T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PATOLOJİ ANABİLİM DALI. Tez Yöneticisi Yrd. Doç. Dr. Şemsi ALTANER

Transkript

1 T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PATOLOJİ ANABİLİM DALI Tez Yöneticisi Yrd. Doç. Dr. Şemsi ALTANER HELICOBACTER PYLORI GASTRİTİ VE NONSPESİFİK GASTRİTLERDE ERKEN İNTESTİNAL METAPLAZİDEKİ HÜCRESEL DEĞİŞİKLİKLERİN CDX2 İLE GÖSTERİLMESİ VE BULGULARIN HİSTOKİMYASAL YÖNTEMLERLE KARŞILAŞTIRILMASI (Uzmanlık Tezi) Dr. Çiğdem ÖZDEMİR EDİRNE

2 TEŞEKKÜR Eğitimimde ve tezimin hazırlanmasında yakın ilgi ve yardımlarını eksik etmeyen Hocam Sayın Prof. Dr. A.Kemal Kutlu ya, eğitimim ve tez çalışmamda derin bir özveri ile beni yönlendiren Yrd. Doç. Dr. Şemsi Altaner e ayrıca eğitimim ve çalışmalarımda bana destek veren Anabilim Dalımız öğretim üyelerinden Prof. Dr. Filiz Özyılmaz a, Yrd. Doç. Dr. Ömer Yalçın a, Yrd. Doç. Dr. Ufuk Usta ya, Yrd. Doç. Dr. Fulya Öz Puyan a, ayrıca immünohistokimyasal boyamalarda yardımcı olan Yük. Biyolog Muzaffer Tudan a, asistan ve teknisyen arkadaşlarıma, tezimin istatistik analizinde yardımlarını esirgemeyen Halk Sağlığı Anabilim Dalı ndan Yrd. Doç. Dr. Burcu Tokuç a saygılarımla ayrı ayrı teşekkür ederim. 2

3 İÇİNDEKİLER Sayfa GİRİŞ VE AMAÇ... 1 GENEL BİLGİLER... 3 MİDENİN ANATOMİSİ VE HİSTOLOJİSİ... 3 İNTESTİNAL METAPLAZİ... 5 MUC MUC5AC... 9 HELICOBACTER PYLORI GASTRİTİ... 9 CDX GEREÇ VE YÖNTEMLER BULGULAR TARTIŞMA SONUÇLAR ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR EKLER 3

4 SİMGE VE KISALTMALAR AB : Alcian Blue H. Pylori : Helicobacter Pylori HE : Hematoksilen Eosin İM : İntestinal Metaplazi LPH : Lactase-Phlorizin Hydrolase PAS : Periodic Acid Schiff PAS-AB : Periodic Scid-Schiff-Alcian Blue RT- PCR : Reverse Transcriptase- Polymerase Chain Reaction SI : Sucrase-Isomaltase 4

5 GİRİŞ VE AMAÇ Helicobacter Pylori ( H. Pylori) gram negatif bir bakteri olup, sadece insan midesinde kolonize olma yeteneğine sahiptir. Gelişmekte olan ülkelerde H. Pylori enfeksiyonu yaygınlığı %90 ın üzerindedir (1). H. Pylori enfeksiyonu başlangıçta kronik gasrit ve nonatrofik gastritin nedeni olup, daha sonraki aşamada atrofik gastrit ve intestinal metaplaziye yol açmaktadır. Atrofik gastrit ve intestinal metaplazinin intestinal tip gastrik kanserin öncü lezyonları olduğu kabul edilmektedir (2,3). İntestinal metaplazi (İM), gastrik mukozanın ışık ve elektron mikroskopik olarak intestinal epitelin bütün özelliklerini taşıyan epitel ile yer değiştirmesidir (4). İM çeşitli gruplara ayrılmıştır. Bu gruplandırma temelde histopatolojik ve histokimyasal özelliklere dayanmaktadır (5). Son zamanlarda İM deki müsin değişimleri immünohistokimyasal yöntemlerle gösterilmiş ve buna göre sınıflandırılmıştır (6). Reverse transcriptase- polymerase chain reaction (RT- PCR) yöntemi kullanılarak mide biyopsilerinde yapılan bir çalışmada, H. Pylori ile enfekte olmuş hem İM li hem de İM siz mide mukozasında CDX2 varlığı tespit edilmiştir (7). H. Pylori ile enfekte mide mukozasında İM olsun ya da olmasın, CDX2 nin İM li mukozada nükleer, metaplazi dışındaki inflamasyonlu mukozada ise sitoplazmik reaksiyon verdiği immunohistokimyasal olarak gösterilmiştir (8). Helicobacter Pylori nin İM deki rolü, hangi mekanizmalarla bu değişimi yaptığı ve İM yi sınıflamaya yönelik çok sayıda immünohistokimyasal çalışma yapılmaktadır. Bu amaçla; intestinal epitelin oluşumu ve diferansiasyonunu sağlayan gen olan CDX2 nin (9), İM de oluşup oluşmadığı; H. Pylori nin yaptığı gastritin CDX2 salgılanmasına etkisinin olup olmadığı ve acaba İM ye dönüşecek mide epitelini öncesinde tanımanın mümkün olup 1

6 olmadığını belirlemeyi hedefledik. Ayrıca İM deki müsin değişimlerinin immünohistokimyasal belirteçler ile tespit edilip edilmediğini ve immünohistokimyasal yöntemlerin histokimyasal yöntemler kadar seçici olup olmadığını araştırmak istedik. Bu çalışmada Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı ında yılları arasında 85 hastanın aynı anda alınan mide antrum ve korpus endoskopik biyopsilerinde immünohistokimyasal yöntem ile CDX2, MUC2, MU5AC ekspresyonlarına bakılıp histokimyasal bulgularla karşılaştırılmıştır. 2

