FUNGAL İNFEKSİYONLARDA MİKROBİYOLOJİK TANI- SORUNLAR. Dr. Betil ÖZHAK BAYSAN Akdeniz Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

Transkript

1 FUNGAL İNFEKSİYONLARDA MİKROBİYOLOJİK TANI- SORUNLAR Dr. Betil ÖZHAK BAYSAN Akdeniz Üniversitesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı

2 Candida türleri ve Aspergillus türleri İnvaziv fungal infeksiyon (İFi) lere neden olan başlıca etkenlerdir. Candida Aspergillus Fusarium Cryptococcus neoformans

3 -Hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HSCT) hastalarında İFİ insidansı; İnvaziv aspergillozis (İA) %43, invaziv kandidiyazis (İC) %28* -Solid organ transplant (SOT) hastalarında; kandidiyazis %53, İA %19 ** *Kontoyiannis DP ve ark. CID ** Peter G. Pappas ve ark. CID 2010.

4 Klinik FUNGAL İNFEKSİYONLARDA MİKROBİYOLOJİK TANI Mikrobiyoloji Histopatoloji Radyoloji

5 FUNGAL İNFEKSİYONLARDA MİKROBİYOLOJİK TANI Konvansiyonel yöntemler Direkt mikroskobik inceleme-boyama Kültür Serolojik yöntemler Antijen-antikor saptanması Moleküler yöntemler

6 Direkt mikroskobik inceleme-boyama yöntemleri Gram Giemsa Kalkoflor beyazı PAS H&E Wright Gomori metanamin gümüş Fontana-Masson KOH Çini mürekkebi

7 Direkt mikroskobik inceleme-boyama yöntemleri Örnekler; Uygun yerden ve yeterli miktarda Kan ml, BOS 2 ml santrifüj, steril sıvı 10ml) Laboratuvara hızlı transport Kan 2s OI, BOS 15 dk OI, 30 C 24 s OI) Hemen işleme alınması Klinik ön tanı

8 Direkt mikroskobik inceleme-boyama Avantajlar Hızlı Uygulaması kolay yöntem Uygun klinik bilgi ile birlikte özgül morfolojik özellikler (Aspergillus türleri çapı eşit hifler 4-6 µm, 45 açı ile dallanır. Septumsuz hifler kurdele gibi kıvrımlı ve 90 lik açı ile dallanma Zygomycetes, pigmentli hifler Feohifomikoz tanısı ) incelenerek tanımlamaya yardımcı olabilir. Dezavantajlar Artefaktlar (yalancı negatif ve yalancı pozitif sonuçlar ortaya çıkabilir) Parçalanmış lenfositler (BOS C. neoformans) Kollajen lifler, eküvyon lifleri (kalkoflor ile hif) Yağ damlacıkları (tomurcuklanan maya) Örnek miktarı az ise duyarlılık çok düşer. Kesin tanı koyduramaz. Negatif direkt mikroskobik inceleme mantar infeksiyonunu dışlamaz.

9 Kültür Kültür Altın standart Kandidemi tanısında kan kültürü çok değerli Kandidemide kan kültürünün duyarlılığı ortalama%50 Sıklıkla sonuç en az 5 günde çıkmaktadır. Mikroorganizma identifikasyonu ve gerekirse antifungal duyarlılığın belirlenmesi için yapılmalı

10 Kültür İzolasyon Selektif ve selektif olmayan besiyerleri birlikte kullanılmalı (BHI agar, SABHI agar, sikloheksimit, kan, A.B, zeytinyağı ilaveli besiyerleri vs.)

11 MAYALAR İdentifikasyon Koloni morfolojisi, Germ tüp testi Mısır unlu tween 80 besiyerinde morfolojik görünüm Kromojenik besiyerleri Kapsül Üreaz aktivitesi Otomatize sistemler (Phonex, MALDI-TOF MS)

12 MAYALAR Kan kültüründen tür düzeyinde direkt tanımlama Candida PNA-FISH (Peptid nükleik asit floresan in situ hibridizasyon) kiti ile floresan problar kullanarak patojen mikroorganizma genomundaki hedef bölge tanımlanarak floresan mikroskopla değerlendirilir. Kan kültürü şişelerinden Candida albicans-non albicans ayrımı yapılabilmekte infeksiyonlarının tanımlanmasında duyarlılığının ve özgüllüğünün yüksek olduğu gösterilmiştir. Avantajları; kan kültüründe üreme sinyali alındıktan 1-2 saat içinde C. albicans içerip içermediği anlaşılmış olur. C. dubliniensis PNA-FISH probu ile saptanamamaktadır.

