Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi. Veterinary Journal of Ankara University

Transkript

1 Cilt/Volume 52 Sayı/Number

2 Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi Cilt / Volume: 52 Sayı / Number: Veterinary Journal of Ankara University Dört ayda bir yayımlanır / Published four monthly ISSN Sahibi Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Adına Prof. Dr. İbrahim BURGU Dekan Editörler Kurulu / Editorial Board Baş Editör / Editor-in Chief Prof.Dr.Rıfkı Hazıroğlu Editör Yardımcıları / Co-Editors Prof.Dr.Mehmet Şahal Prof.Dr.Arif Altıntaş Prof.Dr.Serdar Diker Prof.Dr.Sakine Yalçın Adres / Address Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dekanlığı Yayın Alt Komitesi Ankara, Türkiye Tel: , Fax: Sürdürüm ve İletişim: vfdergi@veterinary.ankara.edu.tr URL: http: // Danışma Kurulu / Advisory Board Prof.Dr.Tahir Aksoy, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Prof.Dr.Erol Alaçam, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Prof.Dr.Feray Alkan, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Prof.Dr.G.Breves, Hannover Veteriner Yüksekokulu Prof.Dr.Dr. h.c.e.deegen, Hannover Veteriner Yüksekokulu Prof.Dr.Nazir Dumanlı, Fırat Üniversitesi Veteriner Fakültesi Prof.Dr.Ahmet Ergün, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Prof.Dr.Sacit Görgül, Uludağ Üniversitesi Veteriner Fakültesi Prof.Dr.R. Merih Hazıroğlu, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Prof.Dr.Nursal Metin, Adnan Menderes Üniv. Veteriner Fakültesi Prof.Dr.Dr. h.c.h.-p.sallmann, Hannover Veteriner Yüksekokulu Prof.Dr.Behiç Serpek, Selçuk Üniversitesi Veteriner Fakültesi Prof.Dr.Sezai Kaya, Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Prof.Dr.Muammer Uğur, İstanbul Üniversitesi Veteriner Fakültesi Bu dergi Uluslar arası CABI yayınlarının CAB Abstracts (AgBiotech News and Information, Animal Breeding Abstracts, Dairy Science Abstracts, Helminthological Abstracts, Horticultural Abstracts, Index Veterinarius, Nutrition Abstracts and Reviews Series A, Nutrition Abstracts and Reviews Series B, Ornamental Horticulture, Poultry Abstracts, Protozoological Abstracts, Review of Aromatic and Medicinal Plants, Review of Medical and Veterinary Entemology, Review of Plant Pathology, Soybean Abstracts, Sugar Industry Abstracts, Veterinary Bulletin, Wheat, Barley and Triticale Abstracts), Global Health (Rewiew of Medical and Veterinary Mycology), CAB Direct, Database Subsets; NISC SA (Fishlit) ile Ulakbim (Tarım, Veteriner ve Biyoloji Bilimleri) veri tabanları kapsamındadır. Ayrıca yine CABI ürünlerinden SPIRS kullanan BEASTCD, CABPESTCD, E-CD, HORTCD, PARASITECD, VETCD için kaynak oluşturmaktadır. This Journal is covered by CAB Abstracts (AgBiotech News and Information, Animal Breeding Abstracts, Dairy Science Abstracts, Helminthological Abstracts, Horticultural Abstracts, Index Veterinarius, Nutrition Abstracts and Reviews Series A, Nutrition Abstracts and Reviews Series B, Ornamental Horticulture, Poultry Abstracts, Protozoological Abstracts, Review of Aromatic and Medicinal Plants, Review of Medical and Veterinary Entemology, Review of Plant Pathology, Soybean Abstracts, Sugar Industry Abstracts, Veterinary Bulletin, Wheat, Barley and Triticale Abstracts), Global Health (Review of Medical and Veterinary Mycology), CAB Dircet, Database Subsets; NISC SA (Fishlit) and Ulakbim (National Agriculture, Veterinary and Biology) database systems. Additionally, it is sourced by BEASTCD, CABPESTCD, E-CD, HORTCD, PARASITECD, VETCD utilizing SPIRS. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi Tüm hakları saklıdır. Bu Derginin tamamı ya da Dergide yer alan bilimsel çalışmaların bir kısmı ya da tamamı 5846 sayılı yasanın hükümlerine göre Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dekanlığının yazılı izni olmaksızın elektronik, mekanik, fotokopi ya da herhangi bir kayıt sistemiyle çoğaltılamaz, yayımlanamaz. Ankara Üniversitesi Basımevi

3 Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi Cilt / Volume: 52 Sayı / Number: Veterinary Journal of Ankara University İÇİNDEKİLER / CONTENTS Yarasa dışkısı (bat guano) mineral düzeyleri Mineral levels of bat guano Arif Altıntaş, Tünay Kontaş, Gültekin Yıldız, Necla Erkal 1 Mast cells in the dog skin : distribution, density, heterogeneity and influnce of fixation techniques Köpek derisindeki mast hücreleri: dağılım, yoğunluk, heterojenite ve tespit tekniklerinin etkisi Reşat Nuri Aştı, Arif Kurtdede, Nevin Kurtdede, Emel Ergün, Murat Güzel 7 Develerin (Camelus dromedarius) perifer kan lökositlerinde alfa-naftil asetat esteraz aktivitesinin belirlenmesi Determination of alpha naphthyl acetate esterase activity in peripheral blood leucocytes of camel (Camelus dromedarius) Mustafa Sandıkçı, Şadiye Kum, Ülker Eren 13 Kedilerde vaginal smear yöntemi ile siklus dönemlerinin saptanması ve ovaryumlar üzerindeki yapılar arasındaki ilişkinin araştırılması Determination of sexual cycle stages by vaginal cytology and its relationship with ovarian structures in the queen Abuzer Zonturlu, Cihan Kaçar, Nil Maral, Selim Aslan 17 Tavşan trakeası üzerine levamizolün etkisinin tek başına ve triklorfonla birlikte araştırılması The investigation of the effect of levamisole on rabbit trachea alone and combined with trichlorfon Ebru Yıldırım 23 Türkiye de amoksisilin içeren müstahzarların etlik piliçlerde farmakokinetiğinin araştırılması The investigation of pharmacokinetics of specialities containing amoxycillin in broiler chickens in Turkey Yasemin Coşkun, Sezai Kaya 29 Renal yetmezlik semptomları görülen köpeklerde sekonder hipertansiyonun osilometrik metot ile değerlendirilmesi ve angiotensin II reseptör antagonistleri ile tedavisi Evaluation of seconder hypertension by oscillometric method in dogs with renal failure symptoms and treatment with angiotensin II receptor antagonists Erdoğan Uzlu, Aslan Kalınbacak 33 Keeping conditions of cattle with health and productivity during the winter season in the north-eastern Anatolia Kuzey-doğu Anadolu da kış mevsimi süresince sağlık ve verimle ilişkili sığırların bakım koşulları Başaran Karademir, Mustafa Saatçi, Güler Karademir 39 Kedi ve köpek dermatofitozlarından izole edilen mantarların retrospektif değerlendirilmesi Retrospective evaluation of dermatophytosis in cats and dogs Alper Çiftçi, Tuba İça, Barış Sareyyüpoğlu, Kaan Müştak 45 Afyon yöresi Phlebotomus (Diptera: Psychodidae) türleri Phlebotomus (Diptera: Psychodidae) species around Afyon province Hatice Çiçek, Mehmet Yaman, Şükran Yağcı, Zafer Karaer 49 Bir broiler sürüsünde cinsiyete göre ayrı büyütmenin ve erken dönemde yem kısıtlamasının karkas ve değerli parçalar üzerine etkisi The effects of sex separate rearing and early feed restriction of broiler chicks on carcass weight and valuable cuts Fatih Atasoy, Tahir Aksoy 53 Tavşan rasyonlarına ekmek mayası kullanımının besi performansı ve besin madde sindirilme derecesi üzerine etkisi The usage of baker s yeast in the diets of rabbit on fattening performance and nutrient digestibility M. Numan Oğuz, Sakine Yalçın 57 Broyler rasyonlarında enerji kaynağı olarak ayçiçek yağı yerine lesitin katkılı karma yağın kullanılma olanakları Possibilities of using lecithin added oil mixture to replace sunflower oil as an energy source in broiler rations İlkay Yalçınkaya 63

4 Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, 1-5, 2005 Yarasa dışkısı (bat guano) mineral düzeyleri Arif ALTINTAŞ 1, Tünay KONTAŞ 2, Gültekin YILDIZ 3, Necla ERKAL 4 1 Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı, 06110, Ankara; 2 Mustafa Kemal Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Biyokimya Anabilim Dalı, Hatay; 3 Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi, Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı, 06110, Ankara; 4 Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Etlik Hayvan Hastalıkları Araştırma Enstitüsü, Ankara. Özet: Adana, Kırklareli, Aydın ve Çorum yörelerindeki toplam 14 mağaradan elde edilen yarasa dışkı materyalleri üzerinde gerçekleştirilen çalışmada, dışkı örneklerinin besinsel mineraller ve toksik elementler açısından incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, fiziksel muayene ve kuru yakma sonrasında kristalleştirilerek çözelti haline getirilen yarasa dışkısından uygun sulandırmalar yapılarak Na, K, Cl, Ca, Mg, P, Fe, Cu, Zn, Pb, Cd ve N analizleri gerçekleştirilmiştir. Çalışma sonunda, Adana, Kırklareli, Aydın ve Çorum yöresi mağaralara ait yarasa dışkı örneklerinin ph da, kahverengimsi ve kına benzeri görünümde oldukları ve başta N-P-K olmak üzere Ca, Mg, Cl, Na ve Fe elementleri için doğal birer kaynak oluşturdukları ortaya konmuştur. Dışkı örneklerinin kuru maddesinde N-P-K % oranları Adana yöresinde ( ); Kırklareli yöresinde ( ); Aydın yöresinde ( ) ve Çorum yöresinde ( ) olarak hesaplanmıştır. Çorum yöresine ait mağara yarasa dışkısının azottan zengin (%5.68), Aydın yöresine ait dışkının fosfordan zengin (%1.50) ve Kırklareli yöresi mağara dışkısının da potasyumdan zengin (%0.63) oldukları hesaplanmıştır. Mağaralara ait dışkı örnekleri arasında özellikle azot, magnezyum, demir, bakır, kurşun ve organik madde yönünden belirgin farklılıklar tespit edilmiştir. Anahtar sözcükler: Besinsel mineraller, organik gübre, yarasa dışkısı, yarasa gübresi Mineral levels of bat guano Summary: The aim of this study was to investigate the nutrient minerals and toxic elements in bat guano samples obtained from the 14 caves of Adana, Kırklareli, Aydın and Çorum regions. For this purpose, following physicial examination and dry burning cristalized bat guano samples were diluted and analysed for Na, K, Cl, Ca, Mg, P, Fe, Cu, Zn, Pb, Cd and N. As a result of this study, it was observed that bat guanos from the caves of Adana, Kırklareli, Aydın and Çorum regions are found to be at ph, brownish and henna like in appereance. It was a good natural source for Ca, Mg, Cl, Na, Fe and especially for N-P-K elements. Percentage levels of N-P-K in dry matter of samples were calculated as in Adana region ( ); in Kırklareli region ( ); in Aydın region ( ) and in Çorum region ( ) shown in brackets. It was observed that bat guanos from Çorum, Aydın and Kırklareli regions were rich for nitrogen (5.68%), phosphorus (1.50%) and potassium (0.63%) respectively. The differences between nitrogen, magnesium, ferrum, copper and lead elements and organic substances were observed in bat guanos from different caves. Key words: Bat guano, bat manure, nutrients minerals, organic fertilizer Giriş Deniz kuşlarının aşağı bıraktıkları damla halindeki dışkıları olarak da bilinen guano çeşitli türde yarasaların ve deniz kuşlarının mağaralarda birikmiş ve kurumuş dışkıları olarak tanımlanır (1). İçerdiği azot (N), fosfor (P) ve potasyum (K) oranı ile doğal gübre olarak bitkilere yüksek düzeyde besinsel bir destek sağlar (3). Yarasa dışkısı bioremediation mikroplar dan zengindir. Örneğin, 100 ml dışkıda yaklaşık olarak bir milyar bakteri bulunur. Bu mikroplar, bir taraftan toprak toksinlerinin parçalanmasına yardımcı olarak toprağın beslenmesini ve kalitesini arttırırlarken diğer taraftan dışkıda doğal olarak bulunan organik bileşiklerin yıkımlanmasından ve değişiminden sorumludurlar. Bu özellikleri ile yarasa dışkısından bilhassa patates, domates vb. sebze üretiminde verim artırıcı olarak yararlanılır. Bu amaçla, içerdiği makro-besinseller (başta N, P, K olmak üzere Mg, Ca, S, Na ve Cl) ve mikro-besinseller (Fe, Mn, Zn, Cu, B, Mo) ile tarımda gübre olarak kullanılır (17). Mineral içeriği ile mükemmel bir organik gübre o- lan yarasa dışkısı (bat guano) evlerde ve işyerlerinde çiçek ve çeşitli süs bitkileri yetiştiriciliğinde de yararlanılabilir. Ancak, yarasa gübresi koku, ekto-parazitler ve bazı sağlık riskleri nedeniyle kimi zaman ev yada işyeri için sorun oluşturabilir. Bu olumsuzluklar; dışkı gübrelere koku gidericiler, ph düzenleyiciler (NaOH, kireç), ilave besleyiciler ve oksitleyici etkenler (Na-hipoklorit, KMnO 4, H 2 O 2 ve ozon) eklenmek suretiyle giderilebilir (7). Yarasa dışkısı içerdiği %15-20 oranındaki fulvik asitler nedeniyle nematosid ve fungisid etkilidir.