7 GENEL BİLGİLER MİDENİN ANATOMİSİ VE HİSTOLOJİSİ Mide, abdominal boşlukta epigastrik, umbilikal ve sol hipokondriak bölge boyunca yerleşim gösterir. Hacmi doğumda 30 ml iken yetişkinde 1000 ml hacime kadar ulaşır. Mide dört anatomik bölgeden oluşur. Kardia, kardiak orifis çevresindeki bölge olup sınırları keskin değildir. Fundus, kardia boyunca çekilen yatay çizginin yukarısında kalan bölgedir. Korpus, fundus ve antrum arasında kalan bölgedir. Antrum, midenin distal üçte bir kısmı ve dar pilorik kanaldan oluşan bölgesidir ki buradan duodenuma açılır. Mide duvar kalınlığı, yetişkinlerde 3-7 mm arasında değişmektedir. Histolojik olarak dört tabakadan oluşmaktadır. Birinci tabaka mukoz membran ya da mukozadır. Bu da luminal yüzey tabaka ya da epitelden oluşur. İkinci tabaka gastrik pitler ve bezlerden oluşur. Üçüncü tabaka lamina propriadan oluşur. Dördüncü tabaka ise lamina muskularis mukozadır. Midenin yüzeyini döşeyen epitel, midenin tüm bölgelerinde aynı niteliktedir. Bu epitel basit kolumnar epitel olup, bazalda yerleşim gösteren belirgin olmayan nükleolusa sahip nükleuslu, berrak ya da soluk eozinofilik, müsin içeren vakuollü sitoplazmalıdır. Yüzey epitel hücreleri nötral müsin salgılar periodic acid Schiff (PAS) ile pozitif reaksiyon verir (10). Yüzey epiteli mukozanın destek dokusu içine girerek mide pitlerini, kript ya da foveola denen yapıları oluşturur. Mide pitleri tübüler yapıdadır. Bu pitler daha sonra midenin bölgesine göre özelleşmiş mide bezleri ile devam eder. Bu bezlerin ve pitlerin özelliklerine dayanılarak midede üç tip mukoza tanımlanmıştır. Kardia mukozası, korpus ya da fundus mukozası, pilor ya da antrum mukozası (11). 3

8 Kardia Mukozası Kardia mukozası özofagial skuamo-kolumnar bileşkeden başlayıp mide içerisinde 0,5-4 cm lik alanı içerir. Pit derinliği tüm mukoza kalınlığının yaklaşık yarısını oluşturur. Derin tabakadaki bezler basit tübüler veya birleşik tübülo-resamöz yapıdadır. Birbirleriyle birleşmiş muskularis mukoza çıkıntıları ile gruplara ayrılmış olup, kistik genişleme sık olarak gözlemlenir. Bezleri döşeyen epitel, yüzey epiteli gibi nötral müsin salgılayan hücrelerden oluşur. Bunların arasında endokrin hücreler, daha az olarak parietal ve çok nadir de esas hücreler içerirler. Korpus Mukozası Mide mukozasının en geniş kısmını oluşturur. Hem fundus hem de korpusu döşemektedir. Pitlerin derinliği mukoza kalınlığının dörtte biri kadardır. Bezler basit, düzgün tübüler yapı gösterir. Bezlerde kistik genişleme nadirdir. Üç ile yedi arasında bez hafif bir dallanma veya boyun bölgesi ile her bir pitin tabanına açılır. Dört tip hücre tanımlanmıştır, müsin salgılayan boyun hücreleri, parietal ya da oksintik hücreler, esas ya da zimojen hücreler ve endokrin hücreler. Pilor Mukozası Antrum mukozası da denir. Midenin 1/3 alt kısmını oluşturur. Pitlerin derinliği mukoza kalınlığının yaklaşık yarısı kadardır. Bezler basit ya da dallanmış tübüler yapı yaparlar. Kardia mukozasına benzer şekilde nötral müsin salgılayan hücrelerle döşelidir. Bazen az miktarda sulfomüsin salgıladıkları da gözlenir. Antrum bezlerinde seyrek olarak parietal hücrelere ve az sayıda endokrin hücrelere rastlanır. Antrum mukozasını korpus mukozasından ayıran en önemli özellik zimojen hücrelerin olmayışıdır. Midenin Epitelyal Hücre Tipleri Parietal (Oxyntic ) hücreler: Bu hücreler büyük, siferik veya piramidal şekilde olup çekirdekleri hücre merkezinde, sitoplazmaları eozinofilik ve vakuollüdür. Golgi çekirdeğin ya altında ya da bir yanındadır. Sitoplazmalarında kristası belirgin çok sayıda mitokondri vardır. Bu hücreler özellikle glandların boyun ve isthmus bölgesinde yerleşim gösterir. Parietal hücreler hidroklorik asid, intrensek faktör, kan grubu maddeleri, potasyum klorür salgılar. Esas (Chief, Zymogenic) hücreler: Bu hücre tipi gastrik bezlerin tabanında yer alır ve tipik olarak protein salınımı yapan hücre görünümüne sahiptir. Piramidalden kolumnara kadar olana değişik şekillere, bazalda yerleşen bir ya da daha çok nükleol bulunduran 4

