GİRİŞ Histoloji terimi histos logia gross anatomi mikroskopik anatomidir Organoloji Histoloji Sitoloji 1- Hücreler

Transkript

1 GİRİŞ Histoloji terimi, doku anlamına gelen histos ve bilim ya da çalışma anlamına gelen logia kelimelerinin birleşmesiyle türemiştir. Bu nedenle sözlük anlamıyla hem bitki ve hem de hayvan dokularının bileşimini ve yapısını özelleşmiş işlevleriyle bağlantılı olarak inceleyen bilim dalını ifade etmektedir. Bugün, bilim dalları içinde histoloji hangi anlamda kullanılıyor şeklinde düşünebiliriz. Anatomi iki alt gruba ayrılmaktadır. Bunlardan biri çıplak gözle görülebilen vücut kısımlarını inceleyen gross anatomi, diğeri yalnızca mikroskop yardımıyla incelenebilen vücut kısımlarını konu edinen mikroskopik anatomidir. Mikroskopik anatomiyi de kendi içinde alt grublara ayırabiliriz: Organoloji (organ bilimi), Histoloji (doku bilimi) ve Sitoloji (hücre bilimi). Histoloji doku bilimi olarak bütün bu mikroskopik anatomi alt gruplarını kapsamakta, hatta mikroskobik anatomi olarak da tanımlanabilmektedir. Her ne kadar vücut, hücrelerden yapılmışsa da, hücreler dışında iki önemli kompenenti daha vardır. Eğer vücut yalnızca hücrelerden yapılmış olsa idi vücudun destek fonksiyonu son derece kısıtlı olacaktı. Bu problemin çözümünde, esas dokulardan birisi olan bağ dokusu hücreleri, bir kaç çeşit lif sentezlerler. Bu lifler cansız yapılar olmakla birlikte inert hücreler arası maddeler değildirler. Bundan başka, hücrelerin yaşam ve fonksiyonel aktivitelerinin devam edebilmesi için, sürekli olarak oksijen ve besleyici maddelerin sağlanması ve toksik maddelerin de uzaklaştırılması gereklidir. Bu fonksiyonlar kan ve diğer sıvıları içeren vücut sıvıları tarafından temin edilir. Kan, kan damarları içerisinde dolaşmaktadır. Diğer vücut sıvılarından ise ileriki bölümlerde bahsedilecektir. Bu nedenle, vücut dokuları üç farklı kompenentten oluşmuştur. Bunlar; 1- Hücreler 2- Hücrelerarası (İntersellüler) maddeler 3- Vücut sıvılarıdırlar. Dolayısıyla histoloji yalnızca dokuları değil, hücreleri ve organ sistemlerini de incelemektedir. Histoloji, hücre, doku ve organlar bilimi olduğuna göre yapılarını inceleme yanında fonksiyonlarını da konu edinecektir. Bu nedenle histoloji yalnızca gross anatomiyi tamamlamakla kalmamakta, fizyoloji biliminin de yapısal temelini oluşturmaktadır. Yapı ve fonksiyon arasındaki ilişki, belki de histolojinin niçin ilgi uyandırıcı ve kolay öğrenilebilir bir konu olduğunu açıklayabilmektedir. Bir hücrenin, dokunun veya organın yapısı ne kadar iyi bilinirse fonksiyonları hakkında da o kadar iyi bilgi sahibi olunacaktır; ters yönden de bir hücre, organ veya dokunun fonksiyonu ne kadar iyi bilinirse mikroskopik yapılarının ne olabileceği hakkındaki varsayımlar da o kadar doğru olacaktır. Normal yapı hakkındaki bir bilgi, çeşitli hastalıklar sonucu hücre, doku ve organların yapılarında görülen değişiklikleri inceleyen patoloji biliminin de temelidir. Bu nedenle, histoloji bilimi gerek tıp ve gerekse diş hekimliği sahalarında hayati bir önemliliğe sahiptir. Biyoloji sahasında ise, histoloji hem biyolojideki profesyonel dereceler için esastır ve hem de oldukça değerli bir başvuru alanıdır. Biyolojik bilimler sahasında, öğrenci sıklıkla yeterli bir mikroskopik bilgiye sahip olmadan fonksiyonel problemlerle karşı karşıya kalmaktadır. 1

2 Histolojik incelemede metodla ilgili olarak iki önemli nokta vardır; kullanılan mikroskobun tipi ve doku veya organın mikroskop ile incelenebilecek şekilde hazırlanması. Bir genelleme yapacak olursak histolojik tekniklerdeki gelişmenin pek çok tip mikroskoplardaki teknik ilerlemeyi takip edemediğini söyleyebiliriz. Mikroskop tekniklerinde ilerlemeye en iyi örnek olarak Elektron Mikroskobu gösterilebilir. Elektron mikroskobu, her ne kadar 1932 de Knoll ve Ruska tarafından geliştirildiyse de, ancak ince kesit alma tekniklerinin geliştirildiği 1940 sonları ve 1950 başlarında biyolojik alanda kullanılabilmiştir. Mikroskobi tarihi, Robert Hooke (1665, şişe mantarında hücreyi tanımladı) ve Marcello Malpighi'nin değişik yapısal özellikleri incelemede basit mercekleri kullandıkları 17. Yüzyıla kadar uzanır tarihleri arasında Leeuwenhoek bileşik mercek sistemini geliştirmiş ve protozoa, bakteri, kas, sinir ve pek çok diğer yapılar hakkında gözlemlerini yayınlamıştır. Mikroskopik anatomi 18. Yüzyılda çok az gelişmiştir. 19. Yüzyıl başlarında ise bileşik mercekler oldukça geliştirilmiştir. 1827'de Amici'nin gelişmiş mercekleri bileme tekniği sonucu bileşik mikroskoplar uyumlu bir şekilde bir araya getirilmiş ve bunun sonunda hücrenin temel canlı ünit olduğu kavramı ortaya çıkarılmıştır. Robert Brown 1831 de çekirdeği keşfetmiştir de Schleiden ve 1839 da Schwann hücre teorisini ortaya atmışlardır de Henle insan histolojisinde o zamanlar için ilk geniş makaleyi yayımlamıştır. Her ne kadar "dokular" tabiri ilk kez 1802 de Bichat tarafından postmortem spesimenlerin gross incelenmesi sonucu ileri sürüldü ise de insan vücudunun bir "hücreler devleti" olarak tanımlanması 1863 de Virchow tarafından yapılmıştır. 19. Yüzyılın son yarısında, kesit almada kullanılan mikrotomlar oldukça geliştirilmiştir. Bunu tespit, gömme ve boyama tekniklerinde gelişmeler takip etmiştir. Boyama teknikleri, özellikle yeni mikroskop tiplerinde kullanılmaları yönünden, hala bir gelişme süreci içerisindedir. Bugünkü histolojik bilgiler pek çok mikroskop tiplerinin bu sahada kullanılması ve farklı histolojik tekniklerin uygulanması sonucu elde edilmiştir. Elde edilen sonuçların değerlendirilmesinin, kullanılan mikroskop ve tatbik edilen metoda göre olduğu hiçbir zaman akıldan çıkarılmamalıdır. Dolayısı ile bugün kullanılan değişik tip mikroskopların kullanılış şekli ve sınırlılığı ile doku hazırlanmasında uygulanan metodların temel prensipleri oldukça önemlidir. Histolojik incelemelerde; Histokimya, sitokimya İmmunositokimya ve hibridizasyon teknikleri Otoradyografi Hücre ve doku kültürü Mikroskobik teknikler ve mikroskoplar kullanılmaktadır. 2

