya tabi tutulan Conidiobolus osmodes zigosporlarının zamana bağlı çimlenme eğrileri 15 Şekil 4.5. Farklı tuzlarla ve sürelerde inkübasyon öncesi kurutma işlemine tabi tutulan Conidiobolus osmodes zigosporlarının zamana bağlı çimlenme eğrileri VI

7 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ ml : Mililitre µl : Mikrolitre lt : Litre gr : Gram PDA : Patates Dextroz Agar SDA : Sobouroad Dextroz Agar SDAY : %1 oranında yeast extract ilave edilmiş sobouroad dextroz agar rpm : Dakikadaki rotasyon sn : Saniye mm : Milimetre SA : Su agar ppm : Milyondaki miktar VII

8 GİRİŞ 1. GİRİŞ Tarım alanlarında sorun olan zararlılara, hastalık etmenlerine ve yabancı otlara karşı pestisit kulanımı, doğal dengenin bozulmasına ve çevre kirliliğine neden olmaktadır. Ayrıca doğrudan ve dolaylı olarak insan sağlığını da olumsuz yönde etkilemektedir (Eken ve Demirci, 1997). Toplum tarafından daha az bilinen fakat en az çevre kirliliği kadar önemli olan bir başka sorun ise pek çok zararlı populasyonunun kimyasal ilaçlardan daha az etkilenmesi yani dayanıklılık probleminin ortaya çıkmasıdır. Tüm bunlar dikkate alındığında alternatif savaşım metotlarının ve entegre mücadele yönteminin önemi ortaya çıkmaktadır (Erkılıç ve Uygun, 1993). Özellikle kimyasal insektisitlerin olumsuz etkileri ortaya çıkıp kullanımlarının azaltılmasının gerekliliği dünya çapında kabul gördükten sonra bu konuda çeşitli ülkelerin politikalar geliştirmeleriyle birlikte kimyasal mücadeleye alternatif olarak ön plana çıkan biyolojik ve entegre mücadele yöntemleri (Bulut ve Tamer, 1996) içerisinde mikrobiyal mücadele konusunda araştırmalar da artmaya başlamıştır (Milner, 2000). Zararlı böcekler üzerinde yaşayan ve onları öldüren funguslar, bakteriler, virüsler, riketsia ve nematodlar gibi mikroorganizmaların biyolojik savaşım çalışmalarında kullanılmasına mikrobiyal mücadele adı verilmektedir (Öncüer, 1995). Entomopatojenler, parazit ve predatör böceklerden sonra biyolojik mücadelede en yaygın kullanılan ve gelecekte ümitvar olan bir grubu oluşturmaktadırlar (Daecon, 1983). Biyolojik mücadelede kullanılan etmenler içerisinde fungusların türce fazla olmaları ve dolayısıyla geniş bir konukçu spektrumuna sahip olmaları yanında, bir çok fungus türünün suni besi ortamlarında kolaylıkla yetiştirilebilmesi ve ticari üretim için uygun olmaları gibi nedenler, biyolojik mücadelede kullanımları açısından bu etmen grubunun önemini artırmaktadır. Nitekim, dünyada bazı fungus türleri çeşitli zararlıların (Çizelge 1.1.), hastalık etmenlerinin ve yabancı otların biyolojik mücadelesinde başarılı bir şekilde kullanılmaktadır (Eken ve Demirci, 1997; Kumar, 1992; Prior, 1989; Tjamos, 1995). Çizelge 1.1. Ruhsatlı olan fungus içerikli bazı mikrobiyal insektisitler (Milner (2000) den değiştirilerek alınmıştır.) Fungusun Türü Etkili Olduğu Konukçu Ticari Adı Beauveria bassiana Beyaz sinek, afit, thrips Mycotrol B. bassiana Emici böcekler Naturalis Metarhizium anisopliae Termitler BioBlast Lecanicillium lecanii Afitler Vertalec L. lecanii Beyaz sinek Mycota1 Paecilomyces fumosoroseus Beyaz sinek, trips PFR-97 B. brongniartii Manas larvaları Engerlingpilz M. anisopliae Çekirgeler Green Muscle B. bassiana Manas larvaları Betel 1

9 GİRİŞ Böcekleri enfekte edebilen 500 ün üzerinde fungus türünün bulunduğu bildirilmektedir (Roberts, 1981). Entomopatojen funguslar, dünyanın çeşitli bölgelerinde tesbit edilmiş olup doğal böcek populasyonları üzerinde etkili bir baskı unsuru oluşturmaktadır (Tanada ve Kaya, 1993; McCoy ve ark., 1988). Entomopatojen funguslar zaman zaman özellikle konukçu populasyon yoğunluğu arttığında epizootiklere neden olarak populasyon düzeyini düşük seviyelere çekebilmektedirler (Carruthers ve Soper, 1987). Entomophthorales türleri için örnekler Çizelge 1.2 de verilmiştir. Çizelge 1.2. Doğal olarak böcek populasyonlarında epizootik oluşturan bazı Entomophthorales türleri (Pell ve ark. (2001) dan değiştirilerek alınmıştır). Konukçu Böcek Fungus Kaynaklar Myzus persicae Erynia neoaphidis McLeod ve ark., 1998 Aphis fabae E. neoaphidis Wilding ve Perry, 1980 Microlophium carnosum E. neoaphidis Hemmati, 1999 Metopolophium dirhodum E. neoaphidi Hatting ve ark., 1999;Yeo,2000 Diuraphis noxia E. neoaphidis Wraight ve Roberts, 1987 Sitobion avenae E. Neoaphidis Schmitz ve ark., 1993; Nielsen ve ark., 2001 Aphis citricola N. fresenii Kuntz, 1925 A. fabae N. fresenii Dedryver, 1978 Therioaphis trifolii Zoophthora radicans Kneneth ve Olmert, 1975 Rhopalosiphon padi Entomophthora planchoniana Nielsen ve ark., 2000 Elatobium abletinum N. fresenii Nielsen ve ark., 2000 Schizolachnus piniradiatae Erynia canadensis Soper ve MacLeod, 1981 Planococcus citri Neozygites fumosa Speare, 1922 Amrasca biguttula Batkoa amrascae Villacarlos ve Keller, 1997 Empoasca kraemeri Z. radicans Galaini-Wraight ve ark., 1991 E. fabae Z. radicans McGuire ve ark., 1987 Massospora levispora Okanagana rimosa Soper ve ark., 1976 Trialeurodes abutilonea Orthomyces aleyrodis Steinkraus ve ark., 1998 Frankliniella occidentalis Neozygites parvispora Montserrat ve ark., 1998 Euproctis chryssorhoea Entomophaga aulicae Speare ve Colley, 1912 Lymantria dispar E. maimaiga Koyama, 1954; Hajek, 1997 Orygyia vetusta E. aulicae Hajek ve ark., 1996 Pseudaletia unipuncta Furia virescens Steinkraus ve ark.,1993a Malacosoma disttria Furia crustosa MacLeod ve Tyrrell, 1979 Lambdina fiscellaria E. aulicae Otvos ve ark., 1973 Choristoneura fumiferana Z. radicans Vandenberg ve Soper, 1978 C. fumiferana E. aulicae Perry ve Regniere, 1986 Musca domestica Entomophthora muscae Mullens ve ark., 1987 E. schizophorae Steinkraus ve ark., 1993b Ophyra aenescens E. muscae Watson ve Peterson, 1993 Chamaepsila rosae E. muscae Eilenberg ve Philipsen, 1988 Delia antiqua E. muscae Carruthers ve ark., 1985 D. coarctata E. muscae Wilding ve Lauckner, 1974 D. floralis E. muscae Klingen ve ark., 2000 D. radicum E. muscae Eilenberg ve Michelsen, 1999 Camnula pullucida Entomophaga grylli Carruthers ve ark., 1997 Dissosteria Carolina E. grylli Carruthers ve ark., 1997 Hypera postica Zoophthora phtyonomi Harcourt ve ark., 1974 Fungusların haricindeki virüs, bakteri, protozoa, vb. patojenler konukçu böcek tarafından ağız yolu ile alındıktan sonra, bağırsak duvarında infeksiyon 2

