II.SINIF TIBBİ MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR FÖYLERİ

Transkript

1 II.SINIF TIBBİ MİKROBİYOLOJİ LABORATUVAR FÖYLERİ

2 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-1 Gr (+) Koklar A- Stafilokok Türlerinin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Stafilokokların genel özelliklerinin öğrenilmesi Stafilokokların laboratuvar tanısında kullanılan testlerin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Stafilokokların genel özelliklerini açıklar. İnsanlarda en sık hastalık etkeni olan Stafilokok türlerini sıralar. Stafilokok türlerinin hangi hastalıklara neden olduğunu sıralar. Stafilokokların Laboratuvar tanısında kullanılan testleri sıralar. Staphylococcus aureus un diğer stafilokoklardan ayrılmasında kullanılan özellikleri sıralar. Katalaz testinin kullanım amacını açıklar. Koagülaz testinin kullanım amacını açıklar. Katalaz testinin uygulama basamaklarını sıralar. Koagülaz testinin uygulama basamaklarını sıralar. Stafilokok kolonilerinin özeliklerini değerlendirir. Katalaz testini uygular. Katalaz testini değerlendirir. Koagülaz testini uygular. Koagülaz testini değerlendirir. Kontamine deney malzemelerini tıbbi atık kabına atar. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Işık mikroskobu Lam Öze %3 H 2 O 2 (Hidrojen peroksit) 1/5 oranında sulandırılmış insan veya tavşan plazması Staphylococcus aureus, Koagülaz negatif stafilokok ve streptokok üremiş kültür plakları Stafilokoklardan hazırlanmış Gram boyalı preperatlar Eldiven Tıbbi atık kabı 2

3 Giriş Stafilokoklar Gram pozitif, kok morfolojisinde, m çapında, hareketsiz, fakültatif anaerop, yüksek tuz konsantrasyonu (örneğin %10 sodyum klorid) içeren ortamlarda, C de üreyebilirler. İnsanlarda bulunan 40 tür ve 24 alt tür tanımlanmıştır. İnsanlarda en sık hastalık etkeni olan türler: 1. Staphylococcus aureus 2. Staphylococcus epidermidis 3. Staphylococcus saprophyticus 4. Staphylococcus lugdunensis 5. Staphylococcus haemolyticus Metisilin dirençli S. aureus (MRSA) hastanede yatan hastalarda ciddi enfeksiyonlara ve son yıllarda sağlıklı insanlarda hastane dışında da enfeksiyonlara neden olmaya başlayan en tehlikeli Stafilokok türüdür. İnsanlarda en sık hastalık etkeni olan stafilokok türlerinin yaptıkları hastalıklar Tablo 4 de gösterilmiştir. Tablo 1-1. Stafilokok türlerinin yaptığı hastalıklar Stafilokok türü Yaptığı hastalıklar Besin zehirlenmesi, haşlanmış deri sendromu, toksik şok S. aureus sendromu, karbonkül, folikülit, impetigo, yara enfeksiyonu, bakteriyemi, endokardit, pnömoni, ampiyem, osteomyelit, septik artrit Bakteriyemi, endokardit, cerrahi yara enfeksiyonu, idrar yolu S. epidermidis enfeksiyonu, kateter, şant, prostatik alet ve peritoneal diyaliz fırsatçı enfeksiyonları S. saprophyticus İdrar yolu enfeksiyonu, fırsatçı enfeksiyonlar S. lugdunensis Endokardit, artrit, bakteriyemi, fırsatçı enfeksiyonlar, idrar yolu enfeksiyonları Bakteriyemi, endokardit, kemik ve eklem enfeksiyonları, S. haemolyticus idrar yolu enfeksiyonları, yara enfeksiyonları, fırsatçı enfeksiyonlar Stafilokokların Laboratuvar Tanısı Mikroskopi: Stafilokoklar katı besiyerinde üretildiklerinde üzüm salkımı şeklinde kümeler yapan fakat klinik örneklerde tek tek veya küçük gruplarlar halinde görülen gram pozitif koklardır. 3

4 Kültür: Stafilokoklar aerobik ve anaerobik koşullarda, seçici olmayan besiyerlerinde büyük, beyaz - altın sarısı pigmentli, S tipi koloniler yaparak 24 saat içinde hızla üremektedir. Nükleik asit bazlı testler: Stafikokların hızlı üremesi nedeniyle bu testler sadece tarama kültürlerinde (hastalarda dirençli bakteriler açısından burun taşıyıcılığı taraması) oksasilin direncini belirlemek için kullanılmaktadır. İdentifikasyon: S.aureus un tanımlanmasında nispeten basit biyokimyasal bir test olan koagülaz testi sıklıkla kullanılmaktadır. Koagülaz negatif stafilokokların tanımlanması daha karmaşık olup, ticari tanımlama sistemleri ya da nükleik asit sekanslama teknikleri ile türe özgül genlerin gösterilmesini gerektirmektedir. Katalaz Testi: Hidrojen peroksitin (H 2 O 2 ) katalaz enzimi tarafından su ve oksijene parçalanması esasına dayanır. Stafilokokların streptokoklardan ayrılması amacı ile kullanılır. Bu test için bir lam üzerine birkaç damla %3 lük H 2 O 2 [Hidrojen peroksit (%30) 1 ml, distile su 9 ml] damlatılır. Stafilokok şüpheli kolonilerden yada bakteri süspansiyonundan bir miktar alınarak %3 lük H 2 O 2 ile steril bir öze yardımı ile karıştırılır. Bu esnada hava kabarcıklarının oluşması testin pozitifliği şeklinde yorumlanır. Pozitif kontrol: Stafilokoklar, Negatif kontrol: Streptokoklar Koagülaz Testi: S. aureus un ayrımında kullanılan bir testtir. Koagülaz sayesinde bakteri fibrin bir zırhla kaplanarak fagositozdan korunur. Serumun bakterisid etkinliğini de engeller. Koagülaz deneyi lamda veya tüpte uygulanabilir. Lam deneyinde temiz bir lam üzerindeki bir damla serum fizyolojik içinde katı besiyerinden bol miktarda stafilokok alınarak süt görüntüsünde bir çözelti oluşturulur. Bu süspansiyon üzerine bir damla 1/5 oranında sulandırılmış plazma damlatılır saniyede pıhtı kümelerinin oluşması olumlu sonuçtur. Tüp deneyi için 1/5 oranında sulandırılmış sitratlı insan veya tavşan plazması kullanılır. 1 ml sulandırılmış plazma üzerine, 1 ml taze buyyon kültürü veya katı besiyerinden alınan koloniler konur. Kontrol olarak plazma + steril buyyon kullanılır. 37 C de bekletilen tüplerde 1., 3., 6. ve 24. saatlerde pıhtılaşma olup olmadığına bakılır. Pozitif kontrol: S. aureus Negatif kontrol: S. epidermidis Şekil 1-1. Solda katalaz negatif, sağda katalaz pozitif test görünümü Şekil 1-2. Solda koagülaz negatif, sağda koagülaz pozitif test görünümü 4

5 Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Laboratuvara hazır olarak getirilen preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz. 2. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerinden katalaz testi yaparak sonuçları değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz. Bakteri:....Bakteri: Sonuç: Pozitif Sonuç: Negatif 3. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerinden koagülaz testi yaparak sonuçları değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz. Bakteri:.Bakteri:.. Sonuç: Pozitif Sonuç: Negatif Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası Kaynaklar 1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Medical Microbiology. Tıbbi Mikrobiyoloji. 6th ed., Atlas Kitapçılık Tic. Ltd. Şti., Ankara, Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı (2003). Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Tünger A., Çavuşoğlu C., Korkmaz M.: Mikrobiyoloji (2005). Dördüncü baskı. Asya Tıp Kitabevi, İzmir,