3 MİKROSKOBİ Biyolojik materyallerin incelenmesinde, bugün pek çok tip mikroskop kullanılabilmektedir. Bu mikroskoplar temel olarak ışık kaynaklarına göre sınıflandırılabilir. Şüphesiz, en çok kullanılan mikroskop, görülebilen ışık kaynağına sahip olanlarıdır. Bu ışık mikroskoplarının da pek çok modifikasyonları vardır: 1- Işık mikroskobu 2- Polarize mikroskop 3- Faz-Kontrast mikroskop 4- İnterference mikroskop 5- Karanlık saha mikroskobu 6- Floresan mikroskop 7- Konfokal mikroskop Mikroskobide son gelişmeleri yansıtan ve ışık kaynağı olarak gözle görülmeyen radyasyonu kullanan mikroskopları da şöyle sıralayabiliriz: 1- Ultraviyole mikroskobu 2- Elektron mikroskoplar, SEM: (Tarayıcı-Scanning Elektron Mikroskop), TEM: (Geçirimli-Transmission Elektron Mikroskop) 3- Atomic Force Microscope (AFM) POLARİZE MİKROSKOP Işık mikroskobunun basitçe modifiye edilmiş şeklidir. Yüksek düzeyde düzenlenmiş moleküllerden oluşan yapıları incelemeye olanak verir. 2 adet polarize edici filtreden (polarizer-analyzer) biri ışık kaynağı ve nesne arasına yerleştirilirken diğeri objektif mercek ile araştırma arasında yer alır. Moleküler yapılar polarizörden çıkan ışığın eksenini saptırır ve koyu zemin üzerinde yapılar parlak görünür. Bu şekilde ışığı saptırma yeteneğine çift kırma denir. Çizgili kas ve kristalloid içeren yapılar (Ör.Leydig hücreleri) bu özelliktedir. FAZ-KONTRAST MİKROSKOP Çalışma prensibi; farklı kırma indislerine sahip boyanmamış, saydam hücre ve hücre dışı yapılardan geçen ışığın, hızının ve yönünün değişmesine dayanır. Bu şekilde yapıların açık ya da koyu görünmesini sağlar. 2 modifikasyonu vardır: İnterferens Mikroskop ve Diferensiyel interferens mikroskop. KARANLIK SAHA MİKROSKOBU Karanlık alanda özel bir kondansör yardımı ile ışıklı bir görüntü oluşturmaktadır. İncelenen partiküllerden yansıyan ışınlar karanlık alan içinde parlak aydınlık görüntüler oluşturur. Otradyografide gümüşlenen kısımların ayırt edilmesinde kullanılır. 3

4 FLORESAN MİKROSKOP İnceleme yapılacak materyalde özel floresan boyalar ve özel inceleme işlemleri kullanılır. Floresan maddeler UV (ultraviyole) maruz kaldığında daha uzun dalga boyunda ışık yayarlar. Floresan maddeler karanlık bir zemin üzerinde parlak parçaçıklar şeklinde görünür. Araştırıcının mor ötesi ışıktan korunması için objektif merceklerden sonra özel bir filtre bulunmaktadır. KONFOKAL MİKROSKOP Bir hücre ya da kesitin çok ince bir düzlemine odaklanabilmeyi sağlar. Örnek çok ince bir ışık demetiyle aydınlatılır ve örnekten gelen görüntü küçük bir delikten geçerek algılayıcıya ulaşır. Odaklanan kısım dışında kalan nesneler görülmez. Bu şekilde odaklanılan bir kaç ince düzlem birleştirerek 3 boyutlu görüntü elde etmek mümkündür. ULTRAVİYOLE MİKROSKOBU Işık kaynağı olarak UV ışını kullanılır. Işınlar, ultraviyole için özel olan bir optik sistemi geçtikten sonra, floresan bir ekran üzerinde görüntü oluştururlar. Ultraviyole ışınları görülmeyen ışınlar oldukları için doğrudan izlenemezler. Dolayısıyla florasan bir ekrandan yararlanma zorunluluğu vardır. Görüntü, duyarlı bir plak üzerine alınarak mikrofotoğraflar alınabilir. Özellikle nükleik asitler ve aminoasitler bu mikroskopla incelenir. ATOMİC FORCE MİKROSKOP (AFM) Biyojik materyallerin incelenmesinde yararlanılan en kullanışlı mikroskoptur. Çalışma prensibi tıpkı parmak uçlarımızla cildimize dokunduğumuzda beynimizin cilt yüzeyinin topografisini algılamasına benzer. Ucu sivri bir konsol atomik kuvvet yoluyla incelenecek örneğin yüzeyini tarar. Laser huzmesi konsola odaklanır ve konsoldan yansıyarak bilgisayara bağlı bir photodiode ulaşır. Photodiode laser huzmesini ölçer, elektriksel akıma dönüştürür ve bilgisayarda taranır. Biyolojik materyallerin incelemesinde AFM nin TEM ve SEM e göre avantajı; yüksek çözünürlüklü optik aletlerden farklı olarak vakum içermeyip canlı hücrelerin çevreleriyle birlikte su içerisinde incelenmesine olanak vermesidir. Herhangi bir mikroskop tipinin kullanışlılığı, yalnızca büyütme gücü ile sınırlı olmayıp, bundan daha önemlisi rezolüsyon (ayırma) gücü ile ifade edilmektedir. Belirli limitlerden sonra daha fazla büyütmenin ek bir yararı yoktur. Herhangi bir ışık mikroskobunda büyütme x1000 civarındadır. Büyütme gücü oküler ve objektif merceklerin büyütme gücünün çarpımı ile hesaplanır, bu durumda rutin ışık mikroskoplarda en yüksek büyütme, oküler mercek x10, objektif x100 kullanıldığında; 10x100= x1000 olmaktadır. Ancak oküler merceğin x20 büyütmeli formu da bulunmaktadır. Bu durumda ışık mikroskopta maksimum büyütme gücü x2000 olmaktadır. Rezolüsyon gücü, birbirine bitişik iki noktayı ayrı noktalar halinde gösterebilme gücüdür. Bir mikroskobun rezolüsyon gücünün ötesinde kalan iki ayrı nokta, tek bir 4

5 nokta halinde gözlenecektir. Rezolüsyon gücü kullanılan mercek sistemleri ve kullanılan ışığın dalga boyu ile ilgilidir. En gelişmiş bir ışık mikroskobunda maksimum rezolüsyon gücü 0,2 µm (mikron) kadardır. Birbirine 0,2 µm dan yakın olan 2 nesne tek bir nesne olarak izlenir ve 0,2 µm den küçük nesneler seçilemez. İnsan gözünün ayırma gücü ise 0,2 mm dir IŞIK (OPTİK) MİKROSKOBU Işık mikroskobu temel olarak iki basamaklı büyütme cihazıdır. Objektif mercek ilk büyütmeyi (magnifikasyon) sağlar. Oküler (projektör) mercek de ilk büyütmeyi tekrar büyütecek şekilde cihaza yerleştirilmiştir. Toplam magnifikasyon (büyütme), objektif ve oküler merceklerin çarpımı ile hesaplanmaktadır. Ek bir toplayıcı (Kondansör) mercek, normalde mikroskop şaryosunun altına yerleştirilir. Bu mercek, ışığı, kaynağından konsantre ederek çok parlak bir huzme oluşturur ve objeyi aydınlatır. Böylece büyütülmüş görüntünün incelenmesi için yeterli ışık sağlanmış olur. Her ne kadar kondenser mercek, toplam büyütmeyi etkilemiyorsa da, görüntünün kalitesini iyileştirmektedir. Oküler (projektör) mercek yaygın olarak x10 büyütme yapmaktadır. Bununla birlikte farklı büyütmeler yapabilen alternatif mercekler de kullanılmaktadır. Genellikle, objektif merceklerin bir kaç tipinin bağlı olduğu, bir disk bulunur. Bu disk mikroskop tüpüne monte edilmiş şekildedir. Bu disk döndürülerek istenilen objektif merceğine ayarlanabilir. Rutin kullanımda genellikle x10, x25, x40 ve x100 büyütmeli objektif mercekler kullanılır. x10 objektif düşük büyütmeli objektif mercek olup, x10 oküler mercek ile birlikte toplam 100 büyütme elde edilir. Benzer şekilde x25 objektifler medium büyütmeli objektif adını alır ve x40 objektif yüksek büyütmeli objektif adını alır ve x10 oküler büyütme ile birlikte sırası ile 250 ve 400 büyütmeler elde edilir. x100 objektife aynı zamanda oil-immersiyon objektifi adı verilir ve toplam olarak bu objektif ile x1000 büyütme sağlanır. Oil-immersiyon objektif merceği kullanıldığında preparat ile mercek arasına immersiyon yağı girer ve böylece uygun kırılma indeksi elde edilir. Objektif, preparat ile çok yakın olduğundan, objektif merceğin fokus ayarlanması çok dikkatli bir şekilde yapılmalıdır. 5

6 Işık Miksoskop (Zeiss Company Germany den alınmıştır) ELEKTRON MİKROSKOP VE KULLANIM ALANLARI İnsan vücudunu oluşturan hücrelerin varlığı 17. yüzyılda ilkel ışık mikroskoplarının yapılmasından sonra gösterilmiş ve 19. yüzyılda bileşik ışık mikroskoplarının geliştirilmesinden sonra hücre kavramı ortaya atılabilmiştir. Hücre kavramı ile özellikle temel tıp bilimleri olan histoloji ve anatomi başta olmak üzere biyolojik bilimlerde önemli gelişmeler olmuştur. Işık mikroskobunun keşfinden sonra, bütün hücre, doku ve organların yapıları incelenmiş ve o zamana kadar bilinmeyen pek çok yapısal ve fonksiyonel bilgiye ulaşılmıştır. Günümüzde en gelişmiş ışık mikroskobunun maksimum büyütme (magnifikasyon) gücü x2000 kadardır. Elde edilen bu büyütme gücü tüm hücresel yapıları göstermeye yeterli değildir. Mikroskopide büyütme gücünden daha önemli bir faktör ise rezolüsyon (ayırma) gücüdür. Rezolüsyon gücü, kullanılan ışığın dalga boyunun yarısına eşittir. Görünen ışığın dalga boyu 0,4-1,7 µm dir. Bu durumda ışık mikroskobunun maksimum ayırma gücü 0,2 µm olmaktadır. Bu sebeple birbirine 0,2 6