10 GİRİŞ yapmaktadır (Roberts, 1981). Ancak entomopatojen funguslar konukçu böcekleri integümentten doğrudan penetrasyon yaparak hastalandırırlar. Bu nedenle diğer gruplardaki patojenlerin etkisiz olduğu sokucu-emici ağız yapısına sahip olan böcekler de dahil olmak üzere genel böcek gruplarının hepsinde konukçuları bulunmaktadır. Böcekler, hayat dönemlerinin tüm safhalarında (yumurta, larva, pupa ve ergin) funguslara hassas olabilirler. Çeşitli fungus gruplarında böceklere patojenik birçok tür bulunmaktadır. Yaygın olarak bulunan türler çoğunlukla Oomycota'dan Lagenidiales ve Saprolegniales, Chytridiomycota'dan Blastocladiales ve Chytridiales, Zygomycota'dan özellikle Entomophthorales, Basidiomycota'dan Septobasidiales, Ascomycota'dan özellikle Shaeriales ve Deuteromycota'dan Moniliales takımlarında yer almaktadır (Boucias ve Pendland, 1998). Entomopatojen fungusların konukçu spektrumu çok çeşitlilik göstermekle beraber geniş spektruma sahip fungus türleri genellikle izolat bazında çok daha dar bir spektruma sahiptirler. Beauveria bassiana (Balsamo) Vuillemin ve Metarhizium anisopliae (Metchnikoff) Sorokin 100'den fazla böcek türünü infekte ederken izolatları konukçuya spesifik özellik gösterir (McCoy ve ark., 1988). Böcek patojeni funguslar hastalandırdıkları konukçularında genellikle hifsel bir şekilde gelişimden çok mayalara benzer şekilde blastospor veya hifsel yapılar formunda çoğalarak böcek vücudunda kan sıvısı hareketiyle birlikte vücut boşluğunada yayılırlar. Konukçudaki hayati organları istila etmesi mümkün olmakla beraber genellikle fungusun çoğalması sonucunda dolaşım sisteminin fonksiyonunu yapamaz duruma gelmesine ve sonuçta böceğin ölümüne neden olmaktadırlar. Bazı entomopatojen funguslar (örn.: B. bassiane, M. anizopliae) ise hastalığın erken dönemlerinde salgıladıkları böceklere toksik maddelerle (örn.: beauvericin, cyclodepsipeptidler, destruxinler, desmethyldestruxin) konukçunun daha hızlı ölümüne de neden olmaktadırlar (Kugera ve Samsimkov, 1968; Suzuki ve ark., 1970). Toksin üreten funguslar, toksin üretmeyenlere oranla daha çabuk konukçuyu öldürebilmektedir (Roberts, 1981). Genellikle funguslar, bir haftada konukçuyu öldürür veya konukçunun beslenmesini durdururlar (Fuxa, 1987). Konukçunun ölümünü takiben fakültatif beslenme dönemine geçen bu funguslar tekrar hifsel gelişim gösterir ve daha sonra da böceğin integümentinden dışarı çıkarak sporulasyon yaparlar ve konukçu populasyonunda hastalığın yayılmasına olanak verirler. Bu genel hastalık gelişimi içerisinde bazı entomopatojen funguslarda farklılıklar da mevcuttur. Böcek canlı ve hareketli iken konukçu üzerinde sporulasyon yapan (Massospora Peck), konukçu vücudu içerisinde spor oluşturan (Ascosphaera Spiltoir & Olive), ve iki konukçuda hayat döngüsünü tamamlayan (Coelomomyces Keilin) entomopatojenik funguslar olduğu gibi tracheae yoluyla infeksiyonun gerçekleştiği durumlar (Hedlund ve Pass, 1968) da bulunmaktadır. Her ne kadar entomopatojen fungusların mikrobiyal insektisit olarak geliştirilmesi yönündeki çalışmalar ağırlık kazanmış ise de klasik biyolojik mücadele şeklinde kullanılmaları göz ardı edilmemelidir. Mesela her ne kadar kaza sonucu yerleşmiş olma ihtimali bulunsa da Entomophaga maimaiga Humber, Shimuzu ve Soper, Lymantria dispar (L.)'ın kontrolü amacıyla 1900'lü yılların başında 3