6 B- Streptokoklar ve Enterokok Türlerinin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Streptokokların genel özelliklerinin öğrenilmesi Streptokok türlerinin ayırt edilmesinde kullanılan testlerin öğrenilmesi Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Bu dersi alan öğrenciler; Streptokok türlerinin hemoliz yapma özelliklerini sayar. Alfa, beta ve gama hemoliz yapan streptokoklara örnek verir. Streptokoklarının morfolojik özelliklerini söyler. Streptokok türlerini diğer gram pozitif koklardan ayırt etmede kullanılan özellikleri sayar. Basitrasin ve optokin duyarlılık testlerinin ne amaçla yapıldığını söyler. PYR ve CAMP testlerinin amacını söyler. Safrada erime testinin amacını söyler. Safra eskülin agarda üreme testinin amacını söyler. Streptokok kolonilerinden Gram boyalı preparat hazırlayabilir. Basitrasin ve optokin duyarlılık testlerini yapabilir. PYR ve CAMP testlerini yapabilir. Safrada erime testini yapabilir. Safra eskülin agarda üreme testini yapabilir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Gram boyama yöntemi ile hazırlanmış preparatda gram pozitif kok zinciri ya da diplokok morfolojisindeki bakterileri tanımlar. Kanlı agarda üremiş olan Streptokok kolonilerinin hemoliz türünü değerlendirir. Basitrasin ve optokin duyarlılık testlerini değerlendirir. PYR ve CAMP testlerini değerlendirir. Safrada erim testini değerlendirir. Safra eskülin agarda üreme testini değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Gerekli Malzemeler Sıvı sabun Kağıt havlu Alkol bazlı solüsyon Atık kapları %70 lik etanol Çamaşır suyu Eldiven 6

7 Öze Lam Mikroskop Gram boyama seti %3 lük hidrojen peroksit %5 kanlı agar Safra eskülin agar 0.04 U Basitrasin diski 1.25/23.75 µg trimetoprim-sülfametoksazol (SXT) diski 5 g optokin diski Ticari olarak hazırlanmış Pyrolidonyl-beta naphtilamid (PYR) emdirilmiş kağıt şeritler ve ayıracı %10 luk sodyum deoksikolat Kanlı agara pasajlanmış S. pyogenes, S. agalactia, S.pneumonia, S. viridans, E. feacalis, S. bovis izolatlarının taze kültürleri Giriş Streptopcoccus cinsine ait bakteri türleri katalaz negatif özellik gösterirler ve sıvı besiyerinde zincirler oluşturan gram pozitif koklardır. Sınıflandırılmasında serolojik özellikleri (Lancefield gruplaması: A dan V ye kadar), hemoliz özellikleri (alfa, beta, gama hemoliz) ve biyokimyasal özellikleri kullanılmaktadır. Klinik olgularda en sık karşılaşılan Streptokok türleri ve sınıflandırılma özellikleri Tablo 5 te verilmiştir. Tablo 1-2. Sık karşılaşılan Streptokok türleri ve sınıflandırılması Filogenetik Grup Tür Lancefield Grup Hemoliz Özellikleri S. pyogenes A Beta Pyojenik Streptokoklar S. agalactiae B Beta S. equisimilis C Beta S. pneumoniae O Alfa S. mitis O Alfa Mitis grup S. oralis Tanımlanmadı Alfa S. sanguis H Alfa S. gordonii H Alfa 7

8 Anginosus grup S. anginosus S. intermedius G, F (ve A) Alfa Alfa Salivarius grup S. salivarius K Gama Bovis grup S. bovis D Alfa veya gama Mutans grup S. mutans S. sobrinus Belirlenmedi Gama Gama Streptokokların Laboratuvar Tanısı I. Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması a. Makroskopik Değerlendirme ve Koloni Görüntüsü: Streptokoklar çoğunlukla gri-beyaz renkte, ıslak ya da parlak özellikte küçük koloniler oluşturmaktadırlar. Kanlı agardaki kolonileri alfa, beta veya non (gama) hemolitik olabilirler. Resim 1-3. Hemoliz çeşitleri b. Mikroskobik Değerlendirme ve Gram Boyama: Gram boyalı preparatların mikroskobik incelemesinde Streptokoklar ve Enterokoklar gram pozitif çiftler veya zincir şeklinde koklar; S. pneumoniae ise çoğunlukla Gram pozitif uzamış görünümlü diplokoklar şeklindedir. 8

9 Şekil 1-4. Gram pozitif kok zincirleri ve Gram pozitif diplokoklar c. Lam Metoduyla Katalaz Testi: Test edilecek bakterinin katalaz enzimi olup olmadığını araştırmaya yönelik bir test olup, sıklıkla gram pozitif koklardan Stafilokok türlerinin Streptokok türlerinden fenotipik olarak ayırt edilmesinde kullanılmaktadır. Temiz bir lam üzerine test edilecek bakteri kolonisi aktarılır ve üzerine bir miktar %3 lük H 2 O 2 damlatılır. Gaz kabarcığı oluşumu gözlenir. Kabarcık oluşumu testin pozitifliği yani bakterinin katalaz enzimi varlığı lehinde yorumlanır. II. Beta Hemolitik Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması: a. Pirolidonil-beta-naftilamid (PYR) Hidrolizi Testi: S. pyogenes in diğer beta hemolitik Streptokoklardan ayırt edilmesinde kullanılan bu test, bakteride PYR enzimi varlığının araştırılmasını temel almaktadır. L-pirolidonil-betanaftilamid PYR enzimi aracılığıyla Beta-naftilamidin ürününe hidroliz olur ve ilgili reaktif eklendiğinde kırmızı renk alır. S. pyogenes dışında Enterokokların, bazı hayvan kaynaklı Streptokok türlerinin ve diğer bazı bakteri türlerinin de PYR testinin pozitif olduğu unutulmamalıdır. Şekil 1-5. Pirolidonil-beta-naftilamid (PYR) hidrolizi testinin yapılışı 9

10 b. Basitrasin Duyarlılık Testi: S. pyogenes, diğer A grubu Streptokoklar ve diğer beta hemolitik Streptokoklardan farklı olarak basitrasine duyarlılık gösterir. S. pyogenes olabileceğinden şüphelenilen bakteriden 3-4 koloni alınarak kanlı agara pasajlanır ve 0.04 U Basitrasin diski plağa yerleştirilir. 35 o C de %5 CO 2 li ortamda bir gece inkübe edilir. Diskin etrafında bakteri üremesinin inhibe olması, test edilen bakterinin basitrasine duyarlı olduğunu düşündürür. Şekil 1-6. Basitrasin duyarlılık testinin yapılışı c. Christie Atkins Munch Peterson (CAMP) Testi: S. agalactia nın diğer beta hemolitik Streptokolardan ayırt edilmesi için yapılan bu test S. aureus un yaptığı hemolizin S. agalactia tarafından artırılması esasına dayanmaktadır (sinerjik lizis). Test edilecek suş ve S. aureus suşu kanlı agara 90 o açıyla çizgi olarak ekilir. 36±1 o C de bir gece inkübe edilir. S. aureus beta hemolizini ve CAMP faktörü diffüzyon bölgesinde üçgen şeklinde artmış hemoliz görülmesi CAMP testinin pozitifliği şeklinde yorumlanır. Şekil 1-7 Christie Atkins Munch Peterson (CAMP) testinin yapılışı 10

