İNEKLERDE SPONTAN OVİDUKT KASILIMLARI ÜZERİNE NİTRİK OKSİTİN ETKİSİNİN İN VİTRO OLARAK BELİRLENMESİ

Transkript

1 AFYON KOCATEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İNEKLERDE SPONTAN OVİDUKT KASILIMLARI ÜZERİNE NİTRİK OKSİTİN ETKİSİNİN İN VİTRO OLARAK BELİRLENMESİ Okty YILMAZ DOĞUM ve JİNEKOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Mehmet UÇAR Bu tez Afyon Koctepe Üniversitesi Arştırm Fonu trfındn 07.VF.04 Proje numrsı ile desteklenmiştir Tez No: AFYONKARAHİSAR

2

3 III ÖNSÖZ Sütçü ve dmızlık inek yetiştirmelerinde döl verimi yönünden yıld bir yvru elde edebilmek, bu işletmelerin devmlılığını sğlyn en önemli ekonomik girdilerden biridir. Bu süreç, hyvnlrın gebe bırkılmsıyl bşlmkt ve sğlıklı bir şekilde yvrulrın doğmsın kdr devm etmektedir. Diğer trftn krşılşıln infertilite problemleri, bu işletmelerin ekonomik çıdn sürdürülebilirliğini etkileyen temel etmenlerden biri olrk krşımız çıkmktdır. İnfertilite problemlerinin orty çıkmsınd pek çok fktör etkili olbilmektedir. Öncelikli olrk en kıs sürede bu problemlerin çözülmesi ve hyvnlrın tekrr gebe bırkılmlrı gerekmektedir. Fertilizsyonun şekillendiği orgn oln ovidukt fizyolojik vey ptolojik koşullr bğlı olrk gebeliğin oluşmsınd ve dolyısıyl döl verimi prmetrelerinin değişmesinde etkili olbilmektedir. Fertilizsyon için optiml ortmı sğlyn oviduktun fonksiyonlrının düzenlenmesinde pek çok fktörün etkili olduğu bilinmektedir. Son yıllrd ypıln çlışmlrd klp dmr sistemi üzerine etkileri belirlenen nitrik oksitin, üreme fonksiyonlrı üzerinde de etkilerinin olduğu orty konulmuştur. Diğer trftn nitrik oksitin ovidukt fonksiyonlrının düzenlenmesindeki etkinliği hkkındki bilgiler yeterli seviyede olmmkl birlikte ypılck rştırmlrl bu konunun dh d fzl ydınltılmsı gerekmektedir. Bu çlışmnın gerçekleşmesi sırsınd öneri ve kritikleri ile ktkıd bulunn tez izleme komitesi üyeleri Doç. Dr. H. Ahmet Çelik e ve Doç. Dr. Aziz Bülbül e şükrnlrımı sunrım. Ayrıc izole orgn bnyosunun çlışm prensibini öğreten ve tezimin isttistiksel değerlendirmelerini ypn Fizyoloji Anbilim Dlı öğretim üyesi Doç. Dr. Aziz Bülbül e tekrr teşekkür etmeyi borç bilirim. İmmünohistokimysl boym yöntemi ile ilgili tecrübelerini ktrn Ptoloji Anbilim Dlı öğretim üyesi Doç. Dr. Alper Sevimli ye teşekkürlerimi sunrım. Polony d bulunn Wrmi Mzury Üniversitesi Veteriner Fkültesinde yürüttüğüm çlışmlrım sırsınd göstermiş olduğu ilgiden dolyı Rektör Yrdımcısı Prof. Dr. Andrzej Koncicki ye ve değerli ilesine, tez çlışmm için kıymetli bilim insnlrıyl bir ry gelmemi sğlyn Veteriner Fkültesi Deknı Prof. Dr. Słwomir Zduńczyk ve Doğum ve Jinekoloji Anbilim Dlı Bşknı Prof. Dr. Tomsz Edwrd Jnowski ye içtenlikle teşekkür ederim. İzole orgn bnyosu kullnımındki tecrübelerini pylşn ve gerekli

4 IV kimysllrı temin ederek deneysel çlışm olnğı sğlyn Dekn yrdımcısı ve Frmkoloji ve Toksikoloji Anbilim Dlı Bşknı Doç. Dr. Jerzy Jroszewski ye, çlışm mterylimi toplmm yrdım eden Frmkoloji ve Toksikoloji Anbilim Dlı öğretim üyesi Dr. Włodzimierz Mrkiewicz e ve lbortur çlışmlrımd göstermiş olduklrı yrdımlrdn dolyı Frmkoloji ve Toksikoloji Anbilim Dlının tüm öğretim elemnlrın sygılrımı ve teşekkürlerimi sunrım. İmmünohistokimysl boym, Western blot ve RT-PCR nlizleri için lbortur olnklrını sğlyn Antomi Anbilim Dlı Bşknı Prof. Dr. Mirosłw Łkomy e, bu nlizler için gerekli finnsl desteği sğlyn ve immünohistokimysl boym sonuçlrını değerlendirdiğimiz Fizyoloji Anbilim Dlı Bşknı Prof. Dr. Jrosłw Cłk y ve misfirperverliği için kıymetli ilesine, konfokl mikroskop kullnımınd teknik bilgileri pylşn doktornt Michł Złęcki ye, RT-PCR ve Western blot nlizlerini değerlendirdiğimiz Antomi Anbilim Dlı öğretim üyesi Dr. Rfł Bukowski ye ve Doç. Dr. Krzysztof Wąsowicz e sonsuz teşekkürlerimi sunrım. Ayrıc tüm çlışmlrım boyunc göstermiş olduğu sonsuz sbırdn dolyı değerli eşim Ebru Yılmz teşekkür ederim.

5 V İÇİNDEKİLER Kbul ve Ony Önsöz İçindekiler Simgeler ve Kısltmlr Dizini Şekiller Dizini Çizelgeler Dizini ÖZET SUMMARY 1. GİRİŞ Ovidukt Nitrik Oksit Nitrik Oksitin Oluşumu Nitrik Oksit Etkinliğinin Belirlenmesinde Kullnıln Yöntemler İzole Orgn ve Doku Bnyosu Sistemleri İzole Orgn ve Doku Bnyosu Tipleri Revers Trnskriptz Polimerz Zincir Reksiyonu ve Western Blot Yöntemi Nitrik Oksitin Etkileri Nitrik Oksitin Dişi Reprodüktif Sistem Üzerine Etkileri Ovryum Folliküler Gelişim ve Ovulsyon Lutel Ypı Uterus Serviks ve Vgin Seksüel Dvrnış Ovidukt GEREÇ VE YÖNTEM Gereç Yöntem Hyvnlrın Seçimi ve Seksüel Sikluslr Göre Gruplndırılmsı Kn Progesteron Düzeyinin Belirlenmesi Kn Nitrik Oksit Düzeyinin Belirlenmesi 18 II III V VII X XII XIII XV

6 VI Oviduktlrın Hzırlnmsı ve Değerlendirilmesi İzole Düz Ks Şeritlerinin Hzırlnmsı ve Değerlendirilmesi Ovidukt Dokusund İmmünohistokimysl Boym, Revers Trnskriptz Polimerz Zincir Reksiyonu (RT-PCR) ve Western Blot Yöntemleri ile Nitrik Oksit Sentz Enzimlerinin Vrlığının Belirlenmesi İmmünohistokimysl Boym için Doku Örneklerinin Tespit Edilmesi ve Değerlendirilmesi Revers Trnskriptz Polimerz Zincir Reksiyonu (RT-PCR) ve Western Blot Yöntemleri için Doku Örneklerinin Hzırlnmsı ve Değerlendirilmesi İsttistiksel Değerlendirme BULGULAR Hyvnlrın Kn Progesteron (P4) Düzeyleri Hyvnlrın Kn Nitrik Oksit Düzeyleri Oviduktt L-rjinin Uygulmsı Sonrsınd Oluşn İzometrik Ksılım Değerleri (%) Oviduktt Sodyum Nitro Prusid (SNP) Uygulmsı Sonrsınd Oluşn İzometrik Ksılım Değerleri (%) Ovidukt Dokusund Nitrik Oksit Sentz Enzimlerinin İmmünohistokimysl Olrk Dğılımlrı Ovidukt Dokusund Revers Trnskriptz Polimerz Zincir Reksiyonu Yöntemi ile Belirlenen Nitrik Oksit Sentz Enzimleri Ovidukt Dokusund Western Blot Yöntemi ile Belirlenen Nitrik Oksit Sentz Enzimleri TARTIŞMA SONUÇ KAYNAKLAR 71