7 µm dan daha yakın olan objeler ışık mikroskopta tek bir yapı olarak gözlenmektedir. Işık mikroskopta hücre ve hücresel elemanların görüntülenmesindeki bu yetersizlik, bu alanda yeni bir mikroskobun keşfi ile sonuçlanmıştır. İlk elektron mikroskop 1932 yılında, Alman fizik mühendisleri Ernst Ruska ve Max Knoll tarafından yapılmıştır lerin erken dönemlerinde elektron mikroskobun biyolojik alanda kullanıma başlanmasıyla birlikte hücre ve hücresel elemanların yapı ve fonksiyonları hakkındaki bilgiler önemli ölçüde değişmiştir. Elektron mikroskobunun keşfi Nobel Bilim Komitesi tarafından yüzyılın buluşu olarak kabul edilmiş ve 1986 yılında, Ruska ya bu keşfinden dolayı Nobel Fizik Ödülü verilmiştir. Bilim dünyasına kazandırılmasıyla beraber Elektron Mikroskop, kimya, tıp, mühendislik, moleküler biyoloji ve genetik gibi pek çok alanda kullanılmış ve bu alanlarda önemli gelişmeler kaydedilmiştir. Bu gelişmeler daha sonraki yıllarda baş döndürücü bir hızla devam etmiş ve sonuçta objeleri yaklaşık X büyütme imkanına sahip elektron mikroskoplar yapılmıştır. Elektron mikroskop, elektronlarla dokuların etkileşmesi temeline dayanan, yüksek ayırma gücüne sahip bir görüntüleme cihazıdır. Bugün biyolojik bilimlerde en yaygın kullanılan elektron mikroskobu olan transmisyon elektron mikroskobu (TEM), temel olarak ışık mikroskobu sistemine eşdeğer bir sistemi içerir. Elektron mikroskobunda ışık kaynağı olarak, ışık mikroskobunda kullanılan gözle görünür ışık yerine tungsten filamanı tarafından üretilen ve gözle görünmeyen elektronlar kullanılır. Yüksek hızlı olan elektronlar havası alınmış bir tüp içerisinde daha da hızlandırılırlar. Işık mikroskobunda elde edilen görüntü ayrıntıları, kullanılan ışığın dalga boyunun yarısı ile sınırlıdır. Görünür ışığın dalga boyu 0,4-1,7 mikron arasında olduğuna göre birbirlerine 0,2 mikrondan daha yakın olan iki nokta birbirlerinden ayrı noktalar olarak ayırt edilmeyecek ve tek bir yapı gibi görüleceklerdir. İncelenecek dokudan görüntü elde edebilmek için görünür ışık yerine dalga boyu çok daha küçük olan elektronlar kullanılarak rezolüsyon gücü oldukça arttırılabilir. Elektron mikroskobunda elektronların dalga boyu kullanılan voltaja göre değişmekle birlikte 60 kv elektrik enerjisi uygulandığında elektronların dalga boyları 0.05 nm kadardır. Buna göre nm olması gereken ayırma gücü bugün kullanılan gelişmiş bir elektron mikroskobunda ancak 1-3 nm arasındadır. Bu değerler elektron ışınlarının dalga boylarının teorik limitlerinden çok daha uzaktır. Bunun nedenleri de elektron mikroskobunda mercek olarak kullanılan elektromanyetik alanların en iyi mercekler olmaması ve doku hazırlama yöntemlerinin henüz yeterli olmamasıdır. Transmisyon elektron mikroskobunda elektronlar tungsten filamanının yüksek derecede ısıtılmasıyla elde edilir. Katot ve anot arasında bir potansiyel farkı nedeniyle sürekli bir elektron dalgası oluşturulur. Elektronlar elektromanyetik mercekler ile demet getirilir. Hızlandırılmış elektronlar demet şeklinde dokuyu geçer ve ışık mikroskobundaki cam mercekler yerine bir seri elektromanyetik veya elektrostatik alanlardan geçerek bir floresan ekrana yansır. Görüleceği üzere elektron mikroskobunda görüntü doğrudan doğruya insan gözüne yansımamaktadır. Floresan ekrandaki görüntü istenilen büyütmede incelenir. Görüntü ve ışık ayarı yapılarak resim çekilir. Elektron mikroskopide doku kalıcı olarak fotoğraf filmi şeklinde saklanabilir. Film elektron mikrograf haline getirilir. Bu işlemde film agrandizör yardımı ile büyütülür ve siyah-beyaz 7

8 olarak fotoğraf kağıdına basılır. Daha ileri teknolojiyle üretilen elektron mikroskoplarda görüntü digital kamera ile bilgisayar ekranına yansıtılır ve fotoğraf çekilir. Modern bir elektron mikroskobunda büyütme gücü x x arasında değişmektedir. Yukarıda belirtildiği gibi, büyütme gücü en gelişmiş ışık mikroskobunda x2000 i geçememektedir. Gerçek büyütme değerlerini agrandizör kullanarak 2-3 kez daha artırma olanaklarını da düşünecek olursak, elektron mikroskopide kez büyütülmüş elektron mikrofotograflar elde edebiliriz. Hemen şunu belirtmeliyiz ki elektron mikroskopide önemli olan büyütme gücü değil, ayırma gücüdür. Elektron mikroskopide büyütme ve ayırma güçleri ışık mikroskopide uzun süredir kullanılan milimetre ve santimetre gibi ölçüm birimlerinin çok ötesine geçmiştir. Milimetre ve santimetre gibi ölçüm birimleri yerlerini önceleri 1 milimetrenin binde biri olan mikrona (µm) bırakmış, bunun da yerini daha sonra Angstrom birimi (A ) almıştır. Ölçüm birimlerinde görülen bu karışıklıklar yeni kabul edilen uluslararası sistemde bir temele bağlanmışlardır. Örneğin, milimikron yerini nanometreye (nm) bırakmış ve elektron mikroskopistler arasında geçerliliğini koruyan Angstrom (A ) uluslararası sistemde, ölçüm birimi olarak değerini yitirmiştir. Eski İsimlendirme Mikron (µm) Milimikron (mµ) Yeni İsimlendirme Mikrometre (µm) Nanometre (nm) 1 Mikron (µm) = 1/1000 Milimetre 1 Milimikron (mµ) = 1/1000 Mikrometre (Nanometre, nm) 1 Angstrom (A ) = 1/10 Nanometre Elektron mikroskobunun biyolojik alanda kullanılması sonucu hücre elemanlarının yeni ölçüm birimleri ile tanımlanması yanında yeni terimlere de gereksinim duyulmuştur. Bir makromolekülden daha küçük yapıları bugün elektron mikroskop ile görebilmekteyiz. Bu şekildeki ayrıntılı yapıların bütünü için "ince yapı" (fine structure) ve "ultrastrüktür" terimleri kullanılmaya başlanmıştır. Bunlardan "ince yapı" yalnızca elektron mikroskop ile görülebilen yapı elemanları için kullanılmaktadır. Halen pek çok elektron mikroskopist tarafından kullanılan "ultrastrüktür" terimi ise lügat anlamında "yapı ötesi" anlamına geldiğine göre bu amaç için kullanılmasından vazgeçmek daha doğru olacaktır. Işık ve elektron mikroskoplarında incelenecek dokular farklı laboratuvar yöntemleri ile hazırlanır. Işık mikroskobunda incelenecek hücre ya da dokular genellikle formalin gibi fiksatifler (tespit edici) ile tesbit edilir ve parafin bloklara gömülür. Bu bloklardan elde edilen ve kalınlıkları mikron ile ölçülen doku kesitleri mikrotom yardımı ile elde edilir ve lam üzerine alınır. Elde edilen kesitler renkli boyalar ile boyanır ve görünür ışık ile incelenir. Biyolojik yapının ayrıntıları ışık mikroskobunda kullanılan ışığın 8