11 III. Streptococcus pneumoniae ve Viridans Grubu Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması: a. Optokin Duyarlılık Testi: S. pneumoniae suşunun optokine duyarlı olduğu bilgisini temel alan bu test S. pneumoniae nın diğer alfa hemolitik Streptokoklardan ayırt edilmesinde kullanılır. Test edilecek organizmanın kültüründen birkaç koloni kanlı agara pasajlanır ve 5 g optokin içeren disk üzerine yerleştirilir. 35 o C de %5 CO 2 li ortamda bir gece inkübe edilir. Diskin etrafında bakteri üremesinin inhibe olması, test edilen bakterinin optokine duyarlı olduğunu düşündürür. Optokine duyarlı S. mitis ve optokine dirençli S. pneumoniae suşlarının da olabileceği unutulmamalıdır. b. Tüp Metoduyla Safrada Erime Testi: Şekil 1-8. Optokin duyarlılık testinin yapılışı S. pneumoniae nın muhtemel tanısında kullanılmaktadır. Sodyum deoksikolat bir tür safra tuzu olup hücre duvarına etki ederek hücrenin erimesine neden olmaktadır. İki adet tüp içerisinde fizyolojik tuzlu suda (ph: 7.0) test edilecek bakteriden yoğun bakteri süspansiyonu hazırlanır. Tüplerden birine %10 luk sodyum deoksikolat solusyonu damlatılır diğerine (kontrol olarak kullanılacaktır) ise fizyolojik tuzlu su damlatılır. Tüpler 35 o C de 3 saatte bir kontrol edilerek inkübe edilir. %10 luk deoksikolat damlatılmış olan tüpdeki bakteri bulanıklığı kaybolmuş ve viskositesi artmış ise test edilen bakterinin safrada erime özelliği olduğu şeklinde yorumlanır. 11

12 Şekil 1-9. Tüp metodu ile safrada erime deneyinin yapılışı IV. Enterokoklar ve D Grubu Streptokokların Fenotipik Olarak Tanımlanması: a. Safra Eskülin Agarda Üreme Testi: Safra eskülin agar, Enterococcus ve grup D Streptokoklar (Streptococcus bovis) türlerini diğer Streptokoklardan ayırt etmek amacıyla kullanılan seçici ve ayırıcı bir besiyeri türüdür. Besi yerinde mevcut olan safra Enterococcus ve grup D Streptokoklar dışındaki streptokokları ve diğer gram pozitif kokların üremesini baskılamaktadır. Besiyerinde mevcut olan eskülin ise söz konusu mikroorganizma tarafından hidrolize edilerek eskületin ve dekstroza ayrıştırılır. Eskületin yine besiyerinde kullanılan demir tuzu ile etkileşerek siyahkahve renk oluşumuna neden olmaktadır. Şüphelenilen koloniler safra eskülin agara pasajlanıp uygun koşullarda inkübe edildikten sonra siyah-kahve renk oluşturan kolonilerin gözlenmesi bakterinin safralı ortamda üreyebildiği, eskülini hidroliz etme yeteneği olduğu ve Enterococcus ve Streptococcus bovis olabileceği şeklinde yorumlanır. Şekil Safra eskülin agarda üreme testinin yapılışı 12

13 Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Laboratuvara hazır olarak getirilen preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz. 2. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerini renk ve hemoliz oluşumu yönünden inceleyiniz. Optokin, basitrasin ve CAMP deneylerini inceleyerek gördüklerinizi çiziniz. 3. Laboratuvara getirilen kanlı agar yüzeyindeki bakteri kolonilerinden katalaz testi yaparak sonuçları değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz. 4. Üreme görülen plaklardan Gram boyama yaparak sonucu değerlendiriniz. Gördüklerinizi çiziniz. Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası 13

14 Gram pozitif kok Üzüm salkımı şeklinde gram pozitif koklar Katalaz pozitif Zincir şeklinde koklar Katalaz negatif Stafilokok? Streptokok? Beta hemoliz Alfa hemoliz Gama hemoliz Basitrasin Duyarlılık Testi Basitrasin duyarlı ve SXT dirençli PYR (+) Basitrasin dirençli ve SXT duyarlı CAMP (+) Gram pozitif diplokok Optokin duyarlı Safrada erime (+) Optokin diski Optokin dirençli Safra eskülin agara ekim S.pyogenes (A grubu Beta Hemolitik Streptokok) S.agalactia (B grubu Beta Hemolitik Streptokok) S.pneumonia Üreme ve siyah renk yok Üreme ve siyah renk var S. viridans? %6.5 NaCl de üreme yok PYR (-) %6.5 NaCl de üreme var PYR (+) 14 Non-enterokok D grubu Streptokok Enterococcus spp

15 Kaynaklar 1. Killian M (2002). Streptococcus and Enterococcus, (Ed: Greenwood D, Slack RBC and Peutherer FF). Medical Microbiology 16th ed. Churchill Livingstore, Philadelphia. p Spellerberg B, Brandt,C. (2007). Streptococcus. Manual of Clinical Microbiology (Ed: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry LM, Pfaller A). 9th ed. Çeviren: Özenci H. Washington, D.C.American Society for Microbiology, Kimberle CC, Tsai-Ling L (2007). Ayraçlar, Boyalar ve Besiyerleri: Bakteriyoloji. Manual of clinical microbiology (Ed: Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry LM, Pfaller A). 9th ed. Çeviren: Başustaoğlu A, Güçlü AÜ). Washington, D.C.American Society for Microbiology, 15

16 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-2 Gram (-) Koklar A- Moraxella ve Haemophilus Türlerinin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Moraxella ve Haemophilus ların genel özeliklerinin öğrenilmesi Moraxella ve Haemophilus ların laboratuvar tanısının öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Moraxella ve Haemophilus ların genel özelliklerini açıklar. Moraxella ve Haemophilus ların kültür özelliklerini açıklar. Moraxella ve Haemophilus cinsi bakterileri diğer bakterilerden ayıran özellikleri sayar. Moraxella ve Haemophilus ların boyanmış preparatlarını mikroskobik olarak değerlendirir. X ve V faktörlerine olan gereksinimlerine göre Haemophilus türlerini tanımlar. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Mikroskop Moraxella ve Haemophilus üremiş kültür plakları Moraxella ve Haemophilus a ait boyalı preparatlar X, V ve XV faktörlerini içeren diskler Süt anne fenomeni ile Haemophilus kolonileri olan kültür plakları DNA içeren besiyeri, 1 N HCl Lam Fizyolojik tuzlu su BOS santrifüj çökeltisi %1 lik metilen mavisi boyası Moraxella türleri Moraxella lar kısa basil, kokobasil ya da Moraxella catarrhalis te olduğu gibi diplokok şeklinde, gram negatif, aerobik ve hareketsiz bakterilerdir. Bu genus içindeki en önemli patojen tür M. catarrhalis tir. Üst solunum yolu florasında bulunmakla birlikte akut bronşit, sinüzit, menenjit, endokardit, konjuktivit, otitis media ve pnömoni etkeni olabilirler. 16