5 2 Arif Altıntaş - Tünay Kontaş - Gültekin Yıldız - Necla Erkal Nematosid etki ile bunlar nematodların birincil safhalarını bozarak onları etkisiz kılarlar. Etkisiz bu nematodlar bitkinin beslenmesi ve üretimi için önemli olan kök sistemlerini korurlar. Fungisid etkisiyle de mantarların neden olduğu hastalıklara karşı koyarlar (1, 7). Kuşlarda ve yarasalarda azotun yarısı dışkı ile organik azot şeklinde, diğer yarısı ise idrarla üre şeklinde atılır ve hızla amonyum azotuna (NH 4 + ) parçalanır. Fosfor ve potasyum ise dışkıda, sırasıyla P 2 O 5 ve K 2 O şeklinde bulunur. Yarasa dışkısı diğer kuş türlerinde olduğu gibi her iki atığı karışım halinde içerir ve dünyada fosforun doğal kaynağı olarak bilinir. Azot, fosfor ve potasyum dışkıda % olarak verilir ve kısaca (N-P-K) şeklinde gösterilir (1). Yarasa dışkısındaki minerallerin bilinmesi, ticari bir gübrenin içeriğinin bilinmesi kadar önemli olup dışkının ticari değerini belirler (4). Dışkı mineral içeriği tür, nem oranı, rasyon, toplama ve depolama kayıpları vb. birçok faktörden etkilenir (1). Bu çalışmada, Türkiye nin değişik yörelerindeki (Adana, Kırklareli, Aydın ve Çorum) mağaralardan elde edilen yarasa dışkı örneklerinin besinsel ve toksik mineraller açısından incelenmesi ve üreticilerin bilgilendirilmesi amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Türkiye nin değişik yörelerindeki (Adana, Kırklareli, Aydın ve Çorum) mağaralardan elde edilen yarasa dışkısı örnekleri temiz naylon poşetler içinde taşınmış ve Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya ve Hayvan Besleme-Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı laboratuvarlarında fiziksel ve kimyasal yönlerden incelenmiştir. Aydın yöresinde mağaraların birbirine çok yakın oldukları ve genellikle mağaraların metre uzunluğunda oldukları ve çok sayıda dehliz içerdikleri gözlenmiştir. Yörelere ait mağaralardan alınan dışkı örnekleri mağaradaki dışkı stoklarının farklı kısımlarından belli miktarlarda alınarak geniş bir naylon poşete konmuş ve homojen olacak şekilde karıştırılmıştır. Bu şekilde, Aydın Yöresi ne ait 9, Adana yöresine ait 3, Çorum yöresine ait 1 ve Kırklareli yöresine ait 1 olmak üzere toplam 14 mağaradan alınan dışkı örnekleri çalışmanın materyalini oluşturmuştur. Her dışkı örneği laboratuvarda çift çalışılarak bulunan değerlerin ortalaması alınmış ve uygulamanın her aşamasında kullanılan kapların mineral madde ile bulaşık olmasından sakınılmıştır (16). Fiziksel inceleme Dışkı örneklerinde koku, renk, görünüm ve ph analizleri gerçekleştirilmiştir. Dışkı ph ölçümünde bir digital ph-metreden (Knick) yararlanılmıştır. Bir miktar dışkının fizyolojik tuzlu suda (%0.9 NaCl) 1:4 oranında hazırlanan çözeltisinden peş peşe iki ölçümden elde edilen değerlerin ortalaması alınarak ph hesaplanmıştır. Kimyasal inceleme Yarasa dışkı örneği >1g tartılarak 110 o C de ağırlığı sabit kalıncaya kadar (bir saat) kurutulmuştur. Daha sonra tam 1 g tartılarak porselen kapta yakma fırınına alınmıştır. Önce 200 o C de 15 dakika sonra kademeli şekilde ısı artırılarak 450 o C de 24 saat tutulmuş ve kül haline getirilmiştir (kuru yakma). Kül, kendi halinde soğutulduktan sonra tartılarak % organik ve % inorganik madde miktarları kaydedilmiştir. Kül üzerine 3 ml yoğun HCl eklenmiş ve karıştırılarak su banyosu üzerinde (110 o C) evapore edilmiştir. Birikinti üzerine 5 ml yoğun HNO 3 eklenerek 50 ml lik balona filtre edilerek (cam pamuktan) filtrat deiyonize su ile 50 ml ye tamamlanmıştır. Bu şekilde, yeniden kristalleştirilerek çözelti haline getirilen dışkı örneği stok çözelti olarak kullanılmıştır. Bu çözelti üzerinde uygun sulandırmalar yapılarak Na, K, Cl, Ca, Mg ve P analizleri Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı Laboratuvarları nda; toplam N, kuru madde ve ham kül % oranları Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Hayvan Besleme ve Beslenme Hastalıkları Anabilim Dalı Laboratuvarları nda; Fe, Cu, Zn, Pb ve Cd analizleri ise Etlik Hayvan Hastalıkları Araştırma Enstitüsü Laboratuvarları nda gerçekleştirilmiştir. Dışkıda toplam N miktarı Kjeldahl Yöntemi ile (6); Ca ve Mg miktarı renklendirici olarak sırasıyla glyoxalbis ve calmagit kullanan Eppendorf-mikroliter sistem ile; P miktarı Younburg un modifiye yöntemi ile (19); Cl miktarı van Slyke in geliştirdiği titrimetrik yöntem ile (14) belirlenmiş; Na ve K miktarı alev fotometresi ile (13); Fe, Zn, Cu, Pb ve Cd miktarları ise atomik absorbsiyon spektrofotometresi ile tayin edilmiştir (20). Bulgular Türkiye nin dört değişik yöresine ait toplam 14 mağaradan alınan yarasa dışkılarının fiziksel incelemesinde kahverengimsi ve kına benzeri görünümde oldukları saptanmış ve kendine özgü kokusu dışında herhangi bir anormal koku alınmamıştır. Dört yöreye ait dışkı örneklerinde ph değerleri arasında hesaplanmış; organik ve inorganik madde oranları ise sırasıyla % ve % arasında bulunmuştur. Kuru madde yüzdesi ortalamaları Adana, Kırklareli, Aydın ve Çorum yörelerini temsil eden mağara dışkı örneklerinde sırasıyla %87.0; %58.8; %74.6 ve %60.5 olarak hesaplanmıştır (Tablo 1). Türkiye de mağara yarasa dışkı örneklerinde N, P, K, Ca, Mg, Na, Cl düzeylerinin diğer mineral düzeylerinden daha yüksek oldukları ve özellikle N-P-K yönünden literatürde bildirilen değerlerden düşük oldukları saptanmıştır.

6 Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, Tablo 1. Mağaralara ait yarasa dışkı örneklerinin ortalama mineral değerleri Table 1. Average mineral values of bat guano obtained different caves Mineral maddeler Adana n=3 Kırklareli n=1 Aydın n=9 Çorum n=1 Azot (%) Fosfor (%) Potasyum (%) Kalsiyum (%) Magnezyum (%) Sodyum (%) Klor (%) Demir (ppm) Bakır (ppm) Çinko (ppm) Kurşun (ppb) Kadmiyum (ppb) Organik madde (%) İnorganik madde (%) Ham kül (%) Kuru madde (%) ph (su) Tablo 2. Adana yöresine ait mağara girişine yakın ve uzak oluşuna göre alınan yarasa dışkı örneklerine ait mineral madde değerleri Table 2. Mineral content of bat guano obtained from the entrance and deep of the caves in Adana region Adana yöresi mağara Mineral maddeler Derin Yüzey Ortalama Azot (%) Fosfor (%) Potasyum (%) Kalsiyum (%) Magnezyum (%) Klor (%) Sodyum (%) Demir (ppm) Bakır (ppm) Çinko (ppm) Kurşun (ppb) Kadmiyum (ppb) Organik madde (%) Ham kül (%) Kuru madde (%) ph (su) En yüksek N-P-K % değerlerine Çorum yöresini temsil eden mağara dışkı örneğinde ( ) ve en düşük % değerlere ise Adana yöresini temsil eden mağara dışkı örneğinde ( ); mikromineraller (Fe, Cu ve Zn) açısından en yüksek % değerlere Adana yöresine ait mağaralardan elde edilen yarasa dışkı örneğinde ( ); en düşük % değerlere ise Kırklareli yöresine ait mağara dışkısında ( ) rastlanmıştır. Azot yönünden en zengin yarasa dışkısını Çorum yöresine ait (%5.60); fosfordan en zengin olanı Aydın yöresine ait (%1.50); potasyumdan en zengin olanı ise Kırklareli yöresine ait (%0.63) örnekler oluşturmuştur (Tablo 1). Mağaranın girişine yakın ve uzak oluşuna göre de yarasa dışkısının renginin, kıvamının ve özellikle Na, K, Ca, Cl, Fe, Cu, Zn, Pb ve Cd değerleri açısından mineral içeriğinin farklı olduğu Adana yöresinde bir mağaraya ait dışkı örneği üzerinde saptanmıştır (Tablo 2). Dışkı renginin mağara girişine yakın yerden alınan daha açık ve hafif kahverengimsi-gri olduğu gözlemlenmiştir. Yarasa dışkısının N-P-K % değerleri sırasıyla mağara derininden alınan dışkı örneğinde ( ) ve mağaranın