9 fiziksel özelliğine bağlı olarak sınırlı olarak görülürse de, kullanılan görünür ışık bütün renkleri içerdiğinden örnekleri renkli olarak görebilmekteyiz. Elektron mikroskobunda ise gözle görünmeyen elektronlar herhangi bir renk içermediğinden görüntüler ancak siyahbeyaz alınabilmektedir. Diğer taraftan değişik tip ışık mikroskobu kullanarak hücreleri canlı olarak incelemek olası iken, elektron mikroskobu ile bu tür bir inceleme yapılamamaktadır. Elektron mikroskobunda elektronlar yüksek vakum altında birbirlerine yapışıp bir demet şeklinde seyreder ve dokuyu büyük bir hızla geçerler. Bu nedenle, en azından şimdilik elektron mikroskobunda hücreleri canlı olarak incelemek olası değildir. Bu durumda elektron mikroskobuyla canlılığını yitirmiş ve dehidrate edilmiş dokular incelenebilmektedir. Buna bağlı olarak elektron mikroskopide hücreleri canlı duruma en yakın şekilde inceleyebilmek için dokunun tespiti, dokudan kesit alınması ve kesitlerin boyanması ile ilgili yöntemlerin geliştirilmesi zorunluluğu doğmuştur. Tespit işlemine bağlı artefaktların ve yapısal bozuklukların elektron mikroskopide, yüksek büyütme gücüne bağlı olarak ışık mikroskopiye oranla çok daha belirgin olarak görülmesi ve elektron mikroskobunun yüksek ayırma gücü, elektron mikroskopide kullanılacak fiksatifin önemle seçilmesini gerektirmektedir. Bu nedenle elektron mikroskopide, çok daha az yapı bozukluğuna neden olan osmik asit (OsO 4 ), glutaraldehit ve akrolein gibi fiksatifler kullanılmaktadır. Fiksatiflerin ph'sının hücre ph'sına yakın ( ) olması için de değişik tampon solusyonları kullanılmaktadır. Elektron mikroskopide kullanılan fiksatiflerden en yaygın olanı % 1 veya %2'lik osmik asittir. Elektron mikroskopide siyah-beyaz dışında renkli boyaları kullanmak elektron optik sistemde renk seçimi yapılmadığından, olası değildir. Osmik asit ise kimyasal olarak lipoprotein membranlara ve atomik değerinin yüksek oluşu nedeni ile hücrenin diğer bileşimlerine bağlanarak elektron mikroskopik görüntülerin kontrastlığını sağlar. Diğer bir fiksatif olan gluteraldehid dokuyu ve hücreyi boyamaz, ancak dokuyu osmik asit ile ikincil tespite ve özellikle de osmik asit ile boyanmaya hazırlar. Tespit edilen doku sonradan etil alkol veya aseton ile dehidrate edilir, akrilik plastik veya epoksi resinlere gömülür. Bu bloklardan cam veya elmas bıçakların kulanıldığı ultramikrotom ile kesitler alınır. Biyolojik alanda kullanılan elektron mikroskoplarda elektron demetinin penetrasyon gücü çok kısıtlıdır, bu nedenle doku kesitleri oldukça ince (50 nm) olmalıdır. Bunun yanında kesitlerde baskı, çizik, katlantılar olmamalıdır. Doku kesitleri daha sonra kontrastı arttırmak için uranil asetat ve kurşun sitrat ile boyanır. Işık ve elektron mikroskopi arasında diğer bir önemli fark ise çalışma için gereken süredir. Elektron mikroskopide doku hazırlama süresi ışık mikroskobiye oranla çok daha uzundur. Bunun yanında istenilen bölgenin fotoğrafının çekilmesinde alanın taranması için ışık mikroskobunda birkaç dakika yeterli iken, aynı amaçla alan taranması elektron mikroskopta günlerce sürebilmektedir. Elektron mikroskobunun kendisi, dokuların özel bir şekilde hazırlanması için gerekli gereçlerle donatılmış elektron mikroskopi laboratuarı ve kesitlerin alındığı ultramikrotom cihazı hep birlikte oldukça karmaşık ve pahalı olan elektron mikroskobi ünitesini oluşturur. Elektron mikroskobik çalışmalar ancak yeterli parasal destek, çok iyi teknik bakım ve uzmanlaşmış personel ile gerçekleştirilebilir. 9

10 Işık mikroskobunun kullanımı elektron mikroskobuna oranla çok daha pratiktir. Öğrenci eğitiminde öğrencinin kendisi bu mikroskopları kullanabilir. Ayrıca ışık mikroskoplarının çok daha ucuz olmaları nedeni ile her öğrenciye bir mikroskop sağlanabilir. Elektron mikroskobunun maliyeti ise milyonlarla ölçülmekte ve kullanılması için beceri ve tecrübe gerekmektedir. Işık mikroskopide en iyi sonuçlar çıplak göz ile inceleme sonucu elde edilirken ışık mikroskobik fotoğraflar aynı ölçüde doyurucu değildir. Elektron mikroskopta ise bunun tam tersi söz konusudur. Diğer bir deyimle en iyi sonuç mikrograflardan sağlanabilmektedir. Dolayısı ile elektron mikroskopist istenilen alanları tarayarak mikrograf haline getirebilir ve bu mikrografları inceleyerek ince yapı hakkında gerekli bilgiyi öğrenir. Elektron mikroskobu ile yapılan çalışmalar sonucu bugüne kadar elde edilen bilgiler ve gelecekteki araştırmalara katkısı göz önünde bulundurulacak olursa bu araştırma aracının pahalı olmasının ve güç çalışma koşullarını gerektirmesinin pek önemli olmadığı görülecektir. Işık mikroskobunun temel prensiplerini içermekle birlikte bu modern araç doku yapılarının ayırma (rezolüsyon) sınırlarını yüzlerce defa aşmış ve böylece daha önce bilinmeyen pek çok biyolojik yapıların keşfini sağlamıştır. Özellikle 1950'lerden sonra elde edilen yeni bilgiler ışığında yapısal organizasyon, hücre alt yapıları ve hücre fonksiyonlarında karanlık kalmış pek çok nokta aydınlığa kavuşturulmuştur. Bu araç özellikle histoloji başta olmak üzere hücre ile ilgili bilim dallarına büyük bir canlılık getirmiştir. Günümüzde araştırma laboratuvarlarında rutin kullanım alanına da girmiş olan elektron mikroskobu ile hücre ve hücre organelleri düzeyindeki pek çok patolojik bozukluklar gösterilebilmiştir. Bütün hücrelerde ortak olan ince yapı özellikleri elektron mikroskopik çalışmalar sonucu bulunmuştur. Farklı hücre tiplerinde, farklı ince yapı özellikleri ve fonksiyonları, farklı patolojik durumlarda görülebilecek ince yapı değişiklikleri hala araştırılmakta ve tanımlandırılmalarına çalışılmaktadır. Günümüzde yaygın olarak kullanılan bir diğer elektron mikroskop ise Taramalı Elektron Mikroskobu (Scanning Electrone Microscope - SEM) dur. SEM, hücre doku ve organ yüzeylerinin üç boyutlu olarak görüntülenmesini sağlar. Elektron-numune etkileşimlerinden köken alan sinyaller, örneğin dış morfolojisi, kimyasal bileşimi ve kristal yapısına ilişkin bilgileri ortaya koyar. Tarayıcı (Scanning) Elektron Mikroskobunun geliştirilmesi, elektro-manyetik merceklerde ve voltaj güçlerindeki yeni gelişmeler ve laboratuvar çalışmalarında kullanılan yeni yöntemler bizlere çok daha gelişmiş ayırma gücüne sahip ve dehidrate edilmemiş (canlı) dokuları incelememizi sağlayacak elektron mikroskopların yapılacağı umudunu vermektedir. Son yıllarda TEM üzerine yerleştirilen SEM ataçmanı ile, TEM ve SEM kısmen birleştirilmiş ve STEM (Scanning Transmission Electron Microscope) oluşturulmuştur. 10

11 Transmisyon Elektron Mikroskop, Jeol JEM 1400 (Japan). Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Elektron Mikroskop Ünitesinde halen kullanılmaktadır. DOKU HAZIRLANMASI Hücre, doku ve organlar mikroskopik gözlem için özel bir şekilde hazırlanmadıkça yeterli bir şekilde incelenemezler. Doku hazırlama metodlarını genel olarak 2 gruba ayırabiliriz: 1) Direkt olarak canlı hücrenin incelenmesinde uygulanan metodlar, 2) Cansız hücrelerin (tesbit edilmiş ya da korunmuş) incelenmesinde uygulanan metodlar. Öğrenciler inceleyecekleri preparatları tespit edilmiş ve boyanmış halde bulacaklarından, dokuların hazır hale gelmelerine kadar geçirdikleri süreçleri, özet bir şekilde öğrenmeleri faydalı olacaktır. Canlı dokuların incelenmesi daha zor ve komplikedir, aynı zamanda canlı doku incelenmesi kısa bir süre için geçerlidir. Öğrenci yine de canlı doku inceleme metodlarını bilmelidir. Canlı hücrede, yapı ve fonksiyon aynı anda incelenebilmektedir. Canlı hücrelerin bu metodlarla, hareketleri, yabancı maddeleri fagosite etmeleri, seyrek olarak bölünmeleri ve diğer bazı fonksiyonları gözlenebilmektedir. 11