11 GİRİŞ Japonya'dan Kuzey Amerika'ya getirilmiş ve bugün zaralı popülasyununda bir baskı unsuru meydana getirmiştir (Lacey ve Goettel, 1995; Hajek ve ark., 1994). Zoophthora radicans (Brefeıd) Batko'ın bir israil izolatı Avustralya'ya getirilerek Thenoaphis maculata (Buckton)'nın mücadelesinde başarılı bir şekilde kullanılmıştır (Milner ve ark., 1982). Bir başka örnek ise Entomophaga grylli (Fresenius) Batko 'nin daha geniş konukçu spektrumuna sahip bir Avustralya patotipinin çekirge mücadelesi için Amerika'ya yerleştirilmesidir (Carruthers ve Onsager, 1993). Çizelge 1.1. 'deki entomopatojen fungus türlerine ek olarak klasik biyolojik mücadele veya mikrobiyal insektisit olarak geliştirilmekte veya geliştirilmesi düşünülen diğer bazı fungus türleri ise Aschersonia aleyrodis Webber, Hirsutella thompsonii Fisher, Lagenidium giganteum Couch, ve Nomuraea rileyi (Farlow) Samson dir (Lacey ve Goettel, 1995). Ülkemizde de çeşitli böcek türlerinde tesbit edilen Deuteromycota, Ascomycota ve Zygomycota'ya ait entomopatojen fungus türleri bulunmaktadır (Eken ve Demirci 1997). Entomopatojen funguslar içerisinde Zygomycetes sınıfı Entomophthorales takımının içerdiği yaklaşık 200 tür hayvanlara nadir de olsa bitkilere patojendirler. Bu takımın üyelerinin bazıları toprakta ve atık maddelerde saprofit olarak yaşarlar. Fungusun hifleri genellikle düzenli olmayan az sayıda bölmeye sahiptir. Hücre duvarları kalındır, kitin içerir, renksiz veya hafif kahverengidir. Entomophthorales takımındaki funguslar seksüel ve aseksüel olarak dinlenme sporu oluştururlar. Seksüel üremede, misel parçalarının veya hifsel yapıların kaynaşması ile kalın duvarlı dinlenme sporu (zigospor) oluştururlar. Aseksüel üremede ise hiflerin parçalanması ve bunların tomurcuklanması sonucunda dinlenme sporları (azigospor) meydana gelmektedir. Bu takımın üyeleri Hemiptere, Homoptera, Diptera, Lepidoptera, Coleoptera, Orthoptera ve Hymenoptera takımından böcekler olmak üzere geniş bir konukçu yelpazesine sahiptirler (Çizelge 1.2). Ancak en yoğun Diptera takımında ve yaprak bitlerinde epizootik olduğu tespit edilmiştir (Humber ve Ramoska, 1986). Entomophthorales takımına giren bazı türlerin yetiştirilmesinin zor olması, ekolojik isteklerinin farklı olması gibi pratiğe aktarılmasındaki bazı zorluklar bu fungusların kullanıma aktarılmasını kısıtlamaktadır. Entomophthorales takımına giren funguslar bol miktarda konidi oluşturmakta ancak konidilerin ömrü kısa olduğu için uygulamada kullanılamamaktadır. Zigosporların canlı kalma süresinin uzun ve saklama şartlarına dayanıklı olması bu sporların uygulamada kullanılmasını mümkün kılmakta ve mikrobiyal mücadelede umut vaat etmektedir. Dinlenme sporlarının oluşumları ve çimlenmeleri tam olarak çözülmüş bir olay değildir. Ancak bu sporların düşük oranlarda ve asenkronize bir şekilde çimlenme göstermeleri veya hiç çimlenmemeleri ise uygulama için büyük bir engel teşkil etmektedir (Kogan ve Hajek, 2000). Entomophthorales takımı türlerinin dinlenme sporlarının uygulamada kullanımlarının mümkün olabilmesi için öncelikle çeşitli çevre şartlarının etkilerinin belirlenmesi gerekmektedir. Bu çalışmada, invitro koşullarında kolaylıkla bol sayıda dinlenme sporu oluşturması nedeni ile entomophthorales takımı türlerinden C. osmodes ele alınmış ve bu fungusun oluşturduğu zigosporların çimlenmesine çeşitli inkübasyon ve pre-inkübasyon şartlarının etkileri tespit edilmiştir. 4

12 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. Yurt İçinde Yapılan Çalışmalar Entomophthorales takımına bağlı fungusların dinlenme sporlarının çimlenmesi ile ilgili yurt içinde yapılmış bir çalışmaya rastlanmamıştır Yurt Dışında Yapılan Çalışmalar Schweizer (1947), yapmış olduğu bir çalışmada Empusa muscae nın dinlenme sporları kitin parçalayan bakteriler ile muamele edildikten sonra çimlendirmeye tabi tutulmuştur. Dinlenme sporlarının hemen hemen % 100 e yakınının çimlendiği bulunmuştur. Soper ve ark. (1975), yapmış oldukları çalışmada dinlenme sporlarını farklı kimyasallarla (Etil alkol, citronellal, d-limonene, n-nonanal, n-nonane, n-nonanol, n- octylamine) muamele ederek, bu kimyasalların dinlenme sporlarının çimlenmeleri üzerindeki etkilerini araştırmışlardır. Sonuç olarak d-limonene ve n-nonanol ile etil alkolün dinlenme sporlarının çimlenme oranını önemli derecede arttırdığını buna karşın n- octylaminin spor çimlenme oranını düşürdüğünü ve diğer kimyasalların ise herhangi bir etkisinin olmadığını belirtmişlerdir. Matanmi ve Libby (1976), yaptığı çalışmada Entomophthora virulenta nın dinlenme sporlarını yumurta sarısı ile Sabouraud dextrose karışımı olan ortamdan elde etmişlerdir. Entomophthora virulenta nın dinlenme sporlarının 16 saat/gün (914 ve 2260 lüks) ışık altındaki şartlarda, karanlık şartlardaki çimlenmeden daha yüksek oranda bir çimlenme elde ettiklerini bildirmişlerdir. Ayrıca % 1 veya % 2 glusulase uygulaması ile dinlenme sporları miktarının arttığını rapor etmişlerdir. Wallace ve ark. (1976), yaptıkları çalışmada Entomophthora aphidis dinlenme sporlarının çimlenme oranının 14 saat/gün veya daha uzun ışıklanma süresinde arttığını bildirmişlerdir. Uzun ışıklanma koşullarında dinlenme sporlarının çimlenme aralığı 10 ile 30 gün arasındadır ancak bu çimlenme 60 gün sonunda durmuştur. Bu süre zarfında ise dinlenme sporlarındaki çimlenme oranlarının % 25 ile % 50 arasında değiştiği bulmuşlardır. Latge ve ark. (1977), yapmış oldukları çalışmada çeşitli katı ve sıvı besin ortamlarında Entomophthora virulenta zigospor üretimi incelenmiştir. Bu amaç için en iyi nitrojen kaynağının yeast extract, soya fasulyesi ve çiğit unu olduğu, en iyi karbon kaynağının ise dekstroz ve mısır şurubu olduğu bulunmuştur. En fazla spor elde edilen katı ortamlardan alınan zigosporların en fazla % 50 nin üzerinde, sıvı ortamdan alınan zigosporların ise en fazla % 70 civarında çimlendiği bildirilmiştir. Payandeh ve ark. (1978), yapmış oldukları çalışmada Entomophthora aphidis dinlenme sporlarını farklı besin ortamlarını kullanarak elde etmişlerdir. Bu dinlenme sporlarını C ile 40 0 C arasındaki farklı sıcaklıklarda, 16 saat/gün şartlarında çimlendirme denemesine tabi tutmuşlardır. Bu denemede 10 0 C ile 22 0 C arasında iyi bir 5