17 Kanlı ve çikolatamsı agarda üreyebilirler. Gri-beyaz renkte, konveks, hemoliz yapmayan, mat S tipi koloni oluştururlar. Agar yüzeyinde buz hokeyi topu gibi kaymaları tipiktir. Oksidaz ve katalaz pozitiftirler. Nitrat redüktaz enzimi ile nitratı nitrite indirgerler. Şekerleri oksidatif ya da fermantatif yolla kullanmayan (asakkarolitik), DNaz enzimi pozitif olan bakterilerdir. Tanımlanması için karbonhidrat fermentasyon testleri de kullanılır. Çoğu -laktamaz üretir ve penisilinlere dirençlidir. Haemophilus türleri Gram negatif, küçük, kokobasil görünümünde, hastalık materyalinde bazen lökosit içinde, kültürde ikişerli, çoklu gruplar veya zincirler oluşturan, hareketsiz, sporsuz bakterilerdir. Taze izolatlarda ince bir kapsül bulundururlar. Pasajlarda kapsül kaybolur. Sulu fuksin ile 2-10 dakikada iyi boyanırlar. Basit besiyerinde üremezler. Üremesi için besiyerlerine üreme stimüle edici faktörlerden X faktörü (protoporphyrin IX) ve V faktöründen (nikotinamid adenin dinükleotid, NAD) bir veya her ikisinin eklenmesine ihtiyaç duyarlar. Su damlası şeklinde koloniler oluştururlar. H. influenzae: Çocuklarda menenjit, pnömoni, bronkopnömoni, laringotrakeit, nazofarenjit gibi hastalıklar oluşturabilirler. Bu bakteriler kapsüllerinin yapı değişikliklerine bağlı olarak a,b,c,d,e,f diye adlandırılan 6 serotipe ayrılırlar. Bunlardan b serotipi invaziv olup Haemophilus enfeksiyonlarının en sık nedenidir. H. influenzae gibi kapsüllü bakterinin BOS'ta varlığından şüphelenilirse kapsül şişme reaksiyonu yapılarak bu bakteriler saptanabilir. Tablo 2-1. X ve V faktörü ihtiyacına göre bazı Haemophilus türleri Tür X V H. influenzae + + H. aegypticus + + H. haemolyticus + + H. parainfluenzae - + H. parasuis - + H. parahaemolyticus - + H. ducreyi + - H. aegypticus: Bu bakteri halk arasında pembe göz olarak bilinen konjuktivit etkenidir. H. ducrei: Yumuşak şankr etkenidir. 1. X ve V Faktörlerine Olan Gereksinimin Saptanması: Haemophilus türü bakteriler triptik soy agar ya da kalp infüzyon agarı plak besiyerlerine bol miktarda ekilir. Besiyeri kurutulur. Daha sonra X, V ve XV faktörlerini içeren üç disk, aralarında en az 20 mm olacak şekilde besiyerinin üzerine bırakılır. Besiyeri 37 C'de, bir gece inkübe edilir. H. influenzae sadece XV faktörü içeren diskin etrafında ürer. 17

18 2. Süt anne fenomeni (satellit üreme): Koyun ya da tavşan kanlı agara incelenecek olan Haemophylus türü bakteri yaygın olarak ekilir. Aynı besiyerine (çizgi ekimi şeklinde ya da belirli bölgelere) S. aureus ekilir. H. influenzae S.aureus kolonileri etrafında daha iyi üreme gösterir. Şekil 2-1. Süt anne fenomeni (satellit üreme) 3. DNAse (deoksiribonuclease) deneyi: Deoksiribonükleik asiti (DNA) parçalama özelliği olan DNaz enzimi içeren bakteriler DNA içeren besiyerinde onu parçalayıp oligonükleotidler oluştururlar. Bu test ile Neisseria'lar ile Moraxella'ları birbirinden ayırmak mümkündür. DNA lı plak besiyerine saf kültürden çizgi ekimi yapılır. 35 C de saat bekletildikten sonra plak yüzeyine 1N hidroklorik asid (HCl) damlatılır. HCl bozulmamış DNA ile birleşerek presipite olur. Bakteri DNaz yapıyorsa ekim çizgisinin çevresinde saydam bir zon oluşur, diğer bölgeler opak görünüm alır. Besiyeri içine indikatör olarak toluidin mavisi konmuşsa DNaz olumlu bakteriler ekim çizgisi çevresinde parlak pembe bir zon oluşturur. Negatif durumda mavi renkli kalır. 4. Kapsül şişme reaksiyonu: Bu yöntem N. meningitidis, S. pneumoniae, H. influenzae, K pneumoniae gibi kapsüllü bakterilerin ön identifikasyonu amacı ile yapılmaktadır. Temiz bir lam alınır, bir yanına bir damla sulandırılmış antiserum, diğer yanına bir damla fizyolojik tuzlu su (kontrol) damlatılır. Her iki damlanın üzerine sırasıyla BOS santrifüj çökeltisi ve bir damla %1 lik metilen mavisi boyası damlatılır. Her birinin üzerine temiz lamel kapatılır. İmmersiyon objektifi veya 400 büyütme ile yapılan incelemede ortası maviye boyanmış bakterilerin etrafındaki renksiz ya da soluk mavi renkli kapsülleri, kontrole göre daha belirgin ve genişlemiş olarak görülürler. 5. ELEK testi: 10 ml agar içine 2 ml at serumu eklenir. Bir petriye dökülür ve katılaşmasına yakın besiyerinin ortasına difteri toksini emdirilmiş bir filtre kağıdı yerleştirilir. Besiyeri katılaşıp yüzeyi kuruduktan sonra test edilecek suşlar filtre kağıdına dik olacak şekilde ekilirler. Testin çalışıp çalışmadığını kontrol etmek için toksijenik olan ve olmayan iki suş; pozitif ve negatif kontrol olarak ekilir. Plaklar 35 C de saat inkübe edilir. İnkübasyon sonunda pozitif kontrol ve toksin yapan suşların ekim çizgisi ile anti toksin bulunan filtre kağıdı arasında 45 derece açı yapacak şekilde presipitasyon çizgileri gözlenir. Toksin yapmayan suşlarda presipitasyon gözlenmez. 18

19 Şekil 2-2. Elek immundifüzyon testi ( dan alınmıştır). Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Difteroid bakterileri Gram boyama yöntemi ile boyayarak inceleyiniz ve çiziniz. 2. X ve V faktörlerine olan gereksinimin saptanması ile ilgili testleri inceleyerek çiziniz. Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası Kaynaklar 1. Bilgehan H (2009). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Beşinci Baskı. Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, İzmir, Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Tıbbi Mikrobiyoloji. Altıncı Baskı. Çev. Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA (2009). Klinik Mikrobiyoloji Manual of Clinical Mikrobiology. Dokuzuncu baskı. Çev. Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, cilt 1, / Editörler: Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara,

20 B- Neisseria Türlerinin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Neisseria ların genel özelliklerinin öğrenilmesi Neisseria ların laboratuvar tanısında kullanılan yöntemlerin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Neisseria ların genel özelliklerini sıralar. İnsanlarda hastalık etkeni olan Neisseria türlerini sayar. Oksidaz testinin yapılış basamaklarını sıralar. Oksidaz testinin yapılış amacını açıklar. Gram boyanma yaparak preperatta Neisseria türü bakteri varlığını değerlendirir. Oksidaz testini uygulayarak sonucunu değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Sıvı sabun Kağıt havlu Eldiven Neisseria gonorrhaoe üremiş kültür plakları Neisseria gonorrhoae içeren örneklerden hazırlanmış preparatlar Oksidaz ayıracı Giriş Neisseria türleri aerobik, hareketsiz, sporsuz, gram negatif bakterilerdir. Genellikle birbirine komşu kenarları düzleşmiş, kahve çekirdeği şeklinde çiftler (diplokoklar) halinde görünür. İnsanlardan en sık izole edilen Neisseria türleri N. gonorhoeae, N. menengitidis, N. lactamica, N. sicca, N. subflava, N. flavescens, N. mucosa, N. cinerae, N. denitrificans, N. elongata, N.canis tir. Bu ailede iki tür insanlarda patojendir. N. gonorhoea ve N. menengititis. N. gonorrhoeae seksüel geçişli bir hastalık olan gonore etkenidir. Bu infeksiyon genellikle erkekler ve kadınlarda genital mukozayı tutmaktadır fakat kolumnar epitelin bulunduğu herhangi bir vücut bölgesini de etkileyebilir. 20