7 VII 7 Simgeler ve Kısltmlr Dizini ATP BH 4 bp BSA C +2 cdna CL CO 2 cgmp DNA E2 ECLIA ET-1 FAD FMN ic ir GTP P4 Adenozin trifosft Tetrhidrobiopterin bse pir Sığır serum lbumini Klsiyum Komplementer deoksiribonükleik sit Korpus luteum Krbondioksit Siklik gunozin 3-5 monofosft Deoksiribonükleik sit Östrojen Elektrokemilüminesns immüno ssy Endotelin-1 Flvin denin dinükleotit Flvin denin mononükleotit İyonize klsiyum İmmunrektivite Gunnozin trifosft Progesteron PGE 2 Prostglndin E 2 PGF 2 α Prostglndin F 2 Alf KS Krebs solusyonu kd Kilo dlton L-NAME N-Nitro-L-rjinin metil ester L-NNA N-Monometil-L-rjinin L-NOARG L-N G -nitro rjinin L-NMMA N5-[imino(methylmino)methyl]-L-ornithine, monocette LPS Lipopoliskkrid MB Metilen mvisi NADPH Nikotinmin denin dinükleotit fosft NADPH-d Nikotinmid denin dinükleotit fosft diforz

8 VIII 8 NN 3 NEDD NO NO 2 -Arg NOS cnos enos bnos inos nnos - NO 2 - NO 3 ODQ OH-L-rg O 2 PKG PBS PBG RNA RT-PCR sgc spermin NONOte SNAP SNP TBS α β Μg μl ml mm mg Sodyum zid N-(1-nphthyl)ethylenedimin Nitrik oksit N G -nitro-l-rjinin Nitrik oksit sentz Ypısl nitrik oksit sentz Endoteliyl nitrik oksit sentz Beyin nitrik oksit sentz Uyrılbilir nitrik oksit sentz Nöronl nitrik oksit sentz Nitrit Nitrt 1H-[1,2,4]oxdizolo[4,3-]quinoxlin-1-one N G -hidroksil-l-rjinin Oksijen Protein kinz G Fosft buffer sline Fosft buffer gliserol Ribonükleik sit Revers trnskriptz polimerz zincir reksiyonu Çözünebilir gunilt siklz (Z)-1-[N-[3-minopropyl]-N-[4-(3- minopropylmmonio)butyl]-mino]dizen-1-ium-1,2-diolte N-(cetyloxy)-3-nitrosothiovline Sodyum nitro prusid TRIS buffered sline Alf Bet Mikrogrm Mikrolitre Mililitre Milimetre Miligrm

9 IX 9 nm Nnomolr % Yüzde g Grm nm Nnomol C Sntigrt derece μm Mikromolr M Molr l Litre

10 X 10 Şekiller Dizini Şekil 1.1: Oviduktun bölümleri ve ovumun ovidukt knlı boyunc silyumlr rcılığıyl hreketi 3 Şekil 1.2: Frklı nitrik oksit sentz (NOS) enzimleri rcılığıyl L-rjininden nitrik oksit sentezi 5 Şekil 1.3: Düz ks dokusund nitrik oksite bğlı gerçekleşen gevşemenin şemtize gösterimi 7 Şekil 2.1: Sodyum nitrt konsntrsyonlrın krşı okunn bsorbns değerleri ile elde edilen klibrsyon eğrisi 19 Şekil 3.1 : Gruplrd istmusun longitidunl düz ksı üzerine çeşitli konsntrsyonlrdki L-rjinin (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M,10-3 M), L-NAME (10-5 M ) + L-rjinin (10-3 M) ve MB (10-5 M ) + L-rjinin (10-3 M) vrlığınd oluşn yüzde (%) ksılım değerleri 31 Şekil 3.2 : Gruplrd istmusun sirküler düz ksı üzerine çeşitli konsntrsyonlrdki L-rjinin (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M,10-3 M), L-NAME (10-5 M ) + L-rjinin (10-3 M) ve MB (10-5 M ) + L-rjinin (10-3 M) vrlığınd oluşn yüzde (%) ksılım değerleri 32 Şekil 3.3: Gruplrd mpullnın longitidunl düz ksı üzerine çeşitli konsntrsyonlrdki L-rjinin (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M), L-NAME (10-5 M ) + L-rjinin (10-3 M) ve MB (10-5 M ) + L-rjinin (10-3 M) vrlığınd oluşn yüzde (%) ksılım değerleri 35 Şekil 3.4: Gruplrd mpullnın sirküler düz ksı üzerine çeşitli konsntrsyonlrdki L-rjinin (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M, 10-3 M), L-NAME (10-5 M ) + L-rjinin (10-3 M) ve MB (10-5 M ) + L-rjinin (10-3 M) vrlığınd oluşn yüzde (%) ksılım değerleri 36 Şekil 3.5: Gruplrd istmusun longitidunl düz ksı üzerine çeşitli konsntrsyonlrdki SNP (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M) vrlığınd oluşn yüzde (%) ksılım değerleri 38 Şekil 3.6: Gruplrd istmusun sirküler düz ksı üzerine çeşitli konsntrsyonlrdki SNP (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M) vrlığınd oluşn yüzde (%) ksılım değerleri 39 Şekil 3.7: Gruplrd mpullnın longitidunl düz ksı üzerine çeşitli konsntrsyonlrdki SNP (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M) vrlığınd oluşn yüzde (%) ksılım değerleri 40

11 XI 11 Şekil 3.8: Gruplrd mpullnın sirküler düz ksı üzerine çeşitli konsntrsyonlrdki SNP (10-8 M, 10-7 M, 10-6 M, 10-5 M, 10-4 M) vrlığınd oluşn yüzde (%) ksılım değerleri 41 Şekil 3.9: İstmusun lmin propri ve muskuler ktmnlrı ile seroz ktmnındki kn dmrlrı endotelinde enos-ir 43 Şekil 3.10: Ampullnın seroz ve muskuler ktmnlrı ile lmin propriysınd bulunn kn dmrlrı endotelinde enos-ir 43 Şekil 3.11: Gruplrd istmusun epitel hücrelerinin lumene bkn yüzünde çizgi trzınd loklize olmuş enos-ir 45 Şekil 3.12: Gruplrd mpullnın epitel hücrelerinin lumene bkn yüzünde çizgi trzınd loklize olmuş enos-ir 46 Şekil 3.13: Endoteliyl NOS için primer ntiserum çıkrılmsı ve non-immun serumun yer değiştirilmesiyle ypıln kontrol boymlrı 47 Şekil 3.14: Aynı shd bulunn epitel tbkd primer ntiserum ve sdece sekunder ntiserum ile boym sonrsı immunfloresns ynıt veren nokt şeklindeki ypılr 47 Şekil 3.15: Gruplrd istmusun epitel hücrelerinin lumene bkn yüzünden lmin propriy kdr uznn nnos-ir 49 Şekil 3.16: Gruplrd mpulnın epitel hücrelerinin lumene bkn yüzünden lmin propriy kdr uznn nnos-ir 50 Şekil 3.17: İstmust metöstrüs grubund serozd, erken diöstrüs grubund muskuler ktmnd ve lmin proprid, geç diöstrüs grubund muskuler ktmnd, folliküler evre grubund lmin proprid ve serozd kn dmrlrı çevresinde sinir fibrilleri 52 Şekil 3.18: Ampulld metöstrüs grubund muskuler ktmnd, erken diöstrüs grubund serozd, folliküler evre grubund lmin proprid ve seroz ktmnınd sinir fibrilleri 54 Şekil 3.19: Nöronl NOS için primer ntiserum çıkrılmsı ve non-immun serumun yer değiştirilmesiyle ypıln kontrol boymlrı 55 Şekil 3.20: Gruplrd istmus ve mpullnın enos, nnos ve inos mrna ekspresyonlrının RT-PCR bulgusu 56 Şekil 3.21: Gruplrd istmus ve mpullnın enos, nnos ve inos proteinlerine it bntlrın Western Blot bulgusu 57

12 XII 12 Çizelgeler Dizini Çizelge 2.1: Lutel ypının krkterine göre seksüel siklus dönemlerinin belirlenmesi 17 Çizelge 2.2: Sodyum nitrt için okunn bsorbns değerler 19 Çizelge 2.3: İsthmus ve mpullnın longitidunl ve sirküler ks şeritlerine uygulnn deney protokolü 22 Çizelge 2.4: Polimerz Zincir Reksiyonu için kullnıln primerlerin seknslrı, büyüklükleri ve bğlnm sıcklıklrı 26 Çizelge 3.1: Hyvnlrın gruplr göre serum progesteron düzeyleri 28 Çizelge 3.2: Hyvnlrın gruplr göre serum nitrik oksit düzeyleri 28 Çizelge 3.3: Gruplr göre istmus ve mpullnın longitidunl ve sirküler ks dokulrınd logritmik olrk rtn dozlrd uygulnn L-rjinin ve SNP ile L-NAME (10-5 M ) + L-rjinin (10-3 M) ve MB (10-5 M ) + L-rjinin (10-3 M) uygulmlrının ksılım şiddetinde oluşturduklrı değişimler 42 Çizelge 3.4: Tüm gruplrd istmus ve mpullnın epitel tbksınd izlenen enos-ir skorlrı 44 Çizelge 3.5: Tüm gruplrd istmus ve mpullnın epitelyum tbksınd izlenen nnos-ir skorlrı 48 Çizelge 3.6: Gruplrd istmust pozitif nnos-ir gösteren sinir fibrillerinin bulunduklrı yerlere göre görülme sıklıklrı 51 Çizelge 3.7: Gruplrd mpulld pozitif nnos-ir gösteren sinir fibrillerinin bulunduklrı yerlere göre görülme sıklıklrı 53

