ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE

Transkript

1 EK-11 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJELERİ KOORDİNASYON BİRİMİ KOORDİNATÖRLÜĞÜNE Proje No Proje Yöneticisi Proje Konusu : 13Ö : Doç. Dr. Özgür Çınar : Normozoospermik ve Oligozoospermik Hastalarda DNA Kırığının Eliminasyonu İçin Uygun Sperm Seçim Yönteminin Belirlenmesi Yukarıda bilgileri yazılı olan projemin kesin raporunun e-kütüphanede yayınlanmasını; İSTİYORUM İSTEMİYORUM GEREKÇESİ:... /... / 20 Doç. Dr. Özgür Çınar

2 EK-11 ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Normozoospermik ve Oligozoospermik Hastalarda DNA Kırığının Eliminasyonu İçin Uygun Sperm Seçim Yönteminin Belirlenmesi Doç. Dr. Özgür Çınar - Burcu Emine ÇETİNKAYA- Betül KOCA 13Ö Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara

3 EK-11 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Türkçe Adı İngilizce Adı : Normozoospermik ve Oligozoospermik Hastalarda DNA Kırığının Eliminasyonu Ġçin Uygun Sperm Seçim Yönteminin Belirlenmesi : Determination of the suitable sperm preparation technique for normozoospermic and oligozoospermic patients in terms of DNA strand break elimination

4 Özeti : DNA (deoksiribonükleik asit); organizmaların canlılık işlevleri ve biyolojik gelişimleri için gerekli genetik bilgiyi taşıyan moleküldür. RNA (ribonükleik asit) ve proteinler gibi diğer hücre bileşenlerinin oluşması için şablon görevi görür. Kimyasal yapısı nükleotit olarak adlandırılan moleküllerden meydana gelmiş iki uzun polimerden oluşur. Birbirlerine ters yönde uzanan bu polimerlerin omurgaları ester bağları ile birbirine bağlanmış şeker ve fosfat gruplarından meydana gelir. Her bir şeker grubuna baz olarak adlandırılan dört çeşit molekülden biri bağlanır (A,T,G,C). DNA nın omurgası boyunca bu bazların oluşturduğu dizi genetik bilgiyi kodlar. Protein sentezi sırasında bu bilgi, mrna aracılığı ile proteinlerin aminoasit dizisini belirler. Spermatozoon, erkek üreme hücresidir. Görev ve fonksiyonu erkeğe ait genetik bilginin oluşacak embriyo için oosite taşınmasını ve bu sırada bu bilginin korunmasını sağlamaktır. Bir spermatozoon genel olarak bir baş ve bir kuyruk bölgesinden oluşur. Baş bölgesi lizozomal bir organelin bulunduğu akrozom, spermin döllenme için ovosite yapıştığı kenar olan ekvator bölgesi ve akrozom sonrası bölgeyi içerir. Genetik bilgiyi baş bölgesi taşır. Döllenme sürecinin tamamlanması ve bunu takiben embriyo gelişimi, sperm DNA bütünlüğüne bağlıdır. Kondanse sperm DNA sı hatasız bir şekilde genetik materyalin geçişi için gereklidir. Hasarlı DNA fertilizasyon oluşumunu engelleyebilir veya oluşan embriyolarda konjenital anomalilere yol açabilir. Ġnfertil çiftlerin yaklaşık %30 sinde erkeğe bağlı faktörler temel neden iken, kadına bağlı faktörlerin de dahil edilmesiyle bu oran %40-%50 lara ulaşmaktadır. Günümüzde, infertil erkeklerin yaklaşık %15 inde infertilitenin kesin tanısı rutin semen analizi ile konulamamaktadır. Bu nedenle son yıllarda dikkatler sperm DNA bütünlüğü üzerine yoğunlaşmıştır. Yapılan son çalışmalarda erkek infertilitesinin belirlenmesinde sperm DNA bütünlüğünün rutin semen analizine göre daha iyi bir belirteç olabileceği