7 4 Arif Altıntaş - Tünay Kontaş - Gültekin Yıldız - Necla Erkal dışa yakın olan (yüzey) yerinden alınan dışkı örneğinde ise ( ) olarak hesaplanmıştır. Yörelere ait değerler topluca verilirken Adana yöresini temsilen derin ve yüzey değerlerinin ortalaması kullanılmıştır (Tablo 2). Tartışma ve Sonuç Yurdumuzun çeşitli yörelerinde ve özellikle Güney ve Batı Anadolu bölgelerinde yer alan tarihi oldukça eski mağaralarda yarasa dışkılarına depolanmış halde rastlanabilir. Çalışmada, Adana, Kırklareli, Aydın ve Çorum yörelerine ait yarasa dışkı örnekleri fiziksel ve kimyasal yönden analiz edilmiş; makro- ve mikro-mineral düzeyleri belirlenmiştir (Tablo 1). Yapılan fiziksel incelemede dışkı renginin kahverengimsi ve daha çok kına benzeri görünümde olduğu saptanmış ve çözelti haline getirilen örneklerde ph arasında hesaplanmıştır. Literatürde yarasa dışkısı ph değeri (21) ve (1) arasında verilmiştir. Dışkı ph değerleri literatür değerlere göre hafif alkali tarafta bulunmuş ve bu durum tarıma uygun olduğu şeklinde değerlendirilmiştir. Çünkü, yarasa dışkısının tarımda kullanılmazdan önce alkali ph da olması gerektiği bildirilmiştir (7). Çalışmada, yarasa dışkısının kuru madde yüzdesi Adana, Kırklareli, Aydın ve Çorum yörelerine göre sırasıyla %87.0; %58.8; %74.6 ve %60.5 olarak hesaplanmıştır. Adana yöresine ait değerin literatürde bildirilen % 30±5 nemlilik ile (1) uyuşmadığı belirlenmiş ve bu durumun yüksek çevre sıcaklığı ile ilişkili olabileceği görüşüne varılmıştır. İncelenen yarasa dışkısı örneklerinde kuru madde oranlarının yüksek olduğu söylenebilir. Dışkı örneklerinde organik madde oranı % ; inorganik madde oranı ise % arasında hesaplanmış (Tablo 1) ve yöreler arasında belirgin farklılıklar olduğu gözlenmiştir. Organik madde oranlarının literatürde yarasa dışkısı için bildirilen (1) limit değerlerin (%40-60) dışına taştığı ve geniş bir değişkenlik gösterdiği saptanmıştır. Adana, Kırklareli, Aydın ve Çorum yörelerine ait mağara yarasa dışkısı örneklerinde N-P-K % oranları sırasıyla ( ); ( ); ( ) ve ( ) olarak hesaplanmıştır. Ticari gübre gibi kıymetlendirmede N-P-K değerlerinin önemli olduğu noktasından (4) hareketle, dört farklı yöreye ait ülkemiz mağara yarasa dışkılarının N-P-K oranlarının literatür değerlere göre düşük olduğu söylenebilir. Yöresel farklılıklar yarasaların beslenme alanlarının ve tükettikleri besinlerin farklılığı ve mağaraların tarihinin eski ve dolayısıyla gübrelerin depolanma sürelerinin farklı oluşu ile ilişkilendirilebilir (1, 18). Ayrıca, yarasa da dahil olmak üzere ölen canlılara bağlı değişimler de etkili olabilir. Deniz kuşu ve yarasa gübrelerinin besinsel içeriğinin çok değişken şekilde diyetin bileşimine dayandığı bildirilmiş (1); örneğin meyve ile beslenen Filipinler yarasalarına ait dışkı örneğinin fosforca zengin (0-15-1) olduğu rapor edilmiştir (12). Mağara yaşı, şekli ve tipinin de etkili olabileceği ifade edilmiştir (1). Nitekim çalışmamızda, Adana yöresine ait bir mağaranın dışkı mineral içeriğinin, deponun mağara girişine yakın ve uzak oluşuna göre de farklı olduğu tespit edilmiş ve bunun hava ile temasına göre dışkı nem oranının farklı oluşundan kaynaklanabileceği görüşüne varılmıştır. İncelenen yarasa dışkısında demir düzeyi mağara girişine yakın 2750 ppm, uzağında 3609 ppm olarak hesaplanmıştır. Dışkı N-P-K % oranları ise sırasıyla mağara uzağında ( ); mağara girişinde ( olarak hesaplanmıştır. Klor, Cu, Zn, Pb ve Cd değerlerinin de mağara girişine ve uzağına göre farklı oldukları gözlenmiştir (Tablo 2). Çalışmada toplam azot değeri Adana, Kırklareli, Aydın ve Çorum yöresine ait mağara yarasa dışkısında sırasıyla %0.97; %1.40; %1.14; %5.68 olarak hesaplanmış ve yöre mağaralarına göre değerlerin farklılık gösterdiği saptanmıştır (Tablo 1). Azot yönünden en zengin yarasa dışkısının Çorum yöresine (%5.68); en düşük değerin ise Adana yöresine (%0.97) ait olduğu belirlenmiştir. Yarasa dışkısında azot miktarı % arasında verilmiştir (1). Adana, Aydın ve Kırklareli yöresine ait mağara yarasa dışkılarında hesaplanan toplam azot miktarının bu değerin altında kaldığı, Çorum yöresine ait örnekte ise bu değerin üzerinde olduğu saptanmıştır. Çalışmada, yarasa dışkısı fosfor düzeyi incelenen yörelerde % arasında bulunmuştur. En yüksek değerin Aydın yöresine ait olduğu (%1.50) saptanmıştır. Mağaralara ait fosfor değerleri arasında büyük farklılıklar olmadığı söylenebilir. Literatürde yarasa gübresinde fosfor değeri P 2 O 5 olarak % arasında bildirilmiştir (1). Bu değer çöl yarasalarında %4.0 (14), Jamaika yarasalarında %10.0 ve %8.0 olarak (8) verilmiştir. Ülkemize ait yarasa dışkı örneklerinin fosfor yönünden literatür değerlerden düşük olduğu söylenebilir. Çalışmada yarasa dışkısı K değerleri % olarak hesaplanmış ve literatür (1, 2, 8, 14) ile uyumlu olduğu saptanmıştır. Çöl yarasalarında %1.0 (14), Jamaika yarasalarında %0.0 ve %1.0 (8), mağara yarasalarında %1.0 (14) ve %0.22 (2) olarak bildirilmiştir. Değer K 2 O olarak % arasında verilmiştir (1). Yarasa dışkı örneklerinde Na ve Cl değerleri 4 farklı yörede sırasıyla % ve % arasında bulunmuş ve düzeylerin birbirine yakın oldukları şeklinde değerlendirilmiştir. En düşük ve en yüksek değerlerin sırasıyla Çorum ve Adana yöresine ait olduğu saptanmıştır (Tablo 1). Çalışma sonunda dışkı Mg değerleri Adana, Kırklareli, Aydın ve Çorum yörelerinde sırasıyla %0.09; 0.08; 0.04 ve %0.05 olarak hesaplanmıştır (Tablo 1). Değerlerin literatürde MgO olarak % arasında bildirilen (1) değerin çok altında kaldığı söylenebilir.

8 Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, Dışkı Ca düzeyi, incelenen 4 yörede % arasında bulunmuş ve literatürde CaO olarak bildirilen % arası düzeyden (1) oldukça düşük olarak değerlendirilmiştir. Yarasa dışkısının demirden zengin olduğu ve F 2 O 3 olarak değerlerin % arasında bulunduğu bildirilirken (1), ülkemize ait mağara yarasa dışkısı için Fe değeri %0.59 olarak rapor edilmiştir (2). Çalışmada Fe düzeyleri 4 farklı yörede ppm (yada % ) arasında bulunmuş (Tablo 1) ve değerlerin literatür değerlerden düşük olduğu; broyler altlığında 451 ppm (9), sığır dışkısında 1340 ppm (5) olarak bildirilen değerler ile de uyumlu olduğu görüşüne varılmıştır. Çalışmada dışkı Cu değerleri ppm arasında (yada % ) bulunmuş (Tablo 1) ve literatürde (1) CuO olarak bildirilen değerlerden (% ) düşük olarak değerlendirilmiştir. Ancak, çalışma sonuçlarının mağara yarasa dışkısı için rapor edilen 257 ppm (2) ve broyler altlığı için bildirilen 98 ppm (9), sığır dışkısı için bildirilen 31 ppm (5) değerler ile uyumlu olduğu söylenebilir. Yarasa dışkısı için Zn değeri ZnO olarak % arasında bildirilirken (1) çalışma sonunda ppm (yada % ) arasında bulunmuştur (Tablo 1). Değerler arasında belirgin fark olduğu ve yarasa gübresi için rapor edilen 88,6 ppm lik değerden (2) yüksek olduğu belirlenmiştir. Çalışmada, kontamine toksik minerallerden Pb ve Cd analizleri de gerçekleştirilmiş ve değerler sırasıyla ppb ve ppb olarak hesaplanmıştır (Tablo 1). Literatürde dışkı Pb ve Cd değerlerine rastlanamadığı için doğrudan bir karşılaştırma olanağı bulunamamıştır. Kadmiyum için fosforlu gübrede ppm, nitratlı gübrede ppm, bakır sülfatlı gübrede 0.21 ppm ve kireçte ppm değerler verilmiştir (10). Toprağa gübreyle uygulanması gereken miktar ise Cd için 39 ppm (en üst değer 85 ppm), Pb için ise 300 ppm (en üst değer 840 ppm) olarak bildirilmiştir (11). Elde edilen Pb ve Cd değerlerinin literatürde verilen en düşük değerlerin de altında kaldığı ve incelenen yarasa dışkı örneklerinin bu açıdan herhangi bir risk taşımadığı kanaatine varılmıştır. Sonuç olarak, Türkiye nin değişik yörelerine ait mağara yarasa dışkılarında N, P, K, Ca, Mg, Na, Cl düzeylerinin dışkıda mevcut diğer minerallerden daha yüksek oldukları saptanmış ve N-P-K açısından Çorum yöresine ait dışkı örneklerinin en yüksek % değerlere ( ) ve Adana yöresine ait dışkı örneklerinin ise en düşük % değerlere ( ) sahip oldukları ve N hariç diğer minerallerin literatür değerlerden genel olarak düşük oldukları kanısına varılmıştır. Kaynaklar 1. Aherin R and Christianson L (-): Manure Storage Entering Procedures. especificaciones.html. Erişim Tarihi: Anonim (2002): T.C. Başbakanlık Köy Hizmetleri Toprak-Gübre Analiz Laboratuvar Sonuçları. http/ gov.tr. Erişim Tarihi: Anonim (2003): Guidelines for Organic Fertilization. Cooperative Extension, University of Vermont. Burlington, VT. pass/pss161/ problem/handout.html, Erişim Tarihi: Anonim (2003): Erişim Tarihi: Antony WB (1970): Feeding value of cattle manure for cattle. J Anim Sci, 30, A.O.A.C (1980): Official Methods of Analysis. 13 th ed. Association of Official Analytical Chemists, Arlington. 7. Bicudo J (1998) Manure and Feed Additives. tml, Erişim Tarihi: Bloomington Wholesale Garden Supply: Erişim Tarihi: Brugman AH, Dickey HC, Plummer PE, Poulton BR (1964): Nutritive value of poultry litter. J Anim Sci, 23, Dede ÖH, Özdemir S (2002): Tarım topraklarında ağır metal kirliliği. Ekin Dergisi, 20, Epa Region 1 (1999): Npdes Permit Sludge Compliance Guidance. slugeguidance.pdf, Erişim Tarihi: Gaia Green Products Ltd: search_details. Erişim Tarihi: Hilgers A (1954): Erfahrungen bei flammenphotometrischen Natrium-, Kalium-und Calcium-Bestimmungen in Blutserum. Hoppe-Seyler s Ztschr. Physol. Chem. 294, Homa Harvest Garden Supply Inc.: Guano the 100% natural organic soil amendment. guano.htm, Erişim Tarihi: Karagül H, Altıntaş A, Fidancı UR, Sel T (1999): Temel Biyokimya Uygulamaları. Birinci Baskı. Medisan yayınevi-ankara. 16. Karagül H, Altıntaş A, Fidancı UR, Sel T (2000): Klinik Biyokimya. Birinci Baskı. Medisan yayınevi-ankara. 17. Keleher S: Guano: Bats gift to gardeners. http// Erişim Tarihi: Koelsch R, Shapiro C: Determining Crop Available Nutrients from Manure. ennotes/enfall98/manure.html, Erişim Tarihi: Levinson AS and Mcfate RP (1952): Clinical Laboratory Diagnosis. Lea and Febiger. Philadelphia. 20. Perkin Elmer (1973): Analytical Methods for Atomic Absorbtion Spectrophotometry. Perkin Elmer. Corp. Nolwalk, Connecticut. 21. Zhu T, Jenssen PD, Mæhlum T and Krogstad T (1997): Phosphorus absorption and chemical characteristics of lightweight aggregates (LWA)-potential filter media in treatment wetlands. Water Sci Technol, 35, Geliş tarihi: / Kabul tarihi: Yazışma adresi: Prof. Dr. Arif Altıntaş Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, 06110, Ankara altintas@veterinary.ankara.edu.tr