12 Canlı Doku İncelenmesi Tek hücreli (unicellular) organizmaları ve seyrek olarak da kompleks bir organizmadan ayrılmış serbest hücreleri canlı durumda, direkt olarak mikroskopla inceleyebiliriz. Serbest hücreler renksiz olup, içlerindeki oluşumlar bir kontrasta sahip değildir. Bu güçlük bir faz-kontrast mikroskop kullanılarak giderilebilir. İnsan kan hücrelerini temin etmek kolaydır ve bu hücreleri kendi doğal şartlarında, plazma içerisinde ince bir film tabakası haline getirerek gözleyebiliriz. Bu şekilde lökositlerin ameboid hareketlerini ve fagositik aktivitelerini saptayabiliriz. Hücre zarları mikroskop altında direkt olarak incelenebilecek kadar ince olabilir; (Örneğin, kurbağa ayağı zarları, yarasa kanatları, kobay yanak kesesi gibi). Karaciğer ve böbrek gibi nisbeten kalın organların ince kesitleri transluminasyon ile gözlenebilir. Transluminasyonda kuartz çubuklar kullanılmaktadır. Bu çubuklardan çıkan soğuk ışınlar protoplazmanın koagüle olmasını önlemektedir. Doku rejenerasyonu veya vasküler aktiviteler gibi olaylar, uzun süreli olarak tavşan, kobay gibi deney hayvanlarının kulak veya diğer uygun vücut kısımlarına, Cam pencereler yerleştirilerek takip edilebilir. Mikroskopik incelemeler için; küçük doku parçalarını çıkartarak serum veya serum fizyolojik ( SF), solusyonu gibi nisbeten zararsız sıvılar içine almak ve çok ince çelik ya da cam iğneler yardımı ile bu doku parçalarını oluşturan lif veya hücreleri birbirlerinden ayırmak mümkündür. Canlı hücrelerin vücut dışında uzun süre hayatiyetini koruması doku kültürü tekniği ile sağlanabilir; doku parçaları aseptik olarak alınır ve bir fizyolojik ortam içerisine transfer edilerek dokunun alındığı hayvanın normal ısısında korunur. Kültür ince bir cam boru veya cam bir yüzey üzerine damla şeklinde yerleştirilir. Bu şekilde hücreler mikroskop ile incelenebilmektedir. Böyle kültürlerde, büyüme, çoğalma ve bazı durumlarda hücrelerin diğer hücre tiplerine differensiyasyonları direkt olarak gözlenebilir. Doku kültürleri aynı zamanda kanser ve pek çok virüslerin incelenmesinde oldukça kıymetli bir yöntemdir. Mikrodiseksiyonda, mikroskop altında oldukça ince cam iğneleri çok hassas bir şekilde hareket ettiren bir cihaz kullanılır. Bu yolla, bir hücrenin çekirdek gibi küçük bir kısmı çıkartılabilir ve bunun hücreye etkisi gözlenebilir. Canlı hayvan veya hücrelerde başarılı şekilde iki boyama metodu uygulanır. Vital boyamada boyalar canlı hayvana enjekte edilir. Belirli hücrelerin aktivitesi, bu hücrelerin renkli maddeleri seçici bir şekilde absorbsiyonu ile sonuçlanacaktır. Bu olaya örnek olarak makrofajların trypan mavisi ile boyanmasını gösterebiliriz; bu şekilde boyama makrofajların kendileri için yabancı bir madde olan trypan mavisini fagosite etme temeline dayanmaktadır. Supravital boyamada organizmadan çıkarılmış olan hücrelerin ortamına bir boya maddesi ilave edilir. Bu boyama metoduna da canlı hücrelerde mitokondriyonların Janus Green (Janus yeşili), lizozomların Neutral Red (Nötral kırmızısı), sinir hücreleri ve sinir liflerinin Methylene Blue (Metilen mavisi) ile boyanmasını gösterebiliriz. Son olarak, hareket filmi ile hücre hareketlerini kayıt edip analizini yapabiliriz. Bu şekilde mitoz, fagositoz ve ameboid hareketler gibi olaylar canlı hücrelerde veya 12

13 doku kültürlerinde gözlenerek, ayrıntıları saptanabilir. Silyumların hareketi gibi süratli olayların analizi de yavaş hareket filmleri ile yapılabilmektedir. Cansız Dokuların Hazırlanması Işık Mikroskobu: Histolojik çalışmanın en uygun yolu, herbiri aşağı yukarı kalıcı bir şekilde korunabilen preparatların mikroskop altında incelenmesidir. Bir kesit tesbit edilmiş doku parçasından ince bir dilim alınarak hazırlanır. Sonradan kesit boyanır, lam üzerine monte edilir ve lamel ile kapatılarak preparat haline getirilir. Bir kesitin hazırlanmasında takip edilen çeşitli yollar histolojik teknikleri oluşturur ki bu konuda pek çok referans kitaplarına başvurabiliriz. Histolojik teknikler hakkında ayrıntılı bilgi bir histoloji öğrencisi için gerekli olmamakla beraber, kesit hazırlanmasındaki genel prensipler bilinmelidir. Bu şekilde öğrenci elindeki preparatları daha iyi bir şekilde değerlendirebilir. Bir histolojik kesitin hazırlanmasında aşağıdaki yollar takip edilir. a-parça Alınması: Sitolojik amaçlar ve en iyi histolojik kesitlerin hazırlanabilmesi için doku anestezi altındaki bir canlıdan veya canlının ölümünü hemen takiben alınmalıdır. Eğer parça insandan alınacaksa çok süratli ve hassas hareket etmelidir. Ameliyatlar sırasında alınan doku parçaları en iyi kaynaktır. Patolojik ya da abnormal doku çıkarıldığında bu doku ile birlikte çoğunlukla bir miktar da normal doku alınmaktadır. Bu normal dokular histolojik çalışmalar için oldukça yararlı olabilmektedir. b- Fiksasyon (Tespit): Fiksasyonda primer amaç; protoplazmayı canlı haline en yakın şekliyle koruyabilmektir. Tespit solusyonu koruyucu göreviyle otolitik değişiklikleri ve bakteriyel üremeyi en aza indirir. Tespit solusyonu (fiksatif) protoplazmayı koagüle eder, dolayısı ile çözülmez hale getirir ve kesit almayı sağlayacak şekilde sertleştirir. Bazı fiksatifler karbonhidrat ve lipidleri korurken bazıları yetersizdir. Pek çok fiksatif de protoplazmanın bazı boyalara karşı ilgisini (affinitesini) arttırmaktadır. Formalin, alkol, merkurik biklorid, potasyum bikromat ve belirli bazı asitler (pikrik, asetik, osmik asit gibi) tesbit edici ajan olarak en yaygın şekilde kullanılan reagentlerdir. Hiçbir fiksatif tek başına istenilen niteliklere sahip değildir, bu nedenle birkaç reagent karıştırılarak tespit solüsyonları hazırlanabilir; Bouin solüsyonu, Zenker solüsyonu ve Susa solüsyonu gibi. Bir fiksatif tipinin seçimi, genellikle, doku tipine ya da o dokuda incelenecek kısmın özelliğine ve tatbik edilecek boyama tipine göre yapılır. Sık kullanılan formalin, %37 oranında sıvılaştırılmış formaldehit solüsyonudur. Çeşitli dilüsyon oranları ile ve başka kimyasallar ve tampon solüsyonları ile çeşitli kombinasyonlar şeklinde fiksatif olarak kullanılmaktadır. Formaldehit, proteinlerin amino grupları ile reaksiyona girerek hücrenin genel yapısını ve hücredışı yapıları korumaktadır. Fakat lipidler ile reaksiyona girmemekte, bu nedenle hücre membranı için zayıf bir fiksatif olarak kabul edilmektedir. Nötral lipidleri korumak için ise, permanganat veya osmium tetroksit gibi fosfolipidlere bağlanan ağır metal içeren özel fiksatifler seçilmelidir. 13