öngörülmektedir. Programlı hücre ölümü mekanizmalarından biri olan apopitoz vücutta ihtiyaç duyulmayan veya anormalleşmiş hücrelerden kurtulmanın normal yoludur. Hipoksi, ısı, anti-kanser ilaçlar, radyasyon, gamma ve ultraviyole ışınlar gibi etkenler apopitoza neden olabilir. Apopitoz sinyali alan bir hücrenin kromatini yoğunlaşmaya başlar. Benzer bir şekilde sitoplazma da yoğunlaşır ve hücrenin boyutları küçülür. Bir süre sonra hücre apopitotik cisimcik olarak adlandırılan daha küçük parçalara bölünür. Morfolojik değişimlerin yanısıra apopitoz; hücre içinde biyokimyasal yolaklarca düzenlenir. Kaspazlar apopitoz esnasında önemli rol oynayan sistein-proteaz grubu enzimlerdir. Hücre ölümü sırasında meydana gelen pek çok hücresel ve şekilsel değişim, bu enzimlerin rol oynadığı birtakım süreçler neticesinde gelişir. Sonlandırıcı kaspazlar aktive olduktan sonra sitoplazmada ve çekirdek içinde hedef proteinleri yıkarlar. Hedef proteinlerden bir tanesi DNA endonu?kleaz ile bağ yapan bir proteindir. Kaspazlar bu proteini yıkarak endonükleazı serbestleştirirler ve çekirdek içine giren Ca++ /Mg++ bağımlı endonu?kleaz, DNA kırıkları oluşturur. TUNEL yöntemi kırık DNA uçlarına (3 -OH uçlarına) flüoresan işaretli nükleotidlerin bir enzim aracılığıyla eklenmesi prensibine dayanarak kırık DNA uçlarını belirler. Terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT) enzimi ile kırık DNA uçlarına bağlanan flüoresan işaretli nükleotidler flüoresan ve/veya konfokal mikroskopi ile görüntülenebilir. Ancak bu yöntemin canlı hücrelere uygulanabilmesi mümkün değildir. Son yıllarda öne çıkan Manyetik hücre ayrıştırma sistemi (MACS) ise sperm hücrelerinin ayrıştırılmasında da kullanılabilmekte, annexin-v işaretli manyetik mikroküreler apopitoz ile birlikte hücre yüzeyine taşınan fosfotidil serin moleküllerine bağlanarak apopitotik sperm

5 II. Amaç ve Kapsam hücrelerinin, sağlıklı sperm hücrelerinden ayırılmasını sağlamaktadır. Tüp bebek kliniklerinde yaygın olarak kullanılan swim-up ve dansite-gradient yöntemleri ise temelde ejekülattan en yüksek sayıda ileri hareketli sperm elde etme esasına dayanır ve seçiciliği sınırlıdır. Çalışmamızda normozoospermik ve oligozoospermik hastalarda rutin sperm yıkama işlemleri olan swim-up ve dansite-gradient yöntemlerinin apopitotik hücrelerin ayrıştırılması üzerine etkinliğinin MACS yöntemi ile karşılaştırılması hedeflenmektedir. Bu gerekle androloji laboratuvarına rutin testler için başvuran hastalardan alınacak örnekler swim-up ve dansite-gradient yöntemleri ile yıkanacak, MACS ile ayrıştırılan spermlerle birlikte DNA kırıklarının varlığı açısından TUNEL yöntemi ile değerlendirilerek karşılaştırılacaktır. Elde edilen sonuçların tüp bebek kliniklerinde erkek infertilitesine yönelik yeni bir bakış açısı kazandırmasının yanısıra, literatüre önemli katkıda bulunacağı öngörülmektedir. Çalışmamızda normozoospermik ve oligozoospermik hastalarda rutin sperm yıkama işlemleri olan swim-up ve dansite-gradient yöntemlerinin apopitotik hücrelerin ayrıştırılması üzerine etkinliğinin MACS yöntemi ile karşılaştırılması ve böylelikle tüp bebek kliniklerinde erkek infertilitesine yeni bir bakış açısı kazandırılması hedeflenmektedir.