9 Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, 7-12, 2005 Mast cells in the dog skin: distribution, density, heterogeneity and influence of fixation techniques Reşat Nuri AŞTI 1, Arif KURTDEDE 2, Nevin KURTDEDE 1, Emel ERGÜN 3, Murat GÜZEL 4 1 Department of Histology and Embryology, 2 Department of Internal Disease, Faculty of Veterinary Medicine, University of Ankara; 3 Department of Histology and Embryology, Faculty of Veterinary Medicine, University of Kırıkkale; 4 Department of Internal Disease, Faculty of Veterinary Medicine, University of Mustafa Kemal, Hatay. Summary: This study was conducted with the aim of examining the location, the morphology, and numerical distribution of mast cells in the different areas of the healthy adult dog skin. Skin samples taken from the cheek, pinna, thorax and thigh areas of 10 healthy dogs were used as the study material. The results show the existence of mast cell heterogeneity in dog skin with respect to staining with alcian blue / safranin O and formaldehyde fixation sensitivity. Mast cells characterized by four combination of these parameters were observed: Mast cells containing only alcian blue-positive granules which were formalin-sensitive, mast cells containing only alcian blue-positive granules which were formalin-resistant, mast cells containing only safranin O-positive granules which were formalin resistant and mast cells containing a mixture of alcian blue-positive and safranin O-positive granules which were formalin resistant. With toluidine blue staining method, it was founded that IFAA fixed tissues were contained more mast cells than those tissues fixed with the 10% formaldehyde in all four regions. The difference in average number of mast cells per mm² between the IFAA and the 10% formaldehyde fixed tissues was statistically significant (p<0.001). In the cheek area, whilst the difference between superficial dermis and deeper dermis in terms of the average mast cell count per mm² was not statistically significant (p>0.05), in the other three areas, statistically significant differences (p<0.001) were found. In the pinna, thorax and thigh areas, superficial dermis contained more mast cells than deeper dermis. In both fixations the highest number of mast cells was observed in the skin of the pinna (p<0.001). Key words: Distribution, dog skin, heterogeneity, mast cell. Köpek derisindeki mast hücreleri: dağılım,yoğunluk, heterojenite ve tespit tekniklerinin etkisi Özet: Bu araştırma sağlıklı erişkin köpeklerde farklı deri bölgelerindeki mast hücrelerinin yerleşim yerlerini, morfolojilerini ve sayısal dağılımlarını incelemek amacıyla yapıldı. Çalışmada materyal olarak 10 adet sağlıklı köpeklerin yanak, kulak kepçesi, kaburga ve but bölgelerinden alınan deri örnekleri kullanıldı. Bulgularımız, alcian blue / safranin O ile boyanmasına ve formaldehit tespitine duyarlılığına göre köpek derisinde mast hücre heterojenitesini gösterdi. Mast hücreleri bu parametrelerin dört kombinasyonu ile tanımlandı: Formole duyarlı sadece alcian blue-pozitif granüller içeren mast hücreleri, formole dirençli sadece alcian blue-pozitif granüller içeren mast hücreleri, formole dirençli sadece safranin O-pozitif granüller içeren mast hücreleri ve formole dirençli hem safranin O-pozitif hem de alcian blue-pozitif mikst granüller içeren mast hücreleri. Toluidin blue ile boyanmış kesitlerde dört bölgede de IFAA tespitli dokuların % 10 formolle tespit edilenlere göre daha fazla mast hücresi içerdiği dikkati çekti. Bu iki tespit arasında mm² de mast hücre sayı ortalamalarındaki farklılığın istatistiksel olarak önemli (p<0.001) olduğu saptandı. Yanak bölgesinde yüzlek ve derin dermis katmanlarında mm² de ortalama mast hücre sayıları istatistiksel olarak önemsiz (p>0.05) iken, diğer üç bölgede istatistiksel fark önemli (p<0.001) bulundu. Kulak kepçesi, kaburga ve but bölgelerinde yüzlek katmanda derin katmana göre daha fazla mast hücresi bulunduğu saptandı. Her iki tespitte de en fazla mast hücresi kulak kepçesi derisinde gözlendi (p<0.001). Anahtar sözcükler: Dağılım, heterojenite, köpek derisi, mast hücresi Introduction The mast cells which play role in both physiological and pathological events have been reported to secrete biologically active substances like heparin, histamine, serotonin, platelet activating factors, neutrophil chemotactic factors, proteolytic enzymes, leukotrienes and prostaglandins in response to mechanical, chemical and immunological stimuli (29). The dermal mast cell mediators that take part in events preceding inflammation and the ability to respond quickly to allergens are considered the first line of defense protecting in the skin against antigens (4). In view of their location close to the nerves and blood vessels, they have also been reported to play a role in the regulation of blood flow to the skin by means of neuropeptides when stimulated (4,17). Mast cell are the principal effector cells in IgE- dependent hypersensitivity reactions. Mast cells are capable of synthesising and responding nerve growth factor (NGF) (27).

10 8 Reşat Nuri Aştı - Arif Kurtdede - Nevin Kurtdede - Emel Ergün - Murat Güzel When morphological, biochemical and physiological differences are considered, mast cells are identified in two types as mucosal mast cells (MMC) and connective tissue mast cells (CTMC) (7,13,14). It has been shown that the formalin sensitive granules of the MMC stain AB(+) (14) in the combined AB/SO stain (8,13, 26) whilst those of the CTMC granules stain as formalin resistant (8,13, 26) SO(+) granules (14). For the fixation of the formalin sensitive MMC the use of any one of the solutions as isotonic formaldehyde-acetic acide (IFAA), Carnoy s and Mota is recommended (13). While the CTMC are designated typical mast cells, the MMC are designated atypical mast cells (2,13). These two subtypes of mast cells differ in their glucosaminoglycans, protease and histamine contents. The response of these cells to their stimulators and inhibitors are also different (5). Histamine contained granules of mast cells have been linked with the classic allergic reactions (4). Marshall and Bienenstock (20) have reported that the mucosal mast cell granules to be rich in chondroitin sulphate whereas the connective tissue mast cell granules are rich in heparin. It has been suggested that whilst the atypical mast cells are responsible for the early phase response against antigens in the skin of the dog, the typical mast cells may be responsible for the late phase response (3). Mast cell play roles in type I hypersensitivity reactions (17, 20) and in skin diseases like contact dermatitis and fibrosis (25). These type I hypersensitivity reactions have a role in the formation of atopic dermatitis in the dog (9, 25). The present study was carried out to determine distribution of mast cell numbers and subtypes in the dog according to skin location, staining and fixation method and this help to evaluate their role in skin diseases. Materials and Methods In the study, skin samples taken from the cheek, pinna, thorax and thigh areas of 10 healthy dogs were used as the study material. Punch biopsies were obtained from each site.the specimens were divided into two portions. One portion of the specimen was fixed in 10% formaldehyde and rinsed in top water later. The remaining portion was fixed in isotonic formaldehydeacetic acide (IFAA, ph 2,9) solution for twelve hours and kept for another twelve hours in 70 % alcohol. Both portions were then passed through a series of varying degrees of alcohol, methylbenzoate and benzol and finally blocked in paraplast (13). Then, took 6 µm serial sections. Sections were stained with 5% toluidine blue (prepared in a buffer of Mc Ilvaine s citric acid disodium phosphate, ph 4), and with a combined alcian blue / safranine O (AB/SO) method (14): from the above mentioned serial sections, 10 sections (each 6 µm thick) were selected, i.e. sections 1 and 2 (next 5 sections omitted), sections 8 and 9 ( next 5 sections omitted), sections 15 and 16 (next 5 sections omitted), sections 22 and 23 (next 5 sections omitted), sections 29 and 30. Thus, 5 pairs of sections were yielded, with a distance of 30 µm between each of the pairs. Each of the pair sections was fixed in 10% formaldehyde and IFAA were placed on the same slide and stained in an alcian blue / safranin O staining procedure (14). The skin and intestine of rat used as the control. For to determine the numerical distribution of the mast cells in the toluidin blue stained sections, cell counts per ocular 100 squares micrometer (eyepiece graticule) was used. Under the 40x magnification objective, the number of cells per unit area in the 100 squares were counted. In each section, the number of cells from ten different areas selected at randomly in both superficiale dermis and deeper dermis were counted (6). Later, all the numerical data were converted to number of mast cells per unit area (mm²). The difference in the average mast cell count between fixations and between the layers of the dermis were determined by the Wilcoxon analysis (19) in each region. However, for every fixation, the difference among regions was analyzed by the Kruskal-Wallis test (19). Results The mast cells from the cheek, pinna, thorax and thigh areas of the dog skin were easily identified because of their exhibition of metachromasia upon staining with toluidine blue after fixation with IFAA and 10% formaldehyde (Figures 1, 2, 3 arrows). Mast cells from the IFAA fixed tissue (Figures 1, 3), were noted to be more preserved and their granules stained dark than those from the tissue fixed with 10% formaldehyde (Figure 2). Mast cells were observed to be oval, round, or spindle-shaped with different sizes. Because the cytoplasm of the cells were homogeneously stained, the Figure 1. The appearance of the mast cells (arrows) in cheek skin by fixed IFAA. K: Blood vessel. Toluidin blue stain.x425. Şekil 1. IFAA ile tespit edilmiş yanak derisindeki mast hücreleri (oklar). K: Kan damarı. Toluidin blue boyaması.x425.

