ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOKTORA TEZİ HALOALKALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU, AMİLAZ, SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA KULLANILABİLİRLİĞİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2008 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ

2 FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HALOALKALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU, AMİLAZ, SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA KULLANILABİLİRLİĞİ DOKTORA TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu tez 04/01/2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği İle Kabul Edilmiştir. İmza İmza. İmza. Prof. Dr. Burhan ARIKAN DANIŞMAN İmza... Prof. Dr. Ömer ÇOLAK ÜYE İmza Doç.Dr.Gökhan CORAL ÜYE Doç.Dr. Hatice Kormaz Güvenmez ÜYE Doç.Dr.Mutlu Nisa Ünaldı Coral ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü İmza-Mühür Bu çalışma Ç.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FBE 2003-D-18 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ DOKTORA TEZİ HALOALKALOFİL BACILLUS SP. İZOLASYONU, AMİLAZ SELÜLAZ VE KSİLANAZ ENZİMLERİNİN ÜRETİMİ, KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULAMALARDA KULLANILABİLİRLİĞİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Yıl: 2008, Sayfa:186 Jüri:Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Doç.Dr. Gökhan CORAL Doç.Dr. Mutlu Nisa ÜNALDI CORAL Bu çalışmada, Van Gölü topraklarından izole edilen haloalkaloflik Bacillus sp. suşlarından amilaz, selülaz ve ksilanaz enzimi izolasyonu ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla bakterilerin besiyerlerinde üreme ve enzim üretme yetenekleri ve aktivite gösterdiği optimum sıcaklık, ph ve NaCl konsantrasyonu saptanmıştır. Bacillus sp. AB-17 suşundan üretilen amilazın SDS-PAGE analizinde iki band elde edilmiş ve moleküler ağırlıkları ve 58 kda olarak belirlenmiştir. Enzim, optimum aktivitesini 150ºC ve ph 10.5 da gösterirken, M NaCl de ortalama %67 lik aktivite ile halofil özellikte olduğu saptanmıştır. Bacillus sp.c-14 suşundan izole edilen endoglukanaz enzimin molekül ağırlığı 61 kda olarak belirlenmiş, optimum aktivite ise 50 C de ph 11.0 de görülmüştür. Maksimum enzim aktivitesi %20 (3.4M) NaCl konsantrasyonunda (%133) elde edilmiştir. Bacillus sp X13 suşundan elde edilen ksilanaz enziminin optimum aktivitesi 40ºC de ph 6.0 da gerçekleşmiştir. Enzim ph aralığında 15 dk süreyle aktivitesini %100 koruyabilmiş, SDS-PAGE analizinde ise moleküler ağırlıkları 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kda olan dört band tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre AB-17 amilaz enziminin Nişastanın sıvılaştırılması ve tekstil endüstrisinde nişastanın uzaklaştırılmasında kullanılabilecek bir enzim olduğu belirlenmiştir. C14 endoglukanaz enziminin tuzlu ortamlarda yüksek düzeyde aktivite göstermesi, halo-stabilitesinin yüksek olması ve deterjanlara dirençli olması bu enzimin tekstil uygulamaları, kağıt endüstrisi ve hayvan yemi üretimi gibi uygulamalarda kullanılabileceğini göstermektedir. X13 Ksilanaz enzimi ise besin endüstrisinde prebiyotik üretiminde ve selülaz ve pektinaz enzimine gerek kalmadan meyve suyu üretiminde kullanılabileceği önerilebilir. Anahtar Kelimeler: Bacillus, amilaz, selülaz, ksilanaz,, haloalkalofil I

4 ABSTRACT Ph.D. THESIS ISOLATION OF HALOALKALOPILIC BACILLUS SP., PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND DETERMINATION OF BIOTECHNOLOGICAL APPLICATION OF THEIR AMYLASE, CELLULASE AND XYLANASE DEPARTMENT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor:Prof. Dr. Burhan ARIKAN Year: 2008, Page: 186 Jury: Prof. Dr. Ömer ÇOLAK Doç.Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ Doç.Dr. Gökhan CORAL Doç.Dr. Mutlu Nisa ÜNALDI CORAL In this study, the amylase, cellulase, xylanase enzymes from Bacillus sp. strains isolated from Van lake soil were produced and characterized. The strains were tested for determination of temperature, ph range and NaCl concentration for growth and enzyme production on plate. Molecular weight of the amylase from Bacillus sp.ab-17 was estimated as and 58 kda on SDS-PAGE. The optimum activity was obtained at 150 o C, ph the enzyme also presented halophilic properties with an activity around 67% between M NaCl concentration. Molecular weight of the Endoglucanase from Bacillus sp.c14 was detected as 61kDa on SDS-PAGE, and the optimum enzyme activity was obtained at 50 o C, ph Maximum endoglucanase activity (%133) was recorded at 20% (3.4M) NaCl. On the other hand the xylanase from Bacillus sp.x13 presented and optimum activity at 40 o C and ph 6.0. The enzyme was 100% stable between ph for 15 min. The enzyme was consist of 4 unit as 108.4, 95.5, 80.6 ve 68.5 kda on SDS-PAGE. The results showed that the amylase AB-17 is a relevant enzyme for desizing processes in textile industries. The increased activity of C14 endoglucanase in high saline conditions, high halostability, resistance to detergents makes the enzyme C14 endoglucanase appropriate for textile, paper, animal feed preparation processes. X13 Xylanase enzyme could also be used for prebiotic preparation in food industries and fruit juice production without needing pectinase and cellulase usage. Key Words: Bacillus, amylase, cellulase, xylanase, haloalkalophile II

5 TEŞEKKÜR Çalışmamın her aşamasında bana yardımcı olan, bilgi ve deneyimleriyle yol gösteren danışman hocam sayın Prof. Dr. Burhan ARIKAN a, Moleküler Biyoloji Anabilim Dalı Başkanı sayın Prof.Dr.Ömer ÇOLAK a, sayın Prof.Dr.Sadık DİNÇER e ve Doç.Dr.Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ e çok teşekkür ederim. Bazı suşların dizi analizlerinde yardımlarını esirgemeyen Dr.A.Akın DENİZCİ ye, bölüm teknisyeni sayın Mustafa TOMAK a ve bölüm sekreteri sayın Mediha KURTOĞLU na teşekkür ederim. Ayrıca bütün çalışmalarım süresince manevi desteğini esirgemeyen annem Meliha, eşim Arife ve kızım Irmak Zehra AYGAN a sonsuz teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA NO ÖZ...I ABSTRACT...II TEŞEKKÜR...III İÇİNDEKİLER...IV ÇİZELGELER DİZİNİ...XII ŞEKİLLER DİZİNİ...XIV SİMGELER VE KISALTMALAR...XVI 1.GİRİŞ Enzimler ve Bazı Özellikleri Enzimlerin Sınıflandırılması Enzimlerin Numaralandırılması ve Sınıflandırılması Amilazlar (Amylase) Amilazların Bazı Uygulama Alanları Selülazlar (Endoglukanaz) Kompleks Olmayan Selülaz Sistemleri Kompleks Selülaz sistemleri (Selülozom) Selülazların Bazı Uygulama Alanları Gıda endüstrisinde Selülazlar İçecek ve Şarap Endüstrisinde Selülazlar Hayvan Yemi Endüstrisinde Selülazlar Tekstil Endüstrisinde Ksilanazlar (Xylanase) Ksilanazların Bazı Uygulama Alanları Ekstremofilik Enzimler (Ekstremozimler) Bacillus Cinsi Elektroforez Uygulamaları Jel Elektroforezleri...24 IV