9 çekirdeğe sahiptirler. Bu hücreler pepsinojen, proteolitik enzimler ve çeşitli elektrolitler salgılar. Mukus boyun hücreleri: Bu hücreler gastrik bezlerin boyun bölgesinde nadiren bazal bölümünde parietal hücreler arasında küçük gruplar halinde ya da tek tek yerleşim gösterirler. Hemotoksilen eozin (HE) boyamada belirsizdir, fakat PAS ile çok kolay saptanabilir. Nükleusları bazalde olup sitoplazmaları hafif bazofilik ve granülerdir. Sitoplazmik müsinleri yüzey epitelinden farklı olarak göreceli dağınıklık gösterir, genelde apekste sınırlıdır. Bu hücreler asidik müsin sekrete ederler, sekrete ettikleri müsin yüzey epiteli müsininden daha koyu kıvamlıdır. Bu hücrelerin sekresyon haricinde proliferasyon ve mukozal rejenerasyon görevleri vardır (10). Endokrin hücreler: Pilorik antrum ve genellikle bezlerin tabanında (11) zimojen hücreler ve bazal membran arasına dağılmış küçük yuvarlak, piramidal şekilli, gümüş tuzları ile boyanan granüllere sahip hücrelerdir. Bu hücreler gümüş ve kromiyum tuzlarını indirgeyen enterokromaffin hücrelerdir. Serotonin, gastrin, somatostatin gibi biyolojik aminleri sekrete ederler. Midede yedi tip endokrin hücre varlığından söz edilmektedir. Ürettikleri maddelere göre en çok rastlanan hücreler şunlardır: G hücreleri gastrin üretir, D hücreleri somatostatin üretir, enterokromaffin hücreler serotonin üretir ve enterokromaffin benzeri hücreler histamin üretir (12). İNTESTİNAL METAPLAZİ İntestinal metaplazi mide mukozasının ışık ve elektron mikroskopik olarak bütün özelliklerini taşıyan intestinal epitel ile yer değiştirmesidir (4). İM normalde mide mukozasında bulunmayan, barsak epitelinde bulunan goblet hücreleri, emici hücreler, Paneth hücreleri ve endokrin hücrelerin varlığı ile tanınır (13). Silialı hücreler de bulunabilir (4). Ancak her zaman bu elemanların tümünü metaplastik epitelde görmek mümkün değildir. İM her zaman barsak epitelinin bütün özelliklerini göstermez. Tüm bu nedenlerden dolayı İM çeşitli gruplara ayrılmıştır. Bu gruplandırma temelde histopatolojik ve histokimyasal özelliklere dayanmaktadır (5). Tüm mide-barsak kanalında epitel hücrelerinin büyük bir kısmı epitelyal müsin dediğimiz mukopolisakkarit yapısında bir tür madde üretir ve salgılar. Epitelyal müsin kimyasal yapısına göre, histokimyasal boyanma yöntemleri ile farklı boyanma özelliğinde olan, nötral ve asidik müsin olmak üzere iki temel gruba ayrılır. Midede baskın olarak nötral müsin, ince ve kalın barsaklarda ise baskın olarak asidik müsin mevcuttur. Asidik müsinin baskın olduğu ince ve kalın barsak epitelinde de farklılıklar vardır. İnce barsakta asidik 5

10 müsinlerin alt grubu sialomüsinler ön planda iken kalın barsakta ise sülfomüsinler ve o-asetil sialomüsinler ön plana çıkar (14). Çeşitli özel boya yöntemleri ile mide barsak kanalındaki müsinlerin boyanma özellikleri Tablo 1 (5,14,15) ve Tablo 2 de görülmektedir (16). Tablo 1. Histokimyasal boyama yöntemleri ile mide barsak kanalındaki epiteliyal müsinlerin boyanma özellikleri (5,14,15) Boya Yöntemleri Nötral Müsin N-asetil Sialomüsin O-asetil Sialomüsin Sülfomüsin Alcian Blue ph2.5/periodic Acid Schiff (ABpH2.5/PAS) High Iron Daimine/ Alcian Blue ph2.5 (HID/ABpH2.5) Periodic Acid Borohydride/Potassium Hydroxide (saponification)/ Periodic Acid Schiff (PB/KOH/PAS) Koyu Pembe* Mavi Mavi Boyanmaz Mavi Mavi Mavi Kahverengi Siyah** Boyanmaz Boyanmaz Koyu Pembe Boyanmaz * Aynı hücrede nötral ve asidik müsinler bir arada ise, hücrede mor renkte boyanma görülür. ** Aynı hücrede sulfomüsin ve sulfatsız asidik müsinler bir arada bulunuyorsa hücrede kahverengi ve mavi boyanma birlikte görülür. Tablo 2. Müsin tiplerinin Alcian Blue ph /periodic Acid Schiff ile boyanma özellikleri (16) Boyama Yöntemleri Alcian Blue ph2.5/periodic Acid Schiff Alcian Blue ph0.5/periodic Acid Schiff 6 Müsin Tipleri Nötral Müsin Sialomüsin Sulfomüsin AB(-) PAS(+) AB(-) PAS(+) AB: Alcian Blue, PAS: Periodic Acid Schiff AB(+) PAS(+) AB(-) PAS(+) AB(+) PAS(zayıf +) AB(+) PAS(zayıf +)