13 XIII 13 ÖZET İneklerde Spontn Ovidukt Ksılımlrı Üzerine Nitrik Oksitin Etkisinin İn Vitro Olrk Belirlenmesi Bu çlışmd, östrüs siklusunun frklı evrelerindeki ineklerde, ovidukt un spontn ksılımlrı üzerine nitrik oksit (NO) in etkisinin in vitro olrk belirlenmesi ve nitrik oksit sentz (NOS) enzimlerinin ekspresyon modellerinin orty konulmsı mçlndı. Özel mezbhlrdn elde edilen 64 Holstein ineğin 88 oviduktu değerlendirildi. Hyvnlr seksüel sikluslrın göre metöstrüs, erken diöstrüs, geç diöstrüs ve folliküler evre olmk üzere 4 grub yrılrk progesteron (P4) ve NO düzeylerinin belirlenmesi için knlrı lındı. İzole orgn bnyosu çlışmlrı için 40 ineğe it lutel ypı bulunn ovryum trfındki oviduktun istmus ve mpull kısımlrındn longitidunl ve sirküler düz ks şeritleri hzırlndı. Dokulrd endojen NO etkinliğini belirlemek mcıyl L-rjinin, Nitro-L-rjinin-metil-ester (L-NAME) + L-rjinin ve metilen mvisi (MB) + L-rjinin uygulnırken, eksojen NO etkinliğini belirlemek için sodyum nitro prusid (SNP) verildi. İmmünohistokimysl boym, RT-PCR ve Western blot yöntemleriyle 24 ineğe it oviduktun istmus ve mpull kısımlrı değerlendirilirken, Western blot nlizinde bu hyvnlrın her iki oviduktu d kullnılrk NOS izoformlrının ekpresyonlrın bkıldı. L-rjininin istmusun longitidunl düz ks dokusund geç diöstrüs ve folliküler evrede, sirküler düz kst erken diöstrüste ksılım şiddetini değiştirmediği, diğer gruplrd rttırdığı gözlendi. Ampullnın longitidunl düz ksınd geç diöstrüs, sirküler düz ksınd ise geç diöstrüs ve folliküler evre gruplrınd ksılım şiddetini değiştirmediği nck diğer gruplrd rttırdığı belirlendi. İstmus ve mpullnın longitidunl ve sirküler düz kslrın metöstrüs, geç diöstrüs ve folliküler evre gruplrınd L-NAME sonrsı uygulnn L-rjininin, ksılım şiddetini değiştirmediği vey rttırdığı, erken diöstrüste longitidunl düz kst zlttığı, sirkülerde ise değiştirmediği izlendi. Bu dokulrd MB sonrsı uygulnn L-

14 XIV 14 rjininin erken diöstrüs, geç diöstrüs ve folliküler evre gruplrınd ksılım şiddetini değiştirmediği vey zlttığı, metöstrüste değiştirmediği vey rttırdığı gözlendi. SNP in istmusun longitidunl düz ks dokusund metöstrüs ve folliküler evre gruplrınd ksılım şiddetini zlttığı, erken diöstrüste frk oluşturmdığı ve geç diöstrüs grubund rttırdığı görüldü. İstmusun sirküler düz ksınd metöstrüs, erken diöstrüs ve folliküler evre gruplrınd ksılım şiddetini zlttığı, geç diöstrüste frk oluşturmdığı izlendi. Ampullnın longitidunl ve sirküler düz kslrınd metöstrüs ve folliküler evre gruplrınd zlm izlenirken, erken ve geç diöstrüs gruplrınd SNP nin etkili olmdığı görüldü. İmmünohistokimysl olrk tüm gruplrd istmus ve mpulldki endoteliyl NOS (enos) ekpresyonu seroz, ks ktmnı ve lmin propridki kn dmrlrı endotelinde ve epitelyumd gözlendi. Nöronl NOS (nnos) un epitel hücreler ile seroz, muskuler ktmn ve lmin proprid bulunn sinir fibrillerinde pozitif boym gösterdiği belirlendi. Epitel tbkd enos un istmus ve mpulld metöstrüs grubund şiddetli, folliküler evrede ort ve diğer gruplrd zyıf reksiyon, nnos un metöstrüs ve folliküler evre gruplrınd istmust şiddetli, mpulld ort derece reksiyon verdiği gözlendi. Sinir fibrilleri sıklıkl metöstrüs ve folliküler evre gruplrınd pozitif boym gösterdi. RT-PCR nlizinde ise bütün gruplrd enos, nnos ve inos izoformlrı belirlendi. Western Blot yönteminde nnos için herhngi bir bulguy rstlnılmzken, enos ve inos proteinlerinin ipsilterl ve kontrlterl olrk vrlığı gözlendi. Sonuç olrk, ineklerde spontn ovidukt ksılımlrı üzerine NO nun in vitro olrk bir etkisinin olmdığı, bunun nedeninin NOS enzim etkinliğinden kynklnmdığı, ynı zmnd hormonl durumun NOS enzim etkinliğini değiştirebileceği, NOS / NO sisteminin oviduktun ksılım meknizmsınd değil sekretörik ve silir ktivitelerinde rol oynybileceği knısın vrıldı. Anhtr sözcükler: İnek, nitrik oksit, ovidukt, orgn bnyosu, nitrik oksit sentz

15 XV 15 SUMMARY In Vitro Determintion of The Effect of Nitric Oxide on Spontneous Oviduct Contrctility in Cows The objective of this study ws to determine the effect of nitric oxide (NO) on spontneous contrctility of oviduct of cows in different sexul cycle in vitro nd to revel the expression models of nitric oxide synthse enzymes. The oviducts (n:88) of 64 Holstein cows obtined from privte slughterhouse were evluted. Animls were seprted into four groups s metestrous, erly diestrous, lte diestrous nd folliculr phse, then blood smples were tken to define progesterone (P4) nd NO concentrtion. Longitidunl nd circulr isolted strips of isthmus nd mpull of oviducts of cows (n:40) plcing on the sme side of ovry with lutel structure were prepred for isolted orgn bth experiments. L-rginine, Nitro-L-rginine-metil-ester (L-NAME) + L-rginine nd methylene blue (MB) + L-rginine were pplied to the tissues to determine endogenous NO effect nd sodium nitro prusside (SNP) ws used to determine exogenous NO effect. The expression of NOS isoforms in isthmus nd mpull prts of oviducts of 24 cows were evluted for immunohistochemicl stining, RT-PCR nd Western blotting, but lso both oviducts of these cows were used for Western blotting. In isthmus, it ws observed tht L-rginine did not lter contrctile tension in longitidunl smooth muscle tissues in lte diestrous nd folliculr phse groups nd in erly diestrous in circulr muscles, but rised in other groups. In mpull, it ws determined tht contrctile tension ws not chnged not only in longitidunl strips in lte diestrous but lso in circulr smooth muscle tissues in lte diestrous nd folliculr phse. In other groups, the contrctile tension ws incresed. By using L-rginine pplied fter L-NAME, it ws seen tht contrctile tension ws not chnged or incresed in metestrous, lte diestrous nd folliculr phse in longitidunl nd circulr smooth muscle tissues both in isthmus nd mpull. However, it ws decresed in erly diestrous in longitidunl strips but not chnged in circulr smooth muscle tissues. In ddition, by using L-rginine pplied fter