7 Sodyum Dodesil Sülfat-Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE) Doğal (Native) Jel Elektroforezi Protein İzolasyonu Çöktürme ile Proteinlerin İzolasyonu TCA ile Çöktürme Nötral tuzlar ile Proteinlerin Çöktürülmesi Organik Çözücülerle Proteinlerin Çöktürülmesi Non-İyonik Organik Polimerlerle Çöktürme Kromatografi İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) Araştırmanın Amacı ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD Materyal Bakteri İzolasyonunda ve Teşhisinde Kullanılan Besiyerleri LB Agar M9-Nişasta Agarı CMC-Agar Besiyeri CEPM (Selüloz Enzim Üretimi Besiyeri) Ksilanlı Besiyeri Nutrient Broth Kullanılan Çözeltiler NaOH Çözeltisi Etanol Na 2 CO 3 Çözeltisi Lügol Kongo Kırmızısı NaCl Çözeltisi Sodyum Fosfat Tamponu (0.1 M)...53 V

8 Sitrat Tamponu Sodyum-Fosfat Tamponu Glisin-NaOH Tamponu Borax-NaOH Tamponu Dinitro Salisilik Asit (DNS) Elektroforezde Kullanılan Solüsyonlar Solüsyon A (Akrilamid Solüsyonu) Solüsyon B (4X) Solüsyon C (4X) Amonyum Persülfat (AMPS) Elektroforez Tamponu Örnek Yükleme Tamponu SDS Jel boyama (Staining) Solüsyonu SDS Jelden Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu SDS-PAGE nde Zymogram Analizleri İçin Renatürasyon Solüsyonları Nişastalı Glisin-NaOH Tamponu Çözeltisi İnce Tabaka Kromatografisi Solüsyonları Bütanol-Asetik Asit-Distile Su %20 lik Sülfirik Asit (H 2 SO 4 ) Çözeltisi Kloroform-Asetik Asit-Distile Su Çözeltisi Anilin-Difenilamin-Ortofosforik Asit Çözeltisi D-Glikoz Çözeltisi Maltoz Çözeltisi Ksiloz Çözeltisi S rrna Dizisinin Belirlenmesi İçin Kullanılan Solüsyonlar DNazol Direct TAE (Tris-Asetik Asit-Edta)Tamponu...59 VI

9 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) için Kullanılan Primerler Metod Bakteri İzolasyonu ve Teşhisi Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu Bakteri Teşhisi Bakteri Teşhisi İçin Genomik DNA Hazırlanması Agaroz Jel Hazırlanması Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) için Reaksiyon Koşulları Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Koşulları S rdna Dizisinin Belirlenmesi Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi Katı Besiyerlerinde Amilaz Aktivitelerinin Belirlenmesi Katı Besiyerlerinde Selülaz Aktivitelerinin Belirlenmesi Katı Besiyerlerinde Ksilanaz Aktivitelerinin Belirlenmesi Bakterilerin Katı Besiyerinde Ürediği ve Enzim Sentezlerinin Gerçekleştiği ph Aralığının Saptanması Optimum Üreme ve Enzim Prodüksiyon Sıcaklığının Saptanması Optimum Üreme ve Enzim Prodüksiyonu İçin Gerekli Tuz Konsantrasyonlarının Saptanması Sıvı Kültürde Amilaz Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma Sıvı Besiyerinde Selülaz ve Ksilanaz Enzim Üretimi ve Kısmi Saflaştırma...64 VII

10 Enzimin Optimum Aktivite Göstediği ph Değerinin Saptanması Enzimin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerinin Saptanması Enzimin Termal (Sıcaklık) Stabilitesinin Saptanması Enzimin ph Stabilitelerinin Belirlenmesi NaCl ün Enzim Aktiviteleri Üzerine Etkisinin Belirlenmesi İnhibitörlerin Enzim Aktivitesine Etkisi Poliakrilamid Jel Elektroforezinde (PAGE) Moleküler Ağırlık ve Zimogram Analizi Moleküler Ağırlık Analizi İçin SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması Zimogram Analizi İçin SDS-PAGE Sisteminin Hazırlanması Amilaz Enzimi Zimogram Analizi Için Doğal (Nativ) Jelin Hazırlanması Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi SDS-PAGE Jelinin Boyanması ve Zimogram Analizleri Enzim Substrat Reaksiyonu Sonunda Açığa Çıkan Son Ürünlerin Saptanması İnce Tabaka Kromatografisi (TLC) Plakalarının Hazırlanması Amilaz Enzimine Ait Son ürünlerin Saptanması Selülaz ve Ksilanaz Enzimlerine Ait Son Ürünlerin Saptanması BULGULAR VE TARTIŞMA Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu...73 VIII

11 4.2.Bakterilerin Teşhisi Bakterilerin Morfolojik ve Biyokimyasal Özellikleri AB-17 Suşunun 16S rdna Dizi Analizi sonuçları AB-17 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları AB-17 Suşunun Farklı ph Değerleri ve 37 o C de Üreme ve Amilaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular AB-17 Suşunun Farklı Sıcaklık Değerleri ve ph 9.5 deki Üreme ve Amilaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular M9 Nişastalı Agar Besiyerinde Farklı NaCl Konsantrasyonlarında Bakteri Üreme Davranışı ve Enzim Sentezine Ait Bulgular C-14 Suşunun Katı Besiyerinde Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları C14 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı ph Değerleri ve 37ºC de Üreme ve Selülaz Enzim Aktivitesine Ait Bulgular C14 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı Sıcaklık Değerleri ve ph 9.5 teki Üreme ve Enzim Aktivitesine Ait Bulgular C-14 Suşunun Farklı NaCl (%3-20) İçeren CMC li Agarda Üreme ve Enzim Sentezine Ait Bulgular X-13 Suşunun Katı Besiyerinde 37ºC ve Farklı ph eğerlerinde Enzim Sentezleme ve Ürem Davranışına Ait Bulgular X-13 Suşunun Katı Besiyerinde Farklı Sıcaklıklar ve ph 7.0 deki Ürem ve Enzim Sentezlemesine Ait Bulgular AB-17 Amilaz ın Enzimatik Özellikleri AB-17 Amilaz Enziminin Optimum ph Aralığı AB-17 Amilaz Enziminin Optimum Sıcaklık Aktivitesi AB-17 Amilaz Stabilitesi Üzerine ph nın Etkisi AB-17 Amilaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Bulgular...88 IX

12 4.6.5.AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesi Üzerine NaCl ün Etkisi AB-17 Amilaz Enzimi Üzerine İnhibitörlerin Etkisi AB-17 nin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi AB-17 Amilaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları Kısmi Saflaştırılmış C-14 Selülaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Görüntüsü C-14 Selülaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği ph Değeri ve Aralığına Ait Sonuçlar C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine Ait Sonuçlar C-14 Endoglukanaz Enziminin ph Stabilitesine Ait Sonuçlar C-14 Endoglukanaz Enziminin Termal Stabilite Analizlerine Ait Sonuçlar C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesi ve Stabilitesi Üzerine NaCl ün Etkisine Ait Sonuçlar C-14 Endoglukaaz Enzimi Üzerine İhibitör, Şelatör, Deterjan ve Metal İyonlarının Etkisine Ait Sonuçlar C-14 Selülaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi C-14 Endoglukanaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları Kısmi Saflaştırılmış X-13 Ksilanaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği ph Değeri ve Aralığına Ait Sonuçlar X-13 Ksilanaz ın Sıcaklık Optimumu X-13 Ksilanaz Enziminin ph Stabilitesine Ait Sonuçlar X-13 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilitesine Ait Sonuçlar X

13 4.8.5.X-13 Ksilanaz Enzim Aktivite ve Stabilitesi Üzerine NaCl ün Etkisine Ait Sonuçlar X-13 Ksilanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi X-13 Ksilanaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi Bulguları X-13 Ksilanaz Enzimine Ait İnce Tabaka Kromatografi Bulguları SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ EK 1 Nişasta EK 2 Selüloz (Cellulose) EK 3 Ksilan (Xylan) EK 4 İnce Tabaka Kromatografisi Plakalarının Hazırlanması XI