11 İntestinal metaplazi bir çok araştırmacı tarafından komplet tip ya da Tip I ve inkomplet tip ya da Tip II olarak iki gruba ayrılmıştır. Bu sınıflama müsin tiplerine, histopatolojik görünüme göre yapılmıştır. İnkomplet tip intestinal metaplazi de kendi arasında iki gruba ayrılmıştır Tip IIA ya da Tip II, TipIIB ya da TipIII (5,17-18). Tip I (Komplet Tip) Genellikle ince barsağa benzer, kriptler düz ve düzenli bir yapıya sahiptir. Kriptleri matur absortif hücreler ve goblet hücreleri döşer. Bazen goblet hücreleri kriptin 1/2 yarısında yoğunlaşmış olarak izlenir. Müsin histokimyası olarak ince barsağa benzer, goblet hücreleri N-acetyl sialomüsin sekrete eder nadiren sülfomüsin içerebilir. Goblet hücreleri arasında kalan absorptif hücreler sekresyon yapmaz. Paneth hücreleri sıklıkla vardır. TipII, Tip IIA (İnkomplet Tip) Kriptlerde hafif biçim bozukluğu, hafif düzensizlik olup kriptleri goblet hücreleri ve farklılaşmasının değişik evrelerinde kolumnar mukus hücreleri oluşturmuştur. Absorbtif ya da emici hücreler çok azdır ya da yoktur. Kriptleri oluşturan hücreler karışık özellikte nötral ve sialomüsin sekrete ederler. Goblet hücreleri sialomüsin nadiren sülfomüsin sekrete ederler. Tıp I İM den farklı olarak ya kolumnar hücrelerde ya da goblet hücrelerinde O-acylated sialomüsin izlenmez. Kolumnar hücreler başlıca nötral müsin sekrete ederler. Sekrete edilen materyal ya hücrenin en yukarısında ya da bütün hücrenin tamamını kaplar şekilde izlenir. Bazen küçük miktarlarda N-acetyl sialomüsin de olabilir, ancak sülfomüsine çok az rastlanır. Paneth hücreleri ise çok çok nadir bulunabilir. TipIII, Tip IIB (İnkomplet Tip) Bu tip İM de bezlerin yapısında farklı derecelerde biçim bozukluğu görülür. Hücresel atipi ve farklılaşmadaki bozukluk TipII İM den daha fazladır. Kolumnar hücreler baskın olarak sülfomüsin salgılar. Bu hücreler çoğunlukla müsin ile dolu olarak izlenir. Goblet hücreleri ise sialomüsin ya da sulfomüsin salgılarlar. HE ile yapılan mikroskopik incelemede epitel çoğunlukla hiperplastik kolon mukozasına benzer. Paneth hücrelerinin sayısı azalmıştır. İntestinal metaplazide görülen değişiklikler sadece müsin tipleri ile sınırlı değildir. Işık mikroskobu, elektron mikroskobu düzeyinde yapısal farklılıkların bulunduğu, enzim özelliklerinin ve immünohistokimyasal yöntemler ile çeşitli antijenik özelliklerinin de farklı olduğu saptanmıştır (5,19). Müsinler yüksek oligosakkarit içerikli (%50 90), yüksek moleküler ağırlıklı epitelyal glikoproteinlerdir. Bu oligosakkaritler serin ve/veya treoninle O-glikozit bağı yapmış N-asetil galaktozaminden oluşan nisbeten kısa oligosakkaritlerdir. Pek çok organ birden fazla müsin salgılamakla birlikte belirli bir organda belirli bir müsin tipi yoğunluk gösterir. Günümüzde 7

12 bilinen müsin türleri (MUC1-MUC16) salgılanan müsinler ve membrana bağlı müsinler olarak iki ana gruba ayrılırlar. Membrana bağlı müsinler ailesi üyelerinin tümü bir transmembran bir de sitoplazmik domainden oluşur (20). Müsinler, mukus tabakasının major komponenti olup gastrik epiteli kimsayal ve mekanik etkilerden korur (21). Salgılanan müsinler MUC2, MUC5AC, MUC5B ve MUC6 olup ve bu genlerin ürünlerini içerirler, kromozom 11p15 de, yer almaktadırlar (22). Membrana bağlı müsinler ise MUC1, MUC3A, MUC3B, MUC4, MUC12 ve MUC 17 olup genlerinin ürünlerini içerirler (21). Bunlardan MUC1 haricindekiler kromozom 7q22 de MUC1 ise 1q21 de lokalize olmuştur (23). Normal mide mukozası MUC1, MUC5AC, MUC6 salınımı ile karakterizedir. MUC2, MUC3, MUC4 salınımı yoktur. MUC1 ve MUC5AC süperfisial foveolar epitelde salgılanmasına karşın MUC6 korpusun boyun mukus hücrelerinde, antrumun derin bezlerinde salgılanmaktadır (6). İntestinal metaplazide müsin salınımı şu şekilde tanımlanmıştır: Komplet tip İM de MUC1, MUC5AC, MUC6 salınımı azalırken veya olmazken MUC2 nin de novo salınımı görülür. İnkomplet tip İM de ise MUC1, MUC5AC, MUC6 ve MUC2 nin birlikte salınımı bulunmaktadır (6,21,24). MUC2 Salgılanan müsinlerden olup spesifik olarak gastrointestinal mukozanın goblet hücrelerinde salgılanmaktadır. MUC2 serin ve treoninden zengin tandem ve düzensiz tekrarlayan sekanslarla karakterizedir, bu sekanslar oligosakkarit zincirlerinin bağlandığı noktalardır. MUC2 gen ürünü en sık görüldüğü allelic formda 5100 amino asitten oluşmaktadır. Bu miktar müsin glikoproteininin beşte birini oluşturur. MUC2 proteini disülfit bağları ile uç uca polimerize olup büyük sekrete edilen polimerik jel oluşturan müsinleri yapar. Mukozal yüzeylerde koruyucu bariyer olarak görev yapar. MUC2 diğer müsinlerden saflaştırılabileceği gibi, intestinal mukus sekresyonunun ana bileşenidir. MUC2 nin dimer glikolizasyonu golgide gerçekleşir. MUC2 de kollojen ve heparin bağlayan bölümler bulunması MUC2 nin hücre dışı makro moleküllerle etkileşiminin olabileceğinin kanıtıdır (25). MUC2 salınımı homeobox genler olan CDX1 ve CDX2 tarafından düzenlenir (7-8,26). Ayrıca MUC2 salınımı p53 tarafından da düzenlenmektedir. MUC2 geni p53 bağlayan bölgeye sahiptir (27). Hücresel stres durumlarında p53 hücresel çoğalmayı ve DNA onarımını aktive eder. p53 apoptozisi tetiklediğinde tamir çabaları boşa gider (28). Gerçekte p53, MUC2 salınımını tetikler, bu stresten sorumlu programın parçasıdır (27). 8

