ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ BĠYOTEKNOLOJĠ ENSTĠTÜSÜ YÜKSEK LĠSANS TEZĠ

Transkript

1 ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ BĠYOTEKNOLOJĠ ENSTĠTÜSÜ YÜKSEK LĠSANS TEZĠ HEREDĠTER SFEROSĠTOZDA MEMBRAN PROTEĠN EKSĠKLĠKLERĠNĠN ELEKTROFORETĠK VE SPEKTROMETRĠK YÖNTEMLER ĠLE ARAġTIRILMASI Selen PEKER DanıĢman Öğretim Üyesi Yrd. Doç. Dr. F. Duygu ÖZEL DEMĠRALP ANKARA 2011

2 Herediter Sferositozda Membran Protein Eksikliklerinin Elektroforetik ve Spektrometrik Yöntemler ile Araştırılması ÖZET Herediter sferositoz (HS) 1:5000 ile 1:2000 arasında değiģen görülme sıklığı ile beyaz ırkta en sık görülen doğumsal hemolitik anemidir (Morton vd 1962, Eber vd 1990). Periferik kan yaymasında sferositlerin görülmesi ve eritrositlerin artmıģ ozmotik frajilitesi ile karakterizedir. Hemolitik aneminin derecesi ve eģlik eden semptomlara göre hafif, orta veya ağır olarak sınıflandırılır (Bolton-Maggs vd 2004, Perrota vd 2008). HS olgularının çoğunda otozomal dominant geçiģ görülmekle beraber (%75) yaklaģık dörtte birinde otozomal resesif veya de novo mutasyonlar da söz konusudur. Otozomal dominant formda eksiklik hafif, dolayısıyla aneminin Ģiddeti hafiftir. Resesif formda ise eksiklik daha büyük ve anemi daha Ģiddetlidir (Segel 2004). Spektrin-α (SPTA1), spektrin-β (SPTB), ankrin (ANK1), band 3 (SLC4A1) ve protein 4.2 (EPB42) gibi eritrosit membran proteinlerindeki bozukluklar sonucu eritrosit membran stabilitesi bozulur, daha sert ve sferositik hale gelir. Esnekliğini kaybetmiģ olan eritrositler dalak porlarından geçemez ve yıkıma uğrar, bunun sonucunda hemolitik anemi görülür (Cooper vd 1969, Da Costa vd 2001). HS da hastalığın Ģiddetinin membrandaki spektrin düzeyi ile iliģkili olduğu, membranda spektrin miktarı azaldıkça hastalık Ģiddetinin arttığı düģünülmektedir (Agre vd 1986, Jarolim vd 1996, Nakanishi vd 2001). Eritrosit membran proteinlerinin 2-D jel elektroforezi ile protein profillerinin incelenmesi, spektrometrik yöntemler ile ilgili proteinlerin kimliklendirilmesi, HS gibi kalıtsal hastalıklar için omik teknolojilerin kullanıldığı yeni veri üretme potansiyeli olan değerli yöntemlerdir. Yük ve moleküler ağırlık gibi iki bağımsız biyofiziksel değiģkene dayalı bu protein ayırma yöntemi özellikle kompleks karıģımların ayrımı ve spektrometrik yöntemlerle beraber kullanımı ile translasyon sonrası fosforilasyon, metilasyon gibi proteinlerin gerçek yapı fonksiyonlarını belirleyen değiģimleri göstermesi açısından klinik proteomikste oldukça önemlidir (Bruschi vd 2005). Bu çalıģmada, proteomik yaklaģımlar ile HS hastalığında önemli olan eritrosit membran proteinlerinin araģtırılması amacıyla 4 HS olgusu ve 5 kontrol, 2 hasta probandı aileleri ile birlikte çalıģılmıģtır. Eritrosit membran proteinlerinin eldesi ve ayrımında bilinen metodlarda birtakım değiģiklikler yapılmıģ, elde edilen iki boyutlu elektroforez jellerinin PDQuest programı ile protein profil analizleri yapılmıģ ve ifade farklılıkları tespit edilmiģ, peptid kütle parmakizi (PMF) analizleri ile ankrin, spektrin, band 3 gibi HS patolojisinde önemli rol oynayan eritrosit membran proteinleri tanımlanabilmiģtir. Anahtar kelimeler: Herediter sferositoz, eritrosit membran proteinleri, ankrin, spektrin, proteomik iii

3 Investigating Deficiencies of Membrane Proteins in Hereditary Spherocytosis by Electrophoretic and Spectrometric Methods ABSTRACT Hereditary spherocytosis (HS) is the most common congenital hemolytic anemia in Caucasians, with an estimated prevalence ranging from 1:2000 to 1:5000 (Morton et al. 1962, Eber et al. 1990). HS is characterized with the presence of spherocytes and increased osmotic fragility of erythrocytes (RBC). It is classified as mild, moderate and severe, according to the degree of the haemolytic anaemia and the associated symptoms (Morton et al. 1962, Eber et al. 1990). Although the majority of HS cases present an autosomal dominant inheritance pattern (75%), about one quarter of the patients arise from autosomal recessive or de novo mutations (Bolton-Maggs et al. 2004, Perrota et al. 2008). In autosomal dominant form, the deficiency is mild, and hence, the anaemia is mild while in the recessive form, the deficiency is greater, and the anaemia is profound (Segel 2004). The molecular defect in one of the erythrocytes membrane proteins underlying HS like; spectrin-α (SPTA1), spectrin-β (SPTB), ankyrin (ANK1), band 3 (SLC4A1) and protein 4-2 (EPB42) that lead to membrane destabilization and vesiculation, may change the RBCs into denser and more rigid cells (spherocytes), which are removed by the spleen, leading to the development of a haemolytic anaemia (Cooper et al.1969, Da Costa et al. 2001). It is usually thought that the clinical phenotype of HS is releated with the level of residual spectrin inversely and correlates with the severity of anemia (Agre et al. 1986, Jarolim et al. 1996, Nakanishi et al. 2001). 2D gel electrophoresis of red cell membrane proteins is therefore a potentially valuable method for studying heritable disorders as HS that involve membrane proteins. This separation technique of proteins based upon two biophysically unrelated parameters; molecular weight and charge, is a good option in clinical proteomics in terms of ability to separate complex mixtures, display posttranslational modifications and change after phosphorylation (Bruschi et al. 2005). In the present work, we aimed to use a proteomic approach to characterize the erythrocyte membrane proteins in normal and in hereditary spherocytosis (HS) erythrocytes. 4 HS patients and 5 controls, 2 proband with their families have been studied. We have used contemporary methods with some modifications for the solubilization, separation and identification of erythrocyte membrane proteins. 2DE protein profile analysis were performed using PDQuest software and some erythrocyte membrane proteins were identified by Peptide Mass Fingerprinting (PMF) including ankyrin, spectrin alpha and beta chain, and band 3 proteins. Key words: Hereditary spherocytosis, RBC membrane proteins, ankyrin, spectrin, proteomics iv

4 TEġEKKÜR Eğitimim süresince bilgi ve tecrübelerini benimle paylaģan, çalıģmalarımda her türlü desteği sağlayan, motivasyon kaynağım, güleryüzlü danıģman hocam Yrd. Doç. Dr. F. Duygu ÖZEL DEMĠRALP e, Hasta kan örneklerini temin eden, kıymetli bilgilerinden faydalandığım ve yolumun bir Ģekilde kesiģmiģ olmasından tarifsiz onur duyduğum değerli hocam Prof. Dr. Nejat AKAR a, Laboratuvarda verimli ve huzur içinde, grup ruhuyla çalıģmama olanak veren ve gerektiğinde yardımlarını esirgemeyen sevgili arkadaģlarım BaĢak ÇĠNAR, NaĢit ĠĞCĠ, Beycan AYHAN ve Ayça YILMAZ a, Eğitime ve bilime verdiği önemle ve dehasıyla beni yüreklendiren, attığım her adımı onayladığını hissettiğim merhum babam M. Selçuk PEKER e, bilgi birikimi ve sevgisi ile her anlamda beni destekleyen Ģefkatli annem Ayfer PEKER e, kıvrak zekası ve çözümleri ile yolumu aydınlatan sevgili ablam EvĢen PEKER e teģekkür ederim. Selen PEKER Ocak 2011, ANKARA v

5 İÇİNDEKİLER ÖZET... iii TEġEKKÜR... v İÇİNDEKİLER... vi ŞEKİLLER DİZİNİ... viii ÇİZELGELER DİZİNİ... x SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ... xi 1. GİRİŞ Amaç ve Kapsam KAYNAK ÖZETLERĠ Hemolitik Anemi Hemolitik anemilerin sınıflandırılması Herediter Sferositoz Eritrosit Membran Yapısı Eritrosit Membran Proteinlerine Genel BakıĢ ve Herediter Sferositoz ile ĠliĢkileri Ankrin Spektrin Band Protein Proteomik Protein izolasyonu Proteinlerin ayrımı (elektroforetik, kromatografik vs.) Protein tanımlaması ( Kütle spektrometreleri, Edman) Eritrosit membran proteinlerinin proteomik yöntemlerle araģtırılması MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Hasta ve kontrol örnekleri Kullanılan kimyasal maddeler ve cihazlar Yöntem Tam kandan eritrosit izolasyonu Eritrositlerden membran eldesi Protein miktar tayini ve rehidrasyon Ġki boyutlu jel elektroforezi Jellerin boyanması, görüntülenmesi ve analizi Proteinlerin Jelden Kesilmesi ve Tripsinizasyon MALDI-TOF kütle spektrometresi için örnek hazırlama ve ölçüm Peptit kütle parmakizi (PMF) verilerinin biyoinformatik analizi ve protein tanımlanması ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA vi

6 4. 1. Protein Miktar Tayini İki Boyutlu Jel Elektroforezi ile Protein Profillerinin Çıkarılması ve Jellerin Analizi Peptit Kütle Parmak İzi Yöntemi ile Protein Tanımlanması SONUÇ KAYNAKLAR EKLER EK 1 Deneylerde kullanılan kimyasal maddeler EK 2 Deneylerde kullanılan cihazlar ve programlar ÖZGEÇMĠġ vii

7 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil Kalıtsal Sferositozda OluĢan Sferositler... 2 Şekil Retikülositin dalak pulpasından geçiģi sırasındaki deformasyonu Şekil Ozmotik frajilite testinde kullanılan NaCl dilüsyonları Şekil Ozmotik frajilite testine ait grafik Şekil Eritrosit membran yapısı Şekil Fikol ile tam kandan mononükleer hücrelerin izolasyonu Şekil Eritrosit membranı proteom çalıģmalarında izlenen genel strateji Şekil Bradford yönteminde standart proteinlerle elde edilen kalibrasyon doğrusu Şekil Kontrol ve HS olgularına ait eritrosit protein profil haritaları Şekil Kontrol ve hafif seyreden bir HS olgusuna (C. Y.) ait iki boyutlu protein profil haritalarının PDQuest programında görsel olarak ve üç boyutlu gösterimi Şekil Kontrol ve ağır seyreden bir HS olgusuna (Proband-1) ait ait iki boyutlu protein profil haritalarının PDQuest programında 3D gösterimi Şekil Kontrol-HS (hafif)-hs (ağır) bireylere ait elektroforez jellerinde membran proteinlerindeki ifade farklılıklarının karģılaģtırılması Şekil Probandı içeren aile ile kontrollerin kıyaslanması-pdquest programında protein ifade farklılıklarının 3 boyutlu gösterimi Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylerde eritrosit membran örneklerinin iki boyutlu jel elektroforezi ile elde edilmiģ protein profilleri Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait elektroforez jellerinde PDQuest programı ile bulunan protein kümelerinin (spotların) gösterimi Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylerde elektroforez jellerinde eģleģen protein kümelerinin gösterimi Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylerin karģılaģtırmalı analizinin deney özeti Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının 3 boyutlu gösterimleri- 1. bölge için Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının dansite eğrileri ile gösterimi-1.bölge için Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin yoğunluk farklarının sayısal gösterimi-1.bölge için Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının 3 boyutlu gösterimleri- 2. bölge için viii

8 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının dansite eğrileri ile gösterimi-2.bölge için Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının sayısal gösterimi-2.bölge için Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının 3 boyutlu gösterimleri- 3 ve 4. bölgeler için Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının dansite eğrileri ile gösterimi-3.bölge için Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının sayısal gösterimi-3.bölge için Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının dansite eğrileri ile gösterimi-4.bölge için Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının sayısal gösterimi-4.bölge Şekil Kontrol ve HS iliģkili bireylerde farklı ifadesi bulunan bazı protein kümeleri ve 3D gösterimleri Şekil Kontrol ve HS iliģkili bireylerde farklı ifadesi bulunan bazı protein kümeleri ve 3D gösterimleri Şekil MALDI-TOF kütle spektrometresinin beģ peptit karıģımı ile kalibrasyonundan sonra elde edilen beģ peptit m/z değerleri Şekil Kesilen protein kümelerinden PMF analizleri ile tanımlananların iki boyutlu elektroforez jel görüntüsü üzerinde gösterimi ix

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Hemolitik anemilerin nedenleri ile sınıflandırılması... 5 Çizelge Herediter sferositozda hastalığın Ģiddetinin klinik bulgulara göre sınıflandırılması... 8 Çizelge Herediter sferositozda genetik kusurların klinik ve moleküler karakterizasyonu... 9 Çizelge Membran protein bozukluklarının görülme sıklıkları Çizelge Herediter sferositoz ile iliģkili bazı ankrin mutasyonları Çizelge Herediter sferositoz ile iliģkili bazı α spektrin ve β spektrin mutasyonları Çizelge Herediter sferositoz ile iliģkili bazı band 3 mutasyonları Çizelge Herediter sferositoz ile iliģkili bazı protein Mutasyonları Çizelge Eritrosit membran proteinlerinin genleri ve kromozomal yerleģimleri Çizelge ÇalıĢmaya dahil edilen tüm bireyler ve özellikler Çizelge MALDI-TOF kütle spektrometresinin kalibrasyonunda kullanılan peptitlerin kütleleri Çizelge Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait jellerde PDQuest programıyla tespit edilen spot sayıları ve referans jel ile eģleģme oranları Çizelge MALDI-TOF kütle spektrometresinden alınan m/z değerleri ile PMF analizleri ile tanımlanan proteinler Çizelge HS olguları ve kontrol bireylerde gözlenen membran proteinleri x

