DIŞKI HARİCİNDEKİ GASTROİNTESTİNAL SİSTEM ÖRNEKLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ

Transkript

1 DIŞKI HARİCİNDEKİ GASTROİNTESTİNAL SİSTEM ÖRNEKLERİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ Prof. Dr. Meltem Yalınay Çırak Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Klinik Mikrobiyoloji Uygulamaları Klinik Örnekten Sonuç Raporuna Gastrointestinal Sistem Örnekleri 17 Aralık 2010 Ankara

2 Olgu 1 45 yaşında erkek hasta, 2 aydan beri devam eden kusma ve üst karın ağrısı. Kahve ve alkol alınca durumu kötüleşmekte. Epigastrik hassasiyet. Rektal muayenede dışkıda gizli kan pozitif. Hemogram hafif hipokromik mikrositik anemi

3 Tanı: Peptik ülser Örnek: Mide biyopsi örneği Mikroorganizma: Helicobacter pylori

4

5 Helicobacter pylori Mikrobiyolojik Tanısı Helicobacter pylori saptanması İnvaziv yöntemler Non-invaziv yöntemler Antimikrobiyal duyarlılık testleri

6 İnvaziv yöntemler Kültür Histopatolojik tanı Üreaz testleri Moleküler yöntemler

7 Kültür Mide biyopsi örneği 2 korpus 2 antrum örneği (endoskopiden 2 hafta önce antibiyotik ve PPI ilaçların kesilmesi) Taşıma besiyeri (%20 gliserol içeren- Brucella buyyon) 2 ml steril serum fizyolojik Hemen gönderilmeli, bekleyecekse +4 o C'de, 5 saate kadar

8 Mikroskopik inceleme

9 Mide biyopsi örneği Örnek alınması ve hazırlanması Doku nazikçe kıyılır %5-7 at veya koyun kanı içeren Brucella, beyin kalp infüzyon veya triptik soy agar 37 o C'de mikroaerofilik atmosferde (%5-10 karbondioksit, %80-90 nitrojen, %5-10 oksijen) 5-7 gün

10 Vankomisin 6 mg/l Trimetoprim 2,5 mg/l Sefsulodin 2,5 mg/l Polimiksin B IU/l Amfoterisin B 2 mg/l

11

12 Kültürde Başarıyı Etkileyen Faktörler!!!! 1. Örnek alınması 2. Örnekteki bakteri yoğunluğu 3. Örneğin transport şekli 4. Örneğin ekimden önce uygun şekilde hazırlanması 5. Antibiyotik kullanımı 6. PPI kullanımı 7. Kanama

13 Kültür Mide biyopsi örnekleri Endoskopi Narrow band imaging Endosistoskopi Konfokal lazer endomikroskopi (topikal akriflavin, IV fluoresein) Diğer (gastrik sıvı, kan, karaciğer vs.) String test (gastrik mukus) Oro-gastrik fırçalama

14 Fenotipik tanımlama Antimikrobiyal duyarlılık Genomik çalışmalar için en uygun örnek Duyarlılık %77-95 Özgüllük %100

15 Direkt boyama Histopatolojik tanı Hematoksilen-Eozin Warthin-Starry gümüşleme Akridin oranj Giemza Floresans antikor FISH (Fluorescence in situ hybridization) 16S rrna geni Duyarlılık %93-98 Özgüllük %95-98

16 Üreaz testleri Agar esaslı (CLO test- 1 saatte %70-80 duyarlılık, 24 saatte %90-95 duyarlılık) Üre ve ph ya duyarlı boya Yanlış pozitif üre parçalayan diğer organizmalar Yanlış negatif az sayıda mikroorganizma

17 Strip- esaslı (PyloriTek- 2 saatte %99 duyarlılık %95 özgüllük)

18 Moleküler yöntemler PCR esaslı yöntemlerle H.pylori saptanması (standart PCR, RT- PCR, gerçek zamanlı PCR) (2 korpus, 2 antrum) H.pylori enfeksiyonlarının tanısında ve antimikrobiyal direncin gösterilmesinde H.pylori kantitasyonu (10 3 hedef kopya) Sonuç süresi: 48 saat PCR esaslı yöntemlerle H.pylori patojenik faktörlerinin saptanması cagpai vaca baba2, saba oipa, dupa, icea Duyarlılık %95-99 Özgüllük %95-98 Cirak MY, Akyön Y, Megraud F. Diagnosis of Helicobacter pylori. Helicobacter Oct;12 Suppl 1:4-9.