21 N. meningitidis sağlıklı bireylerde daha çok asemptomatik olarak taşınır. Duyarlı şahıslarda kan akımına karışarak bakteriyemiye, kan beyin bariyerini aşarak menenjit tablosuna neden olabilir. Hastalardan örnek alınması Neisseria Türlerinin Laboratuvar Tanısı Gonore tanısı için erkeklerde üretral akıntı örneği alınır. Belirgin bir pürülan akıntı yoksa pamuklu eküvyon anterior üretradan 2-3 cm içeriye sokulup yavaşça çevrilerek örnek alınır. Kadınlarda ise servikal sürüntü örnekleri, üretral ve vajinal örneklere tercih edilir. Menenjit tanısı için beyin omirilik sıvısı (BOS) alınmalıdır. Ayrıca kan, plevral sıvı, peteşi aspirat sıvısından da inceleme yapılabilir. BOS 1 ml den fazlaysa 1500 rpm de 15 dak santrifüj edilerek üstteki sıvı atılır dipteki çökelti tanı için kullanılır. Alınan örneklerden direk mikroskobik inceleme için preparat hazırlanır ve kültür yapılır. Direk Mikroskobik İnceme Örnekler Gram boyama yöntemi ile boyanarak incelenir. Boyanan preparat immersiyon yağı damlatılarak x100 büyütme ile incelenir. Nötrofiller içinde ve dışında gram negatif diplokokların varlığı gonore için oldukça karakteristiktir. Kültür Şekil 2-3. Hasta örneğinde gram negatif diplokoklar Şekil 2-4. Kültürde üreyen Neisseria lardan yapılan Gram boyama preparatı Alınan örnekler Neisseria türlerinin sıcaklık değişimlerine çok duyarlı olmasından dolayı laboratuvara hızlı bir şekilde ulaştırılmalıdır. En başarılı izolasyon hasta başı ekimlerde görülmektedir. Üretral ve servikal örnekler çukolata agara ekilir. Genital bölge gibi floralı bölgelerden alınan örnekler için selektif besiyerleri tercih edilir. Thayer-Martin, Modifiye Thayer Martin, Martin Lewis, New York City veya GC-LECT besiyerleri Neisseria türleri için kullanılan selektif besiyerleridir. Bu besiyerleri flora elemanlarını baskılamak için çeşitli antibakteriyaller ve/veya antifungaller içerir. Tüm besiyerleri %3-5 CO 2 li ortamda 35 C de 72 saat inkübe edilir saat inkübasyondan sonra küçük şeffaf, konveks, düzgün koloniler oluşturur. Hemoliz ve pigment yapmaz. 21

22 Şekil 2-5. Kültürde üreyen Neisseria kolonileri Oksidaz Testi Neisseria ların ayırıcı tanısında kullanılır. Sitokrom oksidaz oksidatif fosforilasyonla solunum yapan bakterilerin kullandığı bir enzimdir. Oksidaz testi için oksidaz ayıracı (%1 lik dimetil para fenilen diamin dihidroklorid ya da tetrametil para fenilendiamin dihidroklorid) kullanılır. Bu solüsyondan kurutma kağıdına birkaç damla damlatılıp üzerine öze ile birkaç koloni sürülür. 10 saniye içinde koyu mor renk görülürse test pozitiftir. Renk değişmiyorsa oksidaz testi negatiftir. Bu testte E. coli standart suşu negatif, N. gonorrhoeae standart suşu pozitif olarak kullanılır. Şekil 2-6. Oksidaz testi (Sağdaki pozitif, soldaki negatif) Karbonhidrat kullanım testi Karbonhidratların kullanımı patojenik Neisseria ların diğer saprofitik türlerden ayrılmasında kullanılır. Belirli karbonhidratların kullanımı asit üretimi yoluyla indikatörün renginin değişmesiyle gösterilir. Neisserialar karbonhidratları genellikle oksidatif olarak kullanır ve asit oluşturur. Tablo 2-2. Bazı Neisseria türleri ve karbonhidrat kullanım testi sonuçları Tür Glukoz Maltoz Laktoz Sükroz N. gonorrhoeae N. meningitidis N. lactamica N. cinerea N. sicca N. flavescens

23 Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Neisseria türü bakteri üremiş kültür plaklarından Gram boyama yaparak inceleyiniz, gördüklerinizi çiziniz. 2. Hasta örneklerinden hazırlanan preperatları inceleyerek gördüklerinizi çiziniz. 3. Neisseria türü bakteri üremiş kültür plaklarından ve Escherichia coli üremiş kültür plaklarından oksidaz testi yaparak değerlendiriniz. Tarih Laboratuvar Görevlisinin İmzası Kaynaklar 1. Mahon CR, Lehman DC, Manuselis G, eds. (2011). Textbook of Diagnostic Microbiology. 4th ed. W.B. Saunders Company, Maryland Heights (MO), p

24 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-3 A-Nonfermentatif Gram Negatif Bakterilerin Laboratuvar Tanısı Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Nonfermentatif gram negatif bakterilerin genel özelliklerinin ve laboratuvar tanısının öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Nonfermentatif gram negatif basillerin isimlerini sayar. Nonfermentatif gram negatif basillerin özelliklerini sayar. Tanı için incelenebilecek hasta örneklerini sayar. Oksidasyon-fermentasyon testinin basamaklarını anlatır. Sitokrom oksidaz aktivitesi testinin basamaklarını sayar. İndol testinin basamaklarını sayar. Nonfermentatif gram negatif basillerin mikroskobik incelemesini yapar. Oksidasyon-fermentasyon testini yapar ve sonucunu yorumlar. Sitokrom oksidaz aktivitesi testini uygular ve sonucunu değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Mikroskop Lam Öze Bek alevi Gram boya seti Nonfermentatif basiller ekilmiş Kanlı ve EMB agar besiyeri plakları Oksidasyon-fermentasyon testi besiyerleri Hareket besiyeri %1 lik tetrametil p-fenilen diamin dihidroklorid çözeltisi Giriş Nonfermentatif bakteriler karbonhidratları fermente edemeyen sadece oksidatif yolla kullanabilen mikroorganizmalardır. Pseudomonas, Acinetobacter, Stenotrphomonas, Burkholderia, Alcaligenes, Aeromonas, Flavobacterium gibi cinsler nonfermentatif gram negatif basiller grubunu oluşturmaktadır. Tanı için İncelenebilecek örnekler İnceleme maddesi hastalığa göre değişmek üzere irin, yara ve yanık sürüntüleri, idrar, balgam gibi örnekler olabileceği gibi BOS, torasentez sıvısı, parasentez sıvısı gibi steril vücüt sıvıları da olabilir. 24

25 Sık Karşılaşılan Nonfermentatif Gram Negatif Basillerin Mikrobiyolojik Tanımlama Testleri 1. Oksidasyon-Fermentasyon Testi Bakterilerin glikozu hangi yolla parçaladıklarını gösterir. Fermentasyon yolunu kullananlar anaerob ortamda, oksidasyon yolunu kullananlar ise aerob ortamda asit üretecekler ve ayıraç olarak bulunan bromtimol mavisinin yeşil rengini sarıya dönüştüreceklerdir. Testin yapılışı: Testi uygulamak için %0.02 pepton ve %1 karbonhidrat içeren Oksidasyon- Fermentasyon (O-F) Besiyeri kullanılır. İncelenecek koloniler iki O-F besiyeri tüpüne iğne öze ile batırma şeklinde ekilir. Tüplerden birinin kenarından steril parafin yağı yavaşça sızdırılarak havayla teması kesilir. Ekimler 37 C de en fazla 4 gün takip edilip asit ortam oluşması gözlenir. Parafinli tüpün rengi sarıya dönmüşse bakteri üremiş ve fermentasyon ile ortamda asit oluşturmuştur; parafinsiz tüpün rengi sarıya dönmüşse bakteri oksidasyon yolu ile glikozu parçalamış ve ortamı asidik hale getirmiştir. Kontrol ekimleri: E. coli fermentatif, P. aeruginosa oksidatif, Moraxella asakkarolitik". Testin değerlendirilmesi: 3 durum gözlenebilir: Kapalı tüp Yeşil Üstü açık tüp Sarı Kapalı tüp Sarı Üstü açık tüp Sarı Kapalı tüp Yeşil Üstü açık tüp Yeşil Aerob ve Oksidatif Fakültatif anaerob ve Fermentatif Nonsakkarolitik Şekil 3-1. Oksidasyon fermentasyon testi ve değerlendirilmesi 25