10 SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ 1D SDS-PAGE Bir boyutlu sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforezi 2D-PAGE Ġki boyutlu poliakrilamit jel elektroforezi μg. Mikrogram μl. Mikrolitre ACTH Adrenokortikotropik hormon ATP Adenozin tri fofat BSA Sığır serum albümini C Santigrat derece CHAPS 3-(3-Cholanidopropyl)Dimethylammonio-1-Propanesulfonate CHCA alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid cdna Komplementer DNA cm. Santimetre Da Dalton dk. Dakika DNA Deoksiribo nükleik asit DTT Dithiothreitol EDTA Etilen diamin tetra asetik asit GPA Glikoforin A GPC Glikoforin C HED Hidroksi etil disülfit HS Herediter Sferositoz IPG Ġmmobilize ph gradiyent kg. kilogram kda Kilodalton kv Kilovolt MALDI-TOF MS Matriks eģliğinde lazer iyonlaģtırıcılı ve uçuģ zamanıyla ölçüm yapan kütle spektrometresi m/z Kütle/yük mg. Miligram ml. Mililitre mm. Milimetre MS Kütle spektrometresi xi

11 Mw/Ma ng. nm. OFT p PZR pi PLGS PMF PTM pmol sa. SDS SDS-PAGE SSP V Moleküler ağırlık Nanogram Nanometre Ozmotik frajilite testi Ġstatistiksel anlamlılık değeri Polimeraz zincir reaksiyonu Ġzoelektrik nokta ProteinLynx Global Server Peptit kütle parmak izi Post Translasyonal Modifikasyon/Translasyon sonrası değiģiklik Pikamol Saat Sodyum dodesil sülfat Sodyum dodesil sülfat-poliakrilamit jel elektroforezi Sample spot protein Volt xii

12 1. GİRİŞ Herediter Sferositoz (HS), eritrosit membranını oluģturan proteinlerden bir ya da birkaçının eksikliği veya kusuru sonucu eritrositlerin bikonkav disk Ģeklindeki morfolojik yapılarını kaybederek küre Ģeklini almaları ile hemolize eğilimin artması sonucu değiģik derecede anemi, sarılık ve splenomegali ile seyreden kalıtsal bir hastalıktır (Timur 2001, Ilolascon 2010). Bu hastalık eritrositlerin artmıģ ozmotik frajilitesi ve sferositlerin varlığı ile karakterize edilir ve 1:5000 ile 1:2000 arasında değiģen görülme sıklığı ile beyaz ırkta en sık görülen doğumsal hemolitik anemidir (Morton vd 1962, Eber vd 1990). Hastalık membran proteinlerindeki farklı moleküler bozukluklara göre farklı tipte ve Ģiddette görülmektedir (Uysal vd 2001, Anonim 2003, Celkan vd 2004). Normal eritrositler dalak sinüzoidlerinin porlarından rahatça geçerken, membran proteinlerindeki kusur neticesinde yüzey kaybına uğrayaran ve küre Ģeklini alan sferositler normal eritrositlere göre rijid olduğu için dalak pulpasındaki porlardan geçemezler (Anonim 2003). Esneyemeyen eritrositlerin dalak tarafından tutularak yıkılması sonucu belirgin hemoliz ve splenomegali meydana gelir. Hastalığın en önemli özelliği çevresel yaymada sferositik eritrositlerin görülmesidir (ġekil 1. 1). Diğer bir özellik ise eritrositlerin artmıģ ozmotik frajilitesidir. Hastalığın tanısı için genellikle aile öyküsü alınır, klinik bulgular ve laboratuvar bulguları da tipik olduğundan çoğunlukla ileri tetkike gereksinim duyulmadan tanı konulur. Hastalıkta pozitif aile öyküsü HS riskini arttırmakla beraber, bazı sporadik vakalara da rastlanabilir. Aile öyküsü alınmayan ve atipik seyreden olgularda eritrosit zar bozukluğunu belirlemek için eritrosit zar proteinlerinin kantitatif analizleri gerekebilir (Celkan 2009). 1

13 Genlerin son ürünleri olan proteinlerin kalitatif ve kantitatif analizine olanak veren teknikler gün geçtikçe önem kazanmaktadır. Günümüzde proteomik olarak adlandırılan teknolojileri kullanmak sureti ile gerek elektroforetik gerek spektrometrik yöntemler ıģığında proteinler ifade değiģimlerinden, translasyon sonrası aktivite ve fonksiyonlarına doğrudan etkili modifikasyonlara kadar detaylı olarak incelenebilmektedir. Şekil Kalıtsal Sferositozda OluĢan Sferositler ( Amaç ve Kapsam Herediter sferositoz Türkiye de sık görülmekle birlikte hastalığın kesin sıklığı ve protein bozukluk tipleri hakkında veriler henüz yeterli değildir. Herediter sferositoz tanısında kullanılan teknikler oldukça sınırlıdır. Hastalık tanısında kullanılan ozmotik frajilite testi sporadik olgularda ve sınırdaki hastalarda kesin teģhis için yeterli değildir. Bu çalıģmada, herediter sferositoza yol açan membran protein eksikliklerinin elektroforetik ve spektrometrik yöntemler ile araģtırılması amaçlanmıģtır. 2

14 Elektroforetik çalıģmalarda herediter sferositoz ile iliģkili olgularına ait, hastalıktan doğrudan etkilenen eritrosit membran örnekleri ve kontrollere ait eritrosit membran örneklerinin iki boyutlu protein profilleri arasındaki farklılıkların araģtırılması amaçlanmıģtır. Hastalıkta etkin rol oynadığı bilinen ve en sık rastlanan membran protein eksiklikleri arasında yer alan ankrin ve spektrin proteinlerinin ifade modelleri üzerinde özellikle yoğunlaģılmıģtır. Spektrometrik çalıģmalarda ise; elektroforetik çalıģmalarımızda HS ve kontrollere ait iki boyutlu protein profillerinde ilgilenilen proteinlerin ifade farklılıklarının yanısıra protein profillemesi sonucu HS olguları ve kontrol bireyleri arasında anlamlı farklılık gözlenen eritrosit membran protein kümelerinden de MALDI-TOF kütle spektrometresi için analiz peptitleri izole edilerek biyoinformatik analizlerle Peptid Kütle Parmakizi (PMF) analizleri gerçekleģtirilerek oluģturulan peptit kütüphaneleriyle proteinlerin kimliklendirilmesi amaçlanmıģtır. Aynı zamanda çalıģmada elektroforetik ve spektrometrik analizlerin HS olgularında tanıda kullanılabilirliklerinin araģtırılması da hedeflenmiģtir. 3

15 2. KAYNAK ÖZETLERİ Hemolitik Anemi Hemolitik anemi, eritrositlerin yaģam sürelerinin eritrosit dıģı sebeplerle veya eritrositlerin kendilerine ait yapısal değiģikliklere bağlı olarak kısalmasından kaynaklanan bir anemi grubudur. Eritrositlerin kan dolaģımına girdikten sonra belli bir yaģam süresi vardır. Bu süre normal koģullarda ortalama 120 gündür. Hemolitik anemilerde bu süre kısalmıģtır. Kemik iliği, erken eritrosit yıkımına eritrosit yapımını arttırarak cevap verir ve gerektiğinde eritrosit yapımını 6-7 kat arttırabilecek yedek güce sahiptir (Öngören 2001). Bu Ģekilde eritrosit yıkımının telafi edilebildiği durumda anemi görülmez. Eritrosit yapımındaki artıģın eritrosit yıkımındaki artıģı karģılayamadığı durumda ise hemolitik anemi ortaya çıkar Hemolitik anemilerin sınıflandırılması Hemolitik anemiler farklı Ģekillerde sınıflandırılabilir (Çizelge 2. 1.). Eritrositlerin erken yıkıma uğraması yıkımın gerçekleģtiği bölgeye göre sınıflandırıldığında 2 sınıfa ayırmak mümkündür; Damar içi yıkım (İntravasküler hemoliz): Eritrositler dolaģımda lizise uğrar ve içerikleri direkt çevre kanına salınır. Damar dıģı yıkım (Ekstravasküler hemoliz): Eritrositler karaciğer ve dalakta bulunan doku makrofaj sistemi (Retikülo endotelyal sistem=res) tarafından parçalanır. Eritrosit kaynaklı patolojilere bağlı olarak veya eritrositlerden bağımsız olan nedenlere göre de hemolitik anemiler gruplandırılabilir (Çizelge 2.1). 4

16 Çizelge Hemolitik anemilerin nedenleri ile sınıflandırılması 5

17 Hemolitik anemiler, hemoliz nedenlerine göre de sınıflandırılabilir ; Eritrosit içi yıkımda (İntrakorpuskuler hemoliz) hemoliz nedeni eritrosit membranında, hemoglobin yapısında veya enzimatik iģlevlerde meydana gelen bozukluklardır. Eritrosit dıģı yıkımda (Ekstrakorpuskuler hemoliz) ise eritrosite karģı oluģan antikorlar hemoliz nedenidir. Ayrıca hemolitik anemileri doğumsal (konjenital) ve edinsel olarak ayırmak da mümkündür. Birkaç istisnai durum hariç eritrosit içi yıkımdan kaynaklanan hemolitik anemiler doğumsal, eritrosit dıģı yıkımdan kaynaklanan hemolitik anemiler ise edinseldir. Hemolitik anemi tanısını koyduracak tek bir test yoktur. Eritrosit yıkımındaki artıģ ile ilgili testler, eritrosit yapımındaki artıģ ile ilgili testler ve tanıda yararlı olabilen ekstra testler yapılmalı ve testlerin bir bütün olarak ele alınarak değerlendirilmesi gereklidir. Yine de ayırıcı tanının zor olabileceği unutulmamalıdır (Öngören 2001). Eritrosit membran bozukluklarından ileri gelen herediter sferositoz, herediter eliptositoz, herediter stomatositoz, herediter piropoikilositoz gibi hastalıklar kalıtsal hemolitik anemilerin önemli bir grubunu oluģturmaktadır. Bu hastalıklar belirgin klinik ve laboratuvar farklılıkları ile karakterizedir. Son moleküler çalıģmalar bu hastalıklarda önemli genetik heterojenitenin de olduğunu ortaya çıkarmıģtır. Bu durum özellikle her bir akrabanın sferositoz genlerinden birinde özel bir mutasyon bulundurduğu herediter sferositoz hastalığı gibi patolojilerde geçerlidir (Gallagher 2005). Her ailede Ģiddeti farklı hastalığa sahip aile bireyleri bulunabilir. 6

18 2. 2. Herediter Sferositoz Herediter sferositoz (HS) eritrosit membran kusurlarından ileri gelen yaygın ve oldukça heterojen bir hemolitik anemi çeģididir (Hassoun ve Palek 1996). Hastalık klinik olarak çevresel (periferik) kan yaymasında sferositlerin görülmesi, değiģik derecelerde hemoliz ve splenomegali (dalak büyümesi) ile karakterize edilir (Tse ve Lux 1999). Anormal eritrosit morfolojisi (sferosit) ve hücre sağkalım süresindeki azalma spektrin, ankrin, band 3, protein 4.2 gibi eritrosit membran proteinlerinden bir ya da birkaçının eksikliği ya da bir iģlev bozukluğu nedeniyle meydana gelir (Bolton-Maggs vd. 2004, Delaunay vd 1996; Tse ve Lux 1999). HS ilk kez 1871 yılında Vanlair ve Masius adında iki Belçikalı bilim adamı tarafından tanımlanmıģtır. Bundan 20 sene sonra Wilson ve Minkowski ilk kez bir ailede üç nesilde sekiz HS olgusu bildirmiģlerdir. Morton ve arkadaşları (1961), HS nin yaklaşık 5000 bireyde 1 bireyi etkilediğini ve muhtemelen tüm etnik gruplarda görüldüğünü iddia etmiştir. Sessiz olguların da araģtırılması ile hastalığın yaklaģık 1/2000 yaygınlığı ile Kuzey Avrupa kökenli insanlar arasında en sık rastlanan eritrosit membran hastalığı olduğu tespit edilmiģtir. Ancak hastalığın çok hafif formları çok daha yaygın olabilir (Iolascon ve Avvisati 2008). Hastalık dünya çapında görülmekle birlikte siyah ırkta nadir rastlanır. Türkiye de de sık görülmekle birlikte kesin sıklığı ve protein bozukluk tipleri hakkında veriler henüz yeterli değildir (Celkan 2009). Herediter sferositozun moleküler nedenleri son on yıl içerisinde ortaya çıkarılmıģtır. Ortak bir bozukluktan ziyade hemen hemen her ailede benzersiz, özgün bir mutasyon vardır. Olguların yaklaģık %75 i otozomal dominanttır (Guitton vd 2008). Geri kalan hastalar ise sporadik veya otozomal resesif kalıtılır (Köksal 2004). 7