6 III. Materyal ve Yöntem Androloji laboratuvarına gelen hastalardan alınacak normozoospermik ve oligozoospermik toplam 10 adet semen örneğine rutin sperm hazırlama tekniklerinin yanısıra MACS yöntemi uygulanacaktır; 1.Swim-up yöntemi? Semen örneği SpermRinse medyumu ile 1:1 oranında karıştırılan likefiye örnek uygun süre ve santrifüjde santrifüj edilecek.? Supernatant uzaklaştırılır.? Pellet üzerine G-Mops PLUS medyumu eklenerek Falcon tüp 45? lik açıyla inkübatöre (%CO2, 37?C) yerleştirilecek.? Yaklaşık 45 dakika süreyle ileri hareketli spermlerin Falcon tüp yüzeyine ulaşması beklenecek. 2.Dansite-gradient yöntemi? Semen örneği SpermGrad medyumu ile oluşturulan iki ayrı gradient üzerine yavaşça bırakılacak.? Örnek 400g de 10 dakika süreyle santrifüj edilecek.? Her bir gradiente ait supernatant atılacak.? Pellet petriye yayılarak üzeri yağ ile kapatılır, inkübatöre (%CO2, 37?C) yerleştirilecek.? Yaklaşık 45 dakika süreyle ileri hareketli spermlerin medyum kenarına ulaşması beklenecek. Elde edilen ileri hareketli spermler TUNEL yöntemi ile DNA kırıkları açısından değerlendirilecektir. 3.MACS yöntemi? Sperm hücreleri 300g de 4 dakika santrifüj edilecek.? Pellet 15 dakika süreyle Anneksin-V mikroküreleri içeren 500 µl süspansiyon ile oda ısısında inkübe edilecek.? Süspansiyon manyetik bir alan içerisinde yine manyetik özellikli bir kolondan geçirilerek apopitotik hücrelerden arındırılacak. Elde edilen non-apopitotik hücreler TUNEL yöntemi ile DNA kırıkları açısından değerlendirilecektir. 4.TUNEL yöntemi? Sperm hücreleri %4 formaldehit ile +4?C de 20 dakika süreyle fikse edilecek.? Fiksatif 400g de 10 dakika santrifüj ile uzaklaştırılacak.? PBS-azid ile sulandırılan pellet lam üzerine yayılarak kurutulacak.? 37?C de 1 saat süreyle TUNEL işaretleme ve enzim solüsyonları ile muamelenin ardından hücreler, 15 dakika boyunca çekirdek işaretlemesi amacıyla 7AAD ile inkübe edilecek.? Preparatlar kapama medyumu ile kapatılarak lazer taramalı Carl Zeiss konfokal mikroskobu ile DNA kırıklarının varlığı açısından değerlendirilecek. Apopitozun varlığı (TUNEL indeksinin doğruluğu) anti-kaspaz-3 antikoru ile immunoflüoresans boyama sonrasında doğrulanacaktır. 5.Ġmmunoflüoresans boyama? Sperm hücreleri %4 formaldehit ile +4?C de 20 dakika süreyle fikse edilecek.? Fiksatif 400g de 10 dakika santrifüj ile uzaklaştırılacak.? PBS-azid ile sulandırılan pellet lam üzerine yayılarak kurutulacak.? 37?C de 1 saat süreyle flüoresan konjuge anti-kaspaz-3 antikoru ile muamelenin ardından hücreler, 15 dakika boyunca çekirdek işaretlemesi amacıyla 7AAD ile inkübe edilecek.? Preparatlar kapama medyumu ile kapatılarak lazer taramalı Carl Zeiss konfokal mikroskobu ile apopitozun varlığı açısından değerlendirilecek. Tüm istatistiksel analizler SPSS (Statistical Package for Social Sciences) paket programı ile yapılacaktır. IV. Analiz ve Bulgular Analiz ve bulgular ektedir.