19 PCR esaslı yöntemlerle H.pylori saptanması mide biyopsi örneklerinde 16S RNA geni urea glmm (urec) 26 kda antijen (tsaa) bakterinin ve klaritromisin direncine neden olan 23S RNA daki mutasyonların gerçek zamanlı PCR ile gösterilmesi

20 Helicobacter pylori de makrolid direncinden sorumlu 23S rdna mutasyonlarının moleküler beacon ile saptanması FAM kanalı JOE kanalı Meltem Yalınay Çırak, Doruk Engin, Selahattin Ünal, Şükrü Dumlu, Sevgi Türet

21 Antimikrobiyal Duyarlılık Testleri Glikopeptidler Sefsulodin Polimiksinler Nalidiksik asit Trimetoprim Sulfonamidler Nistatin Amfoterisin B Siklohekzimid İntrensek olarak DİRENÇLİ β-laktamlar Fosfomisin Makrolidler Aminoglikozidler Tetrasiklinler Kloramfenikol Rifampin Flurokinolon 5-nitroimidazol Nitrofuran DUYARLI

22 Çeşitli antibiyotiklerin H. pylori MIC 90 dağılımı Etken madde ph a göre MIC 90 (mg/l) Penisilin Ampisilin Sefaleksin Eritromisin Klaritromisin Siprofloksasin Tetrasiklin Nitrofurantoin Metronidazol Bizmut subsitrat 16 8 Goodwin, C. S., P. Blake, and E. Blincow The minimum inhibitory and bactericidal concentrations of antibiotics and anti-ulcer agents against Campylobacter pyloridis. J. Antimicrob. Chemother. 17:

23 Fenotipik Yöntemler Agar dilüsyon yöntemi (CLSI) Klaritromisin 0.25 µg/ml duyarlı >0.5 µg/ml dirençli Amoksisilin µg/ml Tetrasiklin 2 µg/ml Rifabutin 1 µg/ml Siprofloksazin 1 µg/ml

24 Glupczynski, Y., N. Broutet, A. Cantagrel, L. P. Andersen, T. Alarcon, M. Lopez Brea, and F. Megraud Comparison of the E test and agar dilution method for antimicrobial suceptibility testing of Helicobacter pylori. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 21:

25 Sıvı dilüsyon yöntemi Breakpoint duyarlılık testi Disk diffüzyon testi E-test (Epsilometer-test)

26 Genotipik yöntemler Helicobacter pylori de antibiyotik direnci ile ilişkili genler Antibiyotik Makrolid.. Metronidazol.. Kinolon Rifampin. Amoksisilin. Tetrasiklin... rrn 23S rdxa, frxa gyra rpob pbp1 rrn 16S İlgili gen

27 PCR-RFLP Gerçek zamanlı PCR 3 mismatched PCR 3 mismatched reverse PCR INNO-LIPA Sekanslama, pirosekanslama Oligonucleotide ligation assay DNA enzyme immunoassay Microelectronic chip assay FISH

28 Testler ve Maliyet Yöntem Maliyet İnvaziv testler Moleküler testler ++++ Kültür +++ Histopatoloji +++ Üreaz ++ Noninvaziv ÜNT +++ Fekal antijen testler +++ Seroloji +