26 2. Sitokrom oksidaz aktivitesi testi Testin yapılışı: %1 lik tetrametil p-fenilen daimin dihidroklorid çözeltisi kullanılır. Beyaz filtre kağıdına çözeltiden damlatılır. Öze ya da tahta çubuk yardımıyla incelenecek koloniden çözeltinin üzerine sürülür. Sitokrom oksidaz aktivitesi olan bakteri yaklaşık 10 saniyede koyu mavi renk oluşturur. Kontrol: E. coli oksidaz negatif, P. aeruginosa oksidaz pozitif. Şekil 3-2. Oksidaz testi pozitif Şekil 3-3. Oksidaz testi negatif 3. MacConkey Agarda Üreme Nonfermentatif gram negatif basiller MacConkey agarda üreyemezler ya da toplu iğne başı gibi küçük koloniler oluştururlar. 4. Hareket testi Şekil 3-4. MacConkey agarda üreme (lib.jiangnan.edu.cn den alınmıştır). Nonfermentatif bakterilerin çoğu hareketlidir. Hareket besiyerine iğne öze ile ekim yapılır. Bakteriler hareket besiyerinin yüzey kısmında üreyebilecekleri için testi değerlendirmek güçtür. Bu nedenle besiyerine tetrazolyum eklenmesi faydalı olacaktır. Şekil 3-5. Hareket testi 26

27 5. İndol testi Bakterilerin karbon kaynağı olarak triptofan aminoasidini kullanıp kullanmadıklarını gösterir İndol testi pozitif İndol testi negatif Şekil 3-6. İndol testi Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1. Size verilen OF testini değerlendiriniz ve gördüklerinizi çiziniz. 2. Nonfermantatif gram negatif bakterileri Gram boyama yöntemi ile boyayarak mikroskopta inceleyiniz. Gördüklerinizi çiziniz. 3. Size verilen plaklardan oksidaz testi yaparak sonucu değerlendiriniz. Tarih Laboratuvar görevlisinin imzası 27

28 Kaynaklar 1. Murray PR, Rosenthal KS, Pfaller MA (2010). Tıbbi Mikrobiyoloji. Altıncı Baskı. Çev Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, s Murray PR, Baron EJ, Jorgensen JH, Landry ML, Pfaller MA (2009). Manual of Clinical Mikrobiology Dokuzuncu baskı. Çev Edit. Başustaoğlu AC, Atlas Kitapçılık, Ankara, cilt 1, s Tünger A, Çavuşoğlu C, Korkmaz M (2005). Mikrobiyoloji. Dördüncü Baskı. Asya Tıp Kitabevi, İzmir, s Bilgehan H (2004). Klinik Mikrobiyolojik Tanı. Dördüncü Baskı. Barış Yayınları Fakülteler Kitabevi, İzmir, s Günalp A, Yılmaz YA, Pınar A (2003). Tıbbi Mikrobiyoloji Laboratuvar Eğitim Kitabı. Hacettepe Üniversitesi Yayınları, Ankara, s

29 B- Aerop ve Fakültatif Anaerop Gram (-) Bakteriler Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Aerop ve fakültatif anaerop gram negatif bakterilerinin incelenmesi Bu dersi alan öğrenciler; Aerop ve fakültatif anaerop gram negatif bakterilerinin isimlerini söyleyebilir Örneklerin nasıl incelendiğini öğrenir Aerop ve fakültatif anaerop gram negatif bakterilerinin izole edildiği örneklerin isimlerini bilir. Mikroorganizmaların tanımlanmasında hangi testi kullanacağını bilir Laboratuvara gelirken kurallara uygun olarak giyinir. Laboratuvardaki malzemeleri kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Hazır preparatlar Mikroskop İmmersiyon yağı Rose Bengal Testi Tüp Pipet ve pipet ucu Brucella antijenleri Tüp aglütinasyon testi ÖRNEKLERİN İNCELENMESİ Brucella spp. ve Tanısı - Kokobasil görünümünde sporsuz, hareketsiz, organizmadan yeni ayrıldıklarında mikrokapsülleri olan bakterilerdir. - Aerop ve mikroaerofilik bakterilerdir. B. abortus %5-10 CO 2 li ortamda iyi ürerler - Özellikle serum, glikozlu besiyerinde üremeyi sever. Jelozdaki kolonileri küçük yuvarlak kabarık saydam şebnem tanesi görünümünde kolonilerdir. - B. suis en çok ve en uzun süre, B. melitensis ise az ve kısa süre H 2 S oluşturur. - Brucella ların insanlarda yaptıkları hastalıklar bruselloz adı altında toplanır. - 29

30 TANI : Brucella bakterilerinin soyutlanması: Materyal olabildiğince hızlı laboratuvara gönderilmelidir. Hemen ekilmeyecekse soğukta saklanmalıdır. Besiyerleri: Brucella buyyonu ve agarı, Çikolatamsı agar, Kanlı jeloz, Antibiyotikli glikozlu serumlu buyyon ve agar. Brucella kültürleri için genel ilkeler: 1) Kan, BOS gibi içinde az miktarda bakteri bulunan materyaller çok miktarda besiyerine ekilmelidir. 2) Tüm ekimlerin çift yapılarak birinin %5-10 CO 2 li ortamda inkübe edilmelidir. 3) İlk izolasyonda bakteriler yavaş ürediklerinden ekimler 30 gün bekletilmeden çıkarılmamalıdır. 4) Genellikle hastalığın akut döneminde ya da aktivasyon döneminde elde edilme olasılığı fazladır. Brucella ların identifikasyonu: Kuşkulu kolonilerden gram preparatı ve katı besiyerlerine ekimler yapılmalıdır saf kültürden aşağıdaki incelemeler yapılmalıdır. - H 2 S Üretimi: Bir yatık besiyerine ekim yapılır.bakterinin kaç günde H 2 S yaptığına bakılır. Brucella suis 3 gün ve daha çok B. abortus 2 gün, B. melitensis 1 gün ve daha kısa sürede yapar. - Boyalarla birlikte üreme: Amaç thionin ve fuchsin gibi boyaların çeşitli konsantrasyonlarını içeren besiyerlerinde Brucellaların üreyebilme özelliklerinin araştırılmasına dayanır. - Crystensen üre agar: Besiyerinin yüzeyine saf kültürden çizgi ekimleri yapılır. B. suis dk da, B.abortus 2 saatten sonra üreaz etkinliğini göstererek besiyerinin rengini kızartır. B. melitensis saatler sonra veya olumsuz sonuç verir. - Monospesifik antiserumlarla aglütinasyon: Lam aglütinasyonları yapılarak B.melitensis i diğer ikisinden ayırt etmek mümkündür. B. suis bakterisini B. abortus tan ayırt etmek imkansızdır. - Hayvan deneyi: Doğrudan hasta kanından 5-10 ml kobayların peritonuna enjekte edilerek yapılır. Brucella varsa hayvanlar ateş, septisemi, düşük yaparlar. 30

31 Şekil 3-7. Brucella spp. Şekil 3-8. Brucella melitensis Şekil 3-9. Brucella abortus Serolojik tanı Brucella tanısında büyük yer kaplamaktadır. (Rose Bengal ve Wright Testi, Brucella capt) Rose Bengal testi: Lam aglutinasyon testidir. Hızlı tarama amacı ile kullanılır. Antijen: Rose Bengal boyası ile özel teknik ile boyanan Brucella abortus bakterilerinin tamponlu tuzlu sudaki standart süspansiyonlarıdır. Yapılışı: Test kartlarına bir kuyucuğa bir damla hasta serumu damlatılır. Rose bengal antijeni iyice karıştırılarak serumun üzerine damlatılır ve bir kürdan ile iyice karıştırılır. Elde çevirmeli hareketler yapılarak 4 dakika çevrilir. Sonuçta iri tanecikli çökelti oluşursa olumlu, ince tanecikli çökelti oluşursa kuşkulu, homojen görüntü olumsuz olarak değerlendirilir. 31