14 c- Gömme (Bloklama): Gömmeden önce doku artık fiksatifin giderilmesi için yıkanır ve takiben derecesi giderek artan alkol (%70 den %100 e) veya benzeri dehidrate edici ajanlar (aseton) ile dehidrate edilir (suyu giderilir). Daha sonra şaffaflandırılır. Bu olayda dehidratasyon ajanı uzaklaştırılmakta, yerini hem dehidratasyon ajanı ve hem de gömme materyali ile karışabilen sıvılara bırakmaktadır. Bu sıvılar şeffaflandırıcı ajanlar olarak bilinir. Bu sınıfta ksilol, kloroform, benzen ve cedarwood yağı gösterilebilir. Şeffaflandırmadan sonra doku genellikle parafin veya selloidin olan gömme materyali ile infiltre edilir. İnfiltrasyondan sonra doku parçaları taze hazırlanmış gömme materyali içerisine gömülerek bloklar elde edilir. Özel çalışmalar için doku, fiksatif, dehidratasyon solusyonları veya şeffaflandırıcı maddelerle muamele edilmeden direkt parafin içine gömülebilir. Freeze -Drying (dondurarak kurutma) denilen bu metod ile taze doku süratle dondurulur ve donmuş halde iken düşük ısıda bir vakum içerisinde dehidrate edilir, kurutulmuş doku sonradan gömülür. Bu metodun bir modifikasyonu olan Freeze-Substition tekniğinde donmuş doku içerisindeki donmuş suyun gömmeden önce çok düşük ısıda alkol ile yer değiştirmesi sağlanır. d- Kesit Alma: Parafin bloklar içine gömülmüş dokudan oldukça ince kesitler alınabilir. Mikroskobik çalışmaların çoğunluğunda istenilen kesit kalınlığı 3 ile 10 mikron (mikrometre) arasındadır. En uygun kalınlık 5 mikrondur. Bu tip kesitlerin alınmasında mikrotom adı verilen özel cihazlar kullanılmaktadır. Kesit alındıktan sonra temiz bir lam üzerine geçirilir. Bu işlemden önce, kesitin lam üzerinden düşmesini engellemek amacıyla lamın üzerine bir miktar yumurta albumini sürmek faydalı olacaktır. Üzerinde kesit bulunan lam süzmeye bırakılır ve sonradan da hot plate (sıcak metal levha) üzerine yerleştirilir. Geri kalan su buharlaşır ve doku kesitinin lam üzerine sıkıca yapışması sağlanmış olur. Kesit şimdi boyamaya hazırdır. e- Boyama: Boyamada amaç doğal kontrastı arttırmak ve değişik tip hücre ve doku bileşimleriyle hücre dışı materyalleri daha belirgin hale getirmektir. Boyaların çoğunluğu aqueous solüsyonlar içerisinde tatbik edildiğinden, bir parafin kesitinin boyanabilmesi için, parafinin, bir parafin çözücü ya da decerating ajan içerisine alınarak uzaklaştırılması gerekmektedir. Parafin giderici maddeler genellikle ksilol veya tolüoldür. Eğer doku parafin değil de selloidin içerisine gömülü ise yukarıdaki metod kullanılmaz. Parafini giderilen kesitler boyamadan önce derecesi giderek azalan alkol serisinden geçirilerek hidrate edilir ve istenilen boyalarla kesitler boyanır. f- Monte: Boyamadan sonra fazlalık boyayı gidermek için boyanın çözücüsüne göre kesit su veya alkol ile yıkanır ve daha sonra kesit derecesi giderek artan alkol serilerinden geçirilerek dehidrate edilir. Son dehidratasyon ajanı olan absolüte (saf) alkolden sonra kesitler şeffaflandırıcı ajan içerisine alınır. Şeffaflandırmayı takiben kesit üzerine bir damla monte maddesi damlatılır. Kanada balsamı, entellan veya benzeri bir madde olan monte maddelerinin ışığı kırma indeksleri camınkine eşdeğerdir. Monte maddesi damlası üzerine dikkatle bir lamel konur ve kurutulur. Kurutmadan sonra preparat hazırlanmıştır. 14

15 BOYALAR Histolojide kullanılan boyalar genellikle kompleks organik kimyasal maddeler olup, etkinliklerinde bazı farklılıklar gösterirler. Boyaları değişik şekillerde sınıflandırmak olası ise de en basiti boyanın doku ve hücre bileşimleri ile ilgili olarak kullanılması temeline dayanan sınıflandırmadır. Genel olarak kullanılan boyalar ya çekirdeği ya da sitoplazmayı boyar ya da bazı hücre bileşimlerine özgü olabilir. Pek çok boya için dokuların özel bir şekilde tespit edilmesi ve hazırlanması gerektiği de bilinmelidir. Kullanılan boyalar asidik veya bazik olarak kabul edilirler, fakat gerçekte boyalar nötral tuzlar olup, hem asidik ve hem de bazik radikallere sahiptir. Boyanın renklendirici maddesi nötral tuzun bazik radikali içerisinde ise boya bazik olarak kabul edilir ve bu boya ile boyanan yapılar da bazofil olarak tanımlanır. Çoğu durumlarda, bazik boyalarla boyanan bazofil yapıların kendileri asittir; bunlara örnek olarak çekirdeğin nükleik asitlerini (DNA) ve ribonükleik asit (RNA) gibi sitoplazmanın asidik bileşimlerini verebiliriz. Aynı şekilde, renklendirici nötral tuzun asidik radikali içerisinde ise, boya asidiktir ve bu boya ile boyanan yapılar da asidofildir (örnek olarak bütün sitoplazma gösterilebilir). Bazik boyalardan en yaygın şekilde kullanılan nüklear boya hematoksilen'dir. Boyama yeteneği solüsyon içerisinde hematein denen oksidatif maddenin varlığına bağlıdır (Dolayısı ile taze hazırlanmış hematoksilen solüsyonu olgunlaştırılır, diğer bir deyimle kullanmadan önce oksidasyonun olması için bekletilir). Böyle bir boya ile boyandığında çekirdek mavi görülür. Çekirdekteki heterokromatin ve nukleolus kısımları nükleik asitlerdeki iyonize fosfat grupları nedeniyle bazofili gösterir. Ayrıca ergastoplazma gibi sitoplazmik yapılar (içeriklerindeki ribozomal RNA lardaki iyonize fosfat grupları nedeniyle) ve kıkırdak matriksindeki karbonhidratlar (iyonize sülfat grupları içerirler) gibi hücredışı yapılar da bazofiliktir. Yaygın şekilde tatbik edilen demirli hematoksilen boyamasında çekirdek koyu mavi veya siyah renk alır. Demirli hematoksilen boyama metodlarıyla bir yapı aşırı boyanırsa zayıf asit veya ferrik tuz solüsyonları içerisinde differensiye edilebilir. Differensiyasyon direkt olarak mikroskop ile gözlenebilir. Dikkatli bir differensiyasyonla kromozomlar, mitokondriyonlar, Golgi apparatus ve kasın kontraktil elemanları görünür hale gelebilir. Çekirdeği kırmızı veya pembe renge boyayan Carmine önceleri çok yaygın kullanılırdı, fakat bugün çok az tatbik edilmektedir. Bazik anilin boyalar yaygın şekilde kullanılan bir grup boyadır; Azure A, toluidin mavisi ve metilen mavisini de içeren bu grup proteoglikanların (mukopolisakkaritlerin) tanısı için de kullanılmaktadır. Proteoglikanlar metakromatik boyanırlar (meta=ötesi, chroma=renk). Bunun anlamı proteoglikanlar yukarıdaki boyalardan birisi ile boyandığında boyanın esas rengini değil de başka bir rengi alırlar. Yapıların metakromazi göstermelerinin, boyaları konsantre etmelerine veya boyaların moleküler yapılarını değişikliğe uğratmalarına bağlı olduğu düşünülmektedir. Müsin, kıkırdak matriksi ve mast hücre granüllleri, metakromatik boyalarla kolaylıkla 15

16 gösterilebilmektedir. Yaygın olarak kullanılan diğer bazik anilin boyalar parlak cresly mavisi, nötral kırmızısı ve janus yeşilidir, bütün bu boyalar toksik olmayıp vital veya supravital olarak kullanılabilirler. Genel sitoplazma için yaygın olarak kullanılan asidik boyalar; Eosin, Pikrik asit, Kromotrop gibi asit azo boyalar ve asit diazo boyalar, Trypan mavisi ve Trypan kırmızısı'nı içerir. Trypan mavisi ve trypan kırmızısı vital boya olarak da kullanılır. Asidik boyalar ile çoğu sitoplazmik filamanlar ve membranla çevrili organeller ile çoğu hücredışı lifler (içerdikleri iyonize amino grupları nedeniyle) boyanmaktadır. Histolojik kesitlerin çoğunluğu hem asidik ve hem de bazik boyalarla birlikte boyanmaktadır. En yaygın olarak kullanılan kombinasyon Hematoksilen ve Eozindir (H.E.). H.E.'de çekirdeksel yapılar koyu mor veya mavi, bütün sitoplazmik yapılar ile hücrelerarası maddeler pembe boyanır. Trikrom metodlarındaki avantaj ise, sitoplazmik yapılar ile hücrelerarası maddeleri arasındaki farklılığın ayırt edilmesidir. Trikrom metodlarına örnek olarak Mallory'nin bağ dokusu boyasını ve Mallory-Azan metodunu gösterebiliriz. Bu boyalarla bazı bağ dokusu lifleri parlak mavi, çekirdek kırmızı veya portakal rengi ve hücreyi oluşturan diğer yapılar mavi, kırmızı, portakal rengi veya mor boyanır. Yaygın olarak kullanılan diğer bir trikrom metodu da Masson'un boyama metodudur. Bunda ise bağ dokusu lifleri yeşil, çekirdek mavi veya mor, sitoplazmik yapılar kırmızıya boyanır. Her ne kadar kollajen için gerçekten özel bir boya yok ise de en iyi şekilde trikrom metodu içerisinde asit anilin boyalar ile gösterilir. Elastik lifler seçici olarak Orcein veya Resorcin fuchsin ile boyanırlar ve parlak şekilde asidofildirler. Retiküler lifler bir alkali solüsyon içerisinde gümüş ile presipite edilirler, dolayısı ile bu lifler Argyrophil olarak tanımlanır. Görüleceği üzere bir kesit içindeki bütün yapıları tek bir boyama metodu ile ayırt etmek mümkün değildir ve istenilen yapıları görebilmek için onlara özgün boyama metodlarını uygulamak zorundayız. ARTEFAKTLAR Unutulmamalıdır ki, hazırlanan preparatların hepsi tamamen mükemmel olmayabilir. Kullanılan tekniğe bağlı olarak, doku kesitlerinin hazırlanmasında bazı eksiklikler gözlenebilir. Preparat hazırlanmasına bağlı olarak oluşan bu değişikliklere artefaktlar adı verilir. Yaygın olarak rastlanan bazı artefakt tipleri şu şekilde sıralanabilir: a) Büzüşme: Dokuların muamele edileceği, özellikle fiksatifler veya sıcak parafine bağlı olarak dokular büzüşebilir. Böylece canlı halinde bulunmamasına rağmen, kesitlerde hücreler ve dokular etrafında boşluklar meydana gelmektedir. b) Presipitatlar: Eğer kullanılan fiksatif yeterince tamponlanmamışsa veya dokulardan uzaklaştırılmamışsa, kristaller şeklinde hücre ve dokular üzerinde birikintiler şeklinde kalırlar. c) Kırışıklık ve katlantılar: Genellikle, alınan ince kesitler birbiri üzerine katlanırlar veya tam olarak yüzeyleri açılmaz, böylece daha koyu bir şekilde boyanırlar. 16