14 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA NO Çizelge 1.1. İnce Tabaka Kromatografileri İçin Kaplama Malzemeleri...37 Çizelge 1.2. İnce Tabaka Kromatografisi için Bazı Geliştirme Çözeltileri...38 Çizelge 3.1. Sitrik asit Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması...53 Çizelge 3.2. Sodyum Fosfat Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması...54 Çizelge 3.3. Glisin-NaOH Tampon Çözeltilerinin Hazırlanması...54 Çizelge 3.4. Ayırıcı Jelin Bileşimi...68 Çizelge 3.5. Dengeleyici Jelin Bileşimi...69 Çizelge 4.1. AB-17 suşunun farklı ph değerleri ve 37 o C de ki üreme ve Enzim Üretme sonuçları...75 Çizelge 4.2. AB-17 suşunun farklı Sıcaklık değerleri ve ph 9.5 de ki Üreme ve Enzim Üretme sonuçları Çizelge 4.3. AB-17 Suşunun Farklı Tuz Konsantrasyonunda Üreme ve Enzim Üretme Sonuçları...76 Çizelge 4.4. C-14 Suşunun Katı Besiyerinde ve Farklı ph Değerlerindeki Üreme ve Enzim Sentezleme Sonuçları...77 Çizelge 4.5. C-14 Bakterisinin Farklı Sıcaklık ve ph 9.5 teki CMC Agar Besiyerindeki Üreme ve Enzim Sentezleme Sonuçları...78 Çizelge 4.6.C-14 Suşunun Katı Besiyeri ve Farklı Tuz Konsantrasyonlarında Üreme ve Enzim Sentezlemesiyle İlgili Sonuçlar...78 Çizelge 4.7. X-13 Suşunun 37ºC ve Farklı ph değerlerinde Üreme ve Enzim Üretimine Ait Sonuçlar...79 Çizelge 4.8. X-13 Suşunun Farklı Sıcaklık ve ph 7.0 de Gösterdiği Üreme ve Enzim Sentezine Ait Bulgular...80 Çizelge 4.9. AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi...91 XII

15 Çizelge C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyon ve Deterjanların Etkisine Ait Sonuçlar Çizelge X-13 Ksilanaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonu ve Deterjanların Etkisi Çizelge Ek 1.1.Amiloz ve Amilopektinin Bazı Özellikleri XIII

16 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA NO Şekil 1.1. Ksilanın Tam Hidrolizinde Gerekli Enzimler ve Etki Bölgeleri...17 Şekil 4.1. AB-17 Suşundan Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle İzole Edilmiş Enzim Çözeltisinin Nişastalı Agar Ortamında Oluşturduğu Aktivite Reaksiyonu...81 Şekil 4.2.AB-17 Suşundan Elde Edilen Amilaz Enziminin Optimum ph sı...82 Şekil 4.3. AB-17 Amilaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Verileri...84 Şekil 4.4. AB-17 Amilaz Enziminin ph Stabilitesi...86 Şekil 4.5. AB-17 Amilaz Enziminin Sıcaklık Stabilitesi...88 Şekil 4.6. NaCl ün AB-17 Amilaz Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisi...89 Şekil 4.7. AB-17 Amilaz Enziminin SDS-PAGE ve Doğal PAGE Zymogram Sonuçları...94 Şekil 4.8. AB-17 Amilaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografisi ile Son Ürünlerinin Saptanması...96 Şekil 4.9. Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle Elde Edilmiş Endoglukanaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu...97 Şekil C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği ph Değerine Ait Sonuçlar Şekil C-14 Endoglukanaz Enziminin Optimum Aktivite Sıcaklığına Ait Sonuçlar Şekil C-14 Endoglukanaz Enzimine Ait ph Stabilite Sonuçları Şekil C-14 Endoglukanaz Enziminin Termal Stabilite Sonuçları Şekil Farklı NaCl Konsantrasyonlarının C-14 Endoglukanaz Enzim Aktivitesine Etkisi Şekil Farklı NaCl Konsantrasyonlarının C-14 Endoglukanaz Enzim Stabilitesine Etkisi XIV

17 Şekil C-14 Selülaz Enziminin Molekül Büyüklüğü ve Zymogram Analizi Şekil C-14 Endoglukanaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografisi ile Son Ürünlerinin Belirlenmesi Şekil Kısmi Saflaştırma Yöntemiyle Elde Edilmiş Ksilanaz Enziminin Katı Besiyerindeki Aktivite Sonucu Şekil X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği ph Değerine Ait Sonuçlar Şekil X-13 Ksilanaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine ait Sonuçlar Şekil X-13 Ksilanaz Enziminin 15 dakika, 60 dakika ve 24 Saat Ön İnkübasyon İşleminden Sonraki ph Stabilitesine Ait Sonuçlar Şekil X-13 Ksilanaz Enziminin Termal Stabilite Sonuçları Şekil X-13 Ksilanaz Enzim Aktivite ve Stabilitesi Üzerine NaCl ün Etkisine Ait Sonuçlar Şekil X-13 Ksilanaz Enzimi Zymogram Analizi Sonuçları Şekil X-13 Ksilanaz Enziminin Hidroliz Ürünlerine ait Bulgular Şekil Ek 1.1.Amiloz Şekil Ek 1.2.Amilopektin Şekil Ek 2.1.Selüloz, β-d-glukoz polimeri Şekil Ek 3.1.Ksilanaz Yapısı Şekil Ek 4.1.Cam Plakaların Yerleştirilmesi Şekil Ek 4.2.Silika Jel karışımının Hazırlanması Şekil Ek 4.3.Silika Jel Karışımının Yayma Aparatına Dökülmesi Şekil Ek 4.4.Silika Jelin Cam Plakalar Üzerine Yayılması Şekil Ek 4.5.Kuruyan Plakaların Magazine Yerleştirilmesi Şekil.Ek.4.6.Plakaların Dikey Pozisyonda Aktivasyon için Fırına Yerleştirilmesi Şekil Ek 4.7.İnce Tabaka Kromatografisinin Uygulanması XV

18 SİMGELER VE KISALTMALAR AMPS : Amonyum persülfat CMC : Karboksimetilselüloz DNS : Dinitrosalisilikasit CMCaz: Karboksimetilselülaz EDTA : Etilendiaminotetraasetik asit L : Litre LB : Luria Bertani M : Molar ml : Mililitre mm : Milimolar mg : Miligram µg : Mikrogram µl : Mikrolitre SDS : Sodyum dodesil Sülfat SDS-PAGE: Sodyum dodesil süüfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi α : Alfa β : Beta rpm : dakikada devir sayısı Tris : 2-Amino-2-Hidroksimetilpropan-1,3-diol TEMED : N,N,N,N-Tetrametil etilendiamin TAE : Tris-Asetik Asit-Edta XVI