11 Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, granules could not be individually identified (Figures 1, 2, 3 arrows). In some cells, the nuclei were also observed to be covered by this homogeneous mass. Mast cells (Figures 1, 2, 3 arrows) are found abundantly especially around blood vessels (K), nerves, sebaceous gland (Figure 3 Y), sweat gland (T) and hair follicles (F) and also immediately underneath the epidermis of the skin. In all the areas, tissues fixed with both the IFAA and the 10% formaldehyde, mast cells granules that stained blue as AB(+), (Figure 4, arrow), red as SO(+) (Figure 5, arrow), and both red and blue as AB/SO(+) mixed granules (arrow head) with the AB/SO staining were seen. The mast cell heterogeneity in dog skin respect to staining with AB/SO and formaldehyde fixation sensitivity. Mast cells characterized by four combination of these parameters were observed: Mast cells containing only alcian blue-positive granules which were formalin-sensitive, mast cells containing only alcian blue-positive granules (Figure 4, arrow) which were formalin-resistant, mast cells containing only safranin O-positive granules (Figure 5, arrow) which were Figure 2. The appearance of the mast cells (arrows) in cheek skin by fixed 10% formaldehyde. K: Blood vessel. Toluidin blue stain.x500. Şekil 2. %10 formolle tespit edilmiş yanak derisindeki mast hücreleri (oklar). K: Kan damarı. Toluidin blue boyaması.x500. Figure 4. AB (+) mast cell (arrow) in thigh skin by fixed 10% formaldehyde. AB/SO stain.x785. Şekil 4. %10 formolle tespit edilmiş but derisindeki AB (+) mast hücresi (ok). AB/SO boyaması.x785. Figure 3. The appearance of the mast cells (arrows) in thorax skin by fixed IFAA. K: Blood vessel, Y: Sebaceous gland, T: Sweat gland, F: Hair follicle. Toluidin blue stain.x475. Şekil 3. IFAA ile tespit edilmiş kaburga derisindeki mast hücreleri (oklar). K: Kan damarı, Y: Yağ bezi, T: Ter bezi, F: Kıl follikülü. Toluidin blue boyaması.x475. Figure 5. SO (+) (arrow) and AB/SO (+) mixed (arrow head) mast cells in thigh skin by fixed IFAA. AB/SO stain.x780. Şekil 5. IFAA ile tespit edilmiş but derisindeki SO (+) (ok) ve AB/SO (+) mikst (ok başı) mast hücreleri. AB/SO boyaması. x780.

12 10 Reşat Nuri Aştı - Arif Kurtdede - Nevin Kurtdede - Emel Ergün - Murat Güzel Table 1: In four regions the difference in average number of mast cells per mm² between the IFAA and the 10% formaldehyde fixed tissues. Tablo 1: IFAA ve %10 formolle tespit edilmiş dört bölge arasında mm² de ortalama mast hücre sayılarındaki farklılıklar Area Fixation n x+ Sx Z IFAA 10 47,04 ± 2,72 Cheek 3,014* 10% Formaldehyde 10 34,24 ± 2,56 IFAA ,04 ± 4,32 Pinna 5,473* 10% Formaldehyde 10 81,76 ± 3,20 IFAA 10 45,92 ± 2,56 Thorax 3,214* 10% Formaldehyde 10 32,40 ± 1,92 IFAA 10 57,76 ± 2,72 Thigh 4,825* 10% Formaldehyde 10 39,12 ± 1,92 * : p<0,001 Table 2: Statistically differences between the average mast cell count per mm² area of two layers of the dermis. Tablo 2: Dermisin iki katmanında mm² de ortalama mast hücre sayılarındaki farklılıklar. IFAA 10%Formaldehyde Area n x+ Sx Z n x+ Sx Z Superficial dermis 10 49,12 ± 4, ,04 ± 4,32 Cheek 0,816 1,742 Deeper dermis 10 44,96 ± 3, ,44 ± 2,88 Superficial dermis ,88 ± 6, ,40 ± 4,96 Pinna 9,265* 6,361* Deeper dermis 10 71,20 ± 4, ,12 ± 3,52 Superficial dermis 10 57,76 ± 4, ,36 ± 2,88 Thorax 5,643* 3,457* Deeper dermis 10 34,08 ± 2, ,44 ± 2,24 Superficial dermis 10 73,12 ± 4, ,36 ± 3,04 Thigh 5,048* 4,388* Deeper dermis 10 42,40 ± 3, ,88 ± 2,40 : p> 0,05 * : p< 0,001 formalin resistant and mast cells containing a mixture of alcian blue-positive and safranin O-positive granules (Figure 5, arrow head) which were formalin resistant. It was also observed that tissue fixed with IFAA had a greater proportion of stained cells, in which the majority were AB(+) stained, than those cells fixed with 10% formaldehyde. However, SO(+) and AB/SO(+) stained granules were relatively rare. Results of the cell counts and statistical analysis to determine the numerical distribution of the mast cells in the cheek, pinna, thorax and thigh areas of the dog skin are shown in tables 1-4. In the serial sections counted, it was founded that IFAA fixed tissues were contained more mast cells than those tissues fixed with the 10% formaldehyde in all four regions. The average mast cell count per mm² in the superficiale dermis and deeper dermis are similar in the cheek area. However, in the pinna, thorax and thigh regions, the mast cell count was found to be higher in the superficiale dermis than in the deeper dermis. In the four different areas fixed with I- FAA, it was found that pinna had significantly (p< 0.001) more mast cells than the other three regions. There were no significant differences among remaining regions. However, in 10% formaldehyde fixed tissues, mast cell numbers were in the following order; pinna, thigh, cheek, thorax. Table 3: Statistically differences among the four different body sites by fixed IFAA. Tablo 3: IFAA ile tespit edilmiş dört bölge arasındaki istatistiksel farklılık. Area n x ± Sx Chi-square Cheek 10 47,04 ± 2,72 a Pinna ,04 ± 4,32 b 12,545* Thorax 10 45,92 ± 2,56 a Thigh 10 57,76 ± 2,72 a *: p < 0,001 a,b: The averages of groups with different letters in the same column are different.

13 Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, Table 4. Statistically differences among the four different body sites by fixed 10% formaldehyde. Tablo 4: %10 formol ile tespit edilmiş dört bölge arasındaki istatistiksel farklılık. Area n x ± Sx Chi-square Cheek 10 34,24 ± 2,56 a Pinna 10 81,76 ± 3,20 c 18,643* Thorax 10 32,40 ± 1,92 a Thigh 10 39,12 ± 1,92 b *: p < 0,001 a,b,c: The averages of groups with different letters in the same column are different. Discussion and Conclusion Identification of the mast cells by basic dyes like toluidine blue, thionine and azure A, with which the specific granules stain metachromatically is an acceptable method (13,14, 24). It has been shown that mast cells in the IFAA fixed tissue are more preserved, more prominent (13, 14), and have much more dense stained granules (14). It has been reported that mast cells were observed especially around blood vessels, nerves, hair follicles (15, 18), sebaceous and sweat glands in the skin (2, 10, 12, 22, 28). In sections which stained with toluidine blue and examined under the light microscope, it has been shown that these metachromatic granules are not identifiable individually (13, 14) and that in some cells even the nucleus is covered with these homogeneous substance (18). The findings from this study conforms with that of the researchers (2, 10, 13, 14, 15). In a study (21) conducted on the formalin sensitivity and staining properties of the mast cells of the human skin stained with the combined AB/SO staining, four different types of mast cells (the formalin sensitive only AB(+) and formalin resistant only AB(+), formalin resistant only SO(+), and formalin resistant AB(+) and SO(+) mixed granular cells), were observed. It is also reported that the majority of mast cells were formalin sensitive AB(+) MMC (21). Whilst in a study on rat skin, El Sayed and Dyson (11) found that tissue fixed with formaldehyde and stained with the combined AB/SO staining to have a majority of mast cells being AB(+) and a much lesser SO(+) and the least number of AB/SO(+) mixed granules, in those tissue fixed in the Carnoy s solution and stained with the AB/SO combined staining, only mast cells containing AB(+) granules were observed. This finding was attributed to the presence of mast cells containing Carnoy s solution sensitive formalin fixable SO(+) granules in the skin of the rat (11). This fixation and staining properties support the idea that number of mast cells in the formaldehyde fixed tissues is higher than that in the Carnoy s fluid fixed tissues in the toluidine blue stained sections (11). In the study, tissues fixed with both the IFAA and the 10% formaldehyde solutions were observed to have mast cells that exhibited only blue stained AB(+) granules, only red stained SO(+) granules and stained with red and blue as mixed granular AB/SO(+) when stained with the AB/SO staining. It was remarkable that IFAA fixed tissues had more stained cells in comparison to the 10% formaldehyde fixed tissues. Majority of which cells had AB(+) granules. However, the cells including SO(+) and mixed AB/SO(+) granules were in minority. The results of this study are agree with those of Marshall et al. (21). However, the results of this study differ from those of El Sayed and Dyson s (11) in which fixaton in the Carnoy s fluid and staining with the AB/SO stain showed mast cells containing only AB(+) granule, and the 10% formaldehyde fixed tissues compared with the Carnoy s fluid fixed tissues showed much more mast cells. Tissues of the human (21) and dog (1, 2) skin have been shown to contain much more mast cells when fixed in the Carnoy s or Mota fixatives than in 10% formaldehyde. The results of the study agrees with that of these researchers. IFAA fixed tissues were contained more mast cells than those tissues fixed with the 10% formaldehyde in all four regions. The difference in average number of mast cells per mm² between the IFAA and the 10% formaldehyde fixed tissues was statistically significant (p<0.001). Mast cells have been shown to be much more abundant in the superficial dermis than in the deeper dermis in the skin of humans (9, 10, 21, 28), chicken and quails (18), and the dog (2, 23). However, it was more abundant in the deeper dermis than in the superficial dermis in rats (11, 23). In studies conducted on mast cells from the different areas of the skin, the highest number of mast cells was reported in the pinna (1,12,16). In present study, in the cheek area, whilst the difference between superficial dermis and deeper dermis in terms of the average mast cell count per mm² was not statistically significant (p>0.05), in the other three areas, statistically significant differences (p<0.001) were found. In the pinna, thorax and thigh areas, the mast cell count were higher in the superficial dermis than in the deeper dermis. In conclusion, among the four different areas examined in present study, due to the finding of the highest number of mast cells in the pinna area in tissue fixed in both fixations, was reason for our support of the view of Auxilia and Hill (1) that the pinna is one of the predilection sites in atopic dermatitis. References 1. Auxilia ST, Hill PB (2000): Mast cell distribution, epidermal thickness and hair follicle density in normal canine skin: possible explanations for the predilection sites of atopic dermatitis? Vet Dermatol, 11,