19 Baskın (dominant) sferositozda;ankrin, band 3 ve spektrin-β genlerindeki anlamsız mutasyonlar ve çerçeve mutasyonları hakimdir (Eber ve Lux 2004). Otozomal resesif kalıtım gösteren olgularda ise; α-spektrin veya protein 4.2. deki protein defektleri sıklıkla görülmektedir (Gundel ve Eber 2010). Resesif HS olgularının ANK1 ve SPTB genlerinde özellikle de novo mutasyon sonucunda oluştuğu son yıllarda belirlenmiş, gen değişimleri tanımlanmıştır(iolascon vd 1998). EriĢkin dönemde görülen HS için hastalığın Ģiddetinde hafif, tipik (orta) ve ağır olmak üzere üç sınıflandırma vardır. Sınıflandırma ağırlıklı olarak Hb konsantrasyonu, serum bilirubin ve retikülosit sayısı üzerinden yapılır (Iolascon vd 1998) (Çizelge 2. 2.). Çizelge Herediter sferositozda hastalığın Ģiddetinin klinik bulgulara göre sınıflandırılması (Bolton-Maggs vd 2004 den modifiye edilmiģtir). Hafif seyreden HS olgularında hemoglobin ve bilirubin seviyesi normal olabildiğinden bu bireylerde hastalığın tespiti zor olabilmektedir (Bolton-Maggs vd 2004). Sferositozun derecesi ve aneminin ciddiyeti etkilenmiģ aile bireylerinde benzer olmayabilir. Hastalığın klinik seyri, mutasyonlar sonucunda iskelet proteinlerindeki azalmanın derecesine bağlı olarak çok değiģken olabilmektedir (Uysal vd 2001). 8

20 Hastalıktan etkilenmiģ kiģiler minimal hemolizle anemi olmaksızın asemptomatik olabildiği gibi, ağır hemolitik anemi de görülebilir. Aynı zamanda hastalığın ağırlığı spektrin eksikliğinin yüzdesi ile doğrudan orantılıdır (Çizelge 2. 3.). Otozomal dominant vakalarda spektrin miktarı normalin %20-30'u, otosomal resesif vakalarda ise %70-90 ı olarak bulunmuģtur (Timur 2001). Çizelge Herediter sferositozda genetik kusurların klinik ve moleküler karakterizasyonu (Perrota vd 2008) HS olguları Kalıtım Yaygın Mutasyonlar Proteindeki Azalma Hastalık Şiddeti Çevresel yayması kan Ankrin-1 (HS Tip-1) ABD ve Avrupa %40-65 ; Japonya %5-10 OD,OR,d e novo OD veya de novo: null mutasyon; OR: missens ve promotor mutasyonları Spektrin ve ankyrin-1 %15-50 Hafif/orta Sferositler α- Spektrin (HS Tip-3) <%5 OR α -LEPRA alleli ve null mutasyon α -spektrin %50-75 Ağır Sferositler, büzülmüş hücreler poikilositler ve β- Spektrin (HS Tip-2) %15-30 OD, de novo Null mutasyon β-spektrin %15-40 Hafif/orta Sferositler, %5-10 akantositler Band 3 (HS Tip-4) Protein 4.2 (HS Tip-5) %20-35 OD Fonksiyonel olarak null mutasyon ABD ve Avrupa <%5; Japonya %45-50 OR Missense (4.2 Nippon prevalansı) Band 3 %15-35 Protein 4.2 % Hafif/orta Hafif/orta Sferositler, nadiren mantar şekilli hücreler Sferositler, ovalostomatositl er OD : otozomal dominant. OR: otozomal resesif. LEPRA: Low expression allele Prague HS li hastalarda eritrosit membran proteinlerinin ilk biyokimyasal analizlerinde eksikliğin spektrin olduğu görülmüģtür. Hastalığın ciddiyeti ve splenektomiye cevabı spektrin eksikliğinin miktarıyla iliģkilendirilmiģ (Agre vd 1985), devam eden sitogenetik çalıģmalar ve bağlantı analizleriyle altta yatan asıl nedenin ankrin eksikliği olduğu görülmüģtür (Lux vd 1990). Daha sonra Savvides ve arkadaģları (1993) HS li pek çok olguda spektrin ve ankrin eksikliğinin birlikte bulunduğunu açıklamıģlardır. ġimdiki bilgilerimize göre HS, eritrosit membran iskeleti ve lipid tabaka arasında yer alan vertikal (dikey) etkileģimi oluģturan proteinlerdeki defekt sonucu oluģmaktadır (TaĢdemir 2009). 9

21 SDS-PAGE kullanılarak yapılmıģ pek çok araģtırma göstermiģtir ki HS li hastaların % inde kombine spektrin-ankrin defekti, yaklaģık % 30 unda izole spektrin defekti ve yaklaģık % 20 sinde band 3 defekti bulunmaktadır (Jarolim vd 1996, Dhermy vd 1997, Lanciotti 1997). Ġzole protein 4.2 defektine az sayıda Amerikalı ve Avrupalı hastada rastlanırken Japonlarda sık olduğu gözlenmiģtir (TaĢdemir 2009) (Çizelge 2. 4.). Çizelge Membran protein bozukluklarının görülme sıklıkları (TaĢdemir 2009) Olguların yaklaģık %75 inde bir aile öyküsü vardır (Bolton-Maggs vd 2004). Aile öyküsü bulunmayan yaklaģık %25 lik kısımda aile bireylerinde defekt tespit edilemez. Bu durum spontan mutasyonları veya hastalığın otozomal resesif formlarını ifade eder (Hassan vd 2009). Resesif HS hastalarının ebeveynleri klinik olarak asemptomatiktir. Asemptomatik taģıyıcılık denilen bu durumda anemi, splenomegali, hiperbilirubinemi ve periferik yaymada sferosit yoktur. Bu olgularda %2 civarında retikülosit, haptoglobin miktarında hafif azalma ve hafif artmıģ ozmotik frajilite saptanabilir. Ġnkübasyonlu ozmotik frajilite testi (OFT) taģıyıcılar için en duyarlı test olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte tanıda standart test haline gelen OFT nin normal olması HS olmadığı anlamına gelmez. Hastaların %10-20 sinde normal bulunabilir. Dünya nüfusunun %1.4 ünün taģıyıcı olduğu düģünülmektedir (Gallagher vd 1998, Gallagher vd 2001, Canbolat Ayhan 2006). Normal bir bireyde her gün dolaşımdaki eritrositlerin %1'i hemolize uğrar ve kemik iliğinde eritrosit yapımı ile eritrosit sayısı sabit tutulmaya çalışılır. Hemolitik hastalıklarda 10

22 eritrositlerin yaşam ömrü kısaldığından kemik iliği aşırı çalışarak bu açığı kapatmaya çalışır ve retikülosit oranı ve mutlak sayısı artar. Dolayısıyla retikülosit sayısının artmış olduğu durumlarda hemolizden şüphelenmek gerekir. Retikülosit olgunlaģmamıģ eritrositlerin en son safhasıdır. Olgun eritrosit haline gelmeden önce bir retikülosit iki gününü kemik iliğinde, bir gününü de çevre kanında geçirir. Retikülosit sayısı kemik iliğinin anemiye yanıtını, yani ilikteki eritropoetik aktiviteyi gösterir. Orta derecede anemi durumlarında (Hgb <10 g/dl), ilik normal ise, eritropoetin hormonunun etkisiyle 10 gün içinde eritrosit yapımının 2-3 kat artması beklenir. Akut kan kaybı veya hemolizden sonra bu yanıt retikülosit yüzdesinin artması Ģeklinde görülür (retikülositoz). Herediter sferositozda membran proteinlerindeki kantitatif veya kalitatif eksiklikler sonucu eritrosit yüzeyinden lipit kaybı meydana gelmiģ ve eritrosit yüzey-hacim oranının azalmıģtır. Eritrositler sferosit Ģeklini almıģ ve ozmotik olarak kırılgan hale gelmiģtir. Normal eritrositler dalak sinüzoidlerinin porlarından rahatça geçerken, sferositik ve kırılgan hale gelen eritrositler normal eritrositlere göre rijid olduğu için dalak pulpasındaki porlardan geçemezler. Hastalıkta görülen hemolizin baģlıca nedeni bu sferositlerin dalakta yakalanarak yıkıma uğramasıdır (ġekil 2. 1). Bu nedenle temelde zar bozukluğuna bağlı olan hemolizde dalağın da önemli rolü vardır (Timur 2001, Köksal 2004, Perrota vd 2008, Celkan 2009). Splenektomi ile anemi ve sarılık kalıcı olarak düzeltilir, eritrositlerin ömrü normale döner. Fakat Ģekilleri sferosit olarak kalır. 11

23 Şekil Retikülositin dalak pulpasından geçiģi sırasındaki deformasyonu Sferositlerin çapları normal eritrositlere göre daha küçüktür. Santral solukluk kaybolmuģtur. Sferosit varlığı herediter sferositoza özgü değildir. Herediter sferositozda, otoimmün hemoltik anemilerde ve alloimmün hemolitik anemilerde ve bazı konjenital hemolitik anemilerde aģağıda belirtildiği gibi görülebilir. Bununla birlikte, sferosit gözlenen hastalarda klinik bulgular ve direkt antiglobulin testi (DAT= Coomb s testi) de göz önüne alınarak doğru tanı konulabilir (Bain vd 2005). Ġzoimmün hemolitik anemi: Yenidoğan bebeklerde ABO uyuģmazlığı herediter sferositozu taklit edebilir. ABO uyuģmazlığında periferik yaymada sferositler görülür. Ancak direkt coombs testinin pozitif olması ile ayrılır. Otoimmün hemolitik anemi: Daha önce sağlıklı olan bir kiģide aniden ortaya çıkan hemoliz ile karakterizedir. Periferik yaymada sferositlerin olması nedeni ile herediter sferositoz ile karıģabilir. Direkt coombs testinin pozitif olması ile ayrılır. Ağır hipofosfatemi: Sferositoza neden olur. Diğer konjenital hemolitik anemiler Sferosit oluģumu yalnız HS olgularına özgü bir durum olmadığından diğer hastalıklarla karıģabilmesi durumunun yanısıra, Mariani ve arkadaģları (2008) sferosit sayısının HS nin 12

24 tipi veya membran bozukluk Ģiddeti ile iliģkili olmadığını, %10 HS olgusunda çok az sayıda, veya saptanamayan düzeyde sferosit bulunduğundan bazı HS hastalarında yanlıģ teģhis konulmasına veya tam tersi HS hastalarının gözden kaçmasına yol açtığını göstermiģlerdir. Splenomegali de HS hastalarına özgü bir durum olmayıp herediter sferositoz dıģında, otoimmün hemolitik anemi, talassemi majör gibi anemiler yanında farklı grup hastalıklarda da (lösemi, lenfoma gibi) görülebilmektedir. HS tanısı için kullanılan biyokimyasal testlere ek olarak geliģtirilen bazı yöntemler vardır. Bu yöntemler prensiplerine göre 2 kategoriye ayrılabilir ; Birinci prensip ağır koģullarda eritrositlerin dayanıklılığının ölçümüne dayanan ozmotik frajilite testi ile örneklenebilir. Tanı yöntemlerinde Ġkinci prensip ise doğrudan eritrosit membran proteinlerini ölçmekte kullanılan SDS-PAGE yöntemi ile örneklenebilir. Ozmotik frajilite testi : Eritrositlerin yoğunluk yüzdesi giderek azaltılan tuzlu su ortamında tutularak her yoğunlukta hemoliz oranının belirlenmesi ilkesine dayanır. Bu test eritrositlerin hipotonik solüsyonlara direncini ölçer. Eritrositlerin yüzey alanı - hacim iliģkisini değerlendirir. Yüzey alanının hacime oranı azalmıģsa (sferosit) ozmotik frajilite artmıģtır. Hipotonik solüsyonlara direnç azalmıģtır. 13

25 Şekil Ozmotik frajilite testinde kullanılan NaCl dilüsyonları ( Ozmotik frajilite testi özetle aģağıdaki aģamalardan oluģur; Heparinize kan, azalan konsantrasyonlarda NaCl çözeltisine konarak oda ısısında bekletilir. Tüplerde gözlenen hemoliz, eritrositlerin hipotonik hasara hassasiyet derecesinin göstergesidir (ġekil 2.2) Normal eritrositler zarları esnek olduğundan %0.9 (izotonik), 0.8, 0.7, 0.6, 0.5 NaCl çözeltilerinde su alıp ĢiĢmelerine rağmen hemolize uğramazken herediter sferositozda ozmotik frajilite artmıģ olduğundan eritrositler %0.7 lik tuz çözeltisinde bile hemolize uğrayabilirler. 540 nm dalga boyunda spektrofotometrede tespit edilen % hemoliz ve %NaCl konsantrasyonu arasında çizilen grafik sonucunda eğri normal sınırların dıģına, sola doğru kayıyorsa HS tanısı konur. Eğrinin sağa doğru kaydığı durumda tanı talassemidir (ġekil 2. 3.). Çevresel yaymasında sferositleri olan, klinik olarak herediter sferositoz düģünülen fakat ozmotik frajilite testi normal bulunan olgularda, ozmotik frajilite testi inkübasyonlu olarak tekrar edilmelidir (Öngören 2001). 14

26 Şekil Ozmotik frajilite testine ait grafik ( Chauffard ve arkadaģları 1907 yılında HS olgularına ait eritrositlerde ilk kez bu gün HS tanısında en güvenilir tanı yöntemlerinden biri olan yukarıda anlatılan osmatik frajilite testini, eritrositlerin hipotonik tuz çözeltisinde hemolize uğradığını göstererek keģfetmiģlerdir. Bu nedenle hastalık Minkowski-Chauffard hastalığı ismiyle de anılır (Packman 2001, Bolton-Maggs vd 2004, Guitton vd 2008, Celkan 2009). Jacob and Jandl (1964), sferositlerdeki dayanıksızlığın eritrosit membranında Na + ve K + iyonları ile ilgili olduğunu ortaya koymuģtur (Iolascon vd 1998). Na + ve K + geçirgenliğinin artması sonucu Na + -K + ATPaz pompası sürekli olarak yüksek bir hızda çalıģmaya devam eder ve hücrelerin glukoz ihtiyacı artar. ATPaz bağımlı Na + -K + pompası bozularak eritrositlere Na ve su girişi artar. Sonuçta eritrositler lizise uğrar. Ozmotik frajilite testi gibi indirekt testlerin avantajları hızlı olmaları, kolay uygulanabilirlikleri ve az miktarda kan örneği gerektirmeleridir (Iolascon 2010). Ancak bu tip testlerin özgüllüğü düşüktür, pozitif sonuç her zaman HS ile ilişkilendirilemez. Aynı zamanda bu testleri güvenilirliği de düşük testlerdir. Bu sorunların giderilmesi amacı ile bir grup sağlıklı donör negatif kontrol olarak kullanılabilir. Yine bazı laboratuvarlarda 15