13 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR çimlenme oranı elde etmişler ancak maksimum çimlenme oranının C de (% 69.7) olduğunu bulmuşlardır. Bitton ve ark. (1979), Neozygites fresenii dinlenme sporlarında dormansinin kırılması ve çimlenme için minimum C sıcaklığa gereksinim olduğunu bildirmişlerdir. Perry ve ark. (1982), Erynia radicans dinlenme sporlarının çimlenebilmesi için en azından 4 0 C de ıslak toprakta veya % 100 nispi nemde 2 ay kalması gerektiğini rapor etmişlerdir. Perry (1988), araziden topladığı Erynia bulata nın zigosporunu 4 0 C ve 20 0 C sıcaklık, % 100 orantılı nemde ve karanlıkta depolamıştır. Buradan alınan dinlenme sporları 8, 12, 16, 20, 24, 28 0 C sıcaklık 100 lüks ışık altında çimlendirmeye tabii tutulmuştur. Sadece 20 0 C sıcaklıkta depolanan dinlenme sporlarında çimlenme meydana gelmiştir ve 5. günde yapılan kontrolde % 22.6, 9. günde yapılan kontrolde ise % 29.5 çimlenme olduğu bildirilmiştir. Bu yayın içerisinde yazar yayınlamamış olduğu diğer bulgularından da bahsetmektedir. Islak olarak C de Erynia crustosa sporları en az 3 ay, E. phytonomi sporları 2.5 ay bekletildikten sonra çimlenmektedir. Maksimum çimlenme ise E. radicans ve E. crustosa için 6 aydan daha yaşlı dinlenme sporları ile elde edilmiştir. Ayrıca E. crustosa nın 3 ay yaşındaki dinlenme sporlarının C arasında, 6 ay yaşındaki dinlenme sporlarının ise C arasında çimlendiğini bildirmiştir. Stoy ve ark. (1988), yaptığı çalışmada 5 farklı sıcaklıkta (16,19, 22, 25 ve 28 0 C) ve 6 farklı fotoperyotta (0, 4, 8, 12, 16 ve 24 saat/gün) Entomophaga grylli nin dinlenme sporlarını % 1.5 su agar ortamında çimlenme denemesine tabi tutmuşlardır. 22, 25 ve 28 0 C de inkübasyonda 3 gün sonra çimlenmenin başladığını tespit edilmiştir. Sıcaklık ile fotoperiyot konbinasyonlarından 25 0 C sıcaklık 12 saat/gün ışıklanmada 3 günde % 20 çimlenme, 25 0 C sıcaklık 12 saat/gün ışıklanma şartlarında ise 9 günde % 35 çimlenme, 25 0 C sıcaklık 16 saat/gün ışıklanma şartlarında ise 15 günde % 35 çimlenme olduğunu belirtmişlerdir. Dinlenme sporlarının en iyi çimlenme şartlarının 25 0 C sıcaklık ve 12, 16 saat/gün ışıklanmanın olduğu sonucuna varılmıştır. Steinkraus ve Kramer (1989), yaptığı çalışmada labaratuar koşullarında elde edilen Erynia aquatica dinlenme sporları kurutularak oda sıcaklığında muhafaza edilmiştir. 5 ay sonra bir nem çemberi içerisinde mikroskop lamı üzerinde dinlenme sporları çimlenme denemesine tabii tutulmuştur ve 41 gün sonunda çimlenmenin olmadığını rapor etmişlerdir. Ben-Ze ev ve ark. (1990), Neozygites fresenii zigosporlarının çimlenmesi üzerine yaptıkları çalışmada, çimlenme için bir seri gereksinim bulunduğunu bildirmişlerdir. Bunlar: (1) C de yaklaşık 20 günlük bir olgunlaşma dönemi, (2) C de en azından günlük bir vernalizasyon süreci, (3) bir aktivasyon dönemidir. Aktivasyon süreci zaman sıcaklık oranı en az 4:1 (10 0 C nin üzerindeki saat : 10 0 C nin altındaki saat) olduğunda doğada 200 veya üzeri saattir. Bu süreç invitro da sıcaklık 14 0 C nin üzerinde sabit tutulduğunda daha kısadır. 6

14 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Ayrıca yeterli olgunlaşma veya vernalizasyona tabi olmayan sporların çimlenme eğrilerinin sigmoitden ziyade doğrusala (lineer) yakın olarak ortaya çıktığı ve vernalizasyondan sonra sıcaklığın kademeli olarak yükseltilmesinin aniden yükseltilmesine göre daha hızlı çimlenmeye neden olduğu bildirilmiştir. Valovage ve Kosaraju (1992), yaptıkları çalışmada 5 farklı buffer sistemi (orthophosphate (OPHO), citrate-phosphate (CPHO), tris aminomethane (THMM), glycine-naoh (GLYC) ve Tris maleate (TMAL)) ile 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 ph noktaları kullanılarak Entomophaga grylli nin dinlenme sporları üzerinde 25 0 C ve 16 saat/gün ışıklanma şartlarında çimlendirme denemesi yapmışlardır. Genelde tüm buffer sistemlerinde çimlenmenin gerçekleştiği ancak en yüksek çimlenmenin % 40 oranında GLYC kullanılarak ph 7-9 olduğunu tespit etmişlerdir. Hajek ve Humber (1997), yaptıkları çalışmada, arazi koşullarında elde ettikleri Entomophaga maimaga nın dinlenme sporlarının 14 saat/gün, 13 saat/gün ve 12 saat/gün fotoperiyot ile 15 0 C ve 20 0 C sıcaklıklarda laboratuar koşullarında çimlenmeleri araştırılmıştır. Dinlenme sporları laboratuar koşullarına aktarıldıktan en erken 2 gün sonra çimlenmeye başlamıştır. Çimlenmelerin nispeten yavaş olduğu ve en fazla çimlenmenin 4.gün ile 8.gün arasında meydana geldiği bildirilmiştir. 16.gün sonunda 14 saat/gün fotoperiyot ve 15 0 C ve 20 0 C sıcaklıkta toplam çimlenmenin sırasıyla % 71.8, % 72.5 olduğunu tespit etmişlerdir. Er (2001), yapmış olduğu çalışmada C. osmodes in dinlenme sporlarının çimlenmesi için en uygun sıcaklığın 16 0 C olduğunu bulmuş ve çimlenmeden önce sporların kurumasının etkili olabileceğini ancak kontrollü denemeler ile belirlenmesi gerektiğini belirtmiştir. Ayrıca 4 0 C de 4 hafta vernalizasyona tabi tutulan dinlenme sporlarının ise çimlenmediğini belirtmiştir. Li ve ark. (2004), yaptıkları çalışmada Conidiobolus thromboides ve Pandora nouryi nin konidi çimlenmesine 16 kimyasal pestisitin etkisini 2 konsantrasyonda (R ve 0.2R ; R: arazi şartlarında kullanılan en düşük doz) test etmişlerdir. Test edilen fungusitlerden Propamocarb hidrokloridin C. thromboides konidilerinin çimlenmesine önemli bir etkisinin olmadığı fakat P. nouryi nin konidi çimlenmesini ise engellediğini bildirmişlerdir. Tribenuron-methyl in R konsantrasyonu C. thromboides in konidi çimlenmesini engellemesine rağmen Procymidone, İmprodione, Haloxyfop-methyl ve Fenoaprop-p-ethyl fungusitlerinin 0.2R konsantrasyonlarında C. thromboides in konidilerinin bazılarında 24 saat sonra çimlenmenin meydana geldiğini bildirmişlerdir. 7