16 XVI 16 methylene blue (MB), the contrctile tension ws not chnged or decresed in erly, lte diestrous nd folliculr phse, ws not chnged or incresed in metestrous. In longitidunl smooth muscle tissues of isthmus, it ws determined tht contrctile tension ws decresed in metestrous nd folliculr phse groups, but ws not chnged in erly diestrous nd incresed in lte diestrous groups, by using sodium nitro prusside (SNP). Beside this, in circulr smooth muscle tissues, contrctile tension ws decresed in metestrous, erly diestrous nd folliculr phse groups nd ws not chnged in lte diestrous by SNP. In longitidunl nd circulr smooth muscle tissues of mpull, SNP ws not effective on contrctile tension in erly nd lte diestrous groups while the tension ws decresed in metestrous nd folliculr phse groups by SNP. Immunohistochemiclly, in ll groups endothelil NOS (enos) expression in isthmus nd mpull ws observed in endothelium on blood vessels in seros, musculr lyer nd lmin propri nd epithelium. Neuronl NOS (nnos) hd positive stining in epithelil cells nd nerve fibres in seros, musculr lyer nd lmin propri. In epithelil lyer of isthmus nd mpull, it ws seen tht enos rection ws strong in metestrous, moderte in folliculr phse nd wek in other groups, while nnos rection ws strong in isthmus nd moderte in mpull in metestrous nd folliculr phse groups. Positive stining of nerve fibres ws observed mostly in metestrous nd folliculr phse groups. In ll groups enos, nnos nd inos isoforms were detected by RT-PCR. In Western blotting, enos nd inos proteins were evident in ipsi-contr lterl oviduct wheres nnos ws undetectble. In conclusion, it ws suggested tht NO hd no effect on spontneous oviduct contrctility in cows in vitro, this effectiviness ws not due to NOS enzyme ctivity however, hormonl sttus could chnge the NOS enzyme ctivity nd NOS / NO pthwy could ply role in secretory nd ciliry functions, but not in contrctility in oviduct. Key words: Cow, nitric oxide, oviduct, orgn bth, nitric oxide synthse

17 1 1. GİRİŞ İnek yetiştiriciliğinde reprodüktif verimlilik, işletmelerin devmlılığını sğlyn önemli kriterlerden biridir. Günümüze kdr süregelen bilimsel çlışmlr syesinde verimliliğin rttırılmsı yönünde pek çok gelişme sğlnmıştır. Diğer trftn reprodüktif biyoteknoloji lnındki çlışmlr hlen yürütülmektedir. Bu çlışmlr, ovum ve spermtozonın sğlıklı bir zigot oluşturm süreci üzerine yoğunlşmış durumddır. Bu süreci spermtozonın ship olduğu hreketlilik, ovum ve en önemlisi fertilizsyonun gerçekleştiği orgn oln ovidukt etkilemektedir. Diğer trftn özellikle ineklerde % 4.84 insidnst seyreden ovidukt lezyonlrının (1) infertiliteye sebep oln etmenlerden biri olmsı nedeniyle de bu orgn dişi reprodüksiyonund önemli bir yere shiptir. Oviduktun düz ks kontrktilitesi ile epitel hücrelerinin silir ve sekretörik ktiviteleri bu orgnın en önemli fonksiyonlrı rsınddır. Ovryum kökenli hormonlrın (2), prostglndinlerin (3), sitokinlerin (4), endoteliyl büyüme fktörlerinin (5) ve nitrik oksit (NO) in (6-8) ovidukt fonksiyonlrının düzenlenmesinde etkili olbildiği ktrılmktdır. Nitrik oksit, tmosferde bulunn zot (N) ve oksijen (O) gzlrının bileşimiyle oluşn zot monoksit ypısınd bir gzdır (9). Bu gz, kıs ömürlü ve yüksek ornd rektif serbest bir rdikl olup, difüzyon yolu ile membrnlrdn geçebilen bir moleküldür (10). Nitrik oksit etkisini, oluştuğu hücrenin ykınındki vey dh uzğındki hedef hücrelerde göstermektedir. Lipofilik özelliğinden dolyı özel bir tşıyıcıy gereksinim duymmkt ve dolyısıyl dmr endotelinden slındığı zmn hücre zrındn kolylıkl geçerek dmr düz ks hücrelerinde gevşeme ypbilmektedir (11). Reprodüktif süreçte NO nun oosit mtursyonu, ovulsyon, implntsyon, gebeliğin devmı ve doğum gibi pek çok fizyolojik olyd etkili olduğu kbul edilmektedir (12-15).

18 Ovidukt Ovidukt, fertilizsyon sırsınd optiml ortm koşullrını sğlyn, gmetlerin ve erken dönemdeki zigotun uterus doğru trnsportunun gerçekleştiği genitl orgn olmsı nedeniyle reprodüktif çıdn önem tşımktdır (16). Slpfinks, Fllopi tüpü, tub uterin ve yumurt knlı olrk d dlndırıln ovidukt, Müller knllrının ön kısmı trfındn şekillendirilen, ligmentum ltum uteri üzerinde seyreden, ince duvrlı ve küçük çplı bir çift borucuk şeklinde ovryumlrl kornu uteriler rsınd yer ln genitl orgnlrdn biridir. Ovidukt, ineklerde belirli bir sınır göstermeksizin kornu uterilerin uç kısımlrıyl birleşmektedir (17). İnfundibulum, mpull ve istmus olrk üç kısım yrıln ovidukt, içten dış doğru tunik mukoz, tunik muskulris ve peritonun iç yprğındn köken ln tunik seroz tbklrındn oluşmktdır (17, 18). Tunik mukoz oviduktun iç yüzeyini kplmkt ve ovidukt lumenine doğru pili dı verilen uzntılr oluşturmktdır. Uzun oln mukoz çıkıntılrı fimbri tub üzerinde bulunmkt ve ovryum yüzeyine doğru uznmktdır (Şekil 1.1). Ucu huni şeklinde genişlemiş infindibulumun hreketli oln bu uçlrı syesinde oositin lınmsı ve ovidukt ilerlemesinin sğlndığı ktrılmktdır (17). Mukoz tbksı lmin epiteliylis ve lmin propri ktlrındn oluşmktdır. Lmin epiteliylis tek ktlı prizmtik epitel hücrelerinden meydn gelirken lmin propri ise gevşek bğdokudn oluşmktdır. Bir kısmı kinosilyumlu oln epitel hücrelerinin yükseklikleri uterus doğru zlmktdır. Kinosilyumlrın hreketleri ile ovum uterus doğru iletilmektedir (Şekil 1.1). Kinosilyumlr primtlrın dışındki dişilerde sdece folliküler dönemde gelişmektedir. Lutel dönemde ise bunlrın küçüldüğü görülmektedir. Silyumsuz hücrelerin sitoplzmlrınd bulunn slgı grnüllerinden üretilen slgılr, ovum y d embriyonun beslenmesine yrdımcı olmktdır (17,18).

19 3 Şekil 1.1: Oviduktun bölümleri (A) ve ovumun ovidukt knlı boyunc silyumlr rcılığıyl hreketi (B). OV: Ovryum, INF: İnfindibulum, AMP: Ampull, IST: İstmus, UTJ: Uterus istmus birleşme yeri (19). Oviduktun düz ks tbksı, temel olrk sirküler ve longitidunl ks demetleri içermektedir. İnfundibulum ve mpulld tunik muskulris incedir ve iç trft seyreden sirküler ktmn ile dışt seyreden longitidunl düz ks demetlerinden oluşmktdır. İstmustki ks tbksı ise dh belirgin olup uterusun sirküler ks tbksı ile kynşmktdır. Ovum ve zigotun oviduktun bölümleri içerisindeki hreketleri düz ks ksılımlrı ile epitel hücrelerin silir ktiviteleri yrdımıyl gerçekleşmektedir. Spermtozonın mpully geçişi, uterus ve ovidukt duvrının musküler ksılımlrı trfındn sğlnmktdır. Hreketsiz prtiküllerin ve motil olmyn spermtozonın motil spermtozo ile ynı hızd ovidukt ilerleyebilmesi, spermtozo hreketinin sdece kendine özgü motilitesinden kynklnmdığını düşündürmektedir. Nitekim ineklerde spermtozo çiftleşme sonrsı ortlm beş dkik içerisinde mpully ulşbilmektedir. Bu durumun spermtozonın motilite yeteneği, ovidukt düz ks ktivitesi ve/vey ovidukt hücrelerinin silir hreketlerinden dolyı oluştuğu ifde edilmektedir (18). Düz kslrd meydn gelen ks kontrksiyonlrı klsiyum (C +2 ) trfındn düzenlenmektedir. Düz ks miyozini ship olduğu hfif zincirin (p-hfif zinciri) fosforilsyonu ile ksılm döngüsüne bşlmkt ve böylece hücre içine giren C +2 nın klmodüline bğlnmsıyl, ktif hle geçen klmodülin miyozin hfif zincir kinzı (miyozinin fosforile edilmesinde ktlizör) ktive etmektedir (20). Düz ksın gevşeme meknizmsınd C +2 nın klmodulinden yrılmsı ile kinzın inktivsyon uğrryrk p-hfif zincirine yeni fosft eklenmediği görülmektedir. Miyozin bşının ATP nin vrlığınd fibriler ktinden yrıldığı, defosforile p-hfif