13 Kültür Kan kültürlerinde C. glabrata izole edilen 19 hastanın 157 epizodu incelenerek üreme zamanları değerlendirilmiştir. Anaerobik kan kültürü şişelerinde C. glabrata üremesinin %58 oranında daha erken olduğu belirtilmiştir.* BACTEC Myco/ F litik şişeleri ile izolasyon oranı artmamaktadır. Myco/ F litik sistem kullanıldığında C. glabrata daha hızlı üreyebilmektedir.** * Cobos-Trigueros N. Ve ark JCM **Kirby et al. Arch Pathol Lab Med 2009;133:93.

14 Kültür KÜFLER Koloni morfolojisi Laktofenol pamuk mavisi ile mikroskobik inceleme Diğer yöntemler (Moleküler yöntemler, MALDI-TOF MS)

15 Kültür Avantajlar Kesin tanı koydurur. Altın Standart yöntem Cins ve tür düzeyinde tanımlama yapılabilir. Antifungal duyarlılık testlerinin çalışılabilmesini sağlar. Dezavantajlar Üreme süresi uzun (küf mantarları erken tanıya yardımı sınırlıdır. Kontaminasyon riski (küf) yalancı pozitiflik olasılığı kontaminasyon-kolonizasyonenfeksiyon ayırımının yapılması zor. Duyarlılık düşük (uygun ve yeterli örnek alınmazsa) Özgüllük değişken Biyopsi örneklerinde duyarlılık daha yüksek

16 MALDI-TOF-MS Klinik Mikrobiyoloji Laboratuvarlarında mantarların hızlı tanımlanmasında Yeni bir yaklaşım. Daha çok identifikasyonda kullanılmakta Direkt koloniden veya ön ekstraksiyon işleminden sonra mantarların protein profillerinin analizi yapılabilmektedir. Peptidlerin kütle parmak izini çıkarmaktadır. >%90 konvasiyonel yöntemlerle uyumlu Antifungal duyarlılık yapılabiliyor

17 MALDI-TOF-MS Veri tabanındaki bilinen türlerin spektraları ile karşılaştırılarak skorlama yapılır Skor 2 :tür düzeyinde identifikasyon Skor genus düzeyinde identifikasyon Skor 1.7 doğru identifikasyonun olmadığını gösterir

18 MALDI-TOF-MS Bu çalışmada mayalarda değerlendirilmiş. 7 genus 12 tür %85 inde doğru identifikasyon elde edilmiş. Van Veen SQ ve ark. JCM 2010;48:900

19 Dhiman N JCM 2011

20 Bruker MALDI-TOF-MS ile Shimadzu MALDI-TOF-MS sistemleri karşılaştırılmış. Klasik yöntemlerle maya izolatlarının %96.7 si Bruker ile %97.6 Schimadzu ile %96.1 i doğru tanımlanmış

21 Serolojik yöntemler BİYO-BELİRTEÇLER Fungal infeksiyon TANI, hastalığın İZLEMİ, TEDAVİYE YANIT izleminde kullanılmaktadır. Hücre duvar antijenleri ( mannan, -glukan, galaktomannan) Kapsül antijeni Mannan antikoru (anti-mannan) Fungal metabolitler (L/D-arabinitol)

22 Serolojik yöntemler Galaktomannan (GM) antijen testi Aspergillus, Penicillium türlerinin hücre duvarında yer alır. İnvaziv aspergillosis (IA) için tanı göstergesidir (ECIL, EORTC/MSG ). Bir metaanalizde*, Duyarlılık: %71 Özgüllük: %89 KİT hastalarında duyarlılık %82 ye çıkmakta Allojenik transplant hastalarda duyarlılık daha da yükselir. SOT hastalarında duyarlılık %22 *Pfeiffer CD ve ark. CID. 2006