32 Wright testi (Standart tüp aglutinasyon testi): Şekil Rose Bengal testi Antijen olarak B. abortus S99 ya da B. melitensis antijenleri kullanılır. Hem B. abortus hem de B. melitensis antikorları tespit edilebilir. 1/160 ve üzerindeki pozitiflikler anlamlıdır. 1/80 dilüsyonda pozitiflik durumunda 2-4 hafta sonra test tekrar edilmelidir. Rose Bengal testi kuvvetli pozitif olduğu halde, Wright testi negatif veya zayıf reaksiyon gösteriyorsa Blokan antikorlardan şüphelenilir. Blokan antikorların varlığı Coombs testi veya enzim immunoassay ile tespit edilir. Yapılışı: 1- Tüp taşıyıcısına 10 adet tüp sıralanır. Bunlardan birincisine 0.9 diğerlerine 0.5 er ml fizyolojik tuzlu su dağıtılır. 2- Birinci tüpe hasta serumundan 0.1 ml konur. Yeni bir pipet ile birkaç kez karıştırıldıktan sonra bu tüpten 0.5 ml ikinci tüpe aktarılır. Aynı pipet kullanılarak bu kez aynı şekilde ikinci tüpten üçüncüye ve bu şekilde sondan bir önceki tüpe kadar tüpten tüpe 0.5 er ml aktarılır. Bu tüpten 0.5 ml dışarı atılır. Son tüpe serum konmaz (Antijen kontrol tüpü). 3- Antijen süspansiyonu iyice karıştırıldıktan sonra tüm tüplere (kontrol tüpü dahil) 0.5 er ml antijen dağıtılır. Bu işlemle tüpteki serum serum sulandırımları birer kat artmıştır. 4- Tüpler çalkalanarak karıştırılır. 37 o C de 48 saat bekletildikten sonra değerlendirilir. 5- Önce kontrol tüpünde aglütinasyon olup olmadığına bakılır. Sonra ilk tüpten başlanarak tüpte aglutinasyon olup olmadığı kontrol edilir. İlk Tüp sulandırıma göre 1/80, 1/160, 1/320 şeklinde pozitiflik belirlenir. 1/160 ve üzerindeki pozitiflikler anlamlıdır. 1/80 dilüsyonda pozitiflik durumunda 2-4 hafta sonra test tekrar edilmelidir. Brucella tanısında kullanılabilecek diğer serolojik testler; Spot test, ELISA ile IgG ve IgM türü antikorların tespit edilmesi, kompleman birleşme deneyi ya da radioimmunoassay olarak sıralanabilir. 32

33 Şekil Wright testi Şekil Brucella capt testi Haemophilus spp. ve Tanısı Haemophilus influenza - Küçük kokobasil görünümünde hastalık materyalinde bazen lökositlerin içinde kültürlerde ikişerli, çoklu gruplar oluşturabilen hareketsiz, sporsuz bakterilerdir. Yeni soyutlanan bakterilerde küçük bir kapsül bulunur. - Basit besiyerlerinde üremezler, üremeleri için besiyerinde kanda da bulunan X faktörü (protoporphyrin IX) ve V faktörünün (nicotinamide adenine dinucleotid ) bulunmasını gereksinirler. Bu maddeler kanın ısıtılması ve eritrositlerin parçalanması ile açığa çıktıklarından normal taze kanlı agarda üremede güçlük gösterirler. En iyi üredikleri besiyeri çikolatamsı jeloz olup bu besiyerinde koloniler küçük şebnem tanesine benzeyen düzgün koloniler yapar. 33

34 Şekil Haemophilus influenza - Plak yüzeylerine yapılan ekimlerden sonra çizgi halinde bir Staphylococcus aureus ekimi yapılacak olursa H.influenza kolonileri çizgi boyunca daha büyük ve bol oluşur. Süt anne veya satellit etki denilenilen bu etki Stafilokokların V faktörü sentezlemeleri ile ilgilidir. Şekil Süt anne görüntüsü - H.influenza çoçuklarda menenjit, pnömoni, bronkopnomoni, laringotrakeit, nazofarenjit gibi hastalıklar oluşturur. - H.influenza bakterileri kapsüllerinin yapı değişikliklerine bağlı olarak a,b,c,d,e,f, gibi 6 değişik serovara ayrılır TANI : Olabildiğince çabuk incelenmeli ve bekletilirse oda ısısında bekletilmelidir. Hemophylus bakterileri soğuğa ve kuruluğa karşı dayanıksızdır. Direkt boyalı preparatlar: BOS nın santrüfüj çökeltisinden yapılan preparatta lökositlerin içinde ve dışında tipik Gram negatif bakteriler görülmeye çalışılır. Yeterli bakteri varsa H.influenza type b antiserumu ile kapsül şişme testi ile tanıya gidilebilir. 34

35 Şekil Haemophilus influenza nın boyalı preparatları Ekimler : BOS gibi steril materyaller çikolatamsı agara bolca damlatılarak ekim yapılır. Karışık flora içeren materyallerde ise bacitracin+kloxacillin içeren çikolatamsı plaklara ekim yapılmalıdır. İlk izolasyonlarda süt anne fenomoni için koyun yada tavşan kanlı jeloz ya da çikolatamsı besiyerine S.aureus ile birlikte ekilebilir. İlk izolasyonda tüm ekimler %5-10 CO 2 li ortamda 37 0 C de enkübe edilmelidir. Tipik koloniler saat içinde oluşur. X ve V faktöre ihtiyacın saptanması: H.influenza kolonileri triptikazlı soya buyyonda ezilip sulandırılarak bu süspansiyon triptakazlı soya agarı veya kalp infüzyon agarı plak besiyerlerine ekilir. Aralarında 20 mm kalacak şekilde hazır X,V ve X+V faktörlerini içeren diskler konulur. H.influenza yalnızca X+V diskinin etrafında üreme gösterir. Şekil H.influenza kolonileri Karbonhidrat fermentasyon deneyi: Bunun için ayrı ayrı glukoz, laktoz, sukrozdan %1 oranında ve ayrıca her birinden X ve V faktör içeren fenol kırmızılı buyyon besiyeri kullanılır. Serolojik identifikasyon : Özel serovar monospesifik serumlar ile lamda kapsül şişme reaksiyonları yapılabilir. Ko-aglütinasyon yöntemi ile de serovarları araştırılabilir. Floresanlı antikor deneyleri doğrudan klinik materyallerden tanı konabilir. 35

36 Haemophilus parainfluenza - Normal üst solunum yolu florasında bulunur insanlarda endokarditlerden soyutlanmıştır. Haemophilus aegyptius - H.influenza ya benzer X ve V faktörüne ihtiyaç duyar bulaşıcı konjoktivitlere sebep olur. Haemophilus aphrophylus - Endokardit, beyin apseleri kolesistitlerden soyutlanmıştır. Dental plak florasında bulunabilir. Haemophilus ducrei - Küçük kokobasil görünümünde uç uca ikişerli veya zincir biçiminde hareketsiz, sporsuz,kapsülsüz gram olumsuz bakteriler olup çoğu kez kutupsal boyanır. - Üreyebilmek için X faktörüne ihtiyaç duyarlar. Yumuşak yara (şankroid) adı verilen cinsel ilişki ile bulaşan hastalık yaparlar. Tanısı; Yara tabanı kazınarak örnek alınır. Şişmiş ganglionlar varsa ponksiyon ile irin alınıp incelenmelidir. Preparatlar gram, giemsa veya sulu fuksin ile boyanır. Olguların %60-80 de hücre içlerinde ve dışında uçuca ikişerli kokobasiller görülmesinin tanı değeri vardır. Kültürleri oldukça zordur. Çikolatamsı agar veya vankomisin içeren çikolatamsı agara yapılan ekimlerde 33 0 C de ve %5-10 CO 2 li ortamda inkübe edilirse koloniler 2-9 günde oluşur. Şekil Haemophilus ducrei 36