13 MUC2, İM programının parçasıdır. MUC2 gastrik, özofagiyal ve biliyer mukozanın stres durumlarında artar. Tek başına onkojonik olmayabilir fakat koruyucu mekanizmalarda rol oynayabilir. MUC2 karsinojenlerin etkisini önlemede aktif rol oynar (29). Müsin sekresyonu ve MUC2 salınımı birçok stresten sorumlu olayların parçasıdır. Bunlar; solunum yolları, mide ve biliyer sistemdir. Bunun tersine kolorektal kanserlerde sıklıkla MUC2 salınım kaybı vardır (6). MUC5AC MUC5AC salgılanan müsinlerden olup (22), normal midede yüzey epiteli ve trakeobronşial hücrelerde salgılanırken, normal kolon mukozasında salgılanmaz (30). MUC5AC, MUC2 de olduğu gibi değişik sayıda tekrar eden tandemlerden oluşan santral bir bölgeye sahiptir ve bu bölgeler treonin, serin ve prolinden zengin tekrar eden peptitleri kodlarlar (20). Mide kanserlerinde müsin polipeptitinde değişiklikler rapor edilmiştir. MUC5AC nin salınımının kaybı müsin çeşitliliğinde artmaya neden olmaktadır (6). Bu gözlemler müsin değişikliklerinin mide mukozasının malign değişiminin moleküler markerleri olarak hesaba katılabileceğini düşündürmektedir. H. Pylori ekstraselüler ve epiteliyal hücrelerde MUC5AC üretimi ile oldukça yakından ilişkilidir. Bu da MUC5AC nin H. Pylori nin gastrik mukozaya yapışmasında rol oynadığını göstermektedir (31). HELICOBAKTER PYLORI GASTRİTİ Helicobacter Pylori gram negatif bir bakteri olup, sadece insan midesinde kolonize olma yeteneğine sahiptir. Bazı gelişmekte olan ülkelerde H. Pylori enfeksiyonu yaygınlığı %90 ın üzerindedir (1). H. Pylori enfeksiyonu kronik gasrit ve nonatrofik gastritin nedeni olup bu gastrit, atrofik gastrit ve İM ye ilerler. İM nin intestinal tip gastrik kanserin öncü lezyonu olduğu kabul edilir (2,3). H. Pylori mide epitelinde kolonize olduğunda inflamatuar bir reaksiyon oluşturur ve hastanın yaşamı boyunca devam eden kuvvetli yerel immün reaksiyona neden olur. Mide mukozasındaki bu inflamasyonun yaygınlığı ve şiddeti bakterinin virulansı, konağın genetik yapısı, immün cevap, enfeksiyonun başlangıç zamanının hangi yaşta olduğu ve çevresel faktörlere bağlıdır (32). H. Pylori nin normalde yaşadığı ortam midenin mukus jel tabakasıdır. Ancak bazı vakalarda epitelyal yüzeye girdiği görülmektedir (33). H. Pylori gastrik müsinlere bağlanma yeteneğine sahip olması bakterinin gastrik epitele yapışmasını destekleyebilir ya da baskılayabilir (30). H. Pylori normal yolunda gitmesi gereken dinamik bir denge olan hücresel proliferasyonu ve programlı hücre ölümü olan apopitozis dengesini değiştirmektedir: Hücresel proliferasyonu artırırken, apopitotik indeksi 9

14 azaltmaktadır (34). Apopitozisin inhibisyonu karsinogenezisin erken safhasıyla yakından ilişkilidir (35). Atrofik gastrit vakalarının %80 inde H. Pylori infeksiyonu görülmüş iken, %10 unda H. Pylori infeksiyonu varlığı izlenmemiştir (36). İM gelişimi ve H. Pylori arasındaki sebepsel ilişki karşıt-seçilmiş (37), takip eden (38) ve Mongolian gerbil model çalışmalarında gösterilmiştir (39). CDX2 Hücresel proliferasyon, diferansiasyon ve yaşlanmanın tam anlamıyla düzenlenmesi intestinal epitelin sürekli yenilenmesi ve doku yapısının korunması ile sonuçlanır. Barsak epiteli hücrelerinde hem proliferasyon hem de farklılaşmayı düzenleyen ve bir transkripsiyon faktörü olan intestin spesifik homeobox gen CDX2 dir (9). Homeobox genler, metazoanların gelişimi sırasında biçimlendirilme ve hücre faklılaşmasında yer alan nükleer transkripsiyon faktörleridir (40). Bunlar aynı zamanda yeni bir grup protoonkogen olarak tanımlanmışlardır (41). Çeşitli çalışmalar homeobox gen değişimlerinin tümör genezisinde de yer aldığını göstermiştir. Homeobox genlerin fonksiyonunu anlamadaki önemli süreç hücre adezyon molekülleri ve ekstraselüler matriks komponentleri gibi hücresel ilişkilerde yer alan molekülleri düzenlediklerine dair bulgudan ortaya çıkmıştır (42). Homeobox genler kendi kendileri ve diğer homeobox genler (43), retinoidler (44) ve/veya büyüme faktörleri tarafından regüle edilirler (45). Caudal familyanın homeobox genleri olan CDX1 ve CDX2 intestinal epitelden salgılanırlar. CDX1 ve CDX2 ile ilgili ilk çalışmalar farelerde yapılmıştır. Farelerde barsak epiteli arası embriyonik günlerde başlayan ve dört haftalık doğum sonrası dönemde de devam eden sütten kesilmeyle sonuçlanan karmaşık geçişler serisi boyunca visseral endodermden gelişmektedir (9). Tamamiyle gelişmiş barsak epiteli intestinal kriptlerde yer alan kök hücreden sürekli yenilenmektedir. Bu hücreler dört adet morfolojik ve biyokimyasal olarak büyüme tipi içerir. Bunlar, enterositler, değişik tipteki endokrin hücreler, mukus sekrete eden goblet hücreleri ve paneth hücreleridir (46). Proliferasyonun, farklılaşmanın, gen salınımının, hücre geçişinin ve yaşlanmanın alansal belirlenen yapıları epitelin hızlı yenilenmesi esnasında korunmaktadır. Çoğu sistemdeki işleyişten fazlasıyla belli oluyor ki hücresel fenotip herhangi verilen bir zamanda hücrede var olan transkipsiyon faktörlerinin tümü tarafından düzenlenmektedir. Bundan yola çıkarak bu genler ya da başka genlerle ilgili çok detaylı bilgileri insan genom yapısına çok yakın olan Drosophilia melanogaster adı verilen bakteriden elde edilmiştir (47). Bu genler, bu bakterinin caudal, anterior posterior yapılanmasını içermektedir ve intestinal farklılaşmayı düzenlemektedir (48). Bu genlerden memelilerde ilk bulunan CDX1 dir ve endodermde bulunmuştur (49). Bu 10