19 1.GİRİŞ 1. GİRİŞ Canlı yaşamı sürekli bir değişim temeline dayanmaktadır. İnorganik maddeler dünyadaki yaşamı oluşturup karmaşık yapıları meydana getirdikten sonra tekrar cansız yapılara dönüşürler. Bu süreçte güneş ışığı temel bir rol oynamakta olup, bitkilerin yaşam için gerekli maddelerin sentezini geçekleştirmesini sağlar. Sentezlenen bu bileşikler, hayvansal organizmaların yaşamları için gerekli temel besin kaynağını oluştururlar. Bu bileşiklerin sentezi veya yıkımı mucize moleküller olarak adlandırılan enzimler tarafından gerçekleştirilirler. Enzimler, doğal olarak canlılar tarafından sentezlenen protein yapısında ya da bir kısmı protein olan biyo-moleküllerdir. Enzimler, binlerce yıldır içecek, ekmek ve peynir yapımı gibi işlemlerde varlığı ve görevi bilinmeden kullanılmıştır. İlk bulgular eski Mısıra kadar dayanmaktadır. Yakın tarihte ise Doğu ülkelerinde birçok gıda fermentasyonu için ipliksi mantarlar enzim kaynağı olarak kullanılmaktadır. Batıda 1896 da gerçek modern mikrobiyal enzim teknolojisi takadiastase ın ticareti ile başlamıştır. Bu Doğudan Batı toplumuna önemli bir teknolojik transferdir (Smith, 1996). Dericilikte, derinin yumuşatılması köpek ya da güvercin dışkıları ile muamele edilerek yapılırken, bu yüzyıl başlarında Alman kimyacı Otto Röhm köpek dışkılarındaki aktif bileşenlerin proteinleri parçalayan proteaz enzimi olduğunu, hayvansal organlardan bu enzimin elde edilebileceğini ve bu işlemlerde köpek dışkısı yerine kullanılabileceğini ortaya koymuştur. Böylece 1905 den itibaren domuz ve sığır pankreasları sosyal açıdan ve güvenilir bir enzim kaynağı olarak ön plana çıkmıştır (Smith, 1996). Bitkisel kaynaklı enzimlerden bira üretiminde kullanılan malt amilazı içecek endüstrisinde önemli bir yer tutmaktadır (John, 1987). Tarihsel gelişim açısından bakıldığında enzimlerin çok farklı kaynaklardan elde edildiği görülmektedir. Bunlar bitkisel, hayvansal ya da endüstriyel anlamda ihtiyacı karşılayabilen mikrobiyal kaynaklı enzimlerdir (Gupta ve ark, 2003). Bugüne kadar yaklaşık 2500 farklı enzim tanımlanmış ve bunların ancak %10 u ticari alanda kullanım için kendilerine yer bulmuşlardır. Bu %10 içinde 25 tanesi nişasta sanayi ile deterjan katkı maddesi olarak kullanılmış olup, ticari alanda yararlanılan bütün 1

20 1.GİRİŞ enzimlerin %80 ini oluşturmaktadırlar (Woodley, 2000). Bitkisel ve hayvansal enzimlerin endüstriyel ihtiyacı karşılayamaması, bu alandaki ilginin giderek artan bir şekilde mikrobiyal enzimlere yönelmesini sağlamıştır. Mikroorganizmalar, biyokimyasal çeşitlilikleri ve genetik manipülasyonlara uygunluğu gibi sebeplerden dolayı mükemmel bir enzim kaynağı olarak değerlendirilmektedir (Rao ve ark, 1998). Günümüzde endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %90 ı mikroorganizmaların fermentasyonu ile üretilmektedir (Godfrey ve West, 1996). Bacillus cinsi bakteriler, toprakta, hayvan dışkılarında ve bitkisel ürünler üzerinde yaygın olarak bulunurlar. Bu cinsin bireylerinin çoğu zararsız, izolasyonu ve teşhisi kolay, hızlı büyüme oranı ile fermentasyon süresi kısa, genel olarak güvenli olması, sentezledikleri proteinlerin dış ortama salgılama kapasiteleri gibi birçok sebepten dolayı cazip endüstriyel organizmalardır. Çünkü gram negatif bakteriler, ürettikleri proteinleri protoplazmalarında ya da periplazmik boşluklarında biriktirirler. Bu da üretilen ürünün izolasyonunu güçleştirerek suştan birden fazla kez yararlanılmasını engeller. Ayrıca sentezlenen ürünlerin organizmaya karşı toksik etki oluşturması da söz konusudur. İntrasellüler ortamda sentez ürünlerinin biriktirilmesi çözünmez protein oluşumu, yanlış protein katlanmaları ve etkin olmayan disülfit bağ formasyonu gibi problemleri beraberinde getirmektedir. Ayrıca gram negatif bakteriler, insanlara toksik olan endotoksin üretimi ve intrasellüler protein üretimi ile izolasyon ve saflaştırma için ekstra maliyet oluşturmaktadırlar (Schallmey ve ark, 2004). Mantarlardaki aflatoksin gibi toksik ya da alerjen (Sander ve ark, 2000) bileşik üretimi de göz önünde bulundurulduğunda, gram pozitif bakterilerin, özellikle Bacillus türlerinin endüstriyel enzim üretiminde öncelikli olarak tercih edilmesine neden olmaktadır. Dünya geneli incelendiğinde endüstriyel enzimlerin ticari pazar payının yaklaşık 1,6 milyar dolar olduğu tahmin edilmektedir (Schallmey ve ark, 2004). Bu enzimlerin kullanım alanlarına göre dağılımına bakıldığında, %29 unun gıda endüstrisinde, %15 inin hayvan yemi sektöründe ve %56 sının ise genel amaçlı teknik alanlarda yer aldığı görülmektedir (Outtrup ve Jorgensen, 2002). 2

21 1.GİRİŞ Endüstride kullanılan enzimlerin yaklaşık %75 ini hidrolitik enzimler oluşturmaktadır. Proteaz grubundaki enzimler kullanımda ilk sırayı alırken, karbohidratları parçalayan enzimler ikinci sırada yer almaktadır (Harwood, 1992; Bhat, 2000). Karbonhidrat parçalayan enzimlerden amilazlar, enzim piyasasında yaklaşık %25 lik bir paya sahiptir (Sidhu ve ark, 1997; Rao ve ark, 1998). Son zamanlardaki en etkin uygulamaları kağıt hamurunun beyazlatılması için ksilanazların endüstride kullanılması Viikari ve arkadaşlarının (1986) buluşu ile artışa geçmiştir. Hidrolazlardan selülozlar ise selülozik materyallerin şekerlere dönüştürülerek biyo-etanol gibi biyolojik temelli ürünlere dönüştürülmesi söz konusu olduğunda enzim piyasasındaki payı ciddi bir şekilde artması beklenmektedir (Cherry and Fidantsef, 2003). Sellülazların bitkisel atıkların hidrolizinde kullanılması durumunda Amerika Birleşik Devletleri nde yıllık 400 milyon dolarlık bir ticaret hacmine sahip olabileceği tahmin edilmektedir. Bu durum, endüstriyel enzim pazarının %33 lük bir orana yükselebileceğini göstermektedir (Percival Zhang ve ark, 2006). 1.1.Enzimler ve Bazı Özellikleri Biyolojik katalizör olan enzimler hücre içerisinde üretilmelerine rağmen birçoğu hücre dışına salınarak aktivitelerine devam ederler. Enzimlerin bu özellikleri endüstriyel uygulamalarda kullanılmalarının yolunu açmıştır. Enzimin aktivasyonu, sahip olduğu katalitik yapısından kaynaklanmakta olup aktivasyonunu reaksiyon esnasında enzim tüketilmeksizin gerçekleşir. Enzimin etki gösterdiği maddeye substrat adı verilir ve enzimin adlandırılmaları etkilediği maddenin isminin sonuna az (-ase) eki getirilerek yapılır. Bütün enzimlerin şifresi genler üzerindedir. Dolayısıyla amino asit dizilimi kendine özgüldür. Doğada her metabolik reaksiyon enzimler tarafından kontrol edilir. Enzim reaksiyon sırasında değişikliğe uğramadan yapısını korur ve başka bir substrat ile tekrar reaksiyona girer. Kimyasal katalizör maddelerin büyük çoğunluğu birçok 3