23 Serolojik yöntemler ESCMID IDSA/ECIL öneri gücü ve kanıt düzeyi Serum ve BAL/BL örneklerinde GM laboratuvara geldiğinde en kısa sürede çalışılmalı (AI) Serum +4 C de uzun süre bekletildiğinde GM parçalanıp yalancı negatif sonuçlar vermektedir. BAL örnekler -20 C saklanabilir stabilitesi iyi İA tanısında kan GM değerliliği; HKHN nötropenik hasta (AI) hematolojik malignite nötropenik hasta (AII) nonnötropenik hasta (BII) YBÜ hastaları ve SOT alıcıları (CII) Tüm hasta gruplarında akciğer aspergillozu tanısı BAL da GM (AII)

24 GM: Sorunlar GM performansını etkileyen faktörler İnfeksiyonun yeri Etken Aspergillus türü Antifungal kullanımı M.o tarafından salınan galaktomannan molekül yapısı İmmunsupresyon derecesi (nötrofil sayısı) Hastanın karaciğer ve böbrek fonksiyonları Galaktomannan Ab varlığı Örneklerin saklama koşulları Örneklerin çalışma sıklığı Örnek tipi (serum, BAL, BOS) Testin eşik değeri (cut-off) farklılıkları

25 GM: Sorunlar Yalancı pozitiflikler -Otoantikorların varlığı -Immunglobulin -Siklofosfamit -Amoksisilin-klavulanik asit -Piperasilin-tazobaktam tedavisi -Diğer mikozların varlığı Cuenca-Estrella M.JAC 2011.

26 Serolojik yöntemler 1,3 -D-Glukan testi Maya ve küflerin hücre duvarında Candida spp. Aspergillus spp. Pneumocystis jirovecii Cryptococcus Blastomyces dermatitidis Zygomycetes Mantarların polisakkarit yapıdaki karakteristik hücre duvar elemanıdır. Diğer polisakkaritler ile çapraz reaksiyonu yoktur. Plazma, serum, BAL, BOS örneklerinde beta glukan aktivitesi Antifungal tedavisi ile azalmaz. Panfungal tarama sağlar. FDA onaylıdır

27 -D-Glukan 1,3 -D-Glukan testi Kullanılan yöntem Kabul edilen eşik sınır değeri testin performansını etkilemektedir. İnvazif kandidiyazis İnvazif Aspergillozis benzer tanısal değer İFİ radyolojik ve klinik belirtiler ortaya çıkmadan 5-10 gün önce saptanabilir. Ardışık iki pozitif testin özgüllük(%98.9) ve NPV(%94.6) değerleri yüksek olup tanıda değerlidir. Duyarlılık düşük (%49.6) olduğundan -Glukan test klinik, radyolojik, mikrobiyolojik testlerle birlikte değerlendirilmelidir. Lamort F ve ark. CID (%):

28 -D-Glukan mikroorganizma -D-Glukan testi Duyarlılık (%) Özgüllük (%) Candida spp. serum Aspergillus spp. serum P. jirovecii serum Marios Arvanitis M ve ark. Clin. Microbiol Reviews 2014

29 -D-Glukan Pneumocystis pnömonisi tanısında β-glucan testi Özgüllük %94, duyarlılık %98, NPV, %99.8, PPV %64.7 Negatif sonuç PcP nin olmadığını kesinleştirir. β-glucan düzeyi ile hastalığın şiddeti arasında ilişki yok Serum ve BAL örnekleri kullanılabilir

30 -D-Glukan Yanlış pozitiflik oranları yüksek bazı antitümör preparatlar, antibiyotikler albümin, globulin kullanılması hemodiyaliz hastalarında sellüloz membran kullanılması gazlı bez Örneklerde ardışık iki kez pozitiflik oranları düşük Rutin tanıda destekleyici Test çok pahalı

31 Kit Cutoff Pg/ml Yöntem Duyarlılık% Özgüllük% Fungitec-G-MK Test 20 kromojenik Glucan Test 11 turbidimetrik Kromojenik Fungitell (FDA onaylı) kromojenik Karageorgopoulos D.E. -D-Glucan Assay for the Diagnosis of Invasive Fungal Infections: A Meta-analysis. CID 2011;52(6):