29 Olgu 2 5 yaşında erkek hasta, öksürük, kilo kaybı ve gece terleme şikayeti ile başvuruyor. Akciğer muayenesinde diffüz olarak azalan nefes alma sesleri ve akciğer grafisinde konsolidasyon, mediastinal lenfadenopati görülmekte, hasta balgam çıkaramıyor

30 Tanı: Akciğer tüberkülozu (çocukluk çağı) (%5-40) Örnek: Açlık mide sıvısı Mikroorganizma: Mycobacterium tuberculosis

31 Örnek: Açlık mide sıvısı (Balgam, BAL) Klasik tanı yöntemleri Mikroskobik inceleme (EZN, florokrom boyalar) Kültür yöntemleri Geleneksel kültür yöntemleri Hızlı tanı yöntemleri Moleküler tanı yöntemleri İmmünolojik tanı yöntemleri Duyarlılık testleri

32 Tüberkülozun kesin tanısı bakteriyolojiktir.

33 Mikrobiyolojik tanı yöntemleri Klasik tanı yöntemleri Mikroskobik inceleme Kültür yöntemleri Geleneksel kültür yöntemleri Hızlı tanı yöntemleri Moleküler tanı yöntemleri İmmünolojik tanı yöntemleri Duyarlılık testleri

34

35 Klasik Tanı yöntemleri Örnek alınması ve işlenmesi Mikroskopik inceleme Boyama Ehrlich-Ziehl-Neelsen Kinyoun Florokrom Kültür yöntemleri Geleneksel kültür yöntemleri Katı Sıvı Hızlı tanı yöntemleri Katı Sıvı Tanımlama

36 Örnek alınması ve işlenmesi ERİŞKİN Balgam Endotrakeal aspirasyon Bronkoalveolar lavaj sıvısı Akciğer biyopsi örneği Plevral sıvı Gastrik aspirasyon sıvısı Lenf nodu Kemik iliği BOS Kan Karaciğer Peritoneal sıvı İdrar Dışkı ÇOCUK Gastrik aspirasyon sıvısı [Kapsül yutma test (string test)] Balgam İndükte balgam Nasofaringeal aspirasyon Bronkoalveolar lavaj sıvısı Kan Kemik iliği BOS İnce iğne biyopsi materyali İdrar Dışkı

37 Açlık mide sıvısı Mide aspirasyon sıvısı 3 gün üst üste alınan örnek (1 ml, yataktan kalkmadan aç karnına, ml serum fizyolojik verilip geri alınarak) Örnek içine 1 damla brom timol ve %4 sodyum hidroksitle titre edilir 4 saat içinde işleme konulmayacaksa 100 mg sodyum karbonat içeren steril kaplara alınmalı

38 Örnek alınması ve işlenmesi Homojenizasyon Dekontaminasyon N-Asetil-L Sistein-NaOH (NaCl-OH) %4 lük NaOH %5 lik oksalik asit Sülfürik asit metodu Setilpiridinyum klorid-sodyum klorid metodu (CPC) Konsantrasyon

39 Mikroskopik inceleme Duyarlılık %50-80 Lokal infiltrasyon %32 Kaviter tüberküloz %52 AIDS(+) tüberküloz %45 AIDS (-) tüberküloz %81 Özgüllük %99.8

40 Boyama Ehrlich-Ziehl-Neelsen Kinyoun Florokrom (auromin-rodamin) basil/ml

41 EZN Florokrom boyalar Ucuz Uygulaması kolay PPV >90 Özgüllük >98 Pahallı Daha duyarlı Toksik

42 EZN boyama yönteminin her hafta pozitif bir suş Florokrom boya yönteminin ise her hafta pozitif ve negatif suşlar ile çalışılarak kalite kontrolü yapılmalı

43 Boyama yöntemine göre ARB Kantitasyonu EZN Florokrom Sonuç (x1000) (x250) ARB (-)/ 300 alan ARB (-)/ 30 alan ARB (-) 1-2 ARB/ 300 alan 1-2 ARB/ 30 alan Şüpheli 1-9 ARB/ 100 alan 1-9 ARB/ 10 alan ARB/ 10 alan 1-9 ARB/ alan ARB/ alan ARB/ alan 3+ >9 ARB/ alan >90 ARB/ alan 4+