14 12 Reşat Nuri Aştı - Arif Kurtdede - Nevin Kurtdede - Emel Ergün - Murat Güzel 2. Becker AB, Chung KF, McDonald DM, Lazarus SC, Frick OL, Gold WM (1985): Mast cell heterogeneity in dog skin. Anat Rec, 213, Becker AB, Chung KF, McDonald DM, Lazarus SC, Frick OL, Gold WM (1986): Cutaneous mast cell heterogeneity, response to antigen in atopic dogs. J Allergy Clin Immunol, 78, Benyon RC (1989): The human skin mast cell. Clin Exp Allergy, 19, Bienenstock J, Befus AD, Pearce F, Denburg J, Goodacre R (1982): Mast cell heterogeneity: derivation and function, with emphasis on the intestine. J Allergy Clin Immunol, 70, Böck P (1989): Romeis Mikroskopische Tecknik. 17. Aufl. Urban und Schwarzenberg München. 7. Chen W, Alley MR, Manktelow BW, Davey P (1990a): Mast cells in the ovine lower respiratory tract: heterogeneity, morphology and density. Int Arch Allergy Appl Immunol, 93, Chen W, Alley MR, Manktelow BW, Slack P (1990b): Mast cells in the bovine lower respiratory tract: morphology, density and distribution. Br Vet J, 146, Cowen T, Trigg P, Eady RAJ (1979): Distribution of mast cells in human dermis: development of a mapping technique. Brit J Dermatol, 100, Eady RAJ, Cowen T, Marshall TF, Plummer V, Greaves MW (1979): Mast cell population density, blood vessel density and histamine content in normal human skin. Brit J Dermatol, 100, El Sayed S, Dyson M (1993): Histochemical heterogeneity of mast cells in rat dermis. Biotech Histochem, 68, Emerson JL, Cross RF (1965): The distribution of mast cells in normal canine skin. Am J Vet Res, 26, Enerbäck L (1966a): Mast cells in rat gastrointestinal mucosa. 1. effects of fixation. Acta Path Microbiol Scandinav, 66, Enerbäck L (1966b): Mast cells in rat gastrointestinal mucosa. 2. dye-binding and metachromatic properties. Acta Path Microbiol Scandinav, 66, Eren Ü (2000): Köpek derisinde mast hücreleri. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 47, Foster AP (1994): A study of the number and distribution of cutaneous mast cells with disease not affecting the skin. Vet Dermatol, 5, Gordon JR, Parris RB, Galli JS (1990): Mast cells as a source of multifunctional cytokines. Immunol Today, 11, Kurtdede N, Yörük M (1995): Tavuk ve bıldırcın derisinde mast hücrelerinin morfolojik ve histometrik incelenmesi. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 42, Lehmann EL (1998): Non parametrics statistical methods based on ranks. First edition, Prentice-Hall, Inc. Simon&Schuster/ A Viacom Company Upper Saddle River, New Jersey. 20. Marshall JS, Bienenstock J (1994): The role of mast cells in inflammatory reactions of the airways, skin and intestine. Curr Opin Immunol, 6, Marshall JS, Ford GP, Bell EB (1987): Formalin sensitivity and differential staining of mast cells in human dermis. Br J Dermatol, 117, Mikhail GR, Miller-Milinska A (1964): Mast cell population in human skin. J Invest Dermatol, 43, Persinger MA, Lapage P, Simard JP, Barker GH (1983): Mast cell number in incisional wounds in rat skin as a function of distance, time and treatment. Br J Dermatol, 108, Schwartz LB, Austen KF (1984): Structure and function of the chemical mediators of mast cells. Prog Allergy, 34, Scott DW, Miller WH, Griffin CE (1995): Muller and Kirk's small animal dermatology. 5th Edition,W. B. Saunders Company, Philadelphia, Shanahan F, Macniven I, Dyck N, Denburg JA, Bienenstock J, Befus AD (1987): Human lung mast cells: distribution and abundance of histochemicaly distinct subpopulations. lnt Arch Allergy Appl Immunol, 83, Skaper SD, Pollock M, Facci L (2001): Mast cells differentially express and release active high molecular weight neurotrophins. Brain Res Mol Brain Res, 97, Walton S, DeSouza EJ (1983): Variation in mast cell numbers in psoriasis and lichen planus: comparisons with normal skin. Dermatologica, 166, Warton A, Papadimitriou JM, Goldie RG, Paterson JW (1986): An ultrastructural study of mast cells in the alveolar wall of normal and asthmatic lung. Aust Exp Biol Med Sci, 64, Geliş tarihi: / Kabul tarihi: Corresponding address: Prof. Dr. Reşat Nuri Aştı Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı Dışkapı, Ankara resatnuriasti@hotmail.com

15 Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, 13-16, 2005 Develerin (Camelus dromedarius) perifer kan lökositlerinde alfa-naftil asetat esteraz aktivitesinin belirlenmesi Mustafa SANDIKÇI, Şadiye KUM, Ülker EREN Adnan Menderes Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı, Aydın. Özet: Bu çalışma, develerde perifer kan lökositlerinin alfa naftil asetat esteraz (ANAE) aktivitesinin belirlenmesi amacıyla yapıldı. Çalışmada materyal olarak 13 adet erişkin deveden alınan heparinize kan örnekleri kullanıldı. ANAE aktivitesinin belirlenmesi için farklı ph ve sürelerde ANAE boyaması uygulandı. ANAE boyamasına karşı en iyi reaksiyon ph 5.8'de yapılan 3 saatlik boyamalardan elde edildi. Kanda ANAE pozitif T lenfosit oranı % olarak tespit edildi. ANAE boyamasına karşı monositlerin diffuz granuler pozitivite gösterdikleri, eritrositlerin ve granulositlerin ise negatif reaksiyon verdiği dikkati çekti. Anahtar sözcükler: ANAE aktivitesi, deve, lökosit. Determination of alpha naphthyl acetate esterase activity in peripheral blood leukocytes of camel (Camelus dromedarius) Summary: This study was carried out to determine the alpha naphthyl acetate esterase (ANAE) activity of peripheral blood leukocytes in camels. Heparinized blood samples taken from 13 adult camels were used. ANAE stainings were applied at different ph and durations for the determination of ANAE activity. The best reactions against ANAE were obtained for three hours stainings at ph 5.8. The proportion of ANAE positive T lymphocytes were %. There was a diffuse granular pozitivity against ANAE staining in monocytes. However negative reactions were observed in erytrocytes and granulocytes. Key words: ANAE activity, camel, leukocytes. Giriş Kemik iliğinden timusa gelen prekürsör hücreler bu organın korteksinde bazı lokal kimyasal moleküllerin etkisiyle timositlere differensiye olurlar. Bu hücreler timus medulasına geçerek dolaşımla sekonder lenfoid organlara giderler (5,6). Basso ve ark (4) insanlarda perifer kan T lenfositlerinin alpha-naphthyl acetate esterase (ANAE) enzimi taşıdığını ve bu enzimin timus medulasında timosit olgunlaşması sırasında kazanıldığını bildirmişlerdir. B lenfositlerinin ise bu enzime sahip olmadıkları, ANAE enziminin bir T lenfosit markırı olduğu kabul edilmektedir (5,13). ANAE lizozomal bir enzimdir (13,14,27). Zicca ve ark (27) enzimin lizozomların membranlarında bulunduğunu, Aştı ve ark (3) ise enzimin lizozomal içeriğe dahil olduğunu bildirmişlerdir. Monositler, makrofajlar ve retikulum hücrelerinin de ANAE pozitivitesi gösterdiği fakat T lenfositlerinin lokalize granüler pozitivite göstermesine rağmen diğer pozitif hücrelerin diffuz granüler pozitivite gösterdikleri bildirilmiştir (17,20). ANAE enzimi demonstrasyonu metodu perifer kan T lenfositlerinin belirlenmesi için fare (14), sığır (9), insan (8,19), köpek (1,24), kedi (16,26), domuz (16), ve tavuklarda (3,20,22) kullanılmıştır. Araştırmacılar (2,8,10,12,14), ANAE demonstrasyonunda, uygulanan boyanın ph sı ve inkubasyon süresinin hayvan türüne göre farklı olabileceğini bildirmişlerdir. T lenfositleri sağlıklı insan ve hayvanların perifer kanında belirli oranlarda bulunurken, bazı neoplastik hastalıklarda bu oran değişmektedir (9,12). ANAE pozitif T lenfositlerinin % 95 inin elektroforez analiz yöntemi ile de doğrulandığı (21), ANAE demonstrasyon metodunun, klinik bilimlerinde kronik ve akut leukaemia ler gibi kanser olgularında ayırıcı tanı amacıyla kullanılabileceği bildirilmiştir (11). Develerde ANAE demonstrasyonu ile kanda T lenfositlerinin belirlenmesi hakkında herhangi bir çalışmaya rastlanamamıştır. Sunulan çalışma, erişkin develerde ANAE demonstrasyonu yöntemi uygulanarak perifer kan T lenfosit oranının belirlenmesi amacıyla gerçekleştirilmiştir. Materyal ve Metot Çalışmada, 13 adet (9-20 yaşlarında) sağlıklı deve (Camelus dromedarius) den alınan heparinize (Liquemine, Roche) kan örnekleri materyal olarak kullanıldı. Alınan kan örneklerinden frotiler hazırlanarak oda sıcaklığında kurutuldu ve glutaraldehid-aseton tespit sıvısında C da 3 dakika tespit edildikten sonra distile suyla yıkandı. Tespit edilen frotilerde ANAE demonstrasyonu için,

16 14 Mustafa Sandıkçı - Şadiye Kum - Ülker Eren Şekil 1. Erişkin devenin perifer kanında ANAE boyaması. Bir (ok) ya da birkaç (okbaşı) granüle sahip ANAE pozitif Tlenfositler, Bar: 5 µm. Figure 1. ANAE demonstration in peripheral blood of adult camel. ANAE positive T lymphocytes including one (arrow) or a few (arrowhead) granules, Bar: 5 µm. Şekil 3. Erişkin devenin perifer kanında ANAE boyaması. ok: 7-8 adet küçük granül içeren ANAE pozitif lenfosit, Bar: 5 µm. Figure 3. ANAE demonstration in peripheral blood of adult camel. arrow: ANAE positive T lymphocyte including 5-6 small granules, Bar: 5 µm. Şekil 2. Erişkin devenin perifer kanında ANAE boyaması. ok: ANAE pozitif T lenfosit, okbaşı: ANAE negatif lenfosit, * : ANAE negatif nötrofil granülosit, Bar: 5 µm. Figure 2. ANAE demonstration in peripheral blood of adult camel. arrow: ANAE positive T lymphocytes, arrowhead: ANAE negative lymphocytes, * : ANAE negatif neutrophil granulocyte, Bar: 5 µm. Şekil 4. Erişkin devenin perifer kanında ANAE boyaması. ok: diffuz granüler pozitivite gösteren bir monosit, okbaşı: ANAE negatif bir eozinofil granülosit, Bar: 5 µm. Figure 4. ANAE demonstration in peripheral blood of adult camel. arrow: diffuse granular positive monocyte, arrowhead: ANAE negative eosinophil granulocyte, Bar: 5 µm.

