Hemoglobinopatilerde Tanı Yönetimi Genetik Testler

Transkript

1 Hemoglobinopatilerde Tanı Yönetimi Genetik Testler Doç.Dr.Hüseyin Onay Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Genetik AD

2 16. Kromozom üzerinde α globin gen bölgesi 11. Kromozom üzerinde β globin gen bölgesi

3 Globin Genleri globin gen ziniri Gen Uzunluk (bç) Uzunluk (aa) HBB HBD HBE HBG HBG globin gen ziniri HBA HBA HBZ HBQ HBM

4 3 ekzon, 2 intron HBB geni

5 talasemiye neden olan mutasyonlar Tein SL, Cold Spring Harb Perspet Med, 2013

6

7

8 HBA geni

9 Talasemi Mutasyonları

10

11 Talasemide Genetik Danışma 1. Tarama testlerinde taşıyıılık saptanması 2. Öneki çoukta talasemi major hastalığı 3. Kan akrabalarında talasemi major tanısı almış olgu 4. Kan akrabalarında taşıyıılık saptanması 5. Öykü olmadan bu hastalık için riski öğrenmek

12

13 talasemide hematolojik çalışmalarda yol haritası MCV MCH Hb >78 >27 A A 2 <%3 < 78 < 27 A A 2 >%3,5 F %0.1-7 < 78 < 27 A A 2 <%3,5 < =78 < =27 A A 2 <%3 F %2-30 Varyant Hb Doğrulayıı test Normal Taşıyıı Sık mutasyonlar için DNA analizi Tanımlanmamış mutasyonların analizi Fe eksikliği Fe tayini Demiri tamamla Tekrar test yap α talasemi taşıyıısı Normal HbH inkülizyonları α gen analizi βgen analizi Kantitaif HbF, F hüre dağılımı DNA analizi δβ talasemi HPFH HbS Oraklaşma+ α talasemi taşıyıısı Hb C,D,E Hb O Arab Hb Lepore Oraklaşma - Diğer Gerekirse İleri araştırma δ+β tal. taşıyıı δβ taşıyıı Normal Hb A 2

14 Old J. Sand J Clin Lab Invest, 2007

15 Moleküler Genetik Testler Algoritma Talasemilerin oğrafi yayılımı Gen tayini Mutasyonların oğrafi yayılımı Panel tayini Hematolojik parametrelerden gelen ipuçları Yöntem tayini

16 Stripassay Uygulamaları Çoklu mutasyon taramasına olanak veren sistemler Günümüzde sık gözlenen birçok hastalıkla ilgili stripler mevut Hızlı sonuç vermeleri, uuz olmaları ve kolay uygulanabilir olmaları nedeniyle sıklıkla kullanılan yöntemler

17 Reverse Hibridizasyon talasemi 22 mutasyon içeren testle mutasyonların %90 ı taranır* *Tadmouri ve ark. Am J Haemetol Codon 5 HbC HbS Codon 6 Codon 8 Codon 8/9 Codon 22 Codon 30 IVS 1.1 IVS 1.2 IVS 1.5 IVS 1.6 IVS IVS IVS 1.25 Codon 36/37 Codon 39 Codon 44 IVS 2.1 IVS 2.745

18 Reverse Hibridizasyon talasemi

19 DNA Dizi Analizi DNA nükleotid dizisinin yarı otomatik ya da otomatik genetik analiz ihazları yardımıyla ortaya çıkartılması Mutasyon saptanmasında altın standart kabul edilmekte

20

21

22

23 HBA Dizi Analizi

24 Kimerizm Analizi Moleküler genetikte kaydedilen gelişmeler, tek yumurta ikizleri hariç bir kişi için özgün olan DNA profilinin tanımlanmasını sağlamıştır

25 STR Belirteçleri STR lar (Short Tandem Repeat) polimorfik olmaları ve düşük mutasyon hızına sahip olmaları nedeniyle bu amaçla kullanılan önemli genetik markırlardır. a) 100bp N = bp 240bp b) 100bp N = bp 252bp

26 STR Marker Analizi

27 MLPA Çalışma Prensibi 1. MLPA probemix denatüre genomik DNA ya eklenir 2. Probun her iki parçası hedef diziye hibridize olur 3. Thermostable ligaz ile probun iki parçası birleştirilir X 5 Y X 5 Y 3 Hedef A 5 3 Hedef B 5