27 ozmotik frajiliteyi değerlendirmek için birden fazla test kullanılmaktadır. Ayrıca günümüzde bu yöntemlerin eksiklikleri moleküler düzeyde çalışmalar ile giderilmeye çalışılmaktadır. SDS-PAGE yöntemi: Herediter sferositoz, herediter eliptositoz ve herediter piropoikilositoz teģhisinde baģlıca moleküler yöntem SDS-PAGE dir. Bu hastalıklarda eritrosit zarı proteinlerinde görülen sıra dıģı durumlar SDS-PAGE yöntemiyle belirlenebilir (Bolton-Maggs vd 2004). Ankrin ve spektrin eksiklikleri ve bunların band 3 ile oranları, yine band 3 eksikliği ve bunun protein 4.1 ve protein 4.2 ye oranı SDS-PAGE ile tanımlanabilmiģtir. SDS-PAGE yöntemi HS'de eritrosit zarı protein eksikliğinin belirlenmesinde ve kalıtsal eliptositozda spektrin varyantlarının tespitinde Ģu anda halen kaynak laboratuvar yöntemi olarak kabul edilmektedir. Bununla birlikte ne yazık ki bu yöntem çok zahmetli bir yöntemdir ve jel kalitesi, kan örneklerinin depolanma Ģekli, protein izolasyonu, boyama koģulları, sıcaklık gibi pek çok faktöre bağlıdır. Bu nedenle SDS-PAGE yönteminin kullanımı çok az sayıdaki uzmanlaģmıģ laboratuvarlar ile sınırlıdır ve yöntemin uygulanması oldukça uzun sürmektedir. SDS-PAGE yöntemi, jelde elde edilen bantların dansitometrik eğrilerinin çizdirilmesi ve böylece zar proteinlerinin miktarının ölçülmesi esasına dayanır. Eritrosit membran proteinlerinin SDS-PAGE yöntemiyle analizi, HS li olgularda karģılaģılabilecek 4 belirgin alt grubu açıklayabilir, aynı zamanda pek çok alternatif protein eksikliklerinin tanımlanmasına yardımcı olabilir (Jarolim vd 1996, Gallagher vd 2001). HS için geliģtirilen testlerin pek çok eksiklikleri vardır. Özellikle tanıda sınırda kalan hastaların teģhisi için tek bir test yeterli olmamaktadır. Ġndirekt testlerden güvenilir sonuç alabilmek için yukarıda belirtildiği gibi birden çok test kullanılarak tanıya gidilebilir. SDS-PAGE yönteminin herediter sferositozda eritrosit membran bozukluklarının tanımlanmasında major bir klinik etkisi olmamakla beraber, hastalığı taklit eden ve benzer klinik bulgular veren diğer hemolitik hastalıklardan ayırıcı tanı olarak kullanılması yararlı olabilir. Günümüzde SDS-PAGE analizleri hastalığın moleküler lezyonlarının tanımlanması için referans test olarak kullanılmaktadır (Mariani vd 2008). 16

28 Bu bağlamda, özellikle tanıda sınırda kalan HS olguları için günümüz proteom çalıģmalarında sıklıkla kullanılan ve proteinlerin SDS-PAGE deki gibi yalnızca molekül ağırlıklarına göre tek bir biyofiziksel özelliğine göre değil, aynı zamanda izoelektrik noktalarına göre de ayrıldığı iki boyutlu jel elektroforezi tekniği ile yapılan protein profillemesi çalıģmaları ile tanıya yardımcı bilgiler elde edilebilir Eritrosit Membran Yapısı Ġnsan eritrosit hücreleri homojen olmaları, kolay temin edilebilirliği ve genetik, enzimatik ve klinik araģtırmalar için sunduğu pek çok avantaj sebebiyle kapsamlı olarak incelenmiģtir (Edwards vd 1979). Eritrosit membranı diğer hücre membranlarında olduğu gibi protein, lipid ve karbonhidratlardan oluģur. Membranın dıģ yüzeyinde lipit tabaka ve bunun altında membran iskeletini oluģturan 12 major ve yüzlerce minor proteinin bulunduğu protein ağı bulunur (Yenerel 2004). Membran proteinleri diğer biyomembranlarda olduğu gibi membran-protein etkileģimlerine bağlı olarak lipid tabakanın içinde boylu boyunca gömülü; integral (intrensek) veya membranın dıģ yüzeyine gevģek olarak yapıģmıģ halde; periferal (ekstrensek) olarak iki genel kategori içerisinde sınıflandırılırlar. Birçok biyomembran, membran proteinlerinin her iki tipini de içerir. Ġntegral proteinler, eriyik halindeki maddelerin hücre içi ile dıģı arasında taģınmasını sağlar. Bunların içinde en önemlileri band 3, glikoforin A ve glikoforin B dir. Periferal proteinler ise ankrin, spektrin, aktin ve protein 4.2 olarak bilinir. 17

29 Eritrosit membranı hücre iskeleti olarak adlandırılan bir protein ağ yapısı ile güçlendirilmiģtir. Eritrosit hücre iskeleti, plazma membranının tümünün temelini oluģturan yoğun fibriler bir iskeletten oluģur. Ġskelet yapısı birçok noktada integral membran proteinlerine bağlanır ve eritrosit plazma membranına sağlamlık ve esneklik kazandırır. Bu yapı, diğer memeli hücrelerinde bulunan, yine birçok noktada plazma membranına bağlanarak sitoplazmaya tipik olarak yön veren hücre iskeletinden farklıdır. Eritrosit hücre iskeleti α ve β alt birimlerinden oluģan spektrin proteini ile onu hücre membranına bağlayan aktin ve ankrin gibi diğer proteinlerden meydana gelir. Ġskelet proteinleri ile lipit tabaka ve transmembran proteinleri arasındaki bağlantılar membran dengesini sağlar. Bu bağlantılar dikey ve yatay olarak iki tiptir. Yatay bağlardaki bozukluk herediter eliptositoz veya herediter piropoikilositoza, dikey bağlardaki bozuklukların herediter sferositoza neden olduğu bilinmektedir. Dikey bağlar zar iskeleti ve lipit tabaka arasında yer alırken yatay bağlar band 3, ankrin, spektrin ve protein 4.2 arasındadır (ġekil 2. 4). Şekil Eritrosit membran yapısı (An ve Mohandas 2008 den TürkçeleĢtirilmiĢtir). (GPA: Glikoforin A, GPC: Glikoforin C) 18

30 Ankrin proteini, spektrin proteinini integral proteinlerden olan band 3'e bağlar ve hücre zarının dikey olarak kararlılığını sağlar. Benzer Ģekilde aktin de spektrin proteinin hücre membranının eksternal proteinlerinden protein 4.1'e bağlanmasını sağlayarak yatay olarak güçlendirilmesini sağlar. Spektrinin ağsı yapısı hücreye esneklik ve güç verir. Spektrin tetramerleri kuyruk kısımlarından protein 4.1 ile aktin isimli proteine, bir taraftan da bir transmembran proteini olan ankrine bağlanarak lipit tabakasının dıģ yüzeyine çıkan band 3 ile birleģirler. Kendilerine özgü bikonkav yapısıyla eritrositler çok ince kapillerlerden bile bu esneklikleri sayesinde kolayca geçerler ve hemen bikonkav Ģekillerine geri dönerler. Eritrositlerin yaygın çalıģmaları integral membran proteinlerinin hücre iskeletinin temelini oluģturmak için nasıl bağlandığını, bu etkileģimlerin membran proteinlerini nasıl hareketsiz hale getirdiğini ve bir hücreye spesifik Ģekillerini nasıl verdiğini göstermektedir.hücre iskelet proteinleri toplam membran proteinlerinin %50-60 lık kısmını oluģturur ve SDS- PAGE ile birbirlerinden ayırdedilebilirler. Deterjanlar fosfolipid çift tabakasının içine girerek membranları parçalayan, lipidleri ve proteinleri çözen amfipatik moleküllerdir. Sodyum dodesilsülfat (SDS) gibi iyonik deterjanlar yüklü bir grup içerir, suda çözünür proteinlerin iç kısmını oluģturan hidrofobik kısımlara olduğu kadar membran proteinlerinin hidrofobik bölgelerine de bağlanırlar. Yüklerinden dolayı, bu deterjanlar iyonik bağları ve hidrojen bağlarını da parçalar. Yüksek konsantrasyonlarda, SDS her zincire bağlanarak proteinleri tamamen denatüre eder. Böylece jel elektroforezinde SDS de çözünen proteinlerin hareketliliği moleküler ağırlıklarının iyi bir ölçüsüdür (YeĢilkaya 2009) Eritrosit Membran Proteinlerine Genel Bakış ve Herediter Sferositoz ile İlişkileri Agre ve ark (1985) HS nin eritrosit membranında spektrin eksikliğinden kaynaklandığını göstermiģlerdir. Lux ve ark nın (1990) yaptığı sitogenetik çalıģmalar ve bağlantı analizleriyle HS de altta yatan nedenin ankrin eksikliği olduğu bulunmuģtur. Daha sonraki yıllarda Jarolim ve ark (1995) resesif vakaların özellikle ANK1 ve SPTB genindeki 19

31 de novo mutasyonlar sonucu ortaya çıktığını belirtmiģlerdir. HS ile ilgili kapsamlı bilgilere eriģebilmek sodyum dodesilsülfat kullanılarak çalıģılan poliakrilamid jel elektroforezinin (SDS-PAGE) geliģtirilmesiyle mümkün olmuģtur (Laemmli 1970, Fairbanks vd 1971). Bu yöntemle Agre ve arkadaģları (1985) pek çok HS olgusunun spektrin defekti nedeniyle oluģtuğunu göstermiģler, daha sonra spektrin eksikliğinin SPTA1 geni ve daha sıklıkla SPTB genindeki mutasyonlar sonucu olabileceği ve en sık görülen durumun ANK1 genindeki mutasyonlar neticesinde ankrin ile birlikte her iki spektrin zincirinde ikincil azalmanın meydana geldiği durum olduğunu ortaya çıkmıģtır (TaĢdemir 2009). Dolayısıyla bugünkü bilgilerle herediter sferositoz genellikle ankrin, spektrin, band 3, protein 4.2. gibi birkaç eritrosit membran proteininin kalitatif veya kantitatif anormalliği ile iliģkilidir (Maciag vd 2009). Yukarıda bahsedildiği gibi HS olgularının büyük bir kısmında temel moleküler bozukluk ankrin ve spektrin eksikliği olmakla birlikte yapılan çalıģmalarla hastalıkta esas olarak aģağıda belirtilen dört çeģit eritrosit membran protein anormalliği tespit edilmiģ ve bu proteinlerdeki eksiklik veya kusurların hastalıkta rol oynadığı belirlenmiģtir; Ankrin ve spektrinin ikisinin birlikte eksikliği Yalnız spektrin eksikliği Band 3 eksikliği Protein 4.2 kusurları (Gonzales ve Eichner 2009) SDS-PAGE yöntemi kullanılarak yapılan çeģitli çalıģmalar HS olgularının %30-45 inin ankrin ve spektrin birlikte eksikliğine, %30 unun izole spektrin eksikliğine ve %20 sinin de band 3 eksikliğine sahip olduğunu göstermiģtir. HS olgularında %5 civarında görülen protein eksikliği az sayıda Amerikalı ve Avupalı hastada görülmüģtür ancak Japon ırkta daha yaygındır (Reliene 2001) Yine Eber ve ark (1990) tarafından herediter sferositoz un değiģken klinik Ģiddeti üzerine bir araģtırma yapılmıģ ve 63 ü çocuk olmak üzere 80 olgu ve 27 akraba ile yapılan 20

32 çalıģmada taģıyıcı ve hafif olguların eritrosit spektrin konsantrasyonları normal bulunurken orta Ģiddette ve ağır seyreden olgularda spektrinin önemli ölçüde azaldığı gösterilmiģtir Ankrin Ankrin sadece eritrosit membranında değil nöral doku ve iskelet kası dokusunda da kendini ifade eder. Beyin hücrelerinde bulunan ankrin, biyokimyasal olarak eritrosit ankrinine benzer ve ANK2 geni tarafından kodlanır. Eritrosit ankrini ise 8p11.2 kromozomu üzerinde konumlanmıģ ANK1 geni tarafından kodlanan, 206 kda kütleye sahip ve 1880 aminoasitten oluģan bir proteindir (Hassoun ve Palek 1996). Band 3 ve spektrin bağlantısını kurar ve zar iskeletinin lipit tabakaya tutunmasını sağlar. Böylece ankrin eritrosit membran iskeletinin stabilizasyonunda önemli rol oynar (White vd 1990). Eritrosit membran iskeleti ile ilgili yapılan çalıģmalarda, ankrin proteininin spektrinin eritrosit membranı üzerine bağlanmasında temel bir bağlantı bölgesi oluģturduğu, dolayısıyla eritrosit membranında ankrin eksikliği durumunda spektrin sentezi normal olsa dahi membran-spektrin arasındaki bağın zayıflamasına neden olabileceği gösterilmiģtir (Perrota vd 2008, Gundel ve Eber 2010). Böylece, ankrin eksikliğine bağlı HS olgularında spektrin sentezi normal olduğu durumlarda dahi spektrin içeriğinde oransal bir azalma meydana gelir. Kombine ankrinspektrin eksikliği otozomal dominant olgularda oldukça yaygındır (Savvides vd 1993). HS olgularının %75-80 inde kombine ankrin-spektrin eksikliği görülür ve iki protein eģit seviyede azalır (Gonzales ve Eichner 2009). Ġtalyan HS olguları ile yapılan bir çalıģmada HS olgularında en yaygın mutasyonun ankrin mutasyonu olduğu ve dominant ve resesif HS nin baģlıca sebebini oluģturduğu yinelenmiģ, mevcut data üzerinden HS nin lipid tabaka ile iskelet proteinleri arasındaki etkileģimin bozulmasından kaynaklandığı ve membran bütünlüğünü korumada ankrin in oluģturduğu dikey bağların çok önemli olduğu yargısına varılmıģtır (Lanciotti vd 1997). 21