7 V. Sonuç ve Öneriler V. Sonuç ve ÖnerilerSonuç olarak; normozoospermi olgularında yıkama yöntemleri sonrasında toplam ve ileri hareketli sperm sayılarındaki azalmaya rağmen, elde edilen spermlerin gerek intrauterin inseminasyon, gerekse in vitro fertilizasyon tedavileri için sayı ve hareketlilik bakımından uygun olduğu anlaşılmaktadır. YY+MACS yöntemi sonucunda elde edilen sperm sayısı diğer gruplara göre daha az olmakla birlikte bu yöntemin DNA sı hasarlı hücreleri elemesi bakımından daha iyi bir yöntem olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Oligozoospermi olgularında ise yıkama yöntemlerinin birbiri üzerine gerek hareketlilik ve morfoloji, gerekse sperm DNA sı açısından bir üstünlüğü olmadığı saptanmıştır. Yıkama yöntemleri sonrasında toplam ve ileri hareketli sperm sayılarındaki azalmanın Yardımla Üreme Teknikleri için kabul edilebilir olmadığı düşünülmüştür. VI. Kaynaklar VII. Kaynaklar1. Moohan JM, Lindsay KS. Spermatozoa selected by a discontinuous Percoll* density gradient exhibit better motion characteristics, more hyperactivation, and longer survival than direct swim-up. Fertil Steril. 1995;64(1): Van Der Zwalmen P, Bertin-Segal G, Geerts L, Debauche C, Schoysman R.Sperm morphology and IVF pregnancy rate: comparison between Percoll gradient centrifugation and swim-up procedures. Hum Reprod. 1990;6(4): Rawe VY, Boudri HU, Sédo CA, Carro M, Papier S, Nodar F. Healthy baby born after reduction of sperm DNA fragmentation using cell sorting before ICSI. Reprod Biomed Online. 2010;20: Makker K, Agarwal A, Sharma KR. Magnetic activated cell sorting (MACS): Utility in assisted reproduction. Indian Journal of Experimental Biology Jul;46: Sergerie M, Laforest G, Bujan L, Bissonnette F. Sperm DNA fragmentation: threshold value in male fertility.6. World Health Organization. WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. 2010;5th edition. VII. Ekler a) Mali Bilanço ve Açıklamaları: Sarf malzemeler proje bütçesinden ihale usulüyle ve A.Ü. BAP kontrolünde karşılanmıştır. b) Makine ve Teçhizatın Konumu ve Ġlerideki Kullanımına Dair Açıklamalar: Proje kalemlerinde makine ve teçhizat bulunmamaktadır. c) Teknik ve Bilimsel Ayrıntılar: - d) Sunumlar (bildiriler ve teknik raporlar):

8 Çalışmamızın sonuçları XII. Ulusal Histoloji ve Embriyoloji Kongresi nde sözlü bildiri olarak sunulmuş ve Sözlü Bildiri Ġkincilik Ödülü ne layık bulunmuştur.cetinkaya B., Koca B., Aras D., Çakar Z., Ozkavukcu S., Can A., Çınar Ö. Normozoospermi olgularında sağlam DNA ya sahip sperm hücrelerinin seçimi için uygun yöntemin belirlenmesi. XII. Ulusal Histoloji ve Embriyoloji Kongresi, Mayıs 2014, Ankara.NORMOZOOSPERMĠ OLGULARINDA SAĞLAM DNA YA SAHĠP SPERM HÜCRELERĠNĠN SEÇĠMĠ ĠÇĠN UYGUN YÖNTEMĠN BELĠRLENMESĠBurcu Çetinkaya1,2, Betül Koca1,2, Duru Aras1, Zeynep Çakar1,3, Sinan Özkavukcu4, Alp Can1, Özgür Çınar1* 1Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı, Sıhhiye, Ankara2Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Tandoğan, Ankara3Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı, Beşevler, Ankara4Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Üremeye Yardımcı Tedaviler Merkezi, Cebeci, Ankara* Ġletişim:Doç. Dr. Özgür ÇınarAnkara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı, Sıhhiye, Döllenme sürecinin tamamlanmasının ardından sağlıklı bir embriyonun gelişmesi, sperm ve ovosit DNA larının hasarsız olmasıyla yakından ilişkilidir. Hasarlı DNA fertilizasyon oluşumunu engelleyebilir veya oluşan embriyolarda çeşitli anomalilere yol açabilir. Rutin uygulamada sperm seçim yöntemlerinden yukarı yüzdürme (YY, swim-up) ve yoğunluk-gradiyenti (YGr) yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin hareketlilik, morfoloji ve fertilizasyon yeteneği bakımından yetkin spermatozoanın seçiminde etkin olduğu daha önce gösterilmiştir. Manyetik alan yardımıyla