15 MATERYAL VE METOT 3. MATERYAL VE METOT 3.1. MATERYAL Bu çalışma boyunca C. osmodes Drechsler ARSEF-6424 izolatı kullanılmıştır. Çalışmada soğutmalı inkübatörler, steril kabin, otoklav, etüv, vortex çalkalayıcı, santrifüj, faz-kontrast ışık mikroskobu gibi ekipmanlar ve çeşitli kimyasallar ile laboratuar cam malzemeleri yoğun olarak kullanılmıştır METOT Ön çalışmalar ve genel prosedür Fungus kültürleri ve zigospor üretimi Fungus kültürleri çalışma boyunca kullanılmak üzere eğik agar ortamında parafin yağı altında stok kültürlere alınarak 16±2 o C sıcaklık ve karanlık şartlarında korunmuştur. İhtiyaç duyulduğunda bu stok kültürlerden alt kültürler hazırlanarak patates dextroz agar (PDA) ortamında yetiştirilmiştir. Zigospor üretimi amacıyla Conidiobolus osmodes kültürleri üç farklı ortamda kontrollü şartlarda (16±2 o C sıcaklık ve karanlık) yetiştirilmiş ve bu ortamlardaki zigospor oluşumları gözlenmiştir. Bu amaç için; PDA (Merck ), % 1 oranında yeast extract (Merck ) ilave edilmiş sabouroud dekstroz agar (SDAY) (1 lt için, 10 gr pepton, 40 gr glikoz, 15 gr agar) ve % 20 oranında süt ve yumurta sarısı (sırasıyla % 60 ve % 40 oranlarında) ile zenginleştirilmiş SDAY ortamları kullanılmıştır (Papierok ve Hajek, 1997). Bu ortamlarda gelişen fungus kültürlerinin zigospor oluşturması iki ay boyunca takip edilmiştir (Şekil 3.1). Şekil 3.1. Conidiobolus osmodes dinlenme sporları (sağdaki: Laktofenol cotton blue ile boyanmış dinlenme sporları ; soldaki: Faz-kontrast ışık mikroskobu altında dinlenme sporları) 8

16 MATERYAL VE METOT Bu ön deneme sonucunda süt ve yumurta sarısı ile zenginleştirilmiş SDAY ortamında zigospor oluşumu gerçekleşmemiştir. SDAY ortamı bu süre içerisinde oldukça az miktarda zigospor üretimi ile sonuçlanmıştır. Test edilen ortamlar içerisinde en en fazla zigospor üretimi PDA ortamında gerçekleşmiştir. Bununla beraber oluşan zigosporların çoğunun ortam yüzeyinde olması da dikkate alınarak, bu çalışmadaki denemelerde kullanılacak olan zigosporlar, 100 mm çapındaki cam petri kapları içerisinde PDA ortamı kullanılarak 16±2 o C sıcaklık ve karanlık şartlarında gelişmiş olan kültürlerden elde edilmiştir. Bu ortamda zigospor oluşumunun 25 ile 120 gün arasında gerçekleştiği gözlenmiş olup denemelerde kullanılacak olan zigosporlar (aksi belirtilmediği taktirde) 60 günlük kültürlerden alınarak kullanılmıştır Zigospor süspansiyonlarının hazırlanması Steril şartlar altında, zigospor içeren kültürler üzerine 5 ml steril saf su eklenmiş ve 18 numara resim fırçası ile ortam yüzeyindeki sporlar su içerisine karıştırılmıştır. Oluşan bu süspansiyon bir pipet yardımı ile alınarak iki kat steril tülden süzülerek büyük agar parçalarından ayrılmıştır. Süzme sonucunda elde edilen süspansiyon öncelikle bir Vortex çalkalayıcıda çalkalanmış ve içerisindeki zigosporların saflaştırılması ise santrifügasyon yöntemi ile gerçekleştirilmiştir. Saflaştırma amacı için en uygun olan santrifügasyon hızı ve süresini belirlemek amacı ile gerçekleştirilmiş olan ön denemede, tülden süzülen süspansiyon 2000 rpm de 30, 45 ve 60 sn, 3000 rpm de 60 ve 120 sn santrifüj (Nüve NF615) ile çökeltilmiştir. Santrifügasyonda zigosporlar tüpün dip kısmına çökmektedir. Süspansiyonun 3000 rpm de 120 sn santrifüjü sonucunda elde edilen zigosporların saf olduğu mikroskobik incelemelerde belirlenmiş ve çalışma boyunca zigospor saflaştırmasında bu yöntem kullanılmıştır. Bu yöntem ile saflaştırılan zigosporlar bir universal şişede bir araya getirilmiş ve Vortex çalkalayıcı kullanılarak homojen dağılım sağlanmıştır. Elde edilen süspansiyonun yoğunluğu, Improved Neumber Hemocytometer kullanılarak bir fazkontrast ışık mikroskobunda 20X büyütmede belirlenmiştir. Daha sonra steril saf su ile seyreltilerek deneme prosedürlerinde aksi belirtilmediği taktirde 5x10 6 spor ml -1 yoğunluktaki spor süspansiyonu elde edilmiştir. Spor süspansiyonları her deneme için taze olarak hazırlanarak ertesi gün kullanılmıştır Çimlendirme ve veri kayıtları Zigosporların çimlendirilmesi için aksi belirtilmediği taktirde %1.5 luk saf su agar (SA) ortamı kullanılmış ve 100 mm çapındaki petri kaplarında gerçekleştirilmiştir. Her petri kabındaki ortam yüzeyine 5x10 6 spor ml -1 yoğunluktaki spor süspansiyonundan 500µl yayılmış ve denemenin amacına uygun olarak kontrollü şartlarda inkübe edilmiştir. Zigospor çimlenme oranları periyodik olarak belirlenmiştir. Petri kaplarından yaklaşık 5x5 mm büyüklüğünde alınan SA parçaları üzerindeki zigosporlar bir faz-kontrast ışık mikroskobunda 20X büyütmede incelenmiştir. 100 zigospor sayılmış ve bunlar içerisinde çim tüpü uzunluğu en az spor çapı kadar olan sporlar çimlenmiş olarak kabul edilmiştir. Tüm denemeler tesadüf parselleri deneme desenine uygun ve üç tekerrürlü olarak yürütülmüştür. 9