33 Homozigot HS olgularının letal olduğu, bu nedenle tüm HS olgularının homozigot olduğu bildirilmiģse de (Gonzales ve Eichner, 2009) Türk HS olgularına ait örnekler ile yapılan bir ortak çalıģmada daha önce düģünülenin aksine baskın ankrin bağlantılı HS ile ilgili bir mutasyon için homozigotluğun yaģamla bağdaģabileceği gösterilmiģtir (Gallagher vd 2007). Ankrin eksikliği bulunan HS hastalarının yaklaģık üçte birinde bir ankrin mrna alleli delesyon, çerçeve mutasyonu veya anlamsız mutasyonlar nedeniyle neredeyse silinmiģtir ve bu durum transkripsiyonu, iģlenmeyi ve ankrin mrna stabilitesini değiģtirir (Lanciotti vd 1997). Yapılan genetik çalıģmalarda çok sayıda ankrin geninde (ANK1) de novo mutasyon olduğu ve ankrin eksikliğinin baskın geçiģ gösterdiği ortaya konmuģtur (Celkan 2009). ANK1 geninde mutasyon sonucu sferositoz tip 1 ortaya çıkmaktadır. Son yıllarda yapılan çalıģmalarla farklı etnik gruplarda ANK1 geninde 55 farklı mutasyon tanımlanmıģtır, bu mutasyonlardan bazıları Çizelge te gösterilmiģtir. Yine son yıllarda gerek kapsamlı çalıģmalarla gerek olgu raporları ile alfa ve beta spektrin, band 3, protein 4.2 gibi diğer membran proteinlerindeki çeģitli mutasyonlar da tanımlanmıģtır. Çizelge Herediter sferositoz ile iliģkili bazı ankrin mutasyonları (Gallagher ve Forget 2008 den TürkçeleĢtirerek ve değiģtirilerek alınmıģtır) 22

34 Spektrin Spektrin eritrosit membran iskeletinde en bol bulunan proteindir ve eritrosit membranının temel bileģenidir. 1q22-q23 ve 14q23-q24.2 kromozomları üzerinde konumlanmıģ (Hassoun ve Palek 1996) SPTA1 ve SPTB genleri tarafından kodlanan alfa (α) ve beta (β) alt birimlerinden meydana gelir (Dhermy vd 2000). SPTA1 geninde mutasyon sonucu sferositoz tip 3, SPTB geninde mutasyon sonucu sferositoz tip 2 ortaya çıkar. Son yıllarda yapılan çalıģmalarda spektrin yapısındaki spesifik mutasyonların hastalığın ana sebeplerinden olduğu anlaģılmıģtır. Eksikliğin derecesi eritrositlerin sferosit Ģekilli oluģu, frajilitesi, hemolizin ağırlığı ve hastaların splenektomiye cevabı ile iliģki gösterir. Spektrin eksikliği baskın ve çekinik Ģekillerde görülebilir. Ġnsanlarda alfa spektrin yapımı beta spektrin yapımından üç-dört kat daha fazladır. Eritrosit membran iskeletinin biyosentezinde zincir üretim hızını belirleyen beta spektrindir. Heterozigot alfa spektrin bozukluğunda bile beta spektrin zincirleriyle eģleģecek yeterli alfa zinciri bulunmaktadır. Bu nedenle herediter sferositozda spektrin bozukluklarının çoğunluğu beta spektrin geninde bulunmaktadır. Alfa spektrin eksikliği olan hastalar ise ancak homozigot olduklarında bulgu verirler. Beta spektrin zincir yapımında bozukluk olduğunda baskın geçiģ olduğu düģünülür (Celkan 2009). Böylece, α spektrin mutasyonları herediter sferositozun çekinik formları ile iliģkili iken, β spektrin mutasyonları otozomal dominant kalıtılır (Maciag vd 2009). Resesif geçiģ gösteren herediter sferositoz olgularının büyük kısmında spektrin eksikliğinin nedeni bilinmemektedir. Çok ağır spektrin eksikliği olan HS olgularının küçük bir bölümünde mutant bir allel (α Lepra=Low expression Prague) tespit edilmiģtir. Bu allel ile null mutasyon taģıyan baģka bir allelin bir araya gelmesinin resesif herediter sferositoza 23

35 sebep olabileceği düģünülmektedir. Beta spektrin mutasyonlarının çoğunun null aleller ile olduğu gösterilmiģtir. Aralarında akrabalık olmayan pek çok hastada tek bir nükleotid delesyonuna bağlı mutasyon tespit edilmiģ (spektrin Houston) ve bunun HS ile iliģkili yaygın bir beta spektrin mutasyonu olabileceği düģünülmüģtür. Spektrin Kissimmee yine tanımlanmıģ bir diğer mutasyondur. Burada beta spektrin protein 4.1 e bağlanamayan, aktine ancak zayıf bir Ģekilde bağlanan ve stabil olmayan bir durumdadır (Canbolat Ayhan 2006). Yine Hassoun ve arkadaģları (1996) 17.ekzonda bir nokta mutasyonu sonucu meydana gelen ve çift ekzon atlamasına neden olan Winston-Salem adında yeni bir β spektrin varyantı tanımlamıģ, transkripsiyonel mesajdaki kararsızlığın ve kırpılmıģ spektrinin anormal protein oluģumuna ve nihayetinde membranda spektrin eksikliğine yol açtığını kanıtlamıģ ve bu mutant spektrinden hareketle membran üzerindeki α-β spektrin heterodimerlerinin bağlanmasında β spektrin molekülünün oynadığı düzenleyici rolün önemini vurgulamıģlardır. Perrota ve arkadaģları kesik bir zincir (truncated chain) ile karakterize edilen β spektrin- Bari adı verilen bir β spektrin varyantı tanımlamıģ, bu mutant genin transkribe olduğunu, ancak RNA sının gerek normalinden (wild type), gerekse beta spektrin Winston-Salem mrna sından daha düģük olduğunu göstererek farklı uç birleģtirme (splice) bölgelerindeki mutasyonların aynı kırpma etkisine rağmen nasıl farklı klinik tablolar oluģturabileceğini göstermiģlerdir (Perrota vd 2009). 24

36 Çizelge Herediter sferositoz ile iliģkili bazı α spektrin ve β spektrin mutasyonları (Gallagher ve Forget 1998 den TürkçeleĢtirerek ve değiģtirilerek alınmıģtır) 25

37 Band 3 Band 3, 17q21-q22 kromozomal yerleģimindeki AE1 (SLC4A1) geni tarafından kodlanan, ankrin, protein 4.1 ve protein 4.2 aracılığı ile zar iskeletine bağlanan ana bütünleyici proteindir. Eritrosit membranında en bol bulunan integral protein (Hassoun ve Palek 1996) olan band 3, 911 aminoasitten oluģur (Alloisio vd 1996) ve hücrede su ve anyon taģınmasından sorumludur (Celkan 2009). AE1 geninde mutasyon sonucu sferositoz tip 4 ortaya çıkar. Jarolim ve arkadaģları 166 otozomal dominant HS olgusuyla yaptıkları çalıģmada band 3 geninde 13 yeni ve birbirinden farklı mutasyon tanımlamıģlardır (Jarolim vd. 1996). Bunun dıģında çeģitli ülkelerde yapılan çalıģmalarla band 3 geninde pek çok mutasyon tanımlanmıģtır. Bunlardan bazıları Çizelge 2.7. de gösterilmiģtir. Çizelge Herediter sferositoz ile iliģkili bazı band 3 mutasyonları (Gallagher ve Forget 1997 den TürkçeleĢtirerek ve değiģtirilerek alınmıģtır) 26

38 Protein 4. 2 Protein 4.2, 72kDa moleküler ağırlıkta bir periferal proteindir. 15q15 kromozomal yerleģimindeki EPB42 geni tarafından kodlanır (Hassoun ve Palek 1996, Satchwell vd 2009). EPB42 geninde mutasyon sonucu sferositoz tip 5 ortaya çıkar. Protein 4.2, band 3 ün stoplazmik bölgesine bağlanarak ankrin-band 3 bağlantısında önemli rol oynar (Iolascon vd 1998). Bu nedenle HS hastalarında protein 4.2 eksikliği sıklıkla ankrin veya band 3 eksikliği ile birlikte bulunabilir. Membrandaki protein 4.2. varlığı çoğunlukla band 3 varlığına bağlıdır. Band 3 proteininde azalmaya neden olan bir band 3 mutasyonuı protein düzeyinde de orantılı bir azalmaya sebep olur (Satchwell vd 2009). Bununla birlikte bazı hastalarda tek baģına protein 4.2 eksikliği de görülebilir. Tek baģına eksikliği çekinik geçiģ gösterir, hafif bir klinik tablo oluģturur ve hastaların çevresel kan yaymalarında az sayıda sferositin yanı sıra ovalosit ve stomatositler de görülebilir (Celkan 2009). Çizelge Herediter sferositoz ile iliģkili bazı protein mutasyonları (Gallagher ve Forget 1997 den TürkçeleĢtirerek ve değiģtirilerek alınmıģtır) 27

39 Çizelge Eritrosit membran proteinlerinin genleri ve kromozomal yerleģimleri Proteomik Bilimin en önemli dönüm noktalarından biri olan Ġnsan Genom Projesi nin amacı, tüm insan genomunun dizisini ve bütün genlerini belirleyerek bir kaynak oluģturmaktı. Ġnsan Genom Projesi nin tamamlanması yaģamın moleküler temelinin anlaģılması için yürütülen araģtırmaların sayısını artırmıģtır. Genom projesi ile elde edilen bilgilerin klinik çalıģmalara uygulanması ve yeni tedavi yöntemlerinin geliģtirilmesi ihtiyacı ile proteomik kavramı da hızla geliģmeye baģlamıģtır (Karataylı 2008). mrna düzeyinin kodlanmıģ proteinin aktivitesini yansıtmaması, mrna düzeyinde proteinlerin glikozilasyon, fosforilasyon gibi sentez sonrası çeģitli değiģikliklerle (post translasyonal modifikasyonlarla) ilgili bilgi vermemesi gibi nedenlerle proteom çalıģmaları proteinlerin yapı ve fonksiyonlarının aydınlatılmasında vazgeçilmezdir. Bu nedenledir ki Ġnsan Genom Projesi nin ardından gene ait protein ürünlerinin teker teker incelenmesini amaçlayan Ġnsan Proteom Projesi ile ilgili çalıģmalar yakın zamanda baģlamıģtır. Günümüzde moleküler biyolojide gelinen sistem biyolojisine giden bütünleģtirci yolda önümüzdeki yıllarda kromozomlardaki yeri ve nükleotid dizilimi saptanan genlerin ürünlerinin, gen ifadesini kontrol eden mekanizmaların görevlerinin ve birbirlerini nasıl etkiledikleri gibi proteomiks çalıģmaların ağırlık kazanacağı görülmektedir. 28

40 Proteom kelimesi ilk olarak 1994 te Avustralyalı araģtırmacı Marc.R. Wilkins tarafından, bir organizmanın genomu tarafından ifade edilen proteinlerin tümü olarak tanımlanmıģtır. Proteom, bir organizma, doku veya hücrede herhangi bir anda bulunan proteinlerin tümünü ifade eder. Proteomun geniģ çaplı protein ayırma ve tanımlama tekniklerinin kullanılması ile analiz edilmesi olarak bilinen proteomiks ifadesi ise dinamik bir terim olup farklı koģullarda hücre, doku veya vücut sıvılarındaki proteinlerin kantitatif ve kalitatif analiz teknolojisi olarak tanımlanır. Proteomiks teknolojisi ile sağlık ve hastalık gibi farklı koģullarda bulunan hücre, doku ve vücut sıvılarındaki proteinlerin birbirleri ile iliģkileri, yapı ve fonksiyonları sistematik olarak incelenmekte, kalitatif ve kantitatif analizleri yapılmaktadır. Özellikle değiģik hastalık durumlarında proteinlerin fonksiyonlarını anlayabilmek için proteinlerin yapısal değiģimlerini saptamak yeni tedavi yöntemleri geliģtirebilmek açısından gereklidir. Erken teģhis için biyolojik belirteçler bulmak ve tedavi sürecini Ģekillendirebilmek için potansiyel hedefler belirlemek mümkündür. Günümüzde proteomik çalıģmaların temelini iki boyutlu jel elektroforezi ve kütle spektrometrelerinin oluģturduğu görülmektedir Protein izolasyonu Organ, doku, hücre veya çeģitli vücut sıvılarından proteomik analizlerin gerçekleģtirilebilģmesi için öncelikle proteinlerin izole edilmeleri gerekir. Bu yapılardaki protein içerikleri analiz edilebilmeleri için önce hücrenin dıģına, bir sıvı içerisinde çıkarılmalıdırlar. Bu sıvı genellikle proteinlerin fizyolojik özelliklerini koruyabilecekleri bir tampondur. Bu tampon içerisinde hücre zarını parçalayacak ajanlar, ph ı uygun seviyede tutacak tamponlar, proteaz inhibitörleri ve proteinlerin maksimum miktarda elde edilebilmesini sağlayan maddeler bulunmalıdır. Organ, doku ya da hücreler özelliklerine bağlı olarak bistüri, bıçak, havan, sonikatör gibi araçlar kullanılar parçalanırlar. Proteinleri hücre içerisinde tutan hücre zarının kırılmasından sonra oluģan protein ve nükleik asit çözeltisine hücreden arındırılmıģ lizat (cell-free lysate, CFL) adı verilir. CFL lerdeki nükleik asit ve diğer protein dıģı maddeler genellikle santrifüj kullanılarak uzaklaģtırılır. 29