17 Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, M fosfat tamponunun (ph 5.0) 40 ml sine 2.4 ml hekzazotize edilen pararosaniline (Sigma) solusyonu ve 0.4 ml asetonda eritilen 10 mg alpha napthyl acetate (Sigma) eklenerek hazırlanan inkubasyon solusyonu kullanıldı (14). İnkubasyon solusyonları 2N NaOH ile 5.0, 5.4, 5.8, 6.2, 6.4, 6.8 ve 7.2 olmak üzere 7 değişik ph da ayarlandı. Frotilere oda sıcaklığında her ph için 3 ve 6 saatlik boyamalar uygulandı (2,12). İnkubasyondan sonra frotilere methylene blue ile çekirdek boyaması uygulandı. Her frotide 5 değişik alanda olmak üzere toplam 500 lenfosit sayılarak ANAE pozitif lenfosit oranı belirlendi (2,12) ve Leica DC-200 camera ile resimleri çekildi. Bulgular Develerden alınan perifer kan T lenfositlerinde ANAE boyamasına karşı en iyi reaksiyon ph 5.8'de, 3 saatlik boyamadan elde edildi. ANAE enzimi demonstrasyonunda pozitif lenfositlerin büyük çoğunluğunda sayıları 1-2 arasında değişen kahverengi, iri granüller gözlenirken (Şekil 1, 2 oklar), diğer pozitif lenfositlerin 3-8 arasında değişen küçük granüllere sahip oldukları gözlendi (Şekil 1 okbaşı, Şekil 3 ok). Yapılan mikroskopik incelemeler sırasında ANAE negatif lenfositlerin varlığı da dikkati çekti (Şekil 2 okbaşı). ANAE demonstrasyonu'nda 13 deveye ait perifer kan örneklerinde ANAE pozitif T lenfosit oranları Tablo 1 de verildi. Sözkonusu oran ortalama % olarak tespit edildi. ANAE boyamasına karşı monositlerin diffuz granuler pozitivite gösterdikleri (Şekil 4, ok), eritrositlerin, granulositlerin (Şekil 2 yıldız, Şekil 4 okbaşı) ve plateletlerin ise negatif reaksiyon verdiği dikkati çekti. Tablo 1. Develerin perifer kan lenfositlerinde ANAE demonstrasyonu Table 1. ANAE demonstration in peripheral blood lymphocytes of camels Hayvan no ANAE pozitif Lenfosit (%) Mean ± SD ± 6.08 Tartışma ve Sonuç Farklı hayvan türlerinde (2,8) ve insanda (10) perifer kan lökositlerinin ANAE boyamasına karşı gösterdikleri boyanma özelliklerinin, uygulanan boyanın ph sı ve boyama süresine bağlı olarak değişiklikler gösterdiği ileri sürülmüştür. Knowles ve ark (10) ile Muller ve ark (15), insanların perifer kanında ANAE demontsrasyonuna karşı en iyi sonucu ph 5.8 de 3 saatlik boyamadan elde ettiklerini, Higgy ve ark (8) ise ph 8.0 da 30 dakikada boyamanın gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Osbaldiston ve Sullivan (18) köpeklerde ph 6.5 de 90 dakika, domuzlarda ph 6.4 de 2 saat, Maiti ve ark da (12) tavuklarda 7.2 de 16 saatte, en iyi sonucu aldıklarına dikkati çekmişlerdir. Aştı ve ark (2) ise perifer kanda en iyi reaksiyonun tavuk, köpek, koyun ve keçide ph 5.8, at ve sığırda ph 6.2, rat ve kedide ph 6.4 de yapılan 3 saatlik boyamalardan elde edildiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada deve perifer kanında ANAE boyamasına karşı en iyi reaksiyon ph 5.8 de 3 saatlik boyamadan elde edildi ve bu hayvanlarda perifer kan ANAE pozitif T lenfosit oranı % olarak tespit edildi. Yapılan literatür taramalarında develerin perifer kan ve lenfoid organlarında ANAE demonstrasyonu ile ilgili herhangi bir çalışmaya rastlanamamıştır. Wernery ve ark (23) ise develerde T/B lenfosit oranının 5/1 olduğunu bildirmişlerdir. Bu oran insanlarda % 85 (15), sığırlarda % 63 (25), kangal köpeklerinde % 82 (1), tavuklarda % 56 (3, 12) olarak bildirilmiştir. İnsan ve hayvanların perifer kan T lenfositlerinde ANAE pozitivitesinin çoğunlukla 1-2 adet lokalize granül şeklinde gözlendiği, B lenfositlerinin negatif reaksiyon verdiği, monositlerde ise diffuz boyanma gözlendiği bildirilmiştir (4, 9, 14). Bu çalışmada da develerde ANAE pozitif lenfositlerin çoğunda 1-2 adet spesifik kahverengi granül gözlenirken az sayıda lenfositin 3-8 adet küçük granüle sahip olduğu, monositlerin ise diffuz granüler pozitivite gösterdiği tespit edildi. Grossi ve ark (7) T lenfositlerinin ya IgM yada IgG reseptörüne sahip olduğunu, IgM reseptörüne sahip T lenfositlerin B hücre proliferasyonu ve differensiyasyonuna yardımcı olduklarını, IgG reseptörlü T hücrelerinin ise muhtemelen supresör etki yaptıklarını, ANAE pozitivitesi veren lenfositlerin de IgM reseptörlü T lenfositler olduğunu ileri sürmüşlerdir. Bu bilgiler ışığında, perifer kanda ANAE negatif olarak belirlenen lenfositlerin hepsinin B lenfosit olarak değerlendirilemeyeceği, çünkü bu negatif hücrelerin bazılarının IgG reseptörüne sahip T lenfositler olabileceği düşünülebilir. ANAE boyamasına karşı nötrofil granülositlerde insan (8, 10), domuz (18), sığır (25) ve kedide (18) negatif; kobay, rat, keçi ve koyunda (18) pozitif reaksiyon görüldüğü, eozinofil granülositlerde ise insan (8,10) sığır (25), kedi, rat, koyun ve keçide (18) negatif, köpeklerde (18) ise pozitif reaksiyonun görüldüğü bildirilmiştir. Aştı ve

18 16 Mustafa Sandıkçı - Şadiye Kum - Ülker Eren ark (2) ise ANAE demonstrasyonunda nötrofil granülositlerin kedi, köpek ve atlarda negatif, rat, koyun, keçi ve sığırlarda pozitif, eozinofil granulositlerin ise rat, tavuk, kedi, köpek, at, sığır, koyun ve keçide pozitif reaksiyon verdiğini bildirmişlerdir. Sunulan çalışmada ise granülositlerde ANAE pozitivitesi tespit edilmemiştir. Develerin perifer kan lökositlerinde ANAE boyamasına karşı en iyi reaksiyonun ph 5.8 de yapılan 3 saatlik boyamalardan elde edilebileceği ve T lenfositlerinin spesifik olarak belirlenebileceği sonucuna varıldı. Kaynaklar 1. Aştı RN, Kurtdede N, Ergün L (1993): Kangal köpeklerinin perifer kan T lenfositleri üzerinde ışık ve elektron mikroskopik çalışmalar. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 40, Aştı RN, Alabay B, Kurtdede N, Altunay H, Ergün L (1996): Farklı hayvan türlerinin perifer kan lökositlerinde alfa naftil asetat esteraz aktivitesinin belirlenmesi. Ankara Üniv Vet Fak Derg, 43, Aştı RN, Kurtdede N, Özen A (1999): Light and electron microscopic studies on alpha naphthyl acetate esterase activity of peripheral blood T lymphocytes in chicken. Dtsc Tierarztl Wschr, 106, Basso G, Cocito MG, Semenzato G,Pezzutto A and Zanesco L (1980): Cytochemical study of thymocytes and T lymphocytes. Br J Haematol, 44, Beya MF, Miyasaka M, Dudler L, Ezaki T, Trnka Z (1986): Studies on the differentiation of T lymphocytes in sheep: 1. Two monoklonal antibodies that recognize all ovine T lymphocytes. Immunol, 57, Glick B (1985): The ontogeny and microenvironment of the avian thymus and bursa Fabricius: contribution of specialized cells to the avian immuno response. Adv in Vet Sci and Comp Med, 30, Grossi CE, Webb SR, Zicca A, Lydyard PM, Moretta L, Mingari MC, Cooper MD (1978): Morphological and histochemical analyses of two human T cell subpopulations bearing receptors for IgM or IgG. J Exp Med, 147, Higgy KE, Burns GF, Hayhoe FG (1977): Discrimination of B,T and null lymphocytes by esterase cytochemistry. Scand J Haematol, 18, Kajikawa DVM, Koyama H, Yushikawa T, Tsubaki S (1983): Use of alpha naphthyl acetate esterase staining to identyfy T lymphocytes in catle. Am J Vet Res, 44, Knowles DM, Hoffman T Ferrarini M and Kunkel HG (1978): The demonstration of acid alpha naphthyl acetate esterase activity in human lymphocytes usefulness as a T cell marker. Cell Immun, 35, Kulenkampff J, Janossy G, Greaves MF (1977): Acid esterase in human lymphoid cells and leukaemic blasts: a marker for T lymphocytes. Br J Haematol, 36, Maiti NK, Saini SS, Sharma SN (1990): Histochemical studies on chicken peripheral blood lymphocytes. Vet Res Commun, 14, Miyasaka M, Heron I, Dudler L, Cahil RNP, Forni L, Knaak T and Trnka Z (1983): Studies on the differentiation of T lymphocytes in the sheep. I. Reconition of sheep T lymphocyte differentiation antigen by a monoclonal antibody T-80. Immunology, 49, Mueller J, Brun del Re G, Buerki H, Keller HU, Hess MW and Cottier H (1975): Nonspesific acid esterase activity: a criterion for differentiation of T and B lymphocytes in mouse lymph nodes. Eur J Immunol, 5, Muller J, Keller HU, Durig P, Hagmann J, Cornioley DM, Reinhard J, Ruchti C, Hess MW and Cottier H (1981): Nonspesific esterase in human lymphocytes. Int Arch Allergy. Appl Immunol, 64, Nakase Y, Kabayashi K (1984): Cytochemical studies of leukocytes of some animal species: 3. Esterase stain. Bull Azabu Univ Vet Med, 5, Odend hal S, Player EC (1979): Histochemical localization of T cell in tissue sections. Avian Dis, 23, Osbaldiston GW, Sullivan RJ (1978): Cytochemical demonstration of esterases in peripheral blood leukocytes. Am J Vet Res, 39, Pangalis GA, Valdman SR, Rappaport H (1978): Cytochemical findings in human nonneoplastic blood and toncillar B and T lymphocytes. Am Soc Clin Pathol, 69, Pruthi AK, Gupta RKP, Sadana JR (1987): Acid alpha naphthyl acetate esterase activity in peripheral blood lymphocytes monocytes of chickens. J Vet Med A, 34, Ranki A, Totterman TH, Hayry P (1976): Identification of Mouse T and B lymphocytes from cytocentrifuged cell smears. Clin Exp Immunol, 26, Sandıkçı M (2000): Proportion of T lymphocytes in peripheral blood of the hydrocortisone acetate-treated chickens at post hacthing period. Bornova Vet Kont Araşt Enst Derg, 25, Wernery U, Fowler ME, Wernery R (1999): Color Atlas of Camelid Hematology. Blackwell wissenschafts, Verlag, Berlin, Vienna. 24. Wulff JD, Sale GE, Deeg HJ, Storb R (1981): Nonspesific acid esterase activity as marker for canine T lymphocytes. Exp Hematol, 9, Yang TJ, Jantzen PA and Williams LF (1979): Acid alpha naphthyl acetate esterase: presence of activity in bovine and human T and B lymphocytes. Immunology, 38, Yörük M, Aştı RN, Kurtdede N, Ağaoğlu Z, Altunay H (1998): Light and electron microscopic studies on alpha naphthyl acetate esterase activity of the peripheral blood T lymphocytes in van cats. Anat Histol Embryol, 27, Zicca A, Leprini A, Codoni A, Franzi AT, Ferrarini M, Grossi CE (1981): Ultrastructural localization of alpha naphthyl acid estarase in human TM lymphocytes. Am J Pathol, 105, Geliş tarihi: / Kabul tarihi: Yazışma adresi: Yard. Doç. Dr. Mustafa Sandıkçı Adnan Menderes Üniversitesi Veteriner Fakültesi Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı Işıklı / Aydın