28 MLPA Çalışma Prensibi Örnek Kontrol Amplifiye ürünler kapiller elektroforezle ayrıştırılır Hedef bölgedeki kopya sayısı değişiklikleri kontrol örneklerle karşılaştırılarak elde edilir Pik alanları aynı örneğe ait diğer örneklerin pik alanlarının ortalaması ile normalize edilir

29 HBA Probları

30 HBB MLPA DT: Muğla Hb: 12,6 Ht: 33,7 MCV: 65 MCH: 24,4 RBC: 5,18 RDW: 18,1 Hb: 11,1 Ht: 30,4 MCV: 69 MCH: 25,1 RBC: 4,41 RDW: 18,1 Tarama Kendisi Eşi Talasemi Taşıyıılığı HbA: 91,4 HbA2: 4,8 HbF: 3,8 IVS [C >G ] 6-7 hafta HbA: 86,4 HbA2: 2 HbF: 11,5 Normal Dizi analizi: EÜTF Tıbbi Genetik Polikliniği

31 MLPA.4.fsa^GMsTXT.txt SMPD HS HS HS HS HS HS HS HS HBE1 exon HBG HBG2 exon HBG HBBP1 exon HBBP1 exon HBD HBD exon HBD exon HBB HBB HBB promotor HBB exon 01A HBB intron HBB intron HBB exon 03A HBB exon 03B HBB HBB Mapview Ratio Delta beta talasemi taşıyıısı MLPA.3.fsa^GMsTXT.txt SMPD HS HS HS HS HS HS HS HS HBE1 exon HBG HBG2 exon HBG HBBP1 exon HBBP1 exon HBD HBD exon HBD exon HBB HBB HBB promotor HBB exon 01A HBB intron HBB intron HBB exon 03A HBB exon 03B HBB HBB Mapview Ratio Normal

32 Talasemi Mutasyon Veritabanları LOVD HGMD HbVar IthaGenes

33 Bilimsel Güçlükler Prenatal genetik danışmada globin genleri ve düzenleyii bölgelerindeki kompleks yapılanmaların fenotipi etkileyebileeği söylenmelidir HS-40 5 LCR // // ζ ε γg γa α2 5 3 Embriyo Fetus ζ2 ε2 Hb Gower α2 γ2 Hb F I α2 ε2 Hb Gower II ζ2 γ2 Hb Portland I ζ2 β 2 Hb Portland II δ α1 Adult α2 β2 Hb A α2 γ2 Hb A2 β 16. Kromozom 11. Kromozom 5 3

34 Bilimsel Güçlükler β talesemide fenotipik spektrumu etkileyen genetik modifiye edii faktörler Primer: β globin gen mutasyonları + ++ Sekonder: Globin sentezinde rol alan diğer genler Tersiyer: Globin sentezi dışında hastalığın komplikasyonları üzerine etkili genler

35 Fetal Hemoglobin Regülatörleri Sankaran VG et al. Cold Spring Harb Perspet Med 2013

36 Fetal Hemoglobin Regülatörleri

37 Hemoglobinopatilerde Prenatal Tanı Aşamaları Hasta çouk sahibi olma riski içinde olan çiftlerin belirlenmesi Genetik danışma Çiftlerdeki moleküler defektin tanımlanması Bu bozukluğun fetüste araştırılması için fetüsten materyal elde edilmesi Genetik test ve sonuun aileye iletilmesi Fetüs hasta ise ailenin kararı ile gebelik terminasyonu Ailenin izlenmesi

38 Prenatal Tanı Koriyonik villus biyopsisi CVS) haftalarda Kordosentez haftalarda 20-. haftalarda

39 CVS CVS talasemi prenatal tanısında uygun bir yöntem Elde edilen materyal anne hürelerinden mikroskop altında iyi temizlenmeli

40 Preimplantasyon Genetik Tanı Sperm Preimplantasyon genetik tanı oosit Döllenme zigot 8 blastomer Fetus-adult PCR PCR DNA DNA analizi FISH ytogenetik Sağlam embriyo yerleştirilir. Prenatal tanı ile Kontrol önerilir

41 Preimplantasyon Genetik Tanı In-vitro oluşturulan embriyolardan, belirlenmiş genetik hastalıklar açısından, sağlam olanlarını seçip anne adayına transfer etmek için uygulanan yöntem Tek hüre biyopsisi Hasta Sağlam Sağlam Hasta Hasta SAĞLAM EMRİYO TRANSFERi

42 Non-invazif Prenatal Tanı