15 gen barsağın dikey ekseni (aksisi) boyunca artan bir gradientte salgılanmaktadır. Bu salgılanma baskın olarak indiferansiye kript hücrelerinde olmaktadır (50). Barsakta bulunan diğer cauda ile ilişkili gen CDX2 olup, nükleer transkripsiyonel faktör tarafından kodlanır ve diferansiye enterositlerde salgılanır (47). CDX1 ve CDX2 fare embriyosu gelişirken barsak gelişiminde kritik transformasyon olan visseral endodermin nascent villili basit kolumnar epitele dönüşümü sırasında salgılanır. Transgenik farelerde yapılan deneyler, epitelyal hücre silsilesinde ve intestinal traktın kranio kaudal ekseni ve kript-villus boyunca gen traskripsiyonu yapılarını yönlendirmek için karmaşık programlar olduğu hakkında kanıt sunmaktadır. İşte CDX2 intestinal epitelde barsak hücre morfogenezisinde ve farklılaşmış fenotipin korunmasında farklı gen ürünlerinin transkripsiyonunu destekleyerek erken safhaları yönlendirmede önemli bir rol almaktadır. Buradan da anlaşıldığı üzere CDX2 intestinal epitelde gen salınımının, proliferasyonun, morfogenezisin orkestra şefidir. CDX2 çok sayıda intestinal genin transkripsiyonunu regule etmektedir. Farelerde CDX2 geninin gelişimsel paternine ek olarak intestinal diferansiasyondaki rolü olan intestin spesifik genler (enterositik markerler) CDX2 için hedeftir (9). CDX2 enterositik markerlerin gen promoterlerde var olan cis elementelerine bağlıdır. Bu enterositik markerler sucrase-isomaltase (SI), Lactase-phlorizin hydrolase (LPH), apolipoprotein B, carbonik anhidrase 1 ve calbindin D9K dur (48). CDX2 özellikle Sİ gen promoterinin transkripsiyonal aktivasyonu için çok önemlidir (47). CDX2 invitro çalışmalarında IEC (indiferansiye intestinal hücre dizileri) hücrelerinde polarizasyonu ve SI ekspresyonunu tetiklemektedir (9). Caudal familyaya ait bu genler ile yapılan daha geniş çalışmalarda bu genler intestinal diferansiasyona katılmaktadırlar ve onların ekspresyonu epitel konnetif doku etkileşimine bağlıdır. Ayrıca intestinal ontogeny sırasında hücresel diferansiasyonun kontrolunde, matür organda devam eden hücresel yenilenmesinin sırasında epitelial mezenkimal hücre etkileşimleri gösterilmiştir (48). Bu karşılıklı etkileşimler değişik doku rekombinantlarının deneysel graftingleri ile kanıtlanmıştır. Bazal membran, epitelial ve mezenkimal hücreler arası ilişkiye yüzey olarak katılmaktadır. Hem mezenkimal hemde epitelyal hücrelerce salgılanan laminin -1 invitro olarak barsak hücre diferansiasyonunun prometeri olarak bulunmuştur (51). Laminin -1 in üretimi antisensrna sı ile inhibe edildiği zaman intestinal epitelin diferansiasyonu tamamen durmaktadır (SI ve LPH yokluğunda oluşan değerlendirmeler gibi). Bir dizi kolonadenokarsinom hücrelerinde yapılan çalışmalara göre CDX2 overekspresyonu 11

16 farklılaşan enterositlerin özellikleri ile ilgilidir. Matür enterositlerden salgılanan SI ve LPH, CDX2 varlığında yükselme göstermektedirler. Bunlarda Beta 4 integrin subünitini stimüle etmektedirler. Bunun ile bağlantılı olarak invivo olarak bu bazal membran reseptörü kript-villus aksisi boyunca artan bir gradyent sergiler. CDX2 overekspresyonu desmosomların yapısında bulunan integrinlerin salgılınmasını ve toplanmasını uyarmaktadır (48). Laminin 1 tarafından verilen ekstraselluler sinyaller CDX2 homeoproteininin salınımında modifikasyona yol açar ki bu da sekrete bazal membran moleküllerinde değişimi provoke eder (laminin α1 in bozulması ve laminin γ2 mrna sının artması). Ayrıca CDX2, selüler bağlanma özelliklerini ve transduksiyon sinyallerininde değişimini sağlar ki bunlar ise integrinlerin repertuarında modifikasyona yol açar. İntegrin β1 de bozulma integrin β4 subünitinde stimulasyon ile sonuçlanır (52). Birkaç laminin 1 zinciri ve integrin sub ünitleri kript villus aksisi boyunca spesifik dağılım göstermektedir. Bunun sonucunda sürekli yenilenen intestinal epitelin bu sürecinde proliferasyon artık diferansiasyon yönüne kaymaktadır. Diferansiasyonun başladığı gibi bir yerde de durması lazımdır. Bunu sağlayan faktörler nelerdir? Bu amaçla neonatal rat ileumundan elde edilen IEC-6 hücreleri üzerinde çalışma yapılmıştır. Bu hücreler kript tip intestinal hücre özelliğini göstermekte fakat gen ekspresyonu ve farklılaşan morfolojiyi sağlamamaktadır ve ayrıca CDX1 veya CDX2 yi eksprese etmemektedirler. Bu hücreler CDX2 salgılamak için zorlandığı zaman hem diferansiasyonda hem de proliferasyonda kayda değer değişiklikler oluşmuştur. Bu hücre kültürlerinde özellikle diferansiasyonun moleküler markeri olan Sİ nin RNA sını eksprese etmişlerdir (9). Bu hücrelerde oluşan proliferasyon birkaç gün sonra arreste uğramakta bu da myod (53), C/ERB (54), Pit1/GHF1 i (55) de içine alan diferansiasyonu uyaran transkripsiyon faktörlerinin habercisidir. İlginç olarak karmaşık ekstrasellüler matriks üzerindeki bu hücrelerin kültüründe diferansiasyonun bazı göstergeleri ile ilişkisinin olduğuna yol açmaktadır. Hücre-hücre, hücre matriks ilişkilerinin hücre morfogenezisinde önemli olduğu düşünülmüştür. Çünkü bunlar CDX2 salgılamaktadırlar. Bu ilişkilerdeki proteinler CDX2 için hedef (target) olmuşlardır. Farklılaşmanın en önemli markeri olan SI nın prometeri ise CDX2 dir. SI ise farklılaşmanın terminal olarak korunmasında önemli bir gendir (9). CDX2 overeksprese eden hücrelerde ayrıca APC, E-cadherin nin salınımının arttığı (up regülasyon) görülmektedir. Bunlar ise tümör ya da invazyon süpressörüdür (56). Yine CDX2 overekspresyonu izlenen Caco2 hücre kültürlerinde (bu hücreler kolon adenokarsinom hücreleridir), bcl-2 mrna düzeylerinde önemli azalmalar gözlemlenmiştir (48). Ayrıca 12