19 Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, Ankara Üniv Vet Fak Derg, 52, 17-21, 2005 Kedilerde vaginal smear yöntemi ile siklus dönemlerinin saptanması ve ovaryumlar üzerindeki yapılar arasındaki ilişkinin araştırılması Abuzer K. ZONTURLU 1, Cihan KAÇAR 2, Nil MARAL 3, Selim ASLAN 4 1 Harran Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı, Şanlıurfa; 2 Kafkas Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı, Kars; 3 Pets and Vets Kliniği, Cinnah Caddesi 40/3 Çankaya, 06110, Ankara; 4 Ankara Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı, Ankara. Özet: Bu çalışma, kedilerde vaginal smear yöntemiyle seksüel siklus dönemlerinde görülen hücrelerin, ovaryum üzerindeki yapıların ve uterustaki değişikliklerin karşılaştırılması amacıyla planlanmıştır. Çalışmada, yaşları 7 ay ile 8 yaş arasında değişen ve ağırlıkları kg olan toplam 83 adet dişi kedi kullanıldı. Vaginal smear örnekleri genel anestezi altında alındı. Ovaryumlar üzerindeki yapılar ovariohisterektomi operasyonundan sonra incelendi. Elde edilen vaginal smearlerin siklus dönemlerine göre dağılımı %13.25 proöstrus (n=11), %34.93 östrus (n=29), %31.32 metaöstrus (n=26) ve %20.48 anöstrus (n=17) olarak saptandı. Siklusun östrus döneminde bazal, yukarı süperfisial ve keratinize hücrelerin yüzdeleri sırasıyla %0.5, %39.44, %26.17 olarak bulundu. Buna karşın bu oranlar anöstrus döneminde %32.64, %2.17 ve %1.70 olarak belirlendi. Asidofilik indeks oranı en yüksek olarak (%93.45) östrusta, en düşük anöstrusta (%24.70) görüldü ve istatiksel yönden bu fark önemli bulundu (p<0.001). Kedi başına düşen mm çapında follikül oranı en çok siklusun proöstrus evresinde saptandı. 2-3 mm çapta follikül, proöstrus ve anöstruste bulunmadı. Büyük folliküller en yüksek oranda (%29.5) östruste bulundu. Uterusun kalınlığı bakımından istatistiksel açıdan proöstrus, metaöstrus ve anöstrus evreleri arasında önemli (p<0.05) faklılıklar vardı. Vaginal smear örneklerinde proöstrus evresi hariç eritrosit sayıları düşük olarak saptandı. Sonuç olarak kedilerde vaginal sitoloji yöntemi ile siklusun östrus ve anöstrus dönemlerinin kolaylıkla belirlenebileceği buna karşılık Proöstrus ve Metaöstrus dönemlerinin birbirinden kolayca ayrılamayacağı kanısına varılmıştır. Anahtar sözcükler: Kedi, ovaryum yapıları, vaginal sitoloji Determination of sexual cycle stages by vaginal cytology and its relationship with ovarian structures in the queen Summary: This study was designed to determine sexual cycle stages by vaginal cytology and to evaluate the relationship between vaginal smaer results and structures on ovaries. A total of 83 queens weighing kg, at ages between 7 months- 8 years were used. Vaginal smear samples were collected under general anaesthesia. Ovaries were examined following ovariohysterectomie operation. Vaginal smear results reveal that 11, 29, 26 and 17 animals were at proestrous, estrous, metestrous and anestrous stages, respectively. Percentages of basal, upper superficial and cornified cells were 0.5 %, % and % at estrous period, respectively. Same percentages in anestrous period were %, 2.17 % and 1.7 %. Acidophylic index were highest (93.45 %) in estrous and lowest (24.7 %) in anestrous and statistically different between these stages (p<0.001). Follicles mm in diameter were abundant in proestrous. Follicles 2-3 mm in diameter were observed in 29.5 % of estrous queens and none of proestrous and anestrous cats. There were significant differences (p<0.05) in uterine thickness between proestrous, metestrous and anestrous stages. Erythrocyte numbers were low in vaginal smears except for proestrous. In conclusion, estrous, metestrous and anestrous stages of sexual cycle can easily be determined by vaginal cytology in the queen and information can be obtained on ovarian structures. Key words: Ovarian structures, queen, uterus, vaginal cytology Giriş Dişi kediler mevsimsel poliöstrik hayvanlardır. Ocak-Şubat aylarında uzamaya başlayan gün ışığı süresi siklus aktivite dönemini başlatmakta, sonbaharda azalan ışık etkisiyle de fizyolojik anöstrus (AÖ) dönemine geçiş şekillenmektedir. Sonbaharın sonu ve kış ayları da yapay ışık uygulamaları ile seksüel yönden aktif dönemler haline gelmekte, bu durum ev içinde beslenen kedilerde belirginleşmektedir (1). Dişi kedilerde folliküler dönem ortalama 7.4 gün sürmekte olup süreç ırka bağlı olarak 3-16 gün arasında farklılıklar gösterebilmekte, çiftleşme bu süreyi kısaltmaktadır. Steril çiftleşmeyi takiben ovulasyon şekillendiği takdirde ortalama 7 gün, ovulasyon şekillenmez ise 7.6 gün olarak gerçekleşmektedir (5,7,9). Ovulasyon, çiftleşme, serviks uteri ve vaginanın mekanik uyarımı, vulva ve sırt bölgesine uygulanan masajlar ve eksojen gonadotropin uygulamaları sonucu şekillenir. Ovulasyon, söz konusu uyarımlardan saat sonra şekillenmektedir. LH salınımının düzeyi ile süresi, kopulasyon ya da uyarımların sıklığı ve oluştuğu zaman dilimiyle ilgilidir (5,12).

20 18 Abuzer K. Zonturlu - Cihan Kaçar - Nil Maral - Selim Aslan Ovulasyonun oluşmadığı durumlarda kediler 2-10 gün süreyle östrus beldekleri (Ö) gösterirken, folliküller bu sürenin sonunda atreziye uğrarlar. Progesteron salınımı olmadığından endometrium transformasyonu şekillenmez ve 8-9 günlük kısa bir dinlenme döneminden sonra (interöstrus) yeni bir folliküler döneme girilir. Anovulatorik siklusun süresi ortalama 16 gündür. Östrus (Ö) günlük aralıklarla tekrar ederken, persistent follikül olgularında kızgınlığın kesilmeden sürdüğü dikkati çeker (2,8). Kedilerde siklusun proöstrus (PÖ) ve östrusta oluşan folliküler döneminde açıkça fark edilen bağırma, miyavlama, yuvarlanma, sürtünme gibi davranışlar ile dış bakıda belirlenebilen vulvada kıvrım oluşumu ve az miktarda açık renkli müköz akıntı söz konusudur. Östrus (Ö) döneminin saptanması amacıyla vaginal sitoloji, köpeklerde olduğu gibi kedilerde de başvurulan muayene yöntemlerinden biridir (4). Siklusun izlenmesi, hormon uygulamalarına yön verme gibi durumlarda vaginal sitoloji önemli bir başvuru yöntemidir. Östrojen kedilerde vaginal mukusda identifikasyona neden olur. Östrojen aktivitesinin en duyarlı ve tutarlı belirtisi vaginal smear örneğinin zeminindeki temiz görüntüdür. Vagina epiteline ait hücreler debris yani selüler veya non-selüler döküntülerin azalıp ortadan kalkması ile daha kolay gözlenir hale gelir (6). Kedilerde proöstrus döneminde intermediar hücre oranında artış olurken tüm süperfisial hücreler %60 civarında bulunmakta, lökosit oranı metaöstrus (MÖ) dönemindeki kadar görülmektedir (11). Asidofili indeksi (Aİ) ise %30 civarında olmaktadır. Östrus döneminde süperfisial hücrelerin yanısıra piknotik çekirdekli veya çekirdeklerini tamamen yitirmiş keratinize süperfisial hücreler yaklaşık %80 oranında bulunmaktadır (11). Çekirdeksiz süperfisial hücrelerin oranı, folliküler dönemin ilk gününde %10 dan daha fazla artış göstermektedir. Çekirdekli süperfisial hücrelerin oranı ise %20-30 arasında sabit kalırken, intermediar ve parabazal hücrelerin oranı düşmektedir. Eritrositlerin görülmesi ender iken, bazen erken folliküler dönemde rastlanmaktadır (6) Metaöstrus döneminde bazal, parabazal, intermediar, aşağı ve yukarı süperfisial ve yaklaşık %7.3 oranında keratinize süperfisial hücrelerine rastlanmaktadır. Bu dönemde asidofilik hücrelere rastlanırken her preperatta lökosite rastlamak mümkün olmamaktadır. Anöstrus döneminde intermediar hücrelerde artış görülürken, keratinize süperfisial ve parabazal hücre oranları nerdeyse aynı kalmaktadır (11). Bu çalışmada kedilerde vaginal sitoloji yöntemiyle kedilerde seksüel siklus dönemlerinin saptanması ve bu bulguların ovaryum bulguları ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Araştırma amacıyla Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Doğum ve Jinekoloji Anabilim Dalı Kliniği ne, ovariohisterektomi (OHE) operasyonu amacıyla getirilen toplam 83 adet dişi kedi kullanılmıştır. Materyal olarak seçilen kediler, değişik ırklara mensup olup, yaşları 7 ay ile 8 yaş ve ağırlıkları, 1.5 ile 5 kg arasında değişmiştir. Anabilim Dalı Kliniği ne getirilen kedilerin öncelikle genel muayeneleri yapılmış ve ardından rutin genel anestezi protokolü uygulanmıştır (0.02mg/kg Atropin Sülfat; 1-2 mg/kg Xylazine; 10mg/kg Ketamin hidroklorür). Anestezideki dişi kediler, operasyon öncesinde, arkaları hafifçe yukarıya gelecek şekilde tespit edildikten sonra vaginal smear örneği alınmıştır. Smear alma işlemi için, yaklaşık 10 cm uzunluğundaki steril swap kullanılmıştır. Fizyolojik tuzlu su ile nemlendirilen swap, rima vulvadan girilerek, yaklaşık 1 cm kadar cranio-dorsal yönde ilerletilip kendi ekseni etrafında döndürülerek geri çekilmek suretiyle sitolojik örnek elde edilmiştir. Lam üzerine yayılarak, operasyon bitiminde boyanmak üzere tespit edildikten sonra Papanicolaou (10), boyama yöntemi ile boyanmıştır. Elde edilen preparat kaplama medyumu damlatılarak lamel ile kapatılıp hazır hale getirilmiştir. Örnekler mikroskop altında 10x20 ve 10x40 büyütmelerde incelenmiş ve farklı sahalarda toplam 100 adet hücre sayılarak değerlendirme yapılarak elde edilen bulgular kaydedilmiştir. Ovariohisterektomi uygulanan kedilerden alınan ovaryumların taşıdığı fonksiyonel yapılar ile kornu uterilerin durumu makroskopik olarak incelenmiştir. Değerlendirme Reiter in kriterlerine uygun olarak yapılmıştır (11): Anöstrus (AÖ); Fonksiyonel yapı (Follikül, korpus luteum) yok, az sayıda korpus albikans bulunabilir. Kornu uteriler; yan taraftan düz veya silindirik ince duvarlı, yaklaşık saman sapı kalınlığındadır. Proöstrus (PÖ); Küçük folliküller (>1.5 mm) birden 10 a kadar değişebilen sayıda bulunabilir. Kornu uteriler; silindirik, burgu tarzında silindirik, kalın duvarlı, saman sapı ile kurşun kalem kalınlığındadır. Östrus (Ö); Yaklaşık 8 adet kadar büyük follikül ( mm) bulunabilir. Ayrıca ovaryumlarda küçük folliküller, hemorajik folliküller ve korpus hemorajikum yer alabilir. Kornu uteriler burgu biçiminde silindirik ve ince kurşun kalemden daha kalındır. Metaöstrus (MÖ); Korpora lutea (2-3 mm) kırmızı, kırmızı- kahverengi, sarı-beyaz, kubbemsi yapıda olup, sayısı 0-7 arasında olan küçük folliküller de görülür. Kornu uteriler; burgu tarzında silindirik, saman sapından kurşun kalem kalınlığına kadar değişik boyutlarda görülebilir. Kornu uteriler anılan kriterlere uygun olarak sınıflandırıldıktan sonra ayrıca bir cetvel yardımı ile