41 Proteinlerin farklı yapılarda olmaları, farklı organ, doku, hücre ve hücre bölgelerinde bulunmaları ve izolasyonlarının farklı amaçlara yönelik olması nedeni ile izolasyon için kullanılan yöntemler oldukça değiģkenlik gösterir Proteinlerin ayrımı (elektroforetik, kromatografik vs.) Proteinlerin ayrımında kullanılacak örneklerin özelliğine ve çalıģmanın amacına göre elektroforetik ve/veya kromatografik teknikler kullanılabilir. Elektroforetik yöntemlerden günümüz proteomik çalıģmalarında 2D-PAGE tekniği yüksek ayırma gücü ile verimli sonuçlar elde edilmekle birlikte çalıģmanın özelliğine göre SDS-PAGE yöntemi de oldukça sık kullanılmaktadır. Ġki boyutlu jel elektroforezinde protein molekülleri önce birinci boyut ayrımda ph gradiyentine sahip immobilize Ģeritler (IPG Ģeritler) kullanılarak izoelektrik noktalarına göre ayrıldıktan sonra ikinci boyutta SDS jellerde moleküler ağırlıklarına göre ayrılırlar. 1.boyut ayrımda, protein karıģımı elektrik akımı altında IPG Ģerit üzerinde her protein kendi izoelektrik noktasına (ph sına) göre toplam yükünün sıfırlandığı,yüksüzleģtiği bölgeye göç eder ve o noktada hareketsiz durur. Protein moleküllerinin SDS jeldeki hareketleri ise yüklerine ve boyutlarına bağlıdır. Eğer protein moleküllerinin yükleri eģit ise o zaman hareket yalnızca büyüklüğe (kütleye) bağlı olarak gerçekleģecektir. Proteinlerin disülfit bağları 2-merkapto etanol, ditiyotreitol (DTT) gibi indirgeyici ajanlarla kırıldıktan sonra elektroforez uygulanır ve böylece proteinlerin molekül ağırlıkları hesaplanabilir. Protein moleküllerinin sodyum dodesil sülfat (SDS) ile muamelesi sonucu polipeptit zincirlerinin ikincil, üçüncül ve dördüncül yapıları parçalanır. Ayrıca deterjan, proteinin hidrofobik bölgelerine bağlanarak, proteinlerin doğal yüklerini maskeler. Sonuçta, 30

42 polipeptit zincirlerinde sabit bir yük/kütle oranına sahip tek bir yapı ortaya çıkar. SDSpolipeptit kompleksi, SDS ile hazırlanmıģ bir jele konulduğunda ortamdaki hızını belirleyen temel etken molekül ağırlığıdır. Elektrik alan sadece filtrasyon olayının itici gücü görevini yapar (GüneĢtutar ve Rodop 2009). 2D-PAGE yöntemi yüksek ayırma gücüne sahip, tek bir jelde yüzlerce proteini tespit etmeye olanak sağlayan güçlü bir yöntemdir. Bu yöntemde boyamadan sonra jel üzerinde çok sayıda proteinin varlığını gösteren noktalar belirir. Bu noktaların yorumlanabilmesi veya diğer noktalarla karģılaģtırılabilmesi için bilgisayar desteğine ihtiyaç duyulur. Yapılan analizler sonucu hedefe yönelik pek çok veri elde edilebilir Protein tanımlaması ( Kütle spektrometreleri, Edman) Kütle spektrometreleri nötr moleküllerin çeģitli kaynaklarla iyonlaģtırılması ve böylece pozitif olarak yüklenmiģ iyonların bir elektrik ve/veya bir manyetik alandan geçerken kütle/yük (m/z) oranlarına göre ayrılması esasına dayanır. Kütle spektrometrelerinde iyonlaģmayı sağlayacak iyonlaģtırıcı (Lazer veya elektron sprey), kütle çözümleyici (TOF, Quadrupol veya iyon-tuzağı) ve detektör kısımları bulunur. Örneğin MALDI (Matrix-assisted laser desorption/ionization), bir matriks varlığında analizi yapılan molekülün yüzeyden kopma ve iyonizasyonu için gerekli enerjiyi lazerden kullanan bir çarpma iyonizasyon tekniğidir. MALDI iyonizasyon tekniğinde her bir lazer atıģında oluģan iyonların ayrılması ve çözülmesi için bir atıģ analizörüne ihtiyaç vardır. MALDI ile rutin olarak kullanılan iyon ayırıcı kütle analizörü, iyonların ağırlıklarıyla doğru orantıda bir süre içerisinde detektöre ulaģmasını sağlayan time of flight (TOF) analizördür. 31

43 Moleküller normalde yüklü halde değildir, kütle spektrometreleri iyonizasyon iģlemi ile molekülleri uyararak yüklü iyonize moleküller haline dönüģtürürler. Yüklü moleküller stabil değillerdir ve diğer moleküllerle veya bir yüzey ile temas ettikleri zaman parçalanır ve yüklerini kaybederler. OluĢan her bir iyon spesifik bir moleküler kütleye ve yüke sahiptir ve m/z değerlerinin yoğunluğa (intensite) karģı gösterildiği bir spektrum ile bileģik tanımlanmaktadır. Her bir iyonun yoğunluğu detektöre ulaģan miktarı ile orantılıdır ve her bileģiğin spektrumu kendine özeldir. Bilinmeyen bir örneğin analizi sonucu elde edilen spektrum referans spektrumu ile karģılaģtırılarak tanımlanır. Günümüzde hızla geliģen kütle spektrometreleri gerek jel tabanlı, gerek jel tabanlı olmayan proteomiks çalıģmalarında protein ve peptidlerin nitel ve nicel analizlerine olanak vermektedir Eritrosit membran proteinlerinin proteomik yöntemlerle araştırılması 1970 den bu yana eritrosit membran proteinlerinin iki boyutlu jel elektroforezi ile ayrılması üzerine farklı metod, çözünürlük ve elektroforetik modeller içeren bir dizi araģtırma yayınlanmıģtır. Bununla birlikte son on yılda protein ayırma ve tanımlama teknolojisi özellikle ; tekrarlanabilir spot pozisyonlarının elde edilmesine olanak veren IPG Ģeritlerin geliģtirilmesi, protein kümelerinin tespitinde hassas boyaların kullanımı, biyolojik kütle spektrometreleri proteinlerin hızlı bir Ģekilde tespitine izin veren biyoinformatik veritabanlarının bulunması ile birlikte önemli ölçüde geliģmiģtir. Bu yeni teknoloji proteomik olarak adlandırılır (Low vd 2002). GeliĢen proteomik teknolojisi ile birlikte eritrosit membran proteinlerinin kalitatif ve kantitatif analizi için iki boyutlu jel elektroforezinin ve protein tanımlanmasında kütle spektrometrelerinin kullanımı artmıģ, ancak herediter sferositoza yönelik bu tip proteomik çalıģmalar sınırlı sayıda kalmıģtır. 32

44 Mariani ve arkadaģları nın 300 HS olgusu ile yaptıkları ve bugüne kadar HS olguları üzerinde yapılmıģ en kapsamlı klinik ve hematolojik çalıģmada herediter sferositozda eritrosit membran bozukluklarının tanımlanmasının major bir klinik etkisi olmamakla beraber, hastalığı taklit eden ve benzer klinik bulgular veren diğer hemolitik hastalıklardan ayırıcı tanı olarak kullanılması yararlı olabileceği belirtilmiģtir (Mariani vd 2008). Eritrosit membran proteinlerinin 2-D jel elektroforezi ile incelenmesi HS gibi kalıtsal hastalıkları incelemek için potansiyel olarak değerli bir yöntemdir. Yük ve moleküler ağırlık gibi iki bağımsız biyofiziksel değiģkene dayalı bu protein ayırma yöntemi özellikle kompleks karıģımların ayrımı, translasyon ve fosforilasyon sonrası değiģimleri göstermesi açısından klinik proteomikste oldukça önemlidir (Bruschi vd 2005). 33

45 3. MATERYAL ve YÖNTEM Materyal Bu tez çalıģması Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü Merkez Laboratuvarı Proteombilim Birimi nde gerçekleģtirilmiģtir. Tüm kan örnekleri Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Moleküler Genetik Bilim Dalı Laboratuvarı ndan temin edilmiģtir Hasta ve kontrol örnekleri Bu tez çalıģmasında kullanılan tüm hasta kan örnekleri Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Moleküler Genetik Bölümü nden temin edilmiģtir. Hasta grubu için HS teģhisi konmuģ, Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Moleküler Genetik Bölümü ne rutin tetkike gelen HS hastalarının kan örnekleri, kontrol grubu için ise HS yönünden sağlıklı olduğu bilinen bireylerin kan örnekleri kullanılmıģtır. HS teģhisi konmuģ 4 olgu ile ailesinde ve kendisinde HS öyküsü bulunmayan 5 kontrol birey kullanılmıģtır. 2 proband aileleri ile birlikte çalıģılmıģtır. Tüm HS, kontrol ve proband aile bireyleri özellikleri ile çizelge de özetlenmiģtir. ÇalıĢmada Tüm bireylerin ozmotik frajilite testleri deney verileri ile uyumluluğunun araģtırılması için Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi Pediatrik Moleküler Genetik Bölümü nden temin edilmiģtir. Tüm HS olguları ve kontrol bireyler bilgilendirme onam formunu imzaladıktan sonra çalıģmaya dahil edilmiģtir. 34

46 Çizelge ÇalıĢmaya dahil edilen tüm bireyler ve özellikleri Hasta/Kontrol Durumu OFT Testi C. Y. (HS Hafif) OFT normal A. B. Proband 1 (HS Ağır) % 12 hemoliz Ç. B. Proband 1/ anne OFT normal T. B. Proband 1/ baba OFT normal H. Y. Proband 2 (HS) % 10 hemoliz K. Y Proband 2/ baba (HS) % 9.7 hemoliz B. Ç. KONTROL OFT normal B. A. KONTROL OFT normal N. İ. KONTROL OFT normal N. A. KONTROL OFT normal S. P. KONTROL OFT normal Kullanılan kimyasal maddeler ve cihazlar Kullanılan bütün kimyasallar moleküler biyoloji ve/veya proteomiks çalıģmalarında kullanılmaya uygundur. Deneylerde kullanılan kimyasalların listesi Ek 1 de verilmiģtir. Kullanılan cihazlar üreticilerinin talimatlarına uygun olarak kullanılmıģtır. Deneylerde kullanılan cihazların listesi ve hangi amaçlarla kullanıldığı Ek 2 de verilmiģtir. Tüm deneylerde Millipore (Milli-Q ve Elix filtreleri) saf su sisteminden elde edilen ddh 2 O kullanılmıģtır Yöntem Tam kandan eritrosit izolasyonu EDTA lı tüplere alınmıģ olan HS olgularına ve kontrol bireylerine ait tam kanlardan fikol yoğunluk gradiyenti yöntemi ile eritrositler izole edilmiģtir. Bu amaçla tüplerdeki tam 35

47 kanlar önce buz üzerinde 4ºC de 1 saat bekletilmiģtir. Daha sonra kanların miktarlarına göre her bir örnek için tam kan miktarı kadar fikol (PAA) temiz tüplere alınmıģtır. Kanlar pipet yardımı ile kan ile fikolün birbirine karıģmamasına dikkat ederek çok yavaģ bir Ģekilde fikol üzerine bırakılmıģtır. Hazırlanan tüpler 600xg ve 20ºC de hızlanma/yavaģlama dereceleri: 2/2 olacak Ģekilde 30 dk. santrifüj edilerek tam kandan plazma, lökosit ve eritrositlerin izolasyonu gerçekleģmiģtir (ġekil 3. 1.). Şekil Fikol ile tam kandan eritrosit izolasyonu Eritrositlerden membran eldesi HS olguları ve kontrol bireylerine ait eritrositlerden membran eldesi Dodge (1963) metodunda aģağıdaki değiģiklikler uygulanarak gerçekleģtirilmiģtir; Tam kandan izole edilen eritrositler membran preperasyon çözeltisi (5 mm Tris-HCL, ph 7.4, 0.1 mm EDTA) ile lize edildikten sonra, lizatlar önceden soğutulmuģ santrifüjde rpm de 20 dakika santrifüj edilmiģtir. ĠĢleme gri-beyaz membran (ghost) elde edilinceye kadar devam edilmiģtir. 36