17 d) Mikrotom bıçağı hataları: Kullanılan mikrotom bıçağının ucunda çentik gibi hatalar varsa kesitlerde çizgilenme meydana gelir. e) Dokuların zedelenmesi: Dokuların nazik bir şekilde alınmaması veya kullanılan kesici veya tutucu aletlerin sert bir şekilde dokuya uygulanması hücre ve dokularda ezilmeye ve parçalanmalara sebep olacaktır. f) Postmortem dejenerasyon: Postmortem dejenerasyon her ne kadar bir artefakt olarak değerlendirilmese de ileride kesitlerin kalitesini büyük ölçüde etkilemektedir. Dokuların canlıdan alınır alınmaz hızlı bir şekilde fiksasyonu son derece önemlidir. Eğer dokular hızlı bir şekilde fikse edilmezlerse hücrelerde enzimlerin açığa çıkması ile otoliz meydana gelir. Ve böylece postmortem dejenerasyon dediğimiz hücresel değişiklikler ortaya çıkar. HİSTOKİMYA Özel boyaların belirli bölgelerde yoğun şekilde tutulma gerçeği dokular içerisinde temel olarak bulunan kimyasal veya fiziksel maddelere bağlıdır ve histokimyanın temelini oluşturur. Histokimya bugün hızla gelişen bir araştırma sahasıdır ve biyokimyasal metodlarla varlıkları bilinen kimyasal bileşiklerin hücre veya doku içerisindeki özel yerlerini gösterir. Bu şekilde hücresel ve hücredışı yapıların fonksiyonları hakkında da bilgi elde edilmesine yardımcı olmaktadır. Histokimyasal metodlar şimdi pek çok inorganik ve organik maddeleri göstermek için uygulanmaktadır. İnorganik maddeler için uygulanan histokimyasal metoda örnek olarak ferrik iyonların ayırt edilmesinde kullanılan Prusya mavisi reaksiyonunun değiştirilmiş bir şeklini verebiliriz. Kesitler potasyum ferrosiyanid ile hidroklorik asit içeren bir solüsyonda inkübe edildiğinden çözülmez hale gelen ferrik ferrosiyanid tortuları koyu mavi renkte boyanırlar. Deoksiribonükleik asitin (DNA) teşhisinde tatbik edilen Feulgen reaksiyonu da histokimyasal teste bir örnektir. Bir histokimyasal testte kesitin önceden bazı maddelerle muamele edilmesi gereklidir, bu şekilde istenilen madde ya serbest bıraktırılır ya da diğer bir madde meydana getirilir ki bu da özel bir test ile açığa çıkartılır. Bazik fuksin kırmızı-eflatun renginde bir boya olup, hidroklorik asit ve sodyum bisülfit ile soluklaştırılabilir. Soluklaştırılmış boya içerisinde aldehitler karşılıklı tepkime sonucu rengi gene kırmızı-eflatun olan yeni bileşiklere dönüşür. Doku kesitinin hidroklorik asit ile hafif şekilde hidrolize edilmesi DNA'dan aldehitlerin açığa çıkmasına neden olacaktır. Eğer kesit sonradan bazik fuksinin renksiz formu içerisinde immerse edilirse DNA'dan açığa çıkan aldehitler boya ile reaksiyona girecek ve kırmızı-eflatun rengini alacaktır. Deoksiribonükleik asit (DNA) ve ribonükleik asit (RNA) in her ikisi de bazofil olduğundan, Fuelgen reaksiyonunun sonucu ikisi arasında ayırım yapılmasına müsaade edecektir (Bu şekilde bazofil maddenin DNA olduğu anlaşılacaktır). Benzer bir histokimyasal teknik de Peryodik Asid-Schiff reaksiyonudur (PAS reaksiyonu). PAS reaksiyonu, karbonhidratları ve kardonhidrattan zengin makromolekülleri (proteoglikanlar, glikoproteinler gibi) boyamaktadır. Bu yapılar, 17

18 periyodik asit ile zayıf bir şekilde okside edildiğinde bir aldehit grubu kazanırlar. Bu aldehit sonradan Schiff reagenti ile muamele edilir. Schiff reagenti, bazik fuksinin SO 4 (sülfat) ile muamele edilmesi sonucu oluşan renksiz ikincil bir üründür. PAS reaksiyonunun son ürünü kırmızı-eflatun renktedir. PAS reaksiyonu, hücrelerdeki glikojeni, hücreler ve dokulardaki mukusu, epitel dokusunda hücrelerin üzerine oturduğu bazal laminayı göstermek için kullanılmaktadır. Bununla birlikte, glikojen için en iyi metod Best'in carmine boyasıdır. Gerek PAS ve gerekse Best'in carmine boyamasında glikojeni diğer polisakkaritlerden ayırt edebiliriz. PAS reaksiyonu birçok histokimyasal test için geçerli olan belirli prensipleri simgeler. Bunlar: 1- Birincil kimyasal reaksiyon ürünü renksizdir. 2- Oluşan ürün meydana geldiği orijinal yerden belirgin şekilde etrafa yayılmaz. 3- Birincil ürün diğer bir reagentle muamele edilerek renkli bileşik haline dönüştürülebilir. 4- Bu renkli bileşik de 2. maddedeki özelliği gösterir. Enzimler de kimyasal olarak ayırt edilebilirler. Buradaki prensip kimyasal olaylar yardımı ile özel enzimlerin yerlerini belirlemektir. Kimyasal olaylar, enzimlerin in vivo olarak gösterdiği kimyasal reaksiyonların prensiplerine dayanmaktadır. İncelenecek kesit, uygun substratın da bulunması ile vücut ısısında inkübe edilir ve enzimlerin kimyasal reaksiyonu sonucu oluşan ürün belirli renkteki kimyasal bir maddeye dönüştürülür. Örneğin alkaline fosfataz enzimini göstermek için tatbik edilen Gomori metodunda bir alkali ortam içerisinde glycero-phoshate substrat olarak kullanılır ve enzim aktivitesine bağlı olarak açığa çıkan fosfat, kalsiyum iyonlarının varlığında kalsiyum fosfat haline gelir. Kesit kobalt asetat (veya gümüş asetat) içerisinde immerse edilerek kalsiyum fosfat daha kolay görülebilen kobalt sülfid (veya metalik gümüş) siyah çökeltisi haline dönüştürülür ve kesit sonradan ammonium sülfit ile çalkalanır. Bugün fosfatazlar, lipazlar, oksidazlar ve esterazlar dahil pek çok enzim için değişik metodlar uygulanabilmektedir. Histokimyadaki bütün reaksiyonlar kimyasal ilgiye dayanmamaktadır. Yağ çözücüleri ile tespit edilmemiş doku kesitlerindeki yağ Sudan III, Sudan IV ve Sudan Black-B gibi boyalarla gösterilebilir. Bu boyalar lipide fiziksel ilgi göstererek yağ tarafından absorbe edilirler. Bu boyaların kullanılması Sudanofili teriminin temelini oluşturur. İmmunositokimya, histokimyanın bir dalıdır ve günümüzde çok yaygın olarak kullanılmaktadır. Işık mikroskobu düzeyinde floresan antikor tekniği spesifik polisakkaritler veya proteinlerin yerlerinin saptanmasında duyarlı bir metoddur. Bu tekniğin temeli vücudun antijenler olan yabancı maddelere karşı antikorlar olan özel maddeleri yapması gerçeğine dayanır. Antikorlar antijenlerle birleşerek bunları inaktif hale getirir. Floresan boya molekülleri (florokromlar), antikor molekülleri ile kimyasal olarak birleşir ve üzerinde boya molekülleri taşıyan antikorların antijenler ile olan reaksiyon bölgeleri, bu sayede ultraviyole mikroskobu ile görüntülenebilir. Bu metod protein hormonları sentez eden hücreleri, enzimlerin hücre içerisindeki yerlerini ve miyozin gibi proteinlerin bulunduğu yerleri tayin etmede tatbik edilir. Bu metod bir antikoru ferritin gibi bir metalloprotein ile işaretleme suretiyle elektron mikroskopiye de 18