20 4 zincirinin vrlığındn dolyı yeniden bğlnmyrk düz kst gevşemenin şekillendiği ifde edilmektedir (21). Düz kslrd diğer bşk meknizmlrın d gevşeme oluşturbileceği ktrılmktdır. Bun göre; - Siklik gunozin monofosft (cgmp) ve cgmp bğımlı protein kinzın gonistlerle uyrılmış fosfolipz C oluşumunu inhibe ederek inositol trifosft üretiminin engellenmesi, - C +2 hücre dışın tılımının uyrılmsı (C +2 ATPz düzenleyici proteinin, cgmp bğımlı protein kinzl fosforilzyonu sonucund srkoplzmik retikulum C +2 ATPz enziminin etkinleştirilmesiyle), - Miyozinin etkin olmyn formunu stbilize eden miyozin hfif zincirinin defosforilsyonunun rttırılmsı - Reseptörle kontrol edilen C +2 knllrının engellenmesi, - Membrn C +2 ATPz enziminin uyrılmsı, - Potsyum (K + ) knllrı yoluyl K + geçirgenliğinde rtış (cgmp bğımlı protein kinzın cgmp ile etkinleştirilmesi ve K + knllrın çılmsı ile membrnın hiperpolrize olrk voltj bğımlı C +2 knllrın kpnmsı ve dmr genişlemesinin oluşmsı) gibi meknizmlr ile düz kslrd gevşeme oluşbilmektedir (22). Ovidukt düz ks dokusunun ksılımlrı sözü edilen meknizmlr dışınd hormonl olrk d etkilenebilmektedir. Ypıln bir rştırmd; Ulbrich ve rk (23), östrojen ve progesteron reseptörlerinin oviduktun frklı bölümlerinde loklize olduklrını ktrmktdırlr. Ortiz ve rk (24) ise gebe rtlrd yptıklrı çlışmd östrdiolün, ovumun trnsportunu sürekli olrk hızlndırdığını belirtmektedirler. Fuentelb ve rk (25) d bu etkinin eş zmnlı olrk uygulnn progesteron ile bloke edilebildiğini vurgulmktdırlr. Bun ek olrk Hermoso ve rk (26) östrdiolün, ksılım dlglrının doku boyunc yyılmsın izin vererek ve şiddetini rtırrk, düz ks hücreleri rsınd yer ln gp birleşim yerlerinin gelişimini desteklemek suretiyle, ovidukttki ks ktivitesini senkronize ettiğini ktrmktdırlr. Bir bşk çlışmd Lindblom ve rk (27) prostglndinlerin siklusun değişik evrelerinde frklı ovidukt kısımlrınd ksılımlrı etkilediğini ifde etmektedirler. Bun ilve olrk in vitro koşullrd PGF 2 α nın ovidukt ksılımlrını rttırdığı, PGE 2 nin sirküler kslrd inhibisyon, longitidunl kslrd düşük dozlrınd inhibisyon, yüksek dozlrınd stimülsyon neden olduğu belirtilmektedir

21 5 (27). Kotwic ve rk (28) ise inek oviduktund oksitosin reseptörünün vrlığını belirlediklerini, erken lutel ve folliküler evrede oksitosinin motilite üzerindeki stimültör etkisinin izlendiğini belirtmektedirler Nitrik Oksit Nitrik Oksitin Oluşumu Nitrik oksit, substrt olrk yrı esnsiyel bir minosit oln L-rjininin nitrik oksit sentz enzimleri trfındn sentezlenmesiyle gerçekleşmektedir (29). L-rjininden NO sentezi iki şmd oluşmktdır. Birinci şmd L-rjininin bir molekülü, nikotinmin denin dinükleotit fosft (NADPH) ve oksijen vrlığınd, r ürün oln N G -hidroksil-l-rjinin (OH-L-rg) oluşturmk için oksitlendirilmektedir. Son şmd ise OH-L-rg bir derece dh oksitlenerek, bir molekül NO ve L-sitrülinin oluşmsı sğlnmktdır (30-32). Memelilerde L-rjininden NO sentezi, oksijen ve C +2, tetrhidrobiopterin, flvin denin dinükleotid ve flvin denin mononükleotit gibi kofktörlerin vrlığınd meydn gelmektedir (33). Nitrik oksit, hızlı bir şekilde nitrit (NO - 2 ) ve nitrt (NO - 3 ) okside olmktdır (34) (Şekil 1.2). L-rjinin + O 2 NADPH L-rjinin nloglrı inos + Sitokinler, LPS (L-NAME, L-NMMA) FAD NOS enos FMN + ic ++ BH 4 nnos NADP + L-sitrulin + NO NO 3 NO 2 Şekil 1.2: Frklı nitrik oksit sentz (NOS) enzimleri rcılığıyl L-rjininden nitrik oksit sentezi (35). FAD: Flvin denin dinükleotit, FMN: Fflvin denin mononükleotit, BH 4 : Tetrhidrobiopterin, NADP: Nikotinmid denin dinükleotit fosft, NO: Nitrik oksit, NOS: Nnitrik oksit sentz, ic: İyonize klsiyum, NO 2 : Nitrit, NO 3 : Nitrt, LPS: Lipopoliskkrid.

22 6 Nitrik oksit sentz bir enzim grubu olup ypısl NOS (cnos) ve uyrılbilir NOS (inos) olmk üzere iki tipi bulunmktdır (36,37). Ypısl NOS, NO nun sürekli bzl seviyede slınımındn sorumlu oln izofrom I (nnos, bnos, NOS I) ve izoform III (enos; NOS III) ten oluşmktdır. İzoform I in ilk olrk sıçn ve sığır beyinciğinde (38), İzoform III ün de endotel hücrelerde belirlendiği ifde edilmektedir (36). Ypısl NOS ktivitesi için C 2+ /klmodülin kompleksinin vrlığı gerekmektedir. Diğer trftn, cnos ktivitesinin östrojen, meknik fktörler ve endotelin gibi gonistlerle stimüle edilebildiği bildirilmektedir (36, 39, 40). Uyrılbilir NOS (inos) un, ilk olrk mkrofjlrd identifiye edildiği (41) ve sitokinler ile lipopoliskkridlere ynıt olrk ekpresyon uğrybildiği belirtilmektedir (29). Uyrılbilir NOS, C 2+ vrlığın gerek duymdn yüksek miktrlrd NO üretiminden sorumludur (42). Hücre içerisinde rtn C 2+ konsntrsyonu cnos ktivsyonu ve NO sentezi için birbirini izleyen bzı olylrı bşltmktdır. Hücre içindeki C 2+, O 2 ve L- rjininin NO ve L-sitrüline dönüşümünü, flvin gruplrı yoluyl, redüktz bölgesinde bulunn NADPH den hem grubun klmodülin için elektron trnsferini düzenlemek suretiyle sğlmktdır. Ayrıc klsiyum-klmodülin kompleksini oluşturmk için klmodüline bğlnmktdır (43). Ypısl NOS krşın inos, enzimin lt ünitelerine sıkıc bğlnn klmodüline shiptir. Bu nedenle hücre içerisinde C 2+ konsntrsyonund bir rtış olmksızın klıcı bir ktivsyon göstermektedir (44). Nöronl NOS (nnos) ve endoteliyl NOS (enos) trfındn üretilen düşük miktrlrdki NO nörotrnsmisyon, vskuler tonun devmlılığı, trombosit gregsyonunun inhibisyonu, endoteliyl hücrelerde nötrofil/trombosit dezyonunun önlenmesi, poptozisin düzenlenmesi ve düz ks hücre prolifersyonu ile migrsyonunun inhibisyonu gibi fizyolojik olylr rcılık etmektedir (33, 39, 45, 46). Kn dmrlrınd NO trfındn çözünebilir (soluble) gunilt siklz (sgc) ın ktivsyonu endoteliyl kynklı NO nun düz ks hücrelerinde gevşemeye neden olmsıyl sonuçlnmktdır (47). Nitrik oksit, gunilil siklz bğlnrk siklik gunozin monofosft (cgmp)-spesifik proteinzlr (protein kinz G, PKG), N + iyonlrı ve fosfodiesterzlrı ktive ederek gen ekspresyonunu düzenlemektedir (41).