22 1.GİRİŞ reaksiyonu katalizleyebilir. Fakat bunlar genellikle hem özgül hem de seçici değildirler. Buna rağmen enzimler oldukça selektif olup spesifik reaksiyonlara katalizör etkisi yaparlar. Bu özellik, enzim molekülünün şeklinden kaynaklanır. Enzim substrat ilişkisi kilit-anahtar uyumu ile açıklanmaktadır. Enzimlerin bazıları iki farklı kısımdan oluşur. Bunlar Apoenzim (protein kısım) ve Koenzim (Organik ya da İnorganik kısım) yapılarıdır. Ne Koenzim (vitaminler olabilir) ne de apoenzim tek başına işlevsel değildir. Bazı enzimler ise etkinlikeri için belirli iyonlara ihtiyaç duyarlar. Örneğin tükrükteki amilaz nişastayı yalnız klor (Cl -1 ) iyonlarının bulunduğu ortamda parçalayabilir. Canlı bünyesinde bulunan eser elementler, mangan (Mn +2 ), bakır (Cu +2 ), çinko (Zn +2 ), demir (Fe +2 ) ve diğer elementler bu enzimatik işlevlerde aktivatör olarak kullanılır. Ayrıca bazı enzimlerin etkinliği yapılarındaki metal iyonlarına bağlıdır. Yani koenzim kısmı kalsiyum (Ca +2 ), potasyum (K + ), magnezyum (Mg +2 ), çinko (Zn +2 ) ise kofaktör adını alır. Koenzim kısmının organik olduğu durumlarda, bu kısmın apoenzime kovalent bağlarla bağlanması söz konusu ise prostetik grup olarak adlandırılır. Koenzim (Prostetik grup) ve apoenzim birlikteliğine holoenzim denir. Bir enzim molekülü genel anlamda globüler yapıda bulunur ve molekül içi veya arası bağlar ile sekonder ya da tersiyer yapıda tutulur. Proteinlerin bu yapıları sıcaklık ve ph daki değişmeler ile bozulabilir. Bu yüzden, bir enzimin katalitik aktivitesi ph ve sıcaklığa duyarlıdır. Sıcaklığın yükselmesi, reaksiyona girecek moleküllerin kinetik enerji ile yüklenmesini sağlar. Böylece etkileşime girecek moleküllerin reaksiyon için karşılaşma şansını artırır. Her enzimin katalitik aktivitesinin en yüksek seviyede olduğu bir sıcaklık değeri vardır. Buna optimal sıcaklık denir. Bu değerden yüksek sıcaklıklarda enzim yapısı molekül içi veya arası bağların kopması sonucu bozulmaya başlar. Aynı zamanda her enzimin en iyi çalıştığı bir ph aralığı (optimum ph) mevcuttur. Bu, enzimin molekül yapısının ph daki değişime bağlı olarak etkilenmesinden kaynaklanmaktadır. Bazı maddeler ise enzimlerin aktif bölgelerinin tutulması sonucu enzimin deformasyonunu sağlayarak, katalitik aktivitesini düşürebilir. Hatta tamamen durdurabilir. Bu tür maddelere inhibitör adı verilir (Aehle,2004). 4

23 1.GİRİŞ 1.2.Enzimlerin Sınıflandırılması Bilinen enzimlerin sayısı 1950 lerin sonuna kadar çok hızlı bir şekilde artmış ve birçok kişinin aynı enzime farklı isimler vermelerinden dolayı adlandırmada karmaşa ortaya çıkmıştır. Aynı zamanda adlandırılması yapılan birçok enzimin katalizlediği reaksiyonun tabiatı hakkında herhangi bir bilgi içermemesi de bu karmaşayı artırmaktaydı. Bu karışıklığın düzenlenmesi amacı ile 1956 yılında bir Uluslararası Enzim Komisyonu (International Comission on Enzyme) kurulmuştur. Enzimlerin sınıflandırılması ve isimlendirilmesi için kabul edilen sistem 3 genel prensibi içermektedir. Birincisi, -az (-ase) eki ile sonlanan enzim isimleri, tek enzimler için kullanılmalıdır. Bu durum birden fazla sistem içeren enzimler için kullanılmamalıdır. İkincisi, enzimler katalizledikleri reaksiyonlara göre sınıflandırılır ve adlandırılırlar. Son prensip ise katalizlenen reaksiyonların tipine göre adlandırılır ve sınıflandırılır. Bu sistem enzim komisyonu (E.C.) tarafından belirlenen kod numaraları kullanılarak enzimlerin açık bir şekilde tanımlanmalarını sağlar. Bir enzimin genellikle iki ismi mevcuttur. Biri sistematik yada tavsiye edilen, diğeri ise yaygın olarak kullanılan, daha kısa ve kolayca uygulanan genel ismidir. Bir enzim, sistematik ismi ve E.C. kod numarası ile tanımlandıktan sonra önerilen isim herhangi bir karışıklık olmaksızın sorunsuzca kullanılabilir. Bu tür yaklaşımlar literatürlerde yaygın olarak uygulanmaktadır (Aehle, 2004) Enzimlerin Numaralandırılması ve Sınıflandırılması Enzim komisyonu raporuna göre enzimler katalizledikleri reaksiyona göre 6 ana sınıfa ayrılır ve kod numaraları ile tanımlanırlar. E.C. ön eki ile başlayan numaralar noktalarla birbirinden ayrılmış 4 temel öğeyi ifade ederler. 1. İlk rakam, enzimin altı sınıftan hangisine ait olduğunu belirtir. 2. İkincisi, enzimin alt sınıfını (Subclass) ifade eder. 3. Üçüncü rakam, ikinci alt grubu (Sub-Subclass), 5

24 1.GİRİŞ 4. Dördüncü rakam ise enzimin sub-subclass içindeki seri numarasını ifade eder. Örneğin E.C fungal alfa-amilaz enziminin kod numarası ile ifade edilmesidir. Bu sisteme göre ilk rakamın ifade ettiği sınıflar kısaca aşağıdaki gibidir. 1. Oksidoredüktazlar, 2. Transferazlar, 3. Hidrolazlar, 4. Liyazlar, 5. İzomerazlar, 6. Ligazlar. (Aehle, 2004) 1.3.Amilazlar (Amylase) Amilazlar, glikoz birimlerinden oluşan nişasta ve benzer polimer moleküllerini parçalayan glikozid hidrolaz olarak da bilinen enzimlerdir. Doğada bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalarda bulunur ve amiloz, amilopektin ve glikojeni oluşturan glikoz birimleri arasındaki glikozidik bağları parçalayabilme yeteneğine sahiptir. Amilaz enzimleri, endoamilaz ve ekzoamilaz olmak üzere iki kategoriye ayrılabilirler. Endoamilazlar nişasta molekülünü, farklı uzunluklarda düz ya da dallanmış oligosakkarit oluşturacak şekilde rastgele parçalarlar. Ekzoamilazlar ise indirgen olmayan uç kısmından itibaren kısa son ürün bırakacak şekilde parçalar (Gubta ve ark, 2003). Son yıllarda, nişasta ve benzeri polisakkaritleri parçalayan birçok yeni enzimler tespit edilmiştir. Polisakkarit yapıları oluşturan α-1,4 ya da α-1,4 ve/veya α- 1,6 bağlarını parçalayabilen, ticari öneme sahip mikrobiyal veya başka kaynaklı enzimler 6 sınıfa ayrılabilirler (Fogarty ve Kelly, 1979). Bunlar: a) α-1,4 bağlarını hidrolize edebilen ve α-1,6 dallanma noktalarını atlayabilen zincir üzerinde rastgele aktivasyon gösterebilen (Endoakting) α-amilaz enzimleri (E.C: ) 6