48 Protein miktar tayini ve rehidrasyon Elde edilen membranlar uygun miktarda membran preperasyon çözeltisinde çözülerek Bradford (mikro-bradford) yöntemi ile protein miktar tayinleri yapılmıģtır (Bradford 1976). Bu iģlem için 5X stok halinde alınan konsantre Bradford protein boyası (Bio-Rad) ultra saf su ile 1X e seyreltilmiģtir ve 96 kuyucuklu mikro plakalara her bir kuyu 200 μl boya içerecek Ģekilde pipetlenmiģtir. Daha sonra 2000µg/ml stok bovin serum albumin (BSA) ultra saf su ile seyreltilerek 250, 500, 750 ve 1000 μg/ml konsantrasyonlarda protein içerecek Ģekilde protein standartları hazırlanmıģtır. Kör (su), standartlar ve örnekler kuyucuklardaki 200µl boya üzerine 10µl olacak Ģekilde pipetlenmiģtir. Her bir standart ve örnek 3 tekrarlı çalıģılmıģ, örneklerin boyayla reaksiyona girmesi için 15 dk. oda sıcaklığında inkübe edilmiģ ve sonrasında mikroplaka okuyucuda (Molecular Devices) 595 nm. de protein miktarları ölçülmüģtür. Tüm miktar tayini hesaplamalarında standart eğrileri ve eğimleri değerlendirilmiģtir İki boyutlu jel elektroforezi Örnekler üreticilerin talimatlarında belirtilen, 7cm. IPG Ģeritlere yüklenmesi gereken protein miktar aralığı ve toplam rehidrasyon tampon miktarı göz önüne alınarak 125µl toplam hacimde 75µg protein içerecek Ģekilde rehidrasyon tamponu (7 M üre, 2 M tiyoüre, %4 CHAPS, %1 amfolit, ph 3-10, 10 mm DTT, bromo fenol mavisi) ile karıģtırılarak aktif rehidrasyon tepsilerine (tray) pipet yardımı ile çizgi halinde yüklenmiģ, üzerine ph 3 10 aralıklı 7 cm lik lineer immobilize ph gradiyent (IPG) Ģeritler (Bio-Rad) yerleģtirilerek 50V da 16 saat aktif rehidrasyon yapılmıģtır. 37

49 Daha sonra IPG Ģeritler birinci boyut ayrım olan izoelektrik odaklama (IEF) iģlemi için temiz bir odaklama tepsisine alınmıģ ve IEF cihazına (Bio-Rad) yerleģtirilerek izoelektrik noktalarına göre ayrım (15 dk. 250 V, 1 sa. 4 kv, toplamda 20 kv/sa değerine ulaģana kadar 4 kv) sağlanmıģtır. Bu iģlemin ardından Ģeritler, ikinci boyut ayrıma (moleküler ağırlıklarına göre) hazır hale gelmeleri için, çalkalayıcı üzerinde 15 dk. dengeleme tamponu I (6 M üre, 1.5 M Tris-HCl ph 8.8, %2 SDS, %20 gliserol, %2 DTT) ve 15 dk. dengeleme tamponu II (6 M üre, 1.5 M Tris-HCl ph 8.8, %2 SDS, %20 gliserol, %2.5 iyodoasetamid ve bromo fenol mavisi) ile muamele edilmiģtir. Ardından IPG Ģeritler %4 lük toplama ve %12 lik ayırma jellerinden oluģan 1 mm. kalınlığındaki SDS poliakrilamit jellere mekanik olarak yerleģtirilmiģtir. YerleĢtirmenin kolay olabilmesi için tarak boģluğuna Ģeritleri yerleģtirmeden önce %0.5 lik agar koyulmuģtur. Yürütme tamponu olarak SDS tampon (%3.03 Tris-base, %1.44 glisin, %1 SDS) kullanılmıģtır. Jeller 10 dk. 80 V toplama jelinde hizalandıktan sonra izleme boyası jelin altına ulaģıncaya kadar 120 V sabit voltajda yürütülmüģtür. Böylece proteinlerin ikinci boyutta, moleküler ağırlıklara göre ayrımı gerçekleģmiģtir. ÇalıĢmada jeller her bir örnek için en az 2 teknik tekrarlı olarak yapılmıģtır Jellerin boyanması, görüntülenmesi ve analizi Elektroforez iģlemi sonrası jeller floresans özellikte bir boya olan Sypro Ruby (Bio-Rad) ile üreticinin talimatlarına göre boyanmıģtır. Bu amaçla, yürümesi tamamlanan jeller önce çalkalayıcı üzerinde 45 dk. fiksatif çözeltisine (%10 metanol, %7 asetik asit) alınmıģ, daha sonra gece boyu boyada çalkalanmıģtır. Boya sonrasında tekrar 45dk. fiksatifte çalkalanan jeller son olarak kontaminasyonu önlemek amacıyla 1-2 damla asetik asit damlatılmıģ distile su içerisine 38

50 alınarak görüntülenmeye ve saklanmaya hazır hale gelmiģtir. Jeller VersaDoc (Bio-Rad) görüntüleme sisteminde UV altında görüntülenmiģtir. Değerlendirme hem görsel olarak hem de PDQuest (Bio-Rad) programı kullanılarak karģılaģtırmalı analizler Ģeklinde gerçekleģtirilmiģtir Proteinlerin Jelden Kesilmesi ve Tripsinizasyon Yapılan analizler sonucu ilgilenilen protein spotları belirlenmiģ, daha sonra jel robotik bir sistem olan SpotCutter (Bio-Rad) cihazında tekrar görüntülenmesi yapılarak bu sportlar iģaretlenmiģtir. ĠĢaretlenen spotlar 1,5 mm. çaplı daire parçaları Ģeklinde kesilmiģtir. Kesimi yapılan parçalar, her bir kuyucuğuna önceden 200 er μl. ddh 2 O konmuģ 96 kuyucuklu V tabanlı plaka kuyucuklarına seçilen yön ve kuyuya göre aktarılmıģtır. Jellerden ilgilenilen spotların kesiminin ardından tripsin enzimiyle peptit izolasyonu iģlemi gerçekleģtirilmiģtir. Bu amaçla öncelikle amonyum bikarbonat ve asetonitril ile jel parçalarından boya uzaklaģtırılmıģtır (destaining). Daha sonra DTT ile redükleme, iyodoasetamid ile alkilleme yapılmıģtır. Bu iģlemlerin ardından her bir kuyucuğa 30 μl. 50 mm amonyum bikarbonat içinde 150 ng. tripsin enzimi koyularak enzimin kendi kendini sindirmeden jele geçmesini sağlamak için 4 C de 1 saat bekletilmiģ ve enzimin sindirim iģlemini gerçekleģtirebilmesi için de gece boyu 37 C de inkübe edilmiģtir. Daha sonra ekstraksiyon tamponu (%1 formik asit, %2 asetonitril) ile muamele edilmiģ, böylece jel içinde hapsolmuģ peptidler tampon ile açığa çıkarılmıģ ve sıvı halde temiz bir 96 kuyucuklu plakaya alınarak kurumaya bırakılmıģtır. Tripsinizasyon iģleminin bütün basamakları laminar akıģlı kabinde yapılmıģtır. 39

51 MALDI-TOF kütle spektrometresi için örnek hazırlama ve ölçüm MALDI-TOF örnek yükleme plakası (Waters) protokole uygun olarak ultrasonik su banyosunda sırasıyla; % 3-4 lük amonyum hidroksit çözeltisi, ultra saf su, metanol ve asetonitril ile 5 er dk. muamele edilerek örnek yüklemeye uygun hale getirilmiģtir. MALDI-TOF örnek yükleme plakasına yükleme yapılacağında plaka önce pipet yardımı ile tekrar 3-4 µl saf su, daha sonra kurumayı kolaylaģtırmak amacı ile 1-2 µl asetonitril ile yıkanarak temizlenmiģ ve kurumaya bırakılmıģtır. ĠyonlaĢmayı sağlayacak matriks olarak kullanılmak üzere rekristalize edilmiģ alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid (CHCA), mg. baģına 50 µl. çözücü olacak Ģekilde matriks çözücü tamponunda (%75 asetonitril, %0.1 trifloro asetik asit) çözülmüģtür. 96 kuyucuklu plaka içerisinde kuru halde bulunan peptit örneklerinin üzerine önce örnek çözücü tamponu (%50 asetonitril, %0.1 TFA) eklenerek pipetleme ile peptitler tampona geçirilmiģ, daha sonra matriks tamponu ile 1:1 oranında karıģtırılarak MALDI-TOF örnek yükleme plakasının kuyucuklarına 1,5 µl. yükleme yapılmıģtır. MALDI-TOF kütle spektrometresinin kalibrasyonu örnek plakasında bulunan Lock Mass kalibrasyon kuyucuklarına yüklenen ve moleküler ağırlıkları bilinen beģ peptit karıģımı ile yapılmıģtır (dıģ kalibrasyon). Burada hedef, bilinen peptid karıģımlarından yola çıkarak örnek karıģımındaki bilinmeyen peptidlerin moleküler ağırlıklarındaki kaymaların tayinidir. Bu amaçla, adrenokortikotropik hormon (ACTH) 18-19, (Glu1)-fibrinopeptid B (Glu-Fib), substance P, renin-14 ve anjiyotensin 1 peptitleri son konsantrasyonları pmol olacak Ģekilde stok çözeltilerden örnek çözücü tamponuyla seyreltilmiģtir. Kalibrasyonda kullanılan peptitlerin moleküler ağırlıkları Çizelge de verilmiģtir. Yapılan canlı kalibrasyon sonrası peptit karıģımı tekrar okunarak ölçümün doğruluğu test edilmiģtir. 40

52 Çizelge MALDI-TOF kütle spektrometresinin kalibrasyonunda kullanılan peptitlerin kütleleri Peptidin adı Kütlesi (Da) ACTH Glu-Fib Substance P Renin Anjiyotensin Tüm ölçümler Waters Micromass MALDI-TOF kütle spektrometresinde m/z arasında ve reflektron pozitif iyon modunda gerçekleģtirilmiģtir Peptit kütle parmakizi (PMF) verilerinin biyoinformatik analizi ve protein tanımlanması MALDI plakalarında her bir kuyucuktan elde edilen spektrumların MassLynx 4.0 programında ortalaması alınmıģ ve tüm örnek spektrumlarıaynı programda arkaplan çıkarımı iģlemine tabi tutulmuģtur. Peptit kütle değerlerinin karlıģaģtırmalı analizi için Mascot veritabanı ve Expasy sunucusu üzerinden UniProtKB bilgi tabanlı sistemi kullanılmıģtır. MALDI-TOF spektrumlarından elde edilen m/zdeğerleri belirtilen Mascot veritabanında taranırken her bir kuyucuktan elde edilen m/z değerleri 2 grup modifikasyona tabi tutularak taramaları yapılmıģtır. Seçilen modifikasyon grupları aģağıdaki gibidir; 1. Grup : Peptid örneklerine iyodoasetamid ile alkilleme yapıldığı için sistein karbamidometillenmesi sabit modifikasyon olarak seçilmiģtir. DeğiĢken modifikasyon olarak metiyonin oksidasyonu ve fosforilasyonlar seçilmiģtir. 2. Grup : Peptid örneklerine iyodoasetamid ile alkilleme yapıldığı için sistein karbamidometillenmesi sabit modifikasyon olarak seçilmiģtir. 41

53 DeğiĢken modifikasyon olarak metiyonin oksidasyonu ve fosforilasyonlar seçilmiģtir. Bu grupta değiģken modifikasyon olarak ayrıca protein-n ucu asetilasyonu da eklenmiģtir. Seçilen modifikasyonlara ek olarak diğer organizmalarda bulunabilecek ortak peptit içeren protein yanlıģ eģleģmelerini engellemek için taksonomi Homo sapiens (Human) seçilmiģ, böylece verilen m/z değerleri ile eģleģen peptidlerden yalnızca insanda bulunanların listelenmesi sağlanmıģtır. Peptid toleransı ± 1.2 Da olarak seçilmiģ, en fazla 1 kaçırılan kesime izin verilmiģtir. Expasy sunucusunda ise; HS ile iliģkili olduğu bilinen ankrin, spektrin gibi proteinler UniProtKB bilgi tabanı üzerinden teorik olarak tripsin enzimi ile kesimlenerek peptid dizileri ve m/z değerleri bulunmuģ, bulunan m/z değerleri ile MALDI-TOF kütle spektrometresinden elde edilen m/z değerleri karģılaģtırılmıģtır. Her iki yöntemle tanımlanan proteinlerden jelden kesim bölgesine göre moleküler ağırlık ve ph ları uyumlu olan proteinlere ait bilgiler araģtırma bulguları bölümünde verilmiģtir. Şekil Eritrosit membranı proteom çalıģmalarında izlenen genel strateji 42

54 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Protein Miktar Tayini HS olguları ve kontrollere ait tam kanlardan eritrosit izolasyonu ve bunu takiben eritrositlerden membran (ghost) eldesi yapılmıģ, elde edilen eritrositlerin ve eritrosit membranlarının protein miktarları Bradford yöntemi ile tayin edilmiģtir (R 2 değeri en az 0.96 olan ölçümler dikkate alınmıģ, bunun altındaki değerler için yöntem tekrar edilmiģtir). Şekil Bradford yönteminde standart proteinler ve elde edilen kalibrasyon doğrusu (R 2 =0,968) 43

55 4. 2. İki Boyutlu Jel Elektroforezi ile Protein Profillerinin Çıkarılması ve Jellerin Analizi Yöntem bölümünde bahsedildiği gibi IPG Ģeritler 75µg protein içerecek Ģekilde rehidrasyon ve IEF iģlemleri gerçekleģtirilerek hazırlanmıģ ve poliakrilamid jellere yüklenmiģtir. Örnekler arasında kıyaslama yapılabilmesi için her bir elektroforez jelindeki protein miktarlarının eģit olması gerekmektedir. Diğer koģulların stabilizasyonu ile birlikte her bir jeldeki toplam protein miktarının da eģit olması kıyaslanan örnekler arasında gerçek ifade farklılıklarının tespiti için gereklidir. Herediter sferositoz, eritrosit membran proteinlerindeki eksiklikler veya bozukluklar sonucu meydana gelen bir hastalıktır. Optimizasyon çalıģmaları kapsamında öncelikle HSkontrol grupları arasında eritrosit membran protein profillerinde görülmesi beklenen farklılığa benzer bir farklılığın eritrosit protein profillerinde de görülüp görülmeyeceğinin belirlenmesi amacıyla 2 HS olgusu ve 2 kontrol bireye ait eritrositlerden iki boyutlu protein profillemesi gerçekleģtirilmiģtir. ph 3-10 IPG Ģeritlerin kullanıldığı bu çalıģmada HS-kontrol arasında eritrositlere ait protein profillerinde anlamlı bir fark görülmemiģtir (ġekil 4. 2.) Eritrosit protein profillerinde HS-kontrol arasında yapılan kıyaslamada bir fark olmadığının belirlenmesinin ardından izole edilen eritrositlerden eritrosit membran eldesi gerçekleģtirilmiģtir. Burada hem Hb-α ve Hb-β gibi ifadesi fazla olan proteinlerin membran eldesi sırasında filtrelenmesi, hem de HS ile direkt olarak iliģkili olduğu bilinen eritrosit membran proteinlerinin eldesi amaçlanmıģtır. 44