23 7 NO, siklik gunozin 3-5 monofosftın (cgmp) üretimini rttırrk dmrlrd gevşemeyi etkinleştirmektedir (Şekil 1.3) (48). GTP (NOS) (sgc) Endojen NO donörü NO cgmp PKG Gevşeme Eksojen NO donörü Şekil 1.3: Düz ks dokusund nitrik oksite bğlı gerçekleşen gevşemenin şemtize gösterimi (49). NO: Nitrik oksit, NOS: Nitrik oksit sentz, sgc: Çözünebilir gunilt siklz, cgmp: Siklik gunozin monofosft, GTP: Gunnozin trifosft, PKG: Protein kinz G Nitrik Oksit Etkinliğinin Belirlenmesinde Kullnıln Yöntemler Değişken ve kıs ömürlü bir mdde oln NO nun direkt ölçümler ile orty konulmsı oldukç zordur. Bununl birlikte, doku ve hücre kültürleri ile doku ekstrtlrınd NOS ktivitesinin vey NO sentezinin değerlendirilmesi gibi bzı teknikler kullnılbilmektedir. Nitrit ve nitrt in vitro olrk frklı doku ve hücre kültürlerinde NO üretimi için bir indeks olrk değerlendirilebilmektedir (50, 51). Nitrik oksit sentz ktivitesi nlizi için kullnıln diğer bir metot ise NO nun her molekülü için eş zmnlı slınrk üretilen L-rjininin metboliti oln L- sitrülinin direk ölçümüdür (38). Bun ek olrk, NOS loklizsyonunu belirleyen histokimysl yöntemlerle de NO hkkınd yorum ypılbilmektedir (34, 52, 53). Diğer bir lterntif yklşım d NADPH diforz ktivitesinin (NADPH-d) dğılımının belirlenmesidir. Anck NADPH-d ktivitesinin diğer pek çok enzim ile NOS benzer sonuç verebileceği ifde edilmektedir (54). Oksidsyon ürünü oln nitritin (NO - 2 ) Griess reksiyonu dı verilen bir metotl ölçümünün prtik ve güvenli bir yöntem olduğu bildirilmektedir (55, 56). Gunilt siklz, cgmp konsntrsyonunu rtırrk NO nun hücresel etkilerini göstermesine rcılık etmektedir (34). Nitrik oksit, gunilt siklz ve sitokrom P-450 enzimleri gibi proteinlerle tepkimeye girmektedir (57). Oksidsyon, nitrit yoluyl idrrd nitrtın oluşmsın öncülük etmektedir. Okside olmuş NO yrıc sülfhidril

24 8 içeren bileşikleri ile nitrosiylt molekülleri gibi NO nun kendisinden dh stbil oln biyolojik olrk ktif türevlerinin oluşmsıyl sonuçlnmktdır (58). Düz ks hücrelerinde cgmp nin, cgmp bğımlı protein kinzı ktive etmesi hücre içi C 2+ konsntrsyonunun zlmsın ve sonrsınd relkssyon neden olmktdır. Bu nedenle cgmp konsntrsyonunun ölçümü, non-spesifik bir yklşım olmkl birlikte NO ktivitesinin değerlendirilmesinde kullnılmktdır (34) İzole Orgn ve Doku Bnyosu Sistemleri Nitrik oksit ktivitesinin değerlendirildiği diğer bir yklşım d izole doku ve orgn çlışmlrıdır. İzole orgn sistemlerinde, orgn vey doku vücudun sinirsel ve hormonl etkilerinden uzk olmsı nedeniyle ypıln değişiklikler kontrol ltınd tutulbilmekte ve denenen mddeye lınn cevplr bu deneylerde dh net değerlendirilebilmektedir (59, 60). İzole orgn sistemleri, biyolojik sistem ve ölçü sisteminden meydn gelmektedir. Biyolojik sistemi doku vey orgn, orgn bnyosu, fizyolojik çözelti, gz kımını sğlyn prt ve kullnılck deney mddesinden oluşur. Ölçü sistemi, dönüştürücü sistem (trnsduser), mplifiktör ve kyıt sisteminden (kimogrf, osilogrf, bilgisyr) meydn gelmektedir (60-62). İzole orgn deneyleri, çık ve çift duvrlı olrk dlndırıln iki tip orgn bnyosu kullnılrk gerçekleştirilebilmektedir (60, 62-64). Açık tipte, geniş hcimli bir dış bnyo ile bunun içine giren, dokunun tespit edildiği küçük hcimli bir iç bnyo bulunmktdır. Termosttik kontrol meknizmsı ile dış bnyo içindeki ısıtıcı kontrol edilirken, iç bnyonun sıcklığı dış bnyod ısınn su trfındn sğlnır. Fizyolojik çözelti dış bnyo içinde y d orgn bnyosunun dışınd, iç bnyo ile bğlntılı yrı bir bölüme doldurulrk iç bnyoy iletilmektedir (60, 63). Çift duvrlı izole orgn bnyosu fizyolojik çözelti ve termosttik kontrollü su ihtiv eden iki küvetten oluşmktdır. Sistemin sıcklığı dış küvet içerisinde dolşn sıvı trfındn sbit tutulmktdır. Fizyolojik çözelti, orgn bnyosunun üst kısmındki bölümden musluk yrdımıyl kdehlere iletilmektedir. Dokunun tespit edildiği kdehin lt ucundki diğer bir musluk rcılığıyl, gz krışımı iç küvete verilerek dokunun sürekli şekilde hvlndırılmsı sğlnbilmektedir. Deneye bşlmdn önce dokuy 1 vey 2 grmlık gerim uygulnrk ve dkiklık

25 9 periyotlrd fizyolojik çözelti değiştirilerek dokunun dkik süreyle ortm lışmsı için beklenmesi gerektiği belirtilmektedir (60, 62, 64). İzole orgn sistemleri kullnılrk ypıln çlışmlrd, dokunun tespit edildiği kdeh içerisine rştırılck kimyslın etkili doz rlığınd eklenmesiyle kimyslın dokud oluşturduğu etki bilgisyr ortmınd değerlendirilebilmektedir. Rtlrd NO nun uterusun myometril spontn ksılımlrı üzerine etkisinin incelenmesi mcıyl izole orgn bnyo sistemi kullnıldığı ve bu mçl orgn bnyosu kdehi içerisine uygun dozlrd NO donörleri oln L-rjinin ve sodyum nitro prusid (SNP) eklendiği ktrılmktdır (53). L-rjinin, NOS enzimleri rcılığıyl endojen NO oluşmsını sğlyn bir mino sittir (65). Nitrt içeren bir bileşik oln SNP ise eksojen NO oluşumunu sğlmktdır (66). Böylece her iki bileşiğin izole orgn sistemindeki ks dokusund oluşturduğu etkiler, bu bileşiklerin son ürünleri oln NO nun doku üzerindeki etkinliği hkkınd yorum ypılmsını sğlmktdır (53). Bununl birlikte, bu tür kimysllrın etki yollrının frklı şmlrd inhibe edilmesiyle de elde edilen veriler güçlendirilebilmektedir. Nitrik oksit sentz etkisiyle üretilen NO, N-monometil-L-rjinin (L-NMMA) nd N-nitro-L-rjinin metil ester (L-NAME) gibi L-rjininin nloglrı trfındn yrışmlı olrk engellenebilmektedir (34). Bunun ynı sır NO nun etkinliği metilen mvisi (MB) trfındn d inhibe edilebilmektedir. Metilen mvisi bu etkisini, gunilt siklz etkinliğini ve dolyısıyl cgmp seviyesini düşürerek göstermektedir (67). Diğer trftn ovidukt (7), serviks ve vgin (68) gibi dokulrd d NO nun oluşturduğu etkilerin, sözü edilen izole orgn sistemi yklşımı ile değerlendirildiği ktrılmktdır Revers Trnskriptz Polimerz Zincir Reksiyonu ve Western Blot Yöntemi Belirtilen yöntemler dışınd NO etkinliği revers trnskriptz polimerz zincir reksiyonu (RT-PCR) ve Western blot yöntemleriyle de belirlenebilmektedir. Polimerz zincir reksiyonu, bir orgnizmy it deoksiribonükleik sit (DNA) vey ribonükleik sit (RNA) dizilerinin in vitro olrk çoğltılmsı prensibine dynmktdır. Bu yöntem, bir gen y d DNA bölgesinin, bu hedef bölgenin uç kısımlrın bğlnn ve hedef diziye komplementer oligonükleotid primerler

26 10 kullnılrk birbirini izleyen rdışık bir dizi döngü ile çoğltılmsı olrk d çıklnbilmektedir (69). Polimerz zincir reksiyonund üç evre bulunmktdır ve bu üç evre bir döngü olrk kbul edilmektedir. Isıyı düzenleyen otomtik letler yrdımıyl bir döngü yklşık sniye ve 30 döngü dkikd tmmlnbilmektedir. Polimerz zincir reksiyonu ile çoğltıln DNA frgmentleri jel elektroforezis ile yürütülerek büyüklüklerine göre yrılmktdır. Dh sonr bu frgmentler Etidiyum Bromid ile boynrk incelenmekte ve ultrviole ışık ltınd doğrudn ypıln incelemelerde siyh zemin üzerinde beyz bntlr hlinde gözlenebilmektedir (69). Western blot yöntemi ise doku y d ekstrkt içerisindeki spesifik proteinlerin tespit edilmesinde kullnıln bir tekniktir. Jel elektroforezis yrdımıyl doğl y d denture proteinler polipeptidin uzunluğun vey proteinin ypısın göre yrılmktdır. Trnsfer membrnın ktrıln proteinler hedef proteine özgü spesifik nti serumlrın kullnılmsıyl belirlenebilmektedir (70). Her iki yöntemde de herhngi bir doku vey orgn, rştırılck oln proteine y d DNA ypısın shipse uygun metotlr ile tespit edilmesi mümkündür. Pek çok memeli türünde NOS proteinlerinin Western blot ve/vey RT-PCR yöntemleriyle genitl sistemde uterus (49), ovidukt (7, 16, 71, 72), ovryum (73) ve klitoris (74 ) gibi dokulrd vrlığının orty konulduğu belirtilmektedir Nitrik Oksitin Etkileri Nitrik oksit, lbümin ve glutsyon eklenmesi ile nitrozotiol şeklinde etkin olrk uzk hedef dokulr tşınmktdır. Bununl birlikte, hücreden slınır slınmz hızl etkisini kybettiği belirtilmektedir (75). Eksojen nitrtlrın cgmp seviyesini rtırdığının orty konulmsıyl NO nun dmr düz kslrınd gevşemeye neden olduğu belirlenmiştir. Endotel hücrelerinde meydn gelen NO, dmr düz ks hücrelerine difüze olrk cgmp düzeyinin rtmsın sebep olmktdır. Artn cgmp düzeyi ile NO, hücre içi C 2+ düzeyini zltmkt ve K + knllrının geçirgenliğini rtırmktdır. Bun bğlı olrk d plzm membrnı hiperpolrize hle gelmektedir (76). Diğer trftn cgmp, hfif miyozin zincirlerinin defosforilsyonun sebep oln proteinkinzı ktive ederek miyozin/ktin etkileşimini engelmektedir. Böylece dmr düz kslrınd gevşeme oluşmktdır (Şekil 1.3) (22).