25 1.GİRİŞ b) α-1,4 bağlarını hidrolize edebilen fakat α-1,6 dallanma noktalarını geçemeyen β-amilaz gibi nişasta zincirinin indirgen olmayan ucundan itibaren parçalayan (Ekzoakting) ve maltozu son ürün olarak açığa çıkaran enzimler (E:C: ). c) Glukoamilaz (amiloglikozidaz) gibi α-1,4 ve α-1,6 bağlarını parçalayabilen ekzoakting amilazlar (γ-amilaz) (E.C: ). d) Sadece α-1,6 bağlanmalarını parçalayabilen Pullulanaz ve diğer dallanmaları parçalayan enzimler (örn, E.C: ). e) α-glukozidaz gibi özellikle amiloz ve amilopektin üzerine etki eden diğer enzimler sayesinde meydana gelmiş kısa zincirli oligosakkaritler üzerindeki α-1,4 bağlanmalarını hidrolize eden enzimler (E.C: ). f) Nişastayı, Siklodekstrin (Cyclodextrin) adı verilen, indirgenmeyen siklik D-glukozil (non-reducing D-Glucosyl) polimerlerine parçalayan enzimler (E.C: ) (Cyclodextrin Producing Enzyme) (Reddy ve ark, 2003;Aiyer, 2005). Günümüzde amilazlar, bitki, hayvan ve mikroorganizmalar olmak üzere birçok farklı kaynaktan elde edilmelerine rağmen, mikrobiyal kaynaklı olanlar endüstriyel alanda kullanılmaktadır. Nişasta endüstrisinde enzim kullanımı nedeniyle nişastanın kimyasal uygulamalarla parçalanması işlemine son verilmiştir (Gupta ve ark, 2003). Özellikle α-amilazlar endüstride kullanılan enzimlerin en popüler ve önemli formlarından biridir Amilazların Bazı Uygulama Alanları Yaklaşık on yıldır unlu mamüllerde amilazlar yaygın bir şekilde yer bulmuştur. Özellikle ekmek ve unlu mamüllerde daha iyi kabarma, renk ve daha yumuşak ürün eldesi amacıyla kullanılmaktadır. Amilaz ilavesi ile fermentasyon oranı artmakta, hamur viskozitesi azaltmakta, ürün hacmi ve hamurda şeker miktarı yükseltilerek ekmek kalitesi artırılmaktadır. Ayrıca son zamanlarda ürünlerde raf ömrünü uzatıcı olarak da değerlendirilmektedir. Alfa amilazların en büyük pazarı, glukoz ve fruktoz gibi nişastanın parçalanmasından açığa çıkan ürünlerin üretimin alanıdır. Tatlandırıcı 7

26 1.GİRİŞ özelliklerinden dolayı alkolsüz içecek endüstrisinde çok büyük oranlarda kullanılırlar. Aynı zamanda içecek endüstrisinde, alkol fermentasyonu için nişastanın sıvılaştırılması ve şekerleştirilmesi için kullanılmaktadır. Tekstil endüstrisinde nişasta, haşıllama işleminde kullanılır. İpliğin kırılmasını önlemek amacı ile sonradan giderimi kolay koruyucu bir tabaka uygulaması yapılır. Bu amaçla nişasta ile muamele edilmesine sizing, nişastanın uzaklaştırılmasına ise desizing (Haşıllama) denir. Haşıllama dokuma esnasında tekstile direnç kazandırır. Dokuma işleminden sonra nişastanın uzaklaştırılmasını takiben yumuşatma ve boyama işlemi başlar. Nişastanın giderilmesi ise genellikle α-amilaz uygulaması ile gerçekleştirilir (Gupta ve ark, 2003; Aiyer, 2005). Alfa-amilazların kağıt ve kağıt hamuru endüstrisinde kullanımı, kağıt kaplamasında nişastanın modifikasyonu iledir. Tekstilde olduğu gibi, kağıdın nişasta ile kaplanması kağıdı mekanik hasarlara karşı korumaktadır. Aynı zamanda son ürün halindeki kağıdın sertliğini, direncini ve kalitesini de artırmaktadır. Doğal nişastanın viskozitesi kağıt işlemleri için çok yüksektir. Nişastanın istenilen yoğunluğa ulaşması, amilaz enzimi kullanılarak nişastanın belirli düzeyde hidrolizasyonu sonucu elde edilir. Deterjan endüstrisinde ise, nişasta temelli kirliliklerin temizlenmesi amacı ile alfa amilaz enzimi detejanlarda katkı maddesi olarak kullanılmaktadır. Özellikle sıvı deterjanların %90 dan fazlasında amilaz enzimi vardır. Son yıllarda bulaşık makinelerinde kullanılan deterjanlara her geçen gün daha fazla amilaz enzimi katılmaya başlanmıştır. Deterjanlardaki enzim ilavelerinin en büyük avantajı enzimsiz deterjanlara nazaran daha iyi temizleme sağlaması ve ortam koşullarını yumuşatmasıdır. İlk üretilen enzimsiz deterjanlar, solunduğunda sağlığa zararlı olduğu ve çin porselenleri ile ahşap malzemelere zarar verdiği görülmüştür. Medikal ve klinik kimya analizleri ile biyoteknoloji uygulamalarında da amilaz enzimi kullanılmaktadır. Amilaz uzun moleküllü oligosakkaritlerin saptanmasında gümüş nitrat testinden daha başarılı olarak kullanılmaktadır (Giri ve ark,1990). Aynı zamanda elektrolit, izolatör ve yarı-iletken kapasitörlü biyosensörlerde de amilaz enzimi kullanılmaktadır (Menzel ve ark, 1998). 8

27 1.GİRİŞ 1.4. Selülazlar (Endoglukanaz) Selülazlar, selülozu glikoza parçalayabilme kapasitesindeki hidrolitik enzim grubudurlar. Mikroorganizmalar, bitkiler ve hayvanlar (memeliler hariç) tarafından üretilirler ve genellikle bir selülaz sistemi olarak birden fazla farklı enzimden oluşurlar. Selülaz sistemi bileşenleri, başlangıçta katalitik etki şekillerine göre sınıflandırılırken, günümüzde sınıflandırma yapısal özellikler temeli dikkate alınarak yapılmaktadır. Üç ana enzimatik aktivite tipi söz konusdur. Bunlar: a) Endoglukanazlar (endo-1,4-β-glucanases, yada 1,4-β-D-glucan-4- glucanohydrolases, EC ). b) Ekzoglukanazlar (Sellodextrinazlar, 1,4- β-d-glucan glucanohydrolases) (EC ) ve Sellobiyohidrolazlar (exo-1,4-β-glucanases, ya da 1,4-β-Dglucan cellobiohydrolases, EC ). c) Sellobiyazlar (β-glucosidases, yada β-d-glucoside glucohydrolases, EC ). Endoglukanazlar, selülozu meydana getiren polisakkarit zincirinin iç bölgelerinde rastgele hidroliz yaparlar ve değişik uzunlukta oligosakkaritler meydana getirirler. Ekzoglukanazlar ise selüloz zincirinin indirgenen ve indirgenmeyen ucundan itibaren sırasal olarak hidroliz yaparlar ve son ürün olarak glukoz (glukanohidrolaz) ya da sellobioz (Sellobiohidrolaz) açığa çıkarırlar. Ekzoglukanazlar aynı zamanda mikrokristal selülozu da hidrolize etmektedirler. β- Glikozidazlar sellodekstrin ve sellobiozu glikoza parçalayan enzimlerdir. Selülazların çoğunluğunun genel özelliği, hem katalitik hemde karbonhidrat bağlayan yapıları içeren modüler bir şekilde olmalarıdır. Selüloz bağlayan modül (CBM: Cellulose Binding Module) çözünmeyen selülozda muhtemelen katalitik bölgeyi substrata yaklaştırıp selülozun hidrolizini kolaylaştırmaktadır. CBM özellikle ekzoglukanazların hidroliz işlevinin başlangıcında önemlidir. Selüloz sistemleri, her bir enzimin kendi bireysel aktivitelerinin toplamından daha yüksek bir sinerjik aktiviteye sahiptir. Sinerjik aktivitenin 4 formu bildirilmiştir. Bunlar: 9