17 MATERYAL VE METOT Sıcaklığın zigospor çimlenmesine etkisinin belirlenmesi Daha önce yapılmış olan çalışmalarda Entomophthorales takımındaki bazı fungusların dinlenme sporlarının çimlenme sıcaklık istekleri tespit edilmiş olmakla birlikte C. osmodes zigosporlarının çimlenme sıcaklık istekleri üzerine çelişkili bulgular sunulmuştur. Drechsler (1954) zigospor çimlenmesinin gerçekleşmediğini bildirirken Er (2001) optimum çimlenmenin 16 o C civarında gerçekleştiğini bulmuştur. Aynı zamanda fungus izolatları arasında bu yönden farklılığın bulunabileceği de dikkate alınarak bu çalışmada kullanılan C. osmodes izolatının zigospor çimlenmesi için ihtiyaç duyduğu ortam sıcaklığını belirlemek amacı ile bu deneme yürütülmüştür. C. osmodes zigosporları 8, 12, 16, 20 ve 25±2 o C sıcaklıktaki inkübatörlerde karanlık ortamda inkübe edilmiş ve gün aşırı olarak 50 gün boyunca zigospor çimlenme oranları kayıt altına alınmıştır. Elde edilen verilerin oluşturduğu zamana karşılık çimlenme oranı grafiklerinde çimlenmenin logaritmik olarak artış gösterdiği zaman aralığındaki günlük çimlenme hızları belirlenerek en iyi çimlenmenin gerçekleştiği sıcaklık tespit edilmiştir Agar miktarının ve ışığın çimlenmeye etkisinin belirlenmesi Fungus sporlarının çimlenmesi için su önemli bir faktördür ve dinlenme sporlarının çimlenmesi için serbest suyun bulunması gerekliliği bilinmektedir. Bazı Entomophthorales grubu fungusların çimlenmesinde ışığın etkili olduğu daha önceki çalışmalarda belirlenmiştir. Özellikle ortam nispi nemindense ortamdaki suyun spor tarafından kolaylıkla alınabilmesi daha önemlidir. Bu denemede agar oranı % 1.0, 1.5, 2.5, 5.0 olan SA ortamları kullanılarak C. osmodes zigosporlarının çimlenme oranlarının % 1.5 luk SA ortamında % 10, 20, 40, 60, 80, 100 olduğu günler olan 6, 9, 16, 23, 32, 46. günlerde zigospor çimlenme oranları belirlenmiştir. İnkübasyon sonunda elde edilen çimlenme oranları arcsine transformasyonundan sonra ANOVA ve Tukey testlerine tabi tutularak çimlenmenin en iyi gerçekleştiği ortam tespit edilmiştir. Yukarıdaki uygulamalar içerisine % 1.5 luk SA ortamında ancak genel prosedürden farklı olarak ışıklı ortamda inkübe edilerek ışığın bulunmasının çimlenme üzerinde etkisinin olup olmadığı belirlenmiştir. Bu uygulamadan elde edilen veriler % 1.5 luk SA ortamında karanlıkta inkübe edilen uygulama ile t-testi kullanılarak karşılaştırılmıştır Spor yaşı ve vernalizasyonun çimlenmeye etkisinin belirlenmesi Entomophthorales funguslarının bazılarının çimlenmesi için bir olgunlaşma sürecinin gerekli olduğu rapor edilmiştir. C. osmodes zigosporları için bunun bir zorunluluk olmadığı bilinmesine rağmen bu denemede zigospor oluşumundan sonra geçen bir sürenin çimlenme üzerinde etkisinin olup olmadığı test edilmiştir. Denemede 60 ve 120 günlük fungus kültürlerinden elde edilen zigosporlar çimlenme için inkübe edilmiştir. Diğer bazı funguslar için ise bir soğuklama dönemi olmaksızın çimlenme gerçekleşmemektedir. C. osmodes zigosporlarının çimlenmesinde bu şekilde bir vernalizasyon periyodunun etkisini belirlemek amacı ile çimlenme için inkübasyon öncesi 10

18 MATERYAL VE METOT hazırlanan spor süspansiyonları 1 ve 4 hafta boyunca 4 o C sıcaklıkta buzdolabında muhafaza edilmiştir. Her iki uygulama için % 100 çimlenme gerçekleşene kadar zigosporlar inkübe edilmiş ve çimlenme günlük olarak kayıt altına alınmıştır. Elde edilen çimlenme oranlarının zamana göre grafikleri elde edilmiş ve çimlenme eğrilerinin logaritmik artış gösteren kısımları Polo-Pc istatistik programı kullanılarak logit analizine tabi tutulmuştur. Elde edilen eğim değerleri t-testi ile karşılaştırılmıştır Pre-inkübasyon kurutma işleminin çimlenmeye etkisinin belirlenmesi Er (2001) C. osmodes zigosporları üzerinde yaptığı çalışmada zigosporların inkübasyon öncesi kurutulması halinde çimlenme hızının artış gösterebileceğini ve ancak kontrollü şartlarda yapılacak denemeler ile bunun açıklığa kavuşturulması gerektiğini belirtmiştir. Bu amaçla C. osmodes zigosporları mağnezyum klorür, potasyum karbonat tuzları ve silika jel kullanılarak inkübasyon öncesi kurutulmuştur. 60 mm yüksekliğinde ve 120 mm çapındaki kavanozlara 20 mm yükseklikte konulan tuzlar üzerine yerleştirilen 50 mm çapındaki saat camı üzerine 1.5 ml 1x10 7 spor ml -1 yoğunluğundaki zigospor süspansiyonu bırakılmıştır. Kurutma işlemi 20±2 o C de mağnezyum klorür için 1, 3 ve 5 hafta diğerleri için 1 hafta süreyle gerçekleştirilmiştir. Zigospor çimlenmeleri ise genel prosedüre uygun olarak 45 gün boyunca günlük olarak kayıt altına alınmıştır. Elde edilen çimlenme oranlarının zamana göre grafikleri elde edilmiş ve çimlenme eğrilerinin logaritmik artış gösteren kısımları Polo-Pc istatistik programı kullanılarak logit analizine tabi tutulmuştur. Elde edilen eğim değerleri ANOVA ve Tukey testleri ile karşılaştırılmıştır Çeşitli kimyasalların çimlenme oranına etkisinin belirlenmesi Entomopatojen funguslar ile yapılan çalışmalarda sıklıkla kullanılan etil alkol ve Tween 80 ile fungus metabolitlerinden oxalik asit ve sitrik asitin C. osmodes zigosporlarının çimlenmesine etkisi üç farklı miktarda (10, 25, 50 ppm) test edilmiştir. Bu kimyasalların 100, 250 ve 500 ppm yoğunluğundaki solüsyonları saf su içerisinde hazırlanarak sporların çimlenme ortamı olan SA içerisine hazırlama aşamasında eklenmiş ve daha sonra otoklavda sterilizasyona tabi tutulmuştur. Kontrol uygulaması ise kimyasal içermeyen SA ortamında kurulmuştur. Bu şekilde hazırlanan ortamlar üzerindeki spor çimlenmesi kimyasal içermeyen SA ortamındaki çimlenmenin % 10, 20, 40, 60, 80, 100 olduğu günler olan 6, 9, 16, 23, 32, 46. günlerde belirlenmiştir. Elde edilen tüm değerlerin kontrol uygulamasından çok düşük olması nedeni ile sadece 46. günde ulaşılan çimlenme oranları istatistik analizine tabi tutulmuştur. Çimlenme oranları arcsine transformasyonundan sonra ANOVA ve Tukey testleri ile değerlendirilmiştir. 11