DNA kırığı olan spermlerin uzaklaştırılması (MACS) yöntemi son yıllarda uygulama bulmuş bir diğer yöntemdir. Bir sonraki aşamada bu yöntemlerin birlikte kullanımı gündeme gelmiştir. Bu amaçla tasarlanmış olan çalışmamızın hipotezi şudur: YY ve YGr yöntemleriyle MACS ın birlikte kullanılması daha kaliteli spermleri elde etmeyi sağlar. Bu amaçla, YY ve YGr yöntemleri ve bunların MACS ile birliktelikleri karşılaştırılmalı olarak sperm hareketi ve DNA bütünlüğü açısından ele alındı. GEREÇ VE YÖNTEM: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Androloji laboratuvarına rutin testler için başvuran 10 normozoospermik olgudan alınan örneklerde sperm hücrelerinin sayı ve hareket değerlendirmeleri Makler kamarasında yapıldı. Bu örnekler daha sonra 4 grupta ele alınarak ileri işlemlere geçildi. Gruplar şu şekilde oluşturuldu: 1) YY 2) YGr 3) YY+MACS 4) YGr + MACS. Sperm örneklerine rutin YY ve YGr yöntemleri uygulandı. MACS yöntemiyse, içinde apopitotik hücrelerin yüzeyinde beliren bir molekül olan Annexin-V e özgün metal mikroküreler bulunan bir medyum içinde bekletilen sperm hücre süspansiyonunun, daha sonra manyetik alana sahip bir kolondan geçirilerek apopitotik hücrelerin, olmayanlardan uzaklaştırılması mantığı üzerine dayanmaktadır. Her bir gruptan elde edilen sperm hücreleri % 4 yoğunlukta formaldehit içinde tespit edildikten sonra lamellerin üzerinde havada kurutuldu. Daha sonra DNA kırıklarını incelemek için TUNEL yöntemi; DNA bütünlüğünü incelemek için Chromomycin A3 ile işaretleme yapıldı. Hücreler konfokal mikroskopta görüntülendi. Her gruptan en az 500 hücre sayılıp bunların içindeki pozitif sinyal veren hücre oranları belirlenerek TUNEL indeksi (TI) ve DNA bütünlüğü indeksi (DBI) belirlendi. Her bir grup için spermatozoon sayısı, hareketliliği (Dünya Sağlık Örgütü, 2010 yılı kılavuzuna göre), TI ve DBI sonuçları, gruplar arasındaki farkın anlamlılığını saptamak amacıyla tekrarlı ölçümlerde tek faktörlü varyans analizi ve paired t-test yöntemiyle değerlendirildi. P<0,05

9 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. (Not: Çalışma için etik kurul onayı ve imzalanmış kabul edilmiş onam alınmıştır.)bulgular: Taze sperm örnekleriyle karşılaştırıldığında hem sperm hücre sayısında hem de ileri hızlı hareketli (a motil) sperm hücresi sayısında 4 grupta da anlamlı bir azalma izlendi. Gruplar kendi içinde karşılaştırıldığında YY ile YGr arasındaki fark anlamlı değilken; YY ile YY + MACS ve YGr ile YGr + MACS arasında MACS gruplarında toplam sperm sayısının ve ileri hızlı hareketli sperm sayısının azalması şeklinde anlamlı bir fark izlendi. MACS grupları arasındaysa anlamlı bir fark izlenmedi. YY ve YGr yöntemleri arasında TI açısından anlamlı bir fark izlenmedi. YY grubunda %16,4±13,9 olan TI, YY + MACS grubunda %7,6±5,9 olarak izlendi, ama bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. Benzer şekilde YGr + MACS grubundaki TI ndeki azalma YGr grubundan anlamlı olarak farklı değildi. Öte yandan, YY + MACS grubunun TI (%7,6±5,9), YGr + MACS (%15,7±6,8) grubundan anlamlı olarak farklı bulundu (p=0,007).sonuç: Bu bulgular ışığında, normozoospermi olgularında 4 farklı yöntem sonucunda toplam sperm hücresi ve ileri hızlı hareketli sperm hücresi sayısında azalma olsa bile, elde edilen sperm hücrelerinin gerek intra uterin inseminasyon, gerekse in vitro fertilizasyon tedavileri için sayı ve hareketlilik bakımlarından uygun olduğu anlaşılmaktadır. YY + MACS yöntemi sonucunda elde edilen sperm sayısı diğer gruplara göre daha az olmakla birlikte DNA sı hasarlı hücreleri elemesi bakımından daha iyi bir yöntem olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Bundan sonraki aşamada benzer çalışmanın oligozoospermi olgularında da yapılması, bunun yanında sperm hücrelerinde fertilizasyonda görev alan proteinlerin varlığı ve dağılımının incelenmesi planlanmıştır.