17 CDX2 birçok kanserde anti apopitotik protoonkogenleri deregüle etmiştir (57). İnsan kolon tümörlerinde ve ratlarda yapılan indüklenmiş tümörlerde CDX2 bozulmasının dramatik sonuçlara yol açtığı bulunmuştur (58). CDX2 nin tümör süpressör rolünün olduğu gösterilmiştir (48). Heterozigot CDX2 knock-out farelerde kolonda çok sayıda adenomatöz polipler ve metaplazi gelişmiştir (59). CDX2 nin salınımının azaldığı kolon kanserleri yüksek dereceli karsinomlardır. CDX2, IEC6 ve HT-29 ki bunlar human kolon kanser hücre dizileridir, bu hücrelerde proliferasyonu inhibe etmiştir. Onkojenik Ras ın HT-29, Caco-2 hücrelerinde CDX2 yi azalttığı bilinir (48, 60). Fakat bir yandan da nude micelere CDX2 over eksprese eden hücreler enjekte edildiğinde kontrol gruplarına göre daha büyük tümörler oluşmaktadır. Bu beklenmedik sonuçların nedeni ise bu hücrelerde yüksek düzeyde bulunan laminin γ2 zincirlerinin β4 integrinlere bağlanmasıdır. Bu molekül gerçekte tümör formasyonu ve invazyonu ile muhtemelen bağlantılıdır (48). CDX2 nin intestinal yapıların gelişiminde ve hücre fenotipinde özel rolü olmasından dolayı çok sayıda çalışma bu genin kolorektal tümöregenezis ile olan ilişkisine odaklanmıştır. CDX2 kaybı gösteren knockout fareler kullanılan modellerde kolorektal tümör gelişimi önemlidir. CDX2 nin total kaybı embriyogenezis sırasında ölümcüldür (59). Diğer bir çalışma ise mutant farelerde Apc gen ve CDX2 heterozigositesi birlikte değerlendirilmiştir. Apc delesyonları tek başına sadece ince barsakta çok sayıda adenomlara yol açmıştır. Fakat iki genin eskpresyonunun azalması ise distal kolonda artmış sayıda adenomotöz poliplere neden olmuştur. Bu çalışmalar CDX2 nin, kalın barsakta tümör süpressör rolünü düşündürür. CDX2 salınımının kaybı kolorektal tümör ilerlemesi ve gelişmesinde çok önemli rol oynayabileceğini gösterir (3). CDX2 mrna sı normalda çekum ve kolonda yüksek seviyelerde, intestinal kanalın diğer bölgelerinde düşük düzeylerde bulunmuş, midede ise bulunamamıştır (61). CDX2 transgenik farelerde mide epitelini intestinal epitele transforme etmektedir (62). CDX2 nin ektopik olarak intestinal metaplazide overeksprese edildiği ve normal gastrik epitelin intestinal epitele transforme olmasında rol aldığı bulunmuştur (7,63). Reflü özefajit (64) ve kronik H. Pylori enfeksiyonu gibi kronik inflamasyonun CDX2 salınımını indüklediği gösterilmiştir (7,8,65) 13

18 GEREÇ VE YÖNTEMLER Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Etik Kurul un onayı alınarak çalışmaya başlandı (Ek 1). Bu çalışmada Trakya Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilim Dalı nda yılları arasındaki hem antrum hem de korpus bölgesinden alınan mide endoskopik biyopsileri incelendi. Bu vakalar arasından mide karsinomu, mide peptik ülseri olmayan, H. Pylori için hiçbir tedavi almayan, aynı anda hem antrum hem korpusa ait endoskopik biyopsileri bulunan 85 olgu çalışmaya alındı. Çalışmaya alınan 85 olgunun hem antrum hem de korpus endoskopik biyopsilerine ait HE kesitleri retrospektif olarak Sydney Update sisteme (66) göre yeniden değerlendirildi. Bu sistemde bütün parametreler ki bunlar ( inflamasyon, aktivite, metaplazi, atrofi, displazi, H. Pylori dir), yok (0), az (+)/(+++), orta (++)/(+++) ve çok (+++)/(+++) olarak değerlendirilmektedir. Çalışmamızda istatistiksel sonuçların sağlıklı değerlendirilebilmesi için bütün parametreler var ya da yok şeklinde birleştirilmiştir. Çalışmamızda, hem antrum hem de korpusdan alınan biyopsilerin bu parametreleri en iyi yansıtan bir kesite ait parafin bloktan hem immünohistokimyasal hem de histokimyasal inceleme için 4μm kalınlığında seri kesitler alındı. Gerek seçilen kesitlerde gerekse ayrıca konulan kontrol dokularından elde edilen kesitlerde immünohistokimyasal ve histokimyasal belirleyiciler için pozitif ve/veya negatif kontrol oluşturacak doku alanı bulunmasına dikkat edildi. Tüm olgularda immünohistokimyasal olarak Avidin Biotin Peroksidaz yöntemi kullanılarak CDX2, MUC2, MUC5AC antikorlarının ekspresyonları araştırıldı. Kullanılan antikorlar ve özellikleri (Tablo 3) dedir. Ayrıca tüm olgularda histokimyasal olarak periodic acid-schiff-alcian Blue (PAS-AB) PH 2,5 ve PAS-AB PH 0,5 da müsin varlığı araştırıldı. Kullanılan histokimyasal boyaların özellikleri (Tablo 4) dedir. 14