27 11 Nitrik oksitin klp dmr sistemindeki hyti görevinin ynınd mide mukozsının ülserlere (kn kımının desteklenmesinde) (77) ve incebğırsk mukozsının endotoksik şokun zrrlrın krşı korunmsınd (mukozd knlnmyı rtırmsı, ntioksidn etki) etkili olduğu ktrılmktdır (75). Bunun ynı sır böbrek fonksiyonlrının düzenlenmesinde (böbrek otoregülsyonu, tübüloglomerüler geri bildirim, renin slınımı, bsınc bğlı sodyum geri tılımı, böbrek kn bsıncının ve tübül işlevlerinin düzenlenmesi) (78) ve diğer sistemlerde önemli etkilere ship olduğu belirtilmektedir Nitrik Oksitin Dişi Reprodüktif Sistem Üzerine Etkileri Ovryum Ovryum, östrüs siklusu sırsınd pek çok ypısl ve fonksiyonel fktör trfındn kontrol edilen kompleks endokrin bir orgndır. Nitrik oksitin nterior hipofiz hormonlrının slınımlrını düzenleyerek ovryum fonksiyonlrını kontrol ettiği ifde edilmektedir (79). Diğer trftn NO nun, direkt vey dolylı olrk, ovryumun bütünlüğünü sğlyn steroidojenik hücreler, immun sistem, kn dmrlrı ve nöronlrı, otokrin ve/vey prkrin bir jn gibi dvrnrk etkilediği bildirilmektedir (80). Ovryum steroid sentezinin, NO nun hipofiz gondotropinlerinin sentez ve slınımındki rolünün ynınd introvryn düzenleyici etkinliği nedeniyle, direkt olrk NO trfındn düzenlendiği belirtilmektedir. Nitrik oksit, sitokrom P-450 enzimini ve bun bğlı olrk romtz etkinliğini inhibe ederek grnuloz hücrelerindeki steroid sentezinin zlmsın ve dolyısıyl d östrojen (E2) sentezinin engellenmesine neden olmktdır (56, 81, 82). Bunun ynı sır NO nun östrojen sentezini engellediği bildirilmesine krşın, östrojenin NO sentezine rcılık ederek uyrbileceği de ifde edilmektedir (56, 83) Folliküler Gelişim ve Ovulsyon Nitrik oksitin folliküler gelişim, ovulsyon ve treziyi etkilediği (84), östrüs siklusu sırsınd özellikle inos ile enos trfındn üretilen NO nun folliküler gelişim ve ovulsyon ktkıd bulunduğu belirtilmektedir (85). Ovryumdki NOS etkinliğinin ve bun bğlı olrk oluşn NO nun özellikle dmr genişletici etkisinden dolyı

28 12 follikülün rupturu ve ovulsyond fonksiyonel bir görevinin olduğu ifde edilmektedir (12, 56, 82). Rodentlerde in vivo ve in vitro olrk ypıln çlışmlrd NO inhibitörlerinin ovryumd NO üretimini durdurmsının ovulsyon ornınd zlm ile sonuçlndığı bildirilmektedir (12, 84, 86). Diğer trftn L-NAME uygulmsının rtlrd ovulsyon ornını rttırdığı belirtilmektedir (87). Bununl birlikte, periovultor sfh sırsınd NO nun zlığının oosit mtursyonund bzı defektlere neden olduğu ifde edilmektedir (13) Lutel Ypı Lutel dokuyu oluşturn hücrelerin steroid hormonlr, büyüme fktörleri ve sitokinler gibi mddeleri ürettiği, bununl birlikte NO nun d korpus luteum (CL) un fonksiyonlrını düzenleyebileceği belirtilmektedir (88). Jroszewski ve rk (89) sığır CL sinde belirlenen NADPH-d ktivitesinin seksüel siklusun ort ve geç lutel evrelerinde dh yüksek olduğunu bildirmektedirler. Ayrıc enos ve inos immunohistokimysl boymlrının sığır CL sinde geç diöstrüs evresinde dh güçlü olduğu belirtilmektedir (80). Bzı NOS inhibitörlerinin (L-NAME ve L- NOARG) kültüre edilmiş sığır lutel hücrelerinde P4 sekresyonunu uyrdığı nck PGE 2 vey PGF 2 α üretimini etkilemedikleri ifde edilmektedir (90). Nitrik oksitin rt CL sinde steroidogenezis üzerindeki negtif etkisi nedeniyle luteolitik bir rolü olduğu belirtilmektedir (86). Bununl birlikte, oksitosinin NO nun luteolitik etkisine rcılık edebildiği ktrılmktdır (91) Uterus Nitrik oksit sentz izoformlrının (inos, nnos, enos) frklı uterus dokulrınd değişen düzeylerde izlenebildiği bildirilmektedir (46). İnsn uterusund NOS enzim ktivitesinin vrlığı in-situ-hibridizsyon, immunohistokimy ve NADPH-d boymlrıyl belirlenebilmektedir (92). Bzı NOS izoformlrının (inos ve nnos) norml siklik rt uterusund immunohistokimysl olrk ve NADPH-d ktivitesi ile tespit edildiği belirtilmektedir (93). Nitrik oksitin gebelik sırsınd uterustki durgunluğun sğlnmsınd etkili olduğu bildirilmektedir (94). Gebe rt uterusund ypıln in vitro çlışmlr NO nun uterusun ksılımlrının gevşemesine rcılık ettiği göstermektedir (49). Uterustki NO nun etkisinin, prostglndinlerle oln

29 13 etkileşiminden kynklndığı (57) bunun ynı sır NO nun siklooksijenz enzim ktivitesini rttırdığı belirtilmektedir (95). Östrojenin genitl orgnlrd ve sirküle eden knd NO seviyesini rttırmsındn dolyı, östrojenin gebelik ve folliküler evre sırsınd NO düzeyinin rtışındn sorumlu olduğu ileri sürülmektedir (96). Ovryumlrı uzklştırılmış koyunlrd östrojen uygulmsının uterustki dmrlrd genişlemeyi uyrdığı ve bu etkinin L-NAME trfındn ntgonize edildiği belirtilmektedir (97). Bu nedenle NO nun östrojenin bu gevşetici etkisine rcılık ettiği düşünülmektedir (49). Nitrik oksit sentezi üzerinde östrojenin etkisi, östrojenin miktrın ve etki süresine göre değişmektedir. Düşük seviyede seyreden östrojen NO üretimini rttırmktdır. Erken gebelik döneminde rtn östrojen miktrın ynıt olrk NO seviyesinde de bir rtış izlenir. Bununl birlikte gebeliğin son dönemlerine doğru rtn östrojen, NO slınımını engellemektedir (56, 98) Serviks ve Vgin Serviks ve vginnın diğer genitl orgnlr gibi endojen NO için bir kynk olduğu belirtilmektedir (46, 56, 68, 99, 100). Üreme orgnlrı içinde en yüksek NO ktivitesinin servikste (uterustn beş, vgindn iki kt fzl) olduğu bildirilmektedir (56, 83). Rt, tvşn ve insn serviksinde (46, 56, 68, 99, 100), yrıc gebe ve gebe olmyn kdınlrın servikslerinde inos, enos ve nnos izoformlrının hepsinin de vrlığının belirlendiği ifde edilmektedir (99). Nitrik oksitin vgind d vginl sekresyonlrın oluşturulmsı ve tvşn ile rtlrd vginl düz kslrın gevşemesindeki etkileri nedeniyle fizyolojik bir görevi olduğu belirtilmektedir (46, 56, 68) Seksüel Dvrnış Seksüel dvrnışlrı kontrol eden ve hipotlmik bir merkez gibi dvrnn ventromedil nukleusun NOS (101) reseptörlerini içerdiği belirtilmektedir. Nükleusun ventrolterl kısmınd östrojen reseptörlerinin çok syıd NADPH-d pozitif nöronlrı ekprese ettiği, bunun d NO nun seksüel dvrnışlrın şekillenmesinde etkisi olduğunu orty koyn bir bulgu olduğu bildirilmektedir (101).