56 Şekil Kontrol ve HS olgularına ait eritrosit protein profil haritaları Eritrositlerin yapıları basit olmakla beraber, yüksek hemoglobin içerikleri nedeni ile proteom analizlerini gerçekleģtirmek oldukça zordur (Alvarez vd 2009). Serum-plazma gibi örneklerle yapılan proteomik çalıģmalarda albumin, IgG gibi ifadesi çok olan (abundant) proteinlerin filtrelenerek (depletion) ifadesi az olan proteinlerin zenginleģtirilmesi amaçlanır. Burada Hb- α ve Hb-β gibi proteinlerin membran eldesi esnasında filtrelenmesi de aynı amaca hizmet etmektedir. Dolayısıyla önce hafif seyreden, klinik tanısı net olmayan bir HS olgusuna ait eritrosit membrandan iki boyutlu elektroforez jeli hazırlanmıģtır. Eritrosit membran eldesi sırasında yukarıda bahsedildiği gibi Hb- α ve Hb-β gibi proteinlerin filtrelenmesi de gerçekleģmiģtir. Elde edilen jelde Hb- α ve Hb-β gibi proteinler gözlenmemiģ, dolayısıyla filtrelemenin 45

57 baģarılı olduğu gösterilmiģtir. HS (hafif) olgusuna ait bu membran jelinin kontrole ait membran jeli ile PDQuest programı aracılığıyla gerek görsel gerek 3 boyutlu karģılaģtırılması sonucunda HS (hafif)-kontrol arasında HS ile iliģkili proteinler açısından anlamlı bir fark bulunamamıģ, dolayısıyla verilerimiz klinik tanıyı destekler Ģekilde bulunmuģtur (ġekil 4. 3.). Şekil Kontrol (S. P.) ve hafif seyreden bir HS olgusuna (C. Y.) ait iki boyutlu protein profil haritalarının PDQuest programında görsel olarak ve üç boyutlu gösterimi. Bu aģamadan sonra klinik seyrinin ağır olduğu bilinen bir HS olgusu (proband 1) ile kontrol bireye ait iki boyutlu elektroforez jelleri arasında yapılan karģılaģtırma sonucunda yine kliniği destekler biçimde HS (ağır)-kontrol arasında anlamlı protein ifade farklılıkları gözlenmiģtir (ġekil 4. 4.). Elde edilen bu iki bulgu 2D-PAGE yönteminin HS olgularının incelenmesinde güvenilir bir yöntem olabileceğini düģündürmüģtür. 46

58 Şekil Kontrol (S. P.) ve ağır seyreden bir HS olgusuna (A. B. : Proband-1) ait ait iki boyutlu protein profil haritalarının PDQuest programında 3D gösterimi 47

59 Şekil Kontrol-HS(hafif)-HS(ağır) bireylere ait elektroforez jellerinde membran proteinlerindeki ifade farklılıklarının karģılaģtırılması. Kontrol birey ile HS(hafif) ve HS(ağır) bireylere ait elektroforez jellerinde MALDI-TOF kütle spektrometresinde tanımlanan proteinler ve literatür taramaları doğrultusunda spektrin alfa (1 ve 2.bölge) spektrin beta (3.bölge) ve ankrin (3.bölge) proteinlerindeki ifade farklılıkları PDQuest programı ile gösterilmiģtir. Uzun yıllardır yapılan kapsamlı çalıģmalara rağmen membran proteinlerinin geniģ çaplı analizinde halen pek çok zorlukla karģılaģılmaktadır (Rabilloud 2009). Daha önce de bahsedildiği gibi eritrositlerin yüksek hemoglobin içerikleri nedeni ile karģılaģılan zorluklar olmakla beraber bunun dıģında güçlüklerle de karģılaģılmaktadır. Bunların baģında in vitro proteolitik yıkım, sitozolik proteinlerden ileri gelen kontaminasyonlar ve bazı membran proteinlerinin kaybı sayılabilir. Gerek optimizasyon çalıģmalarında kullanılan çözeltilerin farklı etkileri, gerek örneklerin saklanması esnasında proteolitik yıkımdan ileri gelen örnek bozulmaları iki boyutlu jel elektroforezinde farklı protein profilleri oluģturarak halihazırda zor olan membran proteom çalıģmalarını çok daha zor bir 48

60 hale getirmektedir. Tekrarlanabilirlikleri sağlanamayan elektroforez jelleri karģılaģtırmalı analizlere uygun olmayacağından elektroforez jellerini hazırlarken hemoglobin filtrelenmesi, kullanılan çözeltilerin özellikleri ve örnek saklanması gibi koģullar maksimum düzeyde eģ tutulmalı ve bahsedilen olumsuzluklara yönelik çözümler oluģturulmalıdır. Yukarıdaki noktalar göz önüne alınarak gerek membran eldesinde kullanılan çözeltilerde, gerek rehidrasyon tampon içeriğinde çeģitli denemeler ile optimizasyon çalıģmaları sonucunda karģılaģtırmaya olanak verecek nitelikte, tüm hasta-kontrol örneklerinde standart bir protein profili elde edilebilen bir metod oluģturulmaya çalıģılmıģtır. Bu denemeler özellikle örneğin çalıģılma koģulları, saklandığı çözeltiler ve rehidrasyon tampon içeriğinde değiģiklikler Ģeklinde aģağıdaki gibi özetlenebilir; ÇalıĢılan materyalin taze olması ve hemen çalıģılması ; Laboratuvarımıza ulaģan kan örnekleri bozulmanın minimuma indirilebilmesi amacı ile 24 saat içinde tüm basamakları tamamlanarak membranları elde edilmiģtir. Proteaz aktivitesinin engellenmesi; Membran eldesi ve saklanması sırasında kullanılan çözelti (membran preperasyon çözeltisi) içeriğine proteaz inhibitör kokteyli eklenmiģ, böylece olası proteaz aktivitesinden olabildiğince korunma amaçlanmıģtır. Jel kalitesinin iyileģtirilmesi ; Olsson ve arkadaģları (2002) çalıģmalarında hidroksietil disülfit (HED) kullanımının iki boyutlu elektroforez jellerinde kullanımının önemli bir etkiye sahip olduğunu ve büyük bir problem olan çizgilenme sorununu neredeyse ortadan kalktığını göstermiģlerdir. Biz de çalıģmamızda izoelektrik odaklama (IEF) öncesi örnekleri muamele ettiğimiz rehidrasyon tampon içeriğinde HED kullandık ancak önemli bir fark gözlemlemedik. Tüm bu optimizasyon çalıģmaları neticesinde elde edilen kontrol ve HS iliģkili bireylere ait iki boyutlu elektroforez jelleri ve gerçekleģtirilen analizler aģağıdadır. 49

61 Şekil Probandı içeren aile ile kontrollerin kıyaslanması-pdquest programında protein ifade farklılıklarının 3 boyutlu gösterimi. H. Y.: Proband-2, K. Y. : Proband-2/baba, K-1 ve K-2 : kontroller 50

62 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylerde eritrosit membran örneklerinin iki boyutlu jel elektroforezi ile elde edilmiģ protein profilleri 51

63 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait elektroforez jellerinde PDQuest programı ile bulunan protein kümelerinin (spotların) gösterimi 52

64 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylerde elektroforez jellerinde eģleģen protein kümelerinin (spotların) gösterimi. (yeģil harfler referans jeldekiler ile el ile eģleģtirilen spotlar, mavi harfler otomatik olarak eģleģen spotlar, kırmızı yuvarlaklar eģleģmeyen spotlar, mor kareli harfler yer belirleyici olarak seçilen spotlar) 53

65 ÇalıĢmada HS ile direkt olarak iliģkili olduğu bilinen ankrin, spektrin alfa, spektrin beta gibi proteinlerin kümelendiği bölgelere ağırlıklı olarak ilgilenilmekle beraber, yine de her bir jeldeki tüm spotları kapsayan genel bir eģleģtirme (matchset) de yapılmıģ ve analizler sonucunda dikkat çekici olarak HS olgularında gerek kontrollere, gerek HS iliģkili (Ç. B., T. B.) bireylere göre toplam protein spot sayısında azalma görülmüģtür. Deney sonucunda elde edilen spot sayıları ve referans jel ile eģleģme oranları Ģekil ve Çizelge de gösterilmiģtir. Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylerin karģılaģtırmalı analizinin deney özeti 54

66 Çizelge Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait jellerde PDQuest programıyla tespit edilen spot sayıları ve referans jel ile eģleģme oranları Kontroller proband 1 anne/baba HS B. Ç. B. A. N. İ. N. A. Ç. B. T. B. H. Y. K. Y. Toplam spot sayısı Referans jel ile eşleşen spot sayısı Eşleşme oranı (%) %90 %93 %91 %100 %95 %93 %91 %90 Kontrol ve HS iliģkili bireylerin elektroforez jellerinin referans jel ile karģılaģtırılması sonucu eģleģen protein kümelerinin tayininden sonra HS ile direkt olarak iliģkili olduğu bilinen, ve MALDI-TOF kütle spektrometresi ile protein tanımlanması gerçekleģtirilen ankrin, spektrin α, spektrin β gibi proteinlerin jel üzerinde tanımlandıkları bölgelere ait yoğunluk (dansite) değerleri gerek görsel 3D gösterimde gerekse sayısal veri olarak belirlenmiģtir. Burada, western blot uygulamalarında kantitatif değerler için kullanılan ve blot membranı üzerinde her bir bandın yoğunluğunun ölçülerek aktin bantlarına kıyaslanması Ģeklinde gerçekleģtirilen kantitasyon analizlerine benzer bir ölçüm söz konusudur. Bütün kriterleri (elektroforez jeline yüklenen toplam protein miktarı, jellerin boyanması ve fiksasyon süreleri gibi) sabitledikten sonra protein profil haritaları üzerinde konumlanmıģ protein spotlarının yoğunlularındaki farklılık bize protein ifadesindeki farklılığı göstermektedir. Yoğunluk ölçümleri eģleģtirme setindeki her bir jel için dansite eğrileri ve sayısal veriler olmak üzere 2 farklı Ģekilde belirlenmiģtir. Kontrol ve HS iliģkili bireylerde bahsedilen yoğunluk farklanmaları bölüm içerisinde Ģekiller ile gösterilmiģtir. 55

67 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının 3 boyutlu gösterimleri- 1. bölge için 56

68 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının dansite eğrileri ile gösterimi-1.bölge için 57

69 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin yoğunluk farklarının sayısal gösterimi-1.bölge için 58

70 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının 3 boyutlu gösterimleri- 2. bölge için 59

71 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının dansite eğrileri ile gösterimi-2.bölge için 60

72 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının sayısal gösterimi-2.bölge için 61

73 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının 3 boyutlu gösterimleri- 3 ve 4. bölgeler için 62

74 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının dansite eğrileri ile gösterimi-3.bölge için 63

75 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının sayısal gösterimi-3.bölge için 64

76 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının dansite eğrileri ile gösterimi-4.bölge için 65

77 Şekil Kontroller ve HS iliģkili bireylere ait protein profil haritalarında HS açısından önemli proteinlerin ifade farklılıklarının sayısal gösterimi-4.bölge için 66

78 Kontroller ve HS iliģkili bireylerde protein profillerinin karģılaģtırmalı analizleri sonucunda HS ile iliģkili olduğu bilinen bazı proteinlerin ifadelerinde farklar bulunmuģtur. Yapılan karģılaģtırmalarda ayrıca bilinen bu proteinler dıģında bazı bölgelerde HS iliģkili bireyler ile kontroller arasında farklı ifadeli bazı protein kümeleri tespit edilmiģtir (ġekil ve 4.23). Bu protein spotları bilinen protein değiģimleri dıģındaki değiģimler, bilinen proteinlerin varyantları veya PTM ları olabilir. Proteomikte kullandığımız yöntemler bu değiģimleri gösterebilir hassasiyettedir. Bu değiģimlerin araģtırılması hastalık patolojisinin anlaģılmasında yardımcı bilgiler verebilir. 67

79 Şekil Kontrol ve HS iliģkili bireylerde farklı ifadesi bulunan bazı protein kümeleri ve 3D gösterimleri-1 68

80 Şekil Kontrol ve HS iliģkili bireylerde farklı ifadesi bulunan bazı protein kümeleri ve 3D gösterimleri-2 69

81 4. 3. Peptit Kütle Parmak İzi Yöntemi ile Protein Tanımlanması MALDI-TOF kütle spektrometresinde beģ peptit karıģımı ile dıģ kalibrasyon sağlanmıģ, daha sonra tekrar beģ peptit okutularak ölçümün doğruluğu görülmüģ (ġekil ) ve ardından örnek kuyucuklarından peptit m/z değerleri elde edilmiģtir. Şekil MALDI-TOF kütle spektrometresinin beģ peptit karıģımı ile kalibrasyonundan sonra elde edilen beģ peptit m/z değerleri Şekil Kesilen protein kümelerinden PMF analizleri ile tanımlanan proteinlerin iki boyutlu elektroforez jel görüntüsü üzerinde gösterimi. 70