28 1.GİRİŞ a) Endoglukanazlar ve ekzoglukanazların arasındaki endo-ekzo sinerji. b) Selüloz zincirinin indirgenen ve indirgenemeyen uçlarından ekzoglukanaz uygulamaları arasındaki ekzo-ekzo sineji. c) İlk iki enzimin son ürünü olarak sellobiozu (ve Sellodekxtrin) alan β-glukozidaz ve ekzoglukanazların arasındaki sinerji. d) Katalitik domain ve CBM arasındaki intra-moleküler sinerji. Selüloz sistemleri sadece üç enzimi de temsil eden bir birliktelik değil, daha çok selülozun etkin hidrolizi için koordinasyon sunan bir etkiye sahiptirler. Mikroorganizmalar selülozun tam hidrolizi için, doğal olarak lignin ve hemiselüloz polimeri içine gömülmüş substratlar için farklı adaptasyonlar geliştirmişlerdir. Selülolitik filamentöz mantarlar ve aktinomisetlerin, lif uzantıları boyunca selülozik substratlara nüfuz etme kabiliyetleri vardır. Serbest selülazların (CBM li ya da CBM siz) üretimi bu şartlarda selülozun etkin hidrolizi için yeterli olmaktadır. Bu sistemlerdeki enzimler molekül ağırlık bakımından büyük stabil kompleksler oluşturmazlar. Bu yüzden kompleks olmayan (Non-Complex) sistem olarak adlandırılır. Buna rağmen, anaerobik bakterilerin selülozik materyal içine etkin olarak nüfuz olma kabiliyetleri yoktur. Bu yüzden selülozun parçalanabilmesi için diğer mikroorganizmalar selülaz sentezi yapabilmek için ATP nin sınırlı olması nedeniyle alternatif mekanizma bulmak zorundadırlar. Bu durum mikroorganizmaların Selülozom (Cellulosomes) denen kompleks selülaz sistemlerini geliştirmelerini zorunlu hale getirmiştir. Clostridium lar ve ruminant bakterilerde hidrolizin gerçekleştiği bölgelerde selülaz üreten hücrelerin yerleştiği gözlenmiştir (Doi ve ark, 2003) Kompleks Olmayan Selülaz Sistemleri Son 50 yılın en fazla incelenen konusu Tricoderma reesei nin selülaz sistemi olmuştur. T.reesei en az 2 ekzoglukanaz (CBH-I ve II), 5 endoglukanaz (EGI, II,III, IV, ve V), ve 2 β-glukozidaz (BGL-I ve II) üretir. 10

29 1.GİRİŞ İki ekzoglukanazın (sellobiohidrolaz) varlığı, mikrokristal selüloz zincirinin indirgenen (CBH-I) ve indirgenmeyen (CBH-II) uçları için T.reseei nin gösterdiği özel tercihe bağlanmıştır. Bu düşünce iki enzim arasında gözlenen ekzo-ekzo sinerji ile de desteklenmiştir. Sellobiohidrolaz aktivitesi mikrokristal selülozun hidrolizi için gereklidir. Sellobiohidrolazların her ikisi de selüloz polimerizasyonunu (zincir uzunluğu) düşürmede çok yavaştırlar. Endoglukanazların amorfoz bölgelerden selüloz zincirini keserek zincirin kısaltılmasından birincil olarak sorumlu olduğu düşünülmektedir. Böylece CBH ların etkisine açık yeni selüloz zinciri oluşturulmaktadır. Henüz T.reesei de 5 endoglukanaz varlığının nedeni tam olarak açıklanamamıştır. Aynı zamanda endoglukanazlar arasındaki sinerji de gösterilememiştir. Buna rağmen bazı endoglukanazların (EG-I) ksilanaz aktiviteleri gibi geniş substrat özgüllüğü de vardır. CBM nin varlığı bir endoglukanaz aktivitesi ya da endo-ekzo sinerjisi için gerekli değildir. CBH-I ve CBH-II nin temel ürünü olan sellobiozlar sellobiohidrolazların ve endoglukanazların aktivitesini de inhibe ederler. T.reesei nin en az iki β-glukozidaz enzimi üretmesi sellobioz ve kısa oligosakkaritlerin hidrolizini kolaylaştırır. Hem BGL-I ve hem de BGL-II nin büyük çoğunluğu hücre duvarına bağlı olarak kalsalar da, süpernatantlardan da izole edilmişlerdir. β-glukozidazın mantar hücre duvarlarına yakın bulunması, selüloz hidrolizinden açığa çıkan glukozun, çevreye dağılarak kaybını azaltmaktadır. Termofilik mantar H.insolens in selülaz sistemi T.reesei sistemine homolog iken Phanerochaete chrysoporium un ürettiği selülaz sistemi CBH-II ve 6 CBH-I yapılarına homoloji oluşturur (Doi ve ark, 2003) Kompleks Selülaz sistemleri (Selülozom) Selülozomlar, selüloz, hemiselüloz ve pektini parçalayabilen ekstrasellüler enzim komplekleridir. Selülozom sistemlerine sahip mikroorganizmalar anerobik ortamlarda ürerler. Selülozomların kompozisyonları türden türe değişkenlik 11

30 1.GİRİŞ göstermesine rağmen, Clostridium ve ruminant bakterilerden Ruminococcus türlerinde benzerlik gösterirler. Selülozomların yapısı incelendiği zaman enzimatik özelliği olmayan, scaffoldin adı verilen temel bir protein ile buna bağlanmış enzimatik alt ünitelerden oluştuğu görülür. Skafoldin (Scaffoldin) proteini CbpA, CipA ya da CipC denen proteinlerden oluşur ve bunlarla kompleks oluşturan bir çok selülozomal enzimler vardır. Nonenzimatik protein (scaffoldin) bir çok kohezin (cohesin) denen bölgeyi ve selüloz bağlayan bölgeleri (CBM yada CBD, Cellulose Binding Domain) içerir. Bunlardan başka, hidrofilik bölge, dockerin II bölgesi, enzim kodlayan bölge ve görevi bilinmeyen tanımlanmamış bölgeler mevcuttur. Kohezin bölgeleri, skafoldin proteinlerde her zaman mevcut olup, selülozomal enzimlerin dockerin bölgeleri için bağlanma noktalarına sahiptir. Kohezin-dockerin birlikteliği selülozomun bir araya gelmesinde anahtar rol oynar. CBM selülozomu, selülazı substrata sıkıca bağlamakla görevlidir. Kristal selüloza amorfoz selülozdan daha etkin bağlanma özelliği göstermektedir. Ayrıca CBM selülozomu, omurgası selülozunkine benzeyen kitine de bağlanır. CBM selülozomları farklılık gösterebilirler ve aminoasit dizilerine göre birçok familyaya ayrılabilirler. Aynı zamanda, CBM selülozomlar sadece skafoldin proteinlerle bulunmaz daha önce de bahsedildiği gibi selülozomal ya da selülozomal olmayan selülazlarla da bulunabilirler. Selülozomal Enzimler: Minimal olarak bir katalitik ve dockerin bölgesi içerir. Bir enzimde dockerin varlığı genellikle enzimin selülozomal enzim olduğunu gösterir. Çünkü dockerin, skafoldinin kohenzin ile etkileşimi sonucu enzim kompleksini oluşturur. Selülozomal enzimlerin esas kısmını oluşturan selülazlar 5. ve 9. familyanın endoglukanazları ve 48. familyanın ekzoglukanazlarını içeren glikozit hidrolazların 3 familyasına aittirler. Dokuzuncu familyanın üyeleri özellikle selüloz liflerini internal olarak parçalayabildikleri gibi kesme noktasından başlayarak selüloz polimerini kesintisiz olarak da parçalayabilir. Selülozomal hemiselülozlar enzimleri ksilanazları ve mannanazlardan meydana gelirler. Ksilanazlar enzimleri, glikozit hidrolazların 11. familyası içerisinde yer alırlar. Mannanazlar ise 5. familyanın üyeleridirler. Dokuzuncu familyaya ait olan 12