19 BULGULAR VE TARTIŞMA 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Sıcaklığın zigospor çimlenmesine etkisi Bu çalışmada ortam sıcaklığının C. osmodes zigosporlarının çimlenmesinde önemli bir faktör olduğu belirlenmiştir. Test edilen sıcaklık değerleri içerisinde en hızlı çimlenme 16 o C de (günde % 3.14 spor) gerçekleşmiştir (Şekil 4.1). Zigospor çimlenmesi için uygun olan sıcaklık aralığının da oldukça dar olduğu Şekil 4.1 den anlaşılmaktadır. Bu çalışmada 50 günlük inkübasyon süresinde % 100 çimlenmeye sadece 16 o C de ulaşılmıştır. Diğer sıcaklıklarda çimlenme oranları özellikle uç değerlerde çok düşük kalmıştır (en fazla % 4). 4 ÇİMLENME HIZI (GÜNDE %) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, SICAKLIK ( o C) Şekil 4.1. Conidiobolus osmodes zigosporlarının farklı sıcaklıklardaki çimlenme hızları. C. osmodes zigospor çimlenmesi üzerine yapılan diğer bir çalışmada da en iyi çimlenmenin 16 o C de gerçekleştiği bulunmuştur (Er, 2001). Ancak diğer sıcaklıklardaki çimlenme bakımından bu çalışma ile bazı farklılıklar bulunmaktadır. Er (2001) çimlenmenin 8 ve 12 o C de daha hızlı gerçekleştiğini bildirmektedir. Aynı zamanda bu çalışmada 20 o C de düşük de olsa çimlenme görülmesine rağmen Er (2001) in bulgularına göre 21 o C de ve üzerinde çimlenme gerçekleşmemiştir. Bu farklılıklar denemede kullanılan izolatlar arasındaki farklılıktan kaynaklanmış olabilir. Drechsler (1954) C. osmodes zigosporlarının çimlenmesinin oda sıcaklığında gerçekleşmediğini bildirmiştir. Bu da sunulan sonuçlar ile çelişki göstermemektedir. Yüksek sıcaklıkların C. osmodes zigosporlarının çimlenmesi için uygun olmadığı C. osmodes zigospor çimlenme çalışmalarının ortak bulgusudur. Diğer Entomophthorales takımına bağlı türler üzerinde yapılmış çalışmalar da yakın bulguları ortaya koymaktadır. 12

20 BULGULAR VE TARTIŞMA Payandeh ve ark. (1978) Entomophthora aphidis için optimum sıcaklığın 16.5 o C olduğunu, Stoy ve ark. (1988) E. grylli dinlenme sporlarının 25 o C ye kadar hızlanarak çimlendiğini ve nispeten düşük sıcaklıklarda (21, 24 o C ) çimlenmenin gerçekleşmediğini bildirmiştir ÇİMLENME ORANI (%) GÜN Şekil 4.2. Conidiobolus osmodes zigosporlarının 16 o C sıcaklıkta zamana bağlı çimlenme eğrisi C. osmodes zigosporlarının en iyi çimlenme gösterdiği 16 o C sıcaklıktaki zamana bağlı çimlenme eğrisi incelendiğinde, çimlenmenin ikinci günden başladığı ancak logaritmik artışa 14. günde başladığı görülmektedir (Şekil 4.2). Daha sonra 34. günden itibaren çimlenme hızında tekrar düşüş gerçekleşmiştir. Daha önceki bir çalışmada farklı olarak çimlenmeye başlama inkübasyonun 10. gününde başlamıştır (Er, 2001). Zigospor çimlenmesi için sıcaklık isteği ve çimlenme grafiğine göre bu fungusun arazi koşullarında zigosporları ile etkili olması için serin bir dönemin gerçekleşmesi ve bu şartların uzunca bir süre devam etmesi gerekliliği ortaya çıkmaktadır. Buna benzer koşulların varlığı nedeniyle ve özellikle çimlenmenin senkronize olarak hızlı bir şekilde gerçekleşmemesi Entomophthorales grubu fungusların kullanımı yönünden sınırlayıcı faktörlerden birisi olmuştur. Bu durumun nedenlerinin ve muhtemel çözüm yollarının araştırılmasına yönelik çalışmaların yapılması yararlı olabilecektir Agar miktarının ve ışığın çimlenmeye etkisi Farklı agar oranlarında hazırlanmış SA ortamları üzerinde zigosporların 46 günlük inkübasyon boyunca kaydedilen çimlenme oranları Şekil 4.3 de sunulmuştur. Bu süre sonunda ulaştıkları çimlenme oranları arasında istatistiksel olarak önemli fark bulunmuştur 13

21 BULGULAR VE TARTIŞMA (F=419.89; s.d.=3,11; P<0.05). Tukey analizi sonucunda % 2.5 ve % 5 agar içeren SA ortamlarındaki çimlenme oranları arasındaki fark istatitiksel olarak önemli çıkmamış ancak diğer tüm uygulamalar arasındaki farklar istatistiksel olarak önemli bulunmuştur. Deneme süresi sonunda en yüksek çimlenme oranı (% 99.00) % 1.5 agar içeren SA ortamında gerçekleşmiştir. Bunu azalan sıra ile % 1.0, % 2.5 ve % 5.0 agar içeren SA ortamlarındaki çimlenmeler izlemiştir (sırasıyla % 67.33, 9.33, 4.00). Bu verileri karşılaştırmak için Entomophthorales dinlenme sporları ile gerçekleştirilerek yayınlanmış bulgulara literatür taramasında rastlanılmamıştır. Bununla birlikte gerçekleştirilen uygulama ile çimlenme ortamının fiziksel yapısı değiştirilmiştir. Bu farklılığın ortamın sertliği ve su aktivitesi üzerinde olduğu düşünürse elde edilen veriler arasında farklılığın bulunması beklentiler doğrultusunda olacaktır. Ortamın su aktivitesi mikrobiyal gelişim ve bununla birlikte enzimatik reaksiyonlar üzerinde etkilidir (Iglesias ve Bueno, 1999). Agarın içerdiği su miktarının su aktivitesi üzerinde etkili olduğu Iglesias ve Bueno (1999) tarafından gösterilmiştir. Ancak deneme sonucunda % 1.0 agar içeren SA ortamındaki çimlenme oranı % 1.5 agar içeren SA ortamındakine orandan daha düşük bulunmuştur. Bu durumun gerçekleşmesinde en azından bazı sporların ortam yüzeyinde tamamen su tabakası altında kalmış olması ihtimali bulunmakla birlikte bu hipotezi destekleyecek bir çalışma burada gerçekleştirilmemiştir. C. osmodes zigosporlarının su içerisinde çimlenip çimlenmediklerinin ayrıca test edilmesi gerekmektedir. ÇİMLENME ORANI (%) %1 su agar (karanlıkta) %1.5 su agar (karanlıkta) %2.5 su agar (karanlıkta) %5 su agar (karanlıkta) %1.5 su agar (ışıkta) GÜN Şekil 4.3. Farklı agar miktarlarında ve ışıkta Conidiobolus osmodes zigosporlarının zamana bağlı çimlenme eğrileri (barlar standart hatayı göstermektedir, n=3). 46 günlük inkübasyon sonunda % 1.5 luk SA ortamında karanlıktaki çimlenme oranı ışıktaki çimlenme oranından istatistiksel olarak daha yüksek bulunmuştur (t=35.60, s.d.=4, P<0.05). Karanlık ortamda zigospor çimlenmesi % iken ışıkta çimlenme % oranında kalmıştır (Şekil 4.3). Entomophthorales grubu fungusların dinlenme 14