10 e) Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve tezler: Çalışmamızın sonuçları XII. Ulusal Histoloji ve Embriyoloji Kongresi nde bildiri olarak yayınlanmış ve Sözlü Bildiri Ġkincilik Ödülü ne layık bulunmuştur.cetinkaya B., Koca B., Aras D., Çakar Z., Ozkavukcu S., Can A., Çınar Ö. Normozoospermi olgularında sağlam DNA ya sahip sperm hücrelerinin seçimi için uygun yöntemin belirlenmesi. XII. Ulusal Histoloji ve Embriyoloji Kongresi, Mayıs 2014, Ankara.NORMOZOOSPERMĠ OLGULARINDA SAĞLAM DNA YA SAHĠP SPERM HÜCRELERĠNĠN SEÇĠMĠ ĠÇĠN UYGUN YÖNTEMĠN BELĠRLENMESĠBurcu Çetinkaya1,2, Betül Koca1,2, Duru Aras1, Zeynep Çakar1,3, Sinan Özkavukcu4, Alp Can1, Özgür Çınar1* 1Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı, Sıhhiye, Ankara2Ankara Üniversitesi, Fen Fakültesi, Tandoğan, Ankara3Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı, Beşevler, Ankara4Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Üremeye Yardımcı Tedaviler Merkezi, Cebeci, Ankara* Ġletişim:Doç. Dr. Özgür ÇınarAnkara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı, Sıhhiye, Döllenme sürecinin tamamlanmasının ardından sağlıklı bir embriyonun gelişmesi, sperm ve ovosit DNA larının hasarsız olmasıyla yakından ilişkilidir. Hasarlı DNA fertilizasyon oluşumunu engelleyebilir veya oluşan embriyolarda çeşitli anomalilere yol açabilir. Rutin uygulamada sperm seçim yöntemlerinden yukarı yüzdürme (YY, swim-up) ve yoğunluk-gradiyenti (YGr) yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemlerin hareketlilik, morfoloji ve fertilizasyon yeteneği bakımından yetkin spermatozoanın seçiminde etkin olduğu daha önce gösterilmiştir. Manyetik alan yardımıyla DNA kırığı olan spermlerin uzaklaştırılması (MACS) yöntemi son yıllarda uygulama bulmuş bir diğer yöntemdir. Bir sonraki aşamada bu yöntemlerin birlikte kullanımı gündeme gelmiştir. Bu amaçla tasarlanmış olan çalışmamızın hipotezi şudur: YY ve YGr yöntemleriyle MACS ın birlikte kullanılması daha kaliteli spermleri elde etmeyi sağlar. Bu amaçla, YY ve YGr yöntemleri ve bunların MACS ile birliktelikleri karşılaştırılmalı olarak sperm hareketi ve DNA bütünlüğü açısından ele alındı. GEREÇ VE YÖNTEM: Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Androloji laboratuvarına rutin testler için başvuran 10 normozoospermik olgudan alınan örneklerde sperm hücrelerinin sayı ve hareket değerlendirmeleri Makler kamarasında yapıldı. Bu örnekler daha sonra 4 grupta ele alınarak ileri işlemlere geçildi. Gruplar şu şekilde oluşturuldu: 1) YY 2) YGr 3) YY+MACS 4) YGr + MACS. Sperm örneklerine rutin YY ve YGr yöntemleri uygulandı. MACS yöntemiyse, içinde apopitotik hücrelerin yüzeyinde beliren bir molekül olan Annexin-V e özgün metal mikroküreler bulunan bir medyum içinde bekletilen