19 uyarlanmıştır. Ferritin doğal olarak elektron mikroskopta belirgin şekilde görülür. Bu şekilde antikor-antijen reaksiyonunun yeri kesinlikle saptanabilir. İmmümositokimyada kullanılan antikorlar, monoklonal ve poliklonal olmak üzere iki tiptir. Monoklonal antikorlar, antijen molekülü üzerindeki, antikorun kendisini tanıma bölgesi olan epitopun tek bir tanesi ile tek bir antikor üreten hücre tipinin reaksiyon vermesi sonucu üretilirler. Laboratuvarlarda tek bir hücreden özel olarak üretilen hücre klonlarından elde edildiğinden, antijen-antikor kompleksi son derece özgündür. Poliklonal antikorlar ise, antijenin birçok epitopuna karşı, farklı çok sayıdaki antikor üreten hücre tarafından üretilir. Antijenin, farklı bir canlı vücuduna verilmesi ile (bu metodla gösterilmek istenen protein diğer canlı için yabancı olduğundan antijen olarak kabul edilmektedir) vücudun tepki olarak farklı savunma hücreleri tarafından ürettiği antikorlardan elde edilmektedir. Poliklonal antikorların elde edilmesi daha kolay olmakla birlikte, antijene karşı özgünlüğü daha azdır. İmmünohistokimyasal yöntemler ile bir antijenin lokalizasyonunun belirlenmesinde, direkt ve indirekt metodlar olmak üzere 2 metod kullanılmaktadır: 1) Direkt metodda; bir antijen (protein X) içeren kesitler bu antijene spesifik antikor ile birlikte inkübe edilir. Antikor önceden floresan bir boya ile boyanır. Sonuçta antijen, antikor kompleksi ışık ya da elektron mikroskop ile gösterilebilir. 2) İndirekt metod; doku kesitleri öncelikle işaretlenmemiş bir antikor ile inkübe edilir ve sonuçta görünmeyen antijen-antikor kompleksi oluşur. 2. aşama; primer antikora karşı işaretlenmiş, sekonder antikorun üretilmesidir. Bu işlem primer antikorun başka bir hayvana enjeksiyonu ile yapılabilir. Diğer hayvandan elde edilen sekonder antikor, florasan bir boya ile boyanır ve antijeni göstermek istediğimiz doku kesitlerine uygulandığında primer immün kompleks görünür hale getirilir. Bu metod kullanılan tekniğin duyarlılığını daha da arttırmaktadır. OTORADYOGRAFİ Doku kesitlerinden yayılan radyasyonun, fotoğraf emülsiyonları üzerindeki etkileri ile radyoaktif maddelerin yerlerini belirleyerek biyolojik olayların araştırılmasını sağlar. Dokulardaki radyoaktiviteyi saptayan mikro algılayıcılar kullanılır. Araştırma amacına göre farklı moleküller kullanılabilir (radyoaktif aminoasit, radyoaktif nükleotid, radyoakitf şeker). Böylelikle proteinler, nükleik asitler, polisakkarilert ve glikoproteinler işaretlenebilir. Hazırlanan doku kesitleri fotoğraf emülsiyonu ile kaplanır. Radyasyon alan gümüş bromür kristalleri küçük metal tanecikler halinde radyoaktif molekülleri içeren yapıları örter. Böylelikle dokuda radyoaktivite gösteren yapılar seçilebilir. Bir organ ya da dokuda neyin, nerede, ne kadar sentezlendiği, nereye göç ettiği araştırılabilir. Işık ve elektron mikroskopta kullanılabilen bir uygulamadır. HÜCRE VE DOKU KÜLTÜRÜ Canlı hücreler vücut dışında da çoğaltılıp üzerinde çalışılabilir. Çünkü organizmada dokular ve organlar karmaşık bir düzen içerisinde işlev görmektedir ve bu karmaşa içerisinde tek bir molekülün bir hücre ya da doku üzerindeki etkilerini belirlemek güçtür. Hücre ve doku kültürü in vitro ortamda bunu mümkün kılmaktadır. 19

20 Hücreler ve dokular belli bileşimleri (tuzlar, aminositler, vitaminler) içeren çözelti içerisinde çoğaltılır. İstenilen hücreler enzimlerle yalıtıldıktan sonra süspansiyon halinde petri kutusu veya lam üzerinde çoğaltılır. Hazırlanan bu hücre kültürü birincil hücre kültürüdür. Çoğalan hücrelerin önemli bir miktarı kültürün ilerleyen zamanlarında yaşlanma ve bölünmenin durması gibi süreçlere girerler. Bu nedenle bazı değişikliklerle belirlenen hücre hattının ölümsüzleşmesi sağlanabilir. Bu sürece dönüşüm (transformasyon) denir. HÜCRE Vücut Komponentleri Vücut 3 temel elemandan meydana gelmiştir; bunlar hücreler, hücrelerarası maddeler ve vücut sıvılarıdır. Vücut sıvıları; kan, lenf ve doku sıvısıdır. Kan vasküler sistem içerisinde yer alırken, doku sıvısı (hücrelerarası sıvı) hücreler arasında ve çevresinde bulunur ve lenf venöz sisteme drene olan doku sıvısından oluşur. Kan ile hücrelerarası sıvı arasında serbest değişim söz konusudur. Kanın şekilli elemanları olan hücreler dışında, vücudun bu sıvı bileşikleri preparasyon esnasında kayboldukları için normal histolojik kesitlerde, görülmezler, fakat varlıklarını unutmamak gerekir. Hücrelerarası madde adından da anlaşılacağı üzere hücreler arasında yer alır, hücrelere desteklik eder ve onları besler. Bu madde primer olarak dokuların sağlamlığından sorumludur ve histolojide iki ana tip hücrelerarası madde ayırt edilir; fibröz (şekilli) ve amorf (şekilsiz) hücrelerarası madde. Şekilli hücrelerarası madde kollajen, elastik ve retiküler lifler içerir. Amorf (şekilsiz) hücrelerarası madde ground substance (temel madde) ise glikozaminoglikanlar, multiadheziv glikoproteinler ve proteoglikanlardan meydana gelmiştir. Bu maddeler proteinlere bağlı karbonhidratlardır. Glikozaminoglikanlar genellikle bir üronik asit ve bir hekzozamin içeren doğrusal disakkarit ünitlerinden oluşan polisakkaritlerdir. Glikoproteinler ise dallı monosakkarit zincirlere sahiptir. Hyaluronik asit dışındaki glikozaminoglikanlar, bir proteine bağlanarak proteoglikanları oluşturur. İlk kez 1665 yılında, İngiliz bilim adamı Robert Hooke tarafından Latince cellula olarak tanımlanan hücre, tüm canlı organizmaların yapısal ve fonksiyonel ünitidir. Birbiri ile ilişkili, benzer özelliğe sahip hücreler bir araya gelerek dokuları oluşturur. Vücudumuzda epitel, bağ dokusu, kas dokusu ve sinir dokusu olmak üzere 4 temel doku bulunur. Bu dokular bir araya gelerek organları, organlar da birlikte organ sistemlerini oluşturacaklardır. Her bir organ sistemi de sindirim, solunum, üreme gibi fonksiyonlar için özelleşmiştir. İnsan vücudu farklı fonksiyonlara sahip yaklaşık 200 hücre tipinden oluşmuştur. Bu hücrelerin tamamı oosit ve spermin birleşmesi ile oluşan zigottan meydana gelirler. Hücre farklılaşması ile kendilerine özgü proteinler sentezlerler, şekillerini değiştirirler kısacası belli işlevler için özelleşirler. Hücreler tüm canlı organizmaların yapısal birimleridir. Her ne kadar bütün sınırları tam olarak görülemezse de çoğu kesitlerin en belirgin özelliği hücrelerin 20