32 Serolojik yöntemler Mannan antijen/antimannan antikor invaziv Candidiasis mannan ve anti-mannan Ab testlerinin birlikte va ardışık serum örneklerinde birden fazla çalışmalarla* duyarlılık (%80) ve özgüllük(%93) oranları artmıştır.c. albicans duyarlılık %100 olarak bildirilmiştir. ECIL klavuzunda kandidemi (CII) İnvaziv kandidiasis (BII) tanısında önerilmektedir. C. albicans germ tüp spesifik antikorları (CAGTA) D-arabinitol Enolaz, aldolaz candida enzimlerine karşı Ab larda kullanılmaktadır. *ECIL-3 Non-Invasive Diagnostic Procedures for Yeast Infections September 2009 Juan- Ies-Pins France

33 Serolojik yöntemler Lateral Akım Yöntemi (Lateral-Flow Device)LFD Aspergillus türlerinin aktif çoğalma aşamasında salgıladıkları ekstraselüler glikoproteine karşı geliştirilen monoklonal antikor (JF5) kullanılarak gerçekleştirilen immünkromatografik yöntemdir. Aspergillusa spesifik, hızlı, hasta başında uygulanabilir. BAL, serum BII-BIII

34 LFD 103 hematolojik malignite, 529 serum Serumda LFD performansı PCR ve GM ile karşılaştırılmıştır. PCR+LFD: Duyarlılık %77.3 (57-90), Özgüllük:%100(94-100) PCR+GM: Duyarlılık %77.3 (57-90), Özgüllük:%100(94-100) serum LFD PCR GM Duyarlılık (%) Özgüllük(%) PPV(%) NPV(%) Lewis White P. J Clin Microbiol 2013;51:1510-6

35 Serolojik yöntemler Hoenigl M et al.performance of Galactomannan, Beta-d-Glucan, Aspergillus Lateral-Flow Device, Conventional Culture, and PCR Tests with Bronchoalveolar Lavage Fluid for Diagnosis of Invasive Pulmonary Aspergillosis. J Clin Microbiol Jun;52(6): bağışıklığı baskılanmış hasta 78 BAL örneği, 3 kanıtlı, 14 yüksek olasılıklı, 17 düşük olasılıklı İA, 44 non-ia Kültür dışındaki yöntemlerin duyarlılığı %70-88 GM + LFD: Duyarlılık %94 Özgüllük %95 GM + PCR: Duyarlılık %100 Özgüllük %98 Konvansiyonel kültür ve Beta glukan duyarlılık düşük

36 Moleküler yöntemler Polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) Avantajlar Kısa sürede sonuç Kültürde zor üreyen mantarların gösterilebilmesi Nükleik asit miktarlarının saptanması Sorunlar Standardizasyon uygun örnek seçimi Doku Steril vücut sıvıları (BOS ) Bronkoalveolar lavaj (BAL) Kan fraksiyonları (serum, plazma, tam kan) uluslararası standartar yok mantar DNA miktarı ile kantitatif sonuç değerlendirme güçlükler) Kontaminasyon Kolonizasyon-infeksiyon ayırımı X Real-time PZR Proflaksi /antifungal tedavinin DNA salınımına etkisi Antifungal kullanımı duyarlılığı etkiliyor. İFİ tanısında PZR rehberlerde yer almamaktadır.

37 Moleküler yöntemler İFİ tanısında Aspergillus PCR testi Klavuzlarda, EORTC/MSG kriterleri arasında PCR testleri henüz yer almamaktadır. Kültür dışı yöntemler arasında; PCR testleri önemli cins ve tür düzeyinde tanımlama potansiyel azol direnci saptanması

38 PCR PCR testlerinin yeterince validasyonlarının yapılıp standardize edildiklerinde İFİ tanısında EORTC/MSG kriterleri arasında yer alabileceği belirtilmiştir. İA tanısında GM-EIA ve -D-Glukan duyarlılık ve özgüllük değerlerinin sırasıyla (%81.6-%91.6) ve (%76.9- %89.4) olduğu, PCR testi ile benzer duyarlılık (%76.8- %88), özgüllük (%75-%94.5) belirtilmiştir. Lewis White P ve ark. CID 2015:61;

39 PCR IA GM-EIA -D-Glukan PCR Duyarlılık (%) Kan 79.3 BAL Özgüllük (%) Kan BAL Kan Kan BAL Kan Kan BAL Lewis White Pve ark CID 2015:61; Karageorgopoulos DE,ve ark Clin Infect Dis 2011; 52: Lamoth F, ve ark. Clin Infect Dis 2012; 54:633 4 Mengoli C ve ark. Lancet Infect Dis 2009; 9: Pfeiffer CD, ve ark. Clin Infect Dis 2006; 42:

40 PCR IA GM-EIA ve PCR birlikte duyarlılığı(%91.6), özgüllüğü(%94.4) arttırdığı bildirilmiştir. Avni T et al. J Clin Microbiol 2012; 50: Cuenca-Estrella M et al J. Clin. Microbiol. 2009; 47: İnvaziv Candidiasis duyarlılık ve özgüllük değişken (% %100) ve (%54-%100) Kan kültürü negatif olan yüksek riskli İC hastalarında PCR pozitifliğinin saptanmasının önemi belirtilmiştir. İC tüm hasta gruplarında duyarlılık %95, özgüllük %92 Proven/probable hastalarda %85 PCR pozitiflik, kan kültür pozitifliği %38 saptanmıştır. Avni T ve ark J. Clin. Microbiol : Marios Arvanitis M et.al Clinical Microbiology Reviews 2014 ;27 (3):

41 Moleküler yöntemler Nükleik asitler Hibridizasyon Amplifikasyon Uygun klinik örnek seçimi DNA ekstraksiyonu hücre duvarının uzaklaştırılması (kimyasal, enzimatik, mekanik) 18S rrna bölgesi panfungal, 28S rrna bölgesi cins, ITS tür primerler İnternal kontrol Multipleks PCR

42 Yeni yöntemler Raman spektrometrisi (SERRS) altın veya gümüş metal düzeyde özel boya ile kaplanmış DNA nın yaydığı ışığı özel sensörleriyle algılayan yeni bir tekniktir. Mikro array yöntemi çok sayıda işaretsiz probun cam, naylon veya silikon yapıdaki katı yüzeylere yapıştırılıp tanımlanacak olan DNA nın floresan işaretli primerler kullanılarak PCR ile çoğaltılması esasına dayanan hibridizasyon tekniğidir. Lazer teknolojisi ile bağlanan ve bağlanmayan problara bakılarak tür tayini yapılır. T2 Nuclear magnetic resonance (T2MR) tam otomatik direkt kandan candida türlerini saptayan yeni moleküler yöntemdir.* Volatil organik bileşiklerin nefeste saptanması 2 pentil-furan nefes testi İnvaziv Aspergillus fumigatus hastalarının nefeslerinde saptanmıştır.** *Mylonakis E. et al. CID 2015 **Chambers ST ve ark. Med Mycol 2011.

43 SONUÇLAR Klasik yöntemler duyarlılıkları düşük olmasına rağmen altın standart, Serolojik testlerin uygulama kolaylığı ve standart kitlerinin olması ile tanı klavuzlarında yer almakta ancak tek başlarına değil klasik yöntemlerle birlikte kullanılması önerilmektedir. Hızlı tanı için PCR testlerinin standardizasyonu üzerinde çalışılmaktadır. Diğer moleküler yeni yöntemlerin karşılaştırmalı çalışmaların yapılmasına ihtiyaç duyulmaktadır.

44 EŞEKKÜRLER

45 EŞEKKÜRLER

46 mikroorganizma Tanı testleri örnek Duyarlılık (%) Özgüllük (%) Yanlış pozitiflik Yanlış negatiflik Candida spp. Kültür -glukan CAGTA kan serum serum Diğer fungal inf,sellüloz bilinmiyor - Hemolizli örnek, cut-off değerleri bilinmiyor Aspergillus spp. Histopatoloji Kültür Galaktomannan Ag -glukan Lateral-flow Ag Serum,BAL,BOS Serum Serum,BAL , , Fusarium, Scedosporium Hemolizli örnek, cut-off değerleri bilinmiyor Pneumocystis spp. -glukan Serum 94, Cryptococcus spp. Kültür Histopatoloji Ag BOS BOS BOS, serum , bilinmiyor bilinmiyor Trichosporon sp.

47 In conclusion, using the BACTEC 9240 system, either a TTP 56.5 h or growth only or earlier in aerobic flasks is useful to rule out the presence of C. glabrata. In addition, in settings with an 12% prevalence of C. glabrata candidaemia, yeast detection exclusively or earlier in anaerobic vials increases the probability of C. glabrata being present to 58%. Knowing the type of medium in which the growthis detectedwould improve the value of TTP in predicting the presence of C. glabrata and could be useful for early treatment optimization.