sperm hücre süspansiyonunun, daha sonra manyetik alana sahip bir kolondan geçirilerek apopitotik hücrelerin, olmayanlardan uzaklaştırılması mantığı üzerine dayanmaktadır. Her bir gruptan elde edilen sperm hücreleri % 4 yoğunlukta formaldehit içinde tespit edildikten sonra lamellerin üzerinde havada kurutuldu. Daha sonra DNA kırıklarını incelemek için TUNEL yöntemi; DNA bütünlüğünü incelemek için Chromomycin A3 ile işaretleme yapıldı. Hücreler konfokal mikroskopta görüntülendi. Her gruptan en az 500 hücre sayılıp bunların içindeki pozitif sinyal veren hücre oranları belirlenerek TUNEL indeksi (TI) ve DNA bütünlüğü indeksi (DBI) belirlendi. Her bir grup için spermatozoon sayısı, hareketliliği (Dünya Sağlık Örgütü, 2010 yılı kılavuzuna göre), TI ve DBI sonuçları, gruplar arasındaki farkın anlamlılığını saptamak amacıyla tekrarlı ölçümlerde tek faktörlü varyans analizi ve paired t-test yöntemiyle değerlendirildi. P<0,05 değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi.

11 (Not: Çalışma için etik kurul onayı ve imzalanmış kabul edilmiş onam alınmıştır.)bulgular: Taze sperm örnekleriyle karşılaştırıldığında hem sperm hücre sayısında hem de ileri hızlı hareketli (a motil) sperm hücresi sayısında 4 grupta da anlamlı bir azalma izlendi. Gruplar kendi içinde karşılaştırıldığında YY ile YGr arasındaki fark anlamlı değilken; YY ile YY + MACS ve YGr ile YGr + MACS arasında MACS gruplarında toplam sperm sayısının ve ileri hızlı hareketli sperm sayısının azalması şeklinde anlamlı bir fark izlendi. MACS grupları arasındaysa anlamlı bir fark izlenmedi. YY ve YGr yöntemleri arasında TI açısından anlamlı bir fark izlenmedi. YY grubunda %16,4±13,9 olan TI, YY + MACS grubunda %7,6±5,9 olarak izlendi, ama bu azalma istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. Benzer şekilde YGr + MACS grubundaki TI ndeki azalma YGr grubundan anlamlı olarak farklı değildi. Öte yandan, YY + MACS grubunun TI (%7,6±5,9), YGr + MACS (%15,7±6,8) grubundan anlamlı olarak farklı bulundu (p=0,007).sonuç: Bu bulgular ışığında, normozoospermi olgularında 4 farklı yöntem sonucunda toplam sperm hücresi ve ileri hızlı hareketli sperm hücresi sayısında azalma olsa bile, elde edilen sperm hücrelerinin gerek intra uterin inseminasyon, gerekse in vitro fertilizasyon tedavileri için sayı ve hareketlilik bakımlarından uygun olduğu anlaşılmaktadır. YY + MACS yöntemi sonucunda elde edilen sperm sayısı diğer gruplara göre daha az olmakla birlikte DNA sı hasarlı hücreleri elemesi bakımından daha iyi bir yöntem olduğu sonucuna ulaşılmıştır. Bundan sonraki aşamada benzer çalışmanın oligozoospermi olgularında da yapılması, bunun yanında sperm hücrelerinde fertilizasyonda görev alan proteinlerin varlığı ve dağılımının incelenmesi planlanmıştır.