22 BULGULAR VE TARTIŞMA sporlarının çimlenmesi üzerine fotoperiyodun etkili olabileceği daha önceki bazı çalışmalarda bildirilmiştir (Wallace ve ark., 1976; Stoy ve ark., 1988). Bu çalışmalarda E. aphidis (Wallace ve ark., 1976) ve E. grylli (Stoy ve ark., 1988) için gün içerisinde ışıklanma süresinin uzun olmasının çimlenmeyi artırdığı tespit edilmiştir. Bununla birlikte ışıklanma süresinin ekstrem uca yaklaşması durumunda bazı E. grylli patotiplerinin dinlenme sporlarının çimlenmesinde düşüş olduğu bildirilmiştir (Stoy ve ark., 1988) Spor yaşı ve vernalizasyonun çimlenmeye etkisi 60 ve 120 günlük kültürlerden elde edilen zigosporların ve 4 o C de 1 hafta boyunca vernalizasyon uygulamasına tabi tutulan zigosporların zamana bağlı çimlenmeleri Şekil 4.4 de ve bu eğrilere ait logit analiz sonuçları Çizelge 4.1 de verilmektedir. 4 o C de 4 hafta boyunca vernalizasyon uygulamasına tabi tutulan zigosporlar inkübasyon süresinde çimlenmemiştir. 60 günlük kültürlerden elde edilen zigosporlar ile 4 o C de 1 hafta boyunca vernalize edilen zigosporların zamana bağlı çimlenmeleri birbirine benzer şekilde gerçekleşmiştir (Şekil 4.4) ve bu çimlenmelere ait eğim değerleri arasında istatistiksel bir farklılık bulunmamıştır (t=2.61, s.d.=4, P>0.05). 120 günlük kültürlerden elde edilen zigosporların logaritmik artış dönemi diğerlerinden daha geç başlamıştır ancak logaritmik artış dönemindeki eğim aynı uygulamaya tabi tutulan 60 günlük kültürlerden alınan zigosporlardan istatistiksel olarak daha yüksek olarak bulunmuştur (t=12.43, s.d.=4, P<0.05) ÇİMLENME ORANI (%) günlük kültürlerden elde edilen sporlar 120 günlük kültürlerden elde edilen sporlar 1 hafta vernalizasyona tabi olan sporlar GÜN Şekil 4.4. Farklı yaşlardaki kültürlerden alınan ve soğuklamaya tabi tutulan Conidiobolus osmodes zigosporlarının zamana bağlı çimlenme eğrileri (barlar standart hatayı göstermektedir, n=3). 15

23 BULGULAR VE TARTIŞMA Çizelge 4.1. Farklı yaşlardaki kültürlerden alınan ve soğuklamaya tabi tutulan Conidiobolus osmodes zigosporlarının çimlenmelerinin logit analiz sonuçları İntercept Eğim (± s.h.)* X 2 (s.d.) 60 günlük kültürlerden elde edilen sporlar ±0.220 aa (58) 120 günlük kültürlerden elde edilen sporlar ±1.659 b (19) 1 hafta 4 o C de vernalizasyona tabi tutulan sporlar ±0.251 A (61) *Farklı olan büyük ve küçük harfler kendi aralarında t-testine göre (P<0.05, n=3) istatistiksel olarak önemli olan farklılığı belirtmektedir. Entomophthorales türlerinin dinlenme sporlarının çimlenmeleri üzerine yapılmış çalışmalarda yaygın olarak çimlenme için bir olgunlaşma ve/veya vernalizasyon (genellikle 4 o C civarında) sürecinin gerekli olduğu gösterilmiş veya ima edilmiştir (Ben- Ze Ev ve ark., 1990). Neozygites fresenii zigosporları için de bu şartların gerekliliği Ben Ze-Ev ve ark. (1990) tarafından gösterilmiştir. Perry (1988) Erynia bullata dinlenme sporlarının çimlenme için vernalizasyon sürecine ihtiyaç duyduğunu bildirmiştir. Bu çalışmada bir olgunlaşma sürecinin C. osmodes zigosporlarının çimlenmesi için gereksinim olmadığı ancak bu şekilde bir sürece uygun şartlarda maruz bırakıldığında spor çimlenme hızının daha yüksek olabileceği bulunmuştur. Bununla birlikte, C. osmodes kültürlerinde zigosporların koloni genelinde oluşumunun senkronize olarak gerçekleşmediği (bakınız Bölüm ) dikkate alınırsa ilk oluşan dinlenme sporları belirli bir bekleme süreci geçirmiş olmaktadır. C. osmodes zigosporlarının vernalizasyona 1 hafta süreyle tabi tutulması çimlenmede çok büyük bir fark meydana getirmemiştir. Ancak Er (2001) in bulgularıyla paralel olarak vernalizasyon süresinin 4 hafta olması durumunda dinlenme sporları deaktive olmuştur Pre-inkübasyon kurutma işleminin çimlenmeye etkisi Farklı kimyasallar kullanılarak inkübasyon öncesi kurutma işlemine tabi tutulan C. osmodes zigosporlarının zamana bağlı çimlenme eğrileri Şekil 4.5 de verilmiştir. Bu uygulamalar sonucunda ulaşılan çimlenme oranları arasında istatistiksel olarak farklılıklar bulunmuştur (F=220.98; s.d.=5,17; P=0.000). 45 günlük inkübasyon periyodunda en yüksek çimlenme oranına kontrol uygulamasında, en düşük çimlenme oranına mağnezyum klorür ile 5 haftalık kurutma sonucunda ulaşılmıştır. Bu değerler Tukey analiz sonuçlarına göre birbirlerinden ve tüm diğer uygulamalardan istatistiksel olarak farklıdır (Çizelge 4.2). Farklı uygulamalar ile inkübasyon öncesi kurutma işlemleri sonucunda elde edilen zamana bağlı çimlenme eğrilerinin logit analizleri sonucunda elde edilen eğimler Çizelge 4.3 de verilmiştir. Bu eğimler arasında istatistiksel olarak önemli farklar elde edilmiştir (F=11.17; s.d.=5,17; P<0.05). Tukey analizi sonuçlarına göre kontrol uygulamasına ait eğim değeri mağnezyum klorür ile 5 haftalık kurutma uygulaması hariç tüm diğer uygulamaların eğimlerinden daha düşük bulunmuştur. İnkübasyon öncesi zigosporların kurutulması genelde daha hızlı çimlenmeyi sağlamıştır ancak kurutmaya tabi tutulan sporların çimlenmesinde logaritmik artış dönemine başlamaları gecikmiştir (Şekil 4.5). 16