31 1.GİRİŞ pektat liyazlar enzimleri da selülozomlar içerisinde tespit edilmişlerdir. Bu bulgu, selülozomların selüloz, hemiselüloz ve pektini yani tüm hücre duvarı bileşenlerini parçalayabileceğini göstermektedir. Selülozomal kitinazlar da C.thermocellum dan izole edilmiş enzimler olup, lignoselülozu parçalayamamalarına karşın, mantar ve böceklerin ekzo-iskeletini oluşturan kitini parçaladığı gösterilmiştir. Selülolitik mikroorganizmaların çoğunun karbon ve azot kaynağı olarak mantar ve ölü böceklerdeki kitini kullandığı saptanmıştır (Doi ve ark, 2003) Selülazların Bazı Uygulama Alanları Selülazların ana uygulama alanları gıda, hayvan yemi üretimi, tekstil, biyo yakıt, kimya, kağıt ve kağıt hamuru endüstrisi, atıkların giderimi, tıbbi ve farmasötik endüstrisi, protoplast üretimi, genetik mühendisliği ve kirlilik giderimidir (Bhat ve Bhat, 1997). Bazı uygulamalar ayrıntılı olarak incelendiğinde çok farklı kullanım alanlarının olduğu görülür Gıda endüstrisinde Selülazlar a) Tohumlardan yağ ve meyve suyu ekstraksiyonunda, b) Meyve sularının berraklaştırılmasında, c) Tahılların homojen olarak su çekmesini sağlamak ve yeterince ıslanmasının artırılmasında, d) Soya sosu gibi fermente soya gıdaların üretiminde soyanın dış zarının uzaklaştırılmasında, e) Kokonat ve soya fasulyesinden protein izolasyonunda, f) Mısır ve tatlı patatesten nişasta üretiminde, g) Sindirimini artırmak amacı ileyosunlarının jelatinizasyonunda, h) Su yosunlarından agar ekstraksiyonunda i) Gıda katkısı maddesi olarak kullanılan öğütülmüş lignoselülozik materyalin parçalanmasında, 13

32 1.GİRİŞ j) Selülozik atıklardan çözünür şeker, glikoz ve sellooligosakkarit üretiminde. k) Bioetanol üretimi için substrat eldesinde. l) Kurutulmuş sebze ve çorba karışımlarının geri sulandırımının artırılmasında. m) Polisakkarit, protein, enzim ve tat verici maddelerin açığa çıkışını kolaylaştırmak amacıyla bitki hücre duvarlarının uzaklaştırılmalarında kullanılmaktadır(bhat ve Bhat, 1997) İçecek ve Şarap Endüstrisinde Selülazlar Rekombinant mayalardan elde edilen β-1,3 ve β-1,4 glukanazlar şaplarda aroma artışının sağlanması, biranın filtrasyonunun kolaylaştırılması ve düşük kalite arpada bulunan β-1,3 ve β-1,4 glukan hidrolizinde kullanılmaktadırlar Hayvan Yemi Endüstrisinde Selülazlar a) Ruminant ve monogastrik hayvanlar yemlerinde sindirilebilirliği artırmak amacı ile, b) Lignoselülozik materyallerin ön işlemden geçirilmesinde, hububatların kabuklarından arındırılmasında, ruminant ve monogastrik hayvanların selülozda yararlanmalarını artırmak için silaj yapımında kullanılırlar Tekstil Endüstrisinde a) Kumaşlarda boyanın fazlasını almada (biostoning), b) Bir çok yıkama sonunda pamuk kumaşlardan çıkan mikrofibrillerin giderilmesinde, 14

33 1.GİRİŞ c) Pamuk yada pamuklu kumaşların yıkanması, renk parlaklığının artırılması ve yumuşaklığının geri kazandırılmasında kullanılır. (Bhat ve Bhat, 1997) 1.5. Ksilanazlar (Xylanase) Ksilanın kompleks yapısı nedeniyle molekülün tamamen hidrolizi için farklı enzimlere gereksinim duyulmaktadır. Ksilanı hidroliz eden enzimlerin tamamına ksilanolitik enzim sistemi adı verilir. Bu gurupta β-1,4-endoksilanaz, β-ksilozidaz, α-l-araninofuranozidaz, α-glukuronidaz, Asetil Ksilan Esteraz ve Fenolik asit (Ferulik ve p-kumarik asit) esteraz yer almaktadır. Endo-1,4,-β-Ksilanaz (1,4-β-D-xylanxylanohydrolase, EC ) Endoksilanaz enzimi, ksilan omurgasını rastgele hidrolize ederek depolimerizasyonu sağlar. β-ksilozidaz (β-xylosidase; 1,4-β-D-Xylosidase; 1,4-β-D-Xylan Xylohydrolase EC ) kısa oligosakkaritleri parçalar. Ksilanda bulunan yan gruplar, α-l-arabinofuranozidaz, α-d-glukuronidaz, galaktozidaz ve asetil ksilan esterazlar tarafından molekülden kopartılarak serbest kalırlar (Şekil 1.1). Endoksilanazların genel olarak bakteri ve mantarlardan meydana gelen mikroorganizmalar tarafından üretildikleri bulunmuştur. Bununla birlikte, bitkisel kökenli endoksilanazların da bulunduğu ve bazı meyvelerin aşırı olgunlaşma dönemi sonunda üretildikleri saptanmıştır. Su yumuşakçaları dahil bazı gelişmiş hayvanlarda da ksilan üretiminin gerçekleştiği bildirilmiştir. Exo-1,4-β-D-Ksilozidaz enzimi (EC ) indirgen olmayan uçtan D-ksiloz birimlerini başarılı bir şekilde kopartarak 1,4-β-D-ksilo-oligosakkarit hidrolizini katalizler. Ksilanın hidrolizi sırasında ksilozun koparılmasını sağlayan endoksilanazların, β-ksilozidaz tarafından kolayca hidrolize edilebilen ksilobioza (Xylobiose) karşı aktiviteleri yoktur. α-arabinofuranozidazlar (EC: ), 15

34 1.GİRİŞ arabinanların, arabinoksilanların ve arabinogalaktanların indirgenmeyen α-larabinofuranosil ucunu hidrolize ederler. α-d-glukuronidazlar (EC ) ksiloz ve D-glukuronik asit veya 4-0- metileter arasındaki α-1,2-glikozidik bağlarının hidrolizinde görev yapan enzimlerdir. Ksilanın enzimatik hidrolizinde α-1,2 bağları, hidrolizi yavaşlatan bölgelerdir ve α-glukuronidazlar ise farklı substrat ile çalışırlar. Lignin karbohidrat bağlarına benzer şekilde 4-0-metil glukuronik asit bağları ile odunun degredasyonunda engeller. Doğal glukuronidazların hidrolizasyon işleminde tam etki gösterebilmeleri için esterazlara gereksinim vardır. Bu enzimler, ksilan molekülündeki asetik asit ve fenolik asit birimlerinin koparılmasını sağlarlar. Asetil, feruloyl ve p-kumoryl gruplarının ksilandan koparılması, ligninin uzaklaştırılmasında önemli bir basamaktır. Aynı zamanda hemiselüloz ve lignin arasında ester bağlarının koparılmasıyla ligninin çözülmesine katkıda bulunurlar (Subramaniyan ve Prema, 2000). Şekil 1.1: Ksilanın Tam Hidrolizinde Gerekli Enzimler ve Etki Bölgeleri (Beg ve ark,2001) 16