30 14 Nitrik oksitin dişi seksüel dvrnışlrı üzerine rolünün orty konulmsı için Mni ve rk (102) yptıklrı çlışmd ovriektomize edilmiş östrojen uygulnn rtlr intrserebroventriküler enjeksiyonl L-NMMA tedvisinin lordozisi engellediği, SNP uygulmsının ise lordozisin oluşumun yrdımcı olduğunu bildirmektedirler. Bunun ynı sır NO-cGMP etkileşiminde NO nun hücre içi mesjcı gibi dvrnrk pek çok nörotrnsmiter ve hormon yrdımıyl reprodüktif fonksiyonlrın düzenlenmesinde etkili olduğu belirtilmektedir (103) Ovidukt Rosselli ve rk (104), sığır ovidukt epitel hücrelerinin in vitro koşullrd endotelin sentezini gerçekleştirdiğini, endotelin-i in ovidukt kontrksiyonlrını uyrıcı etkisinin N-monometil-L-rjinin monosett (NOS inhibitörü) vrlığınd rttığını bildirmektedirler. Rosseli ve rk (105) çlışmlrınd elde ettikleri bu bulgunun, oviduktt endojen NO sentezinin vrlığını ileri süren ilk çlışm olduğunu ifde ederek NO nun ovidukt fonkisyonlrınd etkili olbileceğini ileri sürmüşlerdir. Dh sonr ypıln çlışmlr frklı türlerde ovidukttki NO etkinliğinin belirlenebilmesi üzerine yoğunlşmıştır. İnsn, sığır, rt ve domuz oviduktlrınd NOS vrlığı bildirilmektedir (6, 29, 106). Uyrılbilir NOS un tubl epitelyum, düz ks hücreleri ve vskuler endotelyumd gözlendiği belirtilmektedir (57). Gwronsk ve rk. (71) enos immunrektivitesinin domuz oviduktunun mukozdki epitelyum hücrelerinde, endotelyumun vskuler dokusund ve ks tbksınd izlediklerini ktrmktdırlr. Chtterjee ve rk (107) enos ktivitesini rt oviduktunun mukozl epitelyumund ve ks tbksınd gözlemlediklerini belirtmektedirler. Ekerhovd ve rk (7) insn oviduktunun istmus kısmınd enos immun boymsını epitel tbk ve kn dmrlrı endotelyumund gözlemlediklerini ifde etmektedirler. Bunun ynı sır sığır oviduktund enos ve nnos immunrektivitesinin epitel hücreler ile kn dmrlrınd, ylnız nnos un epitelyum ve düz ks hücrelerinde belirlendiği ifde edilmektedir (72). İnsn oviduktund NOS ktivitesinin epitel hücreler, düz ks hücreleri, vskuler endotelyum ve konektif dokud vrlığı bildirilmektedir (6). Domuz oviduktundki NOS ktivitesinin ise mukoz epitelinde ks tbksın göre dh fzl olduğu ifde edilmektedir. Ayrıc istmus epitelindeki ktivitenin diğer bölgelere göre dh yüksek ornd olduğu belirtilmektedir. Östrüs esnsınd ovidukt epitelindeki

31 15 NOS enzim ktivitesinin zldığı, ks tbksındki NOS enzim ktivitesinin ise ovulsyon sonrsınd önce rttığı, dh sonr zldığı ifde edilmektedir (71). Nitrik oksitin ovidukt duvrı epitelyumund sentezlenip ks ktmnınd etki göstermesi nedeniyle oviduktt prkrin bir özellik gösterebileceği ifde edilmektedir (8). Ovumun ovidukttn yrılmdn önce NOS ktivitesinde ve ekspresyonund bir zlmnın oluştuğu ve bundn dolyı endotelin-1 (105) ve PGF 2α (108) gibi kontrktil moleküllerin oviduktt bir motiliteye sebep olduğu belirtilmektedir. Arştırıcılr (8) NOS inhibitörlerinin rtlrd burs ovriky enjeksiyonuyl oviduktt bulunn ovumlrın syısınd önemli bir zlm olduğunu belirtmektedirler. Bununl birlikte gebe rtlrd spermin NONOte (NO donörü) nin tek bşın ovum trnsportunu etkilemediğini bildirmektedirler. Bugüne kdr çeşitli yöntemler kullnılrk ypıln çlışmlrd insn, rt, sığır ve domuz ovidukt dokulrının NOS enzim etkinliğine ship olduğu ktrılmktdır (6-8, 16, 29, 71, 72, 109). Bu çlışmlrd, NOS enzimlerinin vrlığındn hreketle, ovidukt dokusund NOS etkinliğine bğlı olrk oluşn endojen bir NO üretiminin gerçekleştiği belirtilmektedir. Bununl birlikte oluşn NO nun, ovidukt düz ks dokusund gevşemeye neden olrk motiliteyi etkileyebileceği, bu nedenle NO nun ovidukt fonksiyonlrının düzenlenmesinde rol oyndığı hipotezi ileri sürülmektedir. Anck seksüel siklusun frklı dönemlerinde bulunn sığırlrd vey diğer memelilerde L-rjinin-SNP / NOS / NO / sgc yolunun oviduktun düz ks ksılımlrı üzerine in vivo ve/vey in vitro etkilerinin incelendiği çlışmlr rstlnılmmıştır. Sunuln çlışmd, östrüs siklusunun frklı evrelerindeki ineklerde, ovidukt düz ks dokusunun spontn ksılımlrı üzerine NO nun etkisinin in vitro olrk belirlenmesi ve NOS enzimlerinin ekspresyon modellerinin orty konulmsı mçlndı.

32 16 2. GEREÇ ve YÖNTEM 2.1. Gereç Çlışmd, özel mezbhlrdn elde edilen 3-4 yşlı, multipr, klinik olrk ptolojik bir sorunu bulunmyn ve gebe olmyn toplm 64 Holstein ineğin 88 oviduktu kullnıldı. Çlışm, ineklerde NO nun spontn ovidukt ksılımlrın etkisinin belirlenmesi ve ovidukt dokusund NOS enzimlerinin vrlığının orty konulmsı mcıyl iki şmd gerçekleştirildi. Spontn ovidukt ksılımlrının belirlenmesi için izole orgn bnyosund gerçekleştirilen çlışmlr Afyon Koctepe Üniversitesi Veteriner Fkültesi Fizyoloji Anbilim Dlı lborturınd yürütüldü. Bu şmd 40 ineğe it lutel ypı bulunn ovryum trfındki 40 det ovidukt kullnıldı. İmmünohistokimysl boym, RT-PCR ve Western blot yöntemleri ile NOS enzimlerinin ovidukt dokusund tespit edilmesi çlışmlrı ise Polony d bulunn Wrmi Mzury Üniversitesi Veteriner Fkültesi Antomi Anbilim Dlı lborturlrınd gerçekleştirildi. Toplm 24 ineğe it ovidukt bu üç yöntemle değerlendirildi. Western blot nlizinde bu hyvnlrın her iki oviduktu d kullnıldı Yöntem Hyvnlrın Seçimi ve Seksüel Sikluslr Göre Gruplndırılmsı Spontn ovidukt ksılımlrının belirlenmesi için izole orgn bnyosund gerçekleştirilen çlışmlrd kullnıln hyvnlr, Afyonkrhisr ilinde bulunn özel bir mezbhdn elde edildi. Kesim öncesi, mezbhnenin dinlenme pdoklrınd bulunn hyvnlrın uterus ve ovryumlrı seksüel siklus dönemi, gebelik ve genel sğlık bulgulrı yönünden rektl plpsyon yoluyl muyene edildi ve kn örnekleri lındı. Kesim sonrsı genitl orgnlr muhtemel bir ptolojik durum olup olmdığı yönünden mkroskobik olrk muyene edildi. Seksüel çıdn ktif ve sğlıklı olrk değerlendirilen hyvnlr çlışmy dhil edildi. İmmünohistokimysl boym, RT-PCR ve Western blot yöntemleri için kullnıln hyvnlr Polony nın Olsztyn şehri ykınlrınd bulunn özel bir mezbhdn elde edildi. Kesim öncesi hyvnlr mezbh veteriner hekimleri trfındn gebelikleri yönünden rektl plpsyon yoluyl muyene edildi. Kesim