19 Helicobacter Pylori değerlendirmesi HE boyalı preparatlarda immersiyon yağı damlatılarak yapıldı. İMMÜNOHİSTOKİMYASAL YÖNTEM İmmünohistokimya; immünolojik ilkelere dayanılarak, varlığı araştırılan antijenlere karşı geliştirilmiş, poliklonal veya monoklonal antikorlar aracılığıyla dokudaki antijeni göstermek amacıyla kullanılan bir yöntemdir (67). Çalışmamızda indirekt immunperoksidaz yöntemi uygulanmıştır. Yöntemin Uygulanışı CDX2 ve MUC5AC için: 1. Tüm parametreleri en iyi örnekleyen kesite ait parafin bloklardan 1/10 luk Poly-L-Lysine ile muamele edilmiş lamlara 4μm kalınlıkta kesitler alındı. 2. Kesitler 12 saat süreyle 56 C etüvde bekletilerek deparafinize edildi. 3. Boyama öncesi deparafinizasyona ksilen ile devam edildi. Bu işlem 60 C etüvde 3 kez 10 ar dakika bekletme ve her 10 dakikanın ardından 5 er dakika dışarıda soğumaya bırakma şeklinde uygulandı. 4. Ksilenin giderilmesi için %96 lık alkol muamelesine geçildi. Kesitler 60 C etüvde 4 kez 10 ar dakika tutuldu. 5. Lamlar 3 kez distile sudan geçirildi. 6. Antijen geri kazanımı için DAKO ChemMate tm Buffer for Antigen Retrieval (kod no. S2031 DAKO, Carpinteria, CA, ABD) solüsyonu kullanıldı. 90 ml distile suya 10 ml bu solüsyondan eklenerek sitrat buffer solüsyonu hazırlandı. 7. Kesitler hazırlanan solüsyon içerisine konularak mikrodalga fırında önce 700 watta 25 dakika daha sonra 350 watta 20 dakika kaynatıldı 8. Kesitler dışarıda oda sıcaklığına gelinceye kadar 20 dakika bekletildi. 9. Dört kez 1 er dakika distile sudan geçirilen lamlara, dokularda bulunan endojen peroksiti bloke etmek için 37 C etüvde 20 dakika, 100 cc distile su içerisine 8,7 cc H2O2 katılarak hazırlanmış %8,7 lük H2O2 uygulaması yapıldı. 10. Üç kez distile sudan geçirilen lamlar ph 7.4 olan PBS solüsyonunda 10 dakika bekletildi. 11. Lamlardaki kesitlerin etrafı reaktiflerin kesit dışına taşmasını engellemek için DAKO- Pen (Kod No. S2002)ile çizildi. 12. Her bir lama Large Volume Ultra V Blok (Kod No: TA-125-UB, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) damlatıldı ve 7 dakika bekletildi. Sonra solüsyon lamlar üzerinden uzaklaştırıldı. 15

20 13. Her bir vaka için ayrı ayrı numaralandırılmış lamlara, oda sıcaklığında, ancak nemli ortamda Anti CDX2 (CDX2-88), (Kod No. MU392A-UC, BioGenex, San Ramon, CA, ABD) konsantre antikoru Antibody Dilue ile 1/10 oranında dilue edilerek, MUC5AC (Kod No. NCL-MUC-5AC, CLH2, Novocastra,) toz halindeki konsantre antikoru 1 ml bidistile su ile sulandırıldı daha sonra Antibody Dilue ile 1/20 oranında dilue edilerek damlatıldı. Antikorun her alana eşit dağılması için lamların üzeri lamelle kapatıldı. Bir saat bekletildi. 14. Lamlar üzerindeki antikorlar distile su ile uzaklaştırılıp PBS solüsyonuna alınarak 5 dakika bekletildi. 15. UltraVision Large Volume Detection System Anti-Polyvalent, HRP kitinin (Kod No. TA 125-HL, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) 1 nolu Biotinylated Goat Anti-Polyvalent (Kod No. TP-125_BN, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) solüsyonu damlatıldı ve 15 dakika bekletildi. 16. PBS solüsyonu ile 5 dakika yıkanan lamlara, 2 nolu biotine bağlanacak olan işaretleyici Streptavidin Peroxidase (Kod No. TS-125-HR, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) damlatıldı ve 15 dakika daha bekletildi. 17. Distile su ile yıkanan lamlar PBS solüsyonunda 5 dakika bekletildi. 18. UltraVision Detection System Large Volume AEC Substrate System (RTU) (Kod No. TA-125-HA, Neomarkers, Fremont, CA, ABD) kitinden karıştırılarak hazırlanan renklendirici solüsyon kesitler üzerine damlatılarak 10 dakika bekletildi. 19. Distile su ile yıkanan lamlar Mayer hematoksilen solüsyonunda 1 dakika tutularak zıt boyama yapıldı. 20. Musluk suyunda yıkandı. 21. Lamlar %5 lik amonyak solüsyonuna bir kez batırılarak morartma işlemine tabi tutuldu. 22. Musluk suyunda yıkandı. 23. Gliserol jel kullanılarak lamelle kapatıldı. MUC2 için: 1. Tüm parametreleri en iyi örnekleyen kesite ait parafin bloklardan 1/10 luk Poly-L-Lysine ile muamele edilmiş lamlara 4μm kalınlıkta kesitler alındı. 2. Kesitler 12 saat süreyle 56 C etüvde bekletilerek deparafinize edildi. 3. Boyama öncesi deparafinizasyona ksilen ile devam edildi. Bu işlem 60 C etüvde 3 kez 10 ar dakika bekletme ve her 10 dakikanın ardından 5 er dakika dışarıda soğumaya bırakma şeklinde uygulandı. 16