44 10 basil/ml Duyarlılık %80-93 Özgüllük %98 Kültür yöntemleri Tür tanımlama Duyarlılık testleri Genomik çalışmalar

45 Kültür yöntemleri Geleneksel kültür yöntemleri Katı (Yumurta bazlı ve agar bazlı) Sıvı Hızlı tanı yöntemleri Katı Sıvı (otomatize sistemler)

46 Geleneksel kültür yöntemleri Katı Sıvı Yumurta bazlı bütün yumurta veya yumurta sarısı, patates unu, tuz ve gliserol Löwenstein-Jensen besiyeri (18-24 gün- 8 hafta) Petragnani besiyeri American Trudeau Society besiyeri Agar bazlı Middlebrook 7H10 (10-12 gün) Middlebrook 7H11 Middlebrook 7H9 MODS (Microscopic Observation Drug Susceptibility Assay - Mikroskobik inceleme İlaç Duyarlılığı Testi)

47 Katı Hızlı tanı yöntemleri TK besiyeri Sıvı (Otomatize kültür sistemleri) BACTEC MGIT MB/BacT Bifazik Septi-check AFB ESP MYCO

48 TK besiyeri (Salubris) Kolorimetrik esaslı sistem Kullanımı kolay, renk değişikliği ile kısa sürede sonuç (2 hafta) Ko-enfekte olan hastalar ve çocuklardan alınan her türlü örnek Kocagoz T, O Brien R, Perkins M, A new colorimetric culture system for the diagnosis of tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis Dec;8(12):1512.

49 Sıvı (Otomatize kültür sistemleri) BACTEC 460 TB Sistemi (radyometrik esaslı sistem) (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD) Mycobacteria Growth Indicator Tube (MGIT) 960 Sistemi (floresans esaslı sistem) BACTEC 9000 MB Sistemi (floresans esaslı sistem) BacT/ALERT MB (MB/BacT) Sistem (kolorimetrik esaslı sistem) (Organon Teknika, Durham, NC)

50 Avantaj 1-4 hafta İlaç duyarlılık süresini kısaltır Tür tanımlama süresini kısaltır İş yükünü azaltır Dezavantaj Pahallı Özel ekipman gerekmekte

51 Tanımlama yöntemleri Kord faktör oluşumu MacConkey agarda, kanlı agarda üreme testi NAP (p-nitro-α-acetylamino-β- hydro-xypropiophenone) testi Biyokimyasal testler Niasin testi Nitrat redüksiyonu Katalaz testi Pirazinamidaz testi, Thiophene-2 karboksilik asit hidrazid testi Moleküler testler (PCR-RFLP, Spoligotipleme,Nükleik asit hibridizasyon, dizi analizi) HPLC (>50 ayırım, M.tuberculosis ve M. bovis i, ayıramaz)

52 Moleküler Tanı Gerçek zamanlı PZR (IS 6110) Sonuç süresi: saat

53 Mycobacterium tuberculosis pozitif örnek

54 Mycobacterium tuberculosis negatif örnek

55 Olgu 3 4 yaşındaki kız çocuk kreşte yediği pastadan 3 saat sonra şiddetli kusma, ishal, ateş şikayetleri ile acil servise başvuruyor. Acil serviste aynı kreşten 3 çocuk daha tedavi altında

56 Tanı: Besin zehirlenmesi Örnek: Gastrik içerik Rektal sürüntü En sık rastlanan patojen: Staphylococcus aureus

57 Örnek: Gastrik içerik Rektal sürüntü Taşıma:Genel taşıma besiyeri (Stuart) Mikroskobik inceleme: Gram boyama Kültür: Kanlı agar Kantitatif kültür