37 Bordetella pertussis ve Tanısı - Küçük ovoid hareketsiz, sporsuz çoğu kez tek tek bazen uçuca ikişerli görünümünde gram negatif bakteriler olup ilk izolasyonlarında bir mikrokapsülleri bulunur. Kutupsal boyanma eğilimindedirler. - En iyi üredikleri besiyeri Bordet-Gengou besiyeridir. Burada saatte oluşan koloniler düzgün saydam küçük civa damlası görünümdedir. - Boğmaca hastalığının etkenidir. TANI: Ekimler: Nazofarenks sürüntü örneği alınmalı ve bekletilmemelidir. En iyi yöntem plak besiyerine öksürtülerek yapılan yöntemdir. Ekimler Bordet-Gengou plaklarına yapılır ve koloniler 3-4 günde oluşur. Şekil Bordetella pertussis ekim görüntüleri Boyalar: Gram boyama, florasanlı antikor boyaması ve homolog serum ile lam aglütinasyonu yapılarak identifiye edilir. 37

38 Şekil Bordetella pertussis ELİSA: Soyutlanan bakterinin identifikasyonu için monoklonal antikorlar kullanılabilir. Pertusis tokinine karşı antikorların saptanması ile erken tanı B.pertusis toksinine karşı Ig M ve Ig G tipi antitoksik antikorları hastalığın erken dönemlerinde oluşur. ELİSA yöntemi ile bu antikorlar tespit edilebilir ve erken tanı konabilir. PCR: Doğrudan klinik materyallerden DNA sı tespit edilip çoğaltılabilir. Francisella tularensis ve Tanısı - Çok küçük kokobasil, hareketsiz, sporsuz ve gram olumsuz olup zor boyanırlar. Kutupsal boyanma gösterirler. - Genel kullanım besiyerlerinde üremezler. Francis besiyerinde küçük saydam damlacık şeklinde koloniler oluşturur. - Çeşitli yabani hayvanlardan ve kemiricilerden bulaşmak sureti ile insanlarda tularemi hastalığı yaparlar. İnsanlarda ülseroglandüler, oküloglandüler ve tifoid formları vardır. 38

39 Şekil Tularemi lezyonu, ülseroglandüler ve mikroskopik görüntüsü TANI: Ekimler: İnceleme örneği olarak lenf ponksiyon sıvısı ve kan örneği alınabilir. Kültür için kanlı, glikozlu ve sistinli besiyeri olan Francis besiyerine ekim yapılır. Ekimler 37 0 C de 2-5 gün tutulur. Tipik koloniler oluşunca spesifik antiserum ile lam aglütinasyonu yapılır. Şekil Francisella tularensis in besiyeri görüntüsü Hayvan deneyi: Kobaylara inokulasyon daha iyi sonuç verir. 39

40 Serolojik testler: Antikorlar ikinci haftadan başlayarak yükselir ve dört-yedinci haftalarda en yüksek titreye ulaşır. Oluşan Ig G antikorları bir iki yıl daha kaybolmaz. Legionella pneumophila ve Tanısı TANI: - Pleomorfizm gösteren sporsuz, kapsülsüz, tek veya birkaç kirpikleri ile hareketli bir basildir. - Gram olumsuz olmakla birlikte güç boyanır. - Genel kullanım besiyerlerinde üremez. İsovitale eklenerek zenginleştirilmiş Mueller Hinton besiyeri, Feely Gorman besiyeri, Charcoal yeast extract agar besiyeridir.ilk izolasyonlarında %3 CO 2 li ortamda üremeyi sever. - Solunum yollarında incelenecek materyal balgam,trekeobronşial aspirasyon sıvısı,plevra sıvısıdır. Ekimler: L.pneumophila yı üretmek zordur. %3 lük CO 2 li ortamda 3-5 günde toplu iğne başı gibi konveks gri koloniler oluşur. Serolojik testler: İndirekt floresan antikor deneyi ile serolojik tanı yapılabilir. Antikor titresinin 1:128 den fazla olması ve iki hafta sonra titrenin belirgin artmasının tanı değeri vardır. Şekil Legionella pneumophila 40

41 Gardnerella vaginalis - Küçük pleomorfizm gösteren sporsuz kapsülsüz, hareketsiz çomakçıklardır. Gram olumlu olmakla birlikte bazen boyalarını bırakırlar. - Genel kullanım besiyerlerinde üremezler. Çikolatamsı jeloz ve insan kanlı agar besiyerinde ürerler. - Kadınlarda non spesifik vaginosis denilen hastalığın etkeni olarak kabul edilen bu bakteri normal vaginal flora da bulunabilir. Vaginitlerde çoğu kez Bacteriodes ve peptococcus lar ile birlikte bulunur. TANI: Boyalar: Vaginal, serviks ve üretral salgılarda G.vaginalisin saptanması ile konur. Direkt materyalin gram ve giemsa preparatlarında ilk göze çarpan lökositlerin azlığıdır. Vaginal epitelyum hücrelerinin üzerinde çok sayıda gram olumlu ve gram labil bakterilerin yapıştıklarının ve arada gram olumlu laktobasillerin görülmesi tanı koydurucudur. Ekimler: Üretilmeleri zordur. Genelikle vaginit yakınmalarını açıklayacak başka bir etken bulunmamış ise ve mikroskopik incelemede yukarıdaki görünüm görülüyorsa G.vaginalis tanısı için yeterlidir. Şekil Gardnerella vaginalis 41

42 Laboratuvarda Yapılacak İşlemler 1- Önceden hazırlanmış preparatları inceleyiniz. 2- Rose Bengal, Wright ve Brucella capt testlerini inceleyiniz. Kaynaklar 1. Bilgehan H. (2009) Klinik Mikrobiyoloji Tanı. Beşinci Baskı. Barış yayınları, İzmir. 42

43 Tıbbi Mikrobiyoloji Pratik-4 Enterik Bakteriler Dersin Amaçları Dersin Hedefleri Bilgi Beceri Tutum Gerekli Malzemeler Enterobacteriaceae familyasının genel özelliklerinin öğrenilmesi Enterobacteriaceae familyasında bulunan ve klinik önemi olan bakterilerin öğrenilmesi Bu dersi alan öğrenciler; Enterobacteriaceae familyasındaki cinsleri sayar ve özelliklerini sıralar. Enterik bakterilerin izolasyonunda kullanılan besiyerlerini sayar. Enterik bakterilerin besiyerlerindeki makroskopik görüntülerini tanımlar. Enterik bakterilerin tanımlanmasında kullanılan biyokimyasal testleri sayar. Gram boyama yöntemiyle boyanmış preparatlardaki enterik basilleri mikroskopik olarak inceler. Enterik bakterilerin tanımlanmasında kullanılan biyokimyasal testlerin sonuçlarını değerlendirir. Laboratuvara gelirken kurallara uygun şekilde giyinir. Mikroskobu kullandıktan sonra temizleyerek bırakır. Laboratuvardan çıkmadan önce ellerini yıkar. Mikroskop Lam Lamel Öze Bek Enterik bakteri (Örn; Escherichia coli, Klebsiella ve Salmonella ssp.) üremiş kültür plakları Mc Conkey/ Endo/ EMB (Eosine Methylene Blue), Selenit F / tetra tiyonat Salmonella-Shigella(SS) agar Triple Sugar Iron (TSI) Agar, İndol besiyeri, Metil red- Voges Proskauer besiyeri ve Simmon's Citrate Agar, Hareket besiyeri, Fenilalanin agar Kovaks ayıracı, Metil Red ayıracı, Ferrik Klorür ayıracı Giriş Enterobacteriaceae klinik olarak önemli gram negatif basil izolatlarının yaklaşık %80 ini ve klinik mikrobiyoloji laboratuvarındaki klinik olarak önemli bakterilerin yaklaşık %50 sini oluşturur. Septisemi olgularının neredeyse %50 sinden, üriner sistem enfeksiyonlarının %70 inden fazlasından ve barsak enfeksiyonlarının önemli bir kısmından 43