Enzimlerin Tanımı ve Özellikleri. Dr. Akın Yeşilkaya Eğitim Dönemi

Transkript

1 Enzimlerin Tanımı ve Özellikleri Dr. Akın Yeşilkaya Eğitim Dönemi

2 Amaç Biyokimyasal katalizörlerin yapısını ve fonksiyonunu tanımlamak Enzimatik reaksiyonların kinetiği kullanılarak özelliklerini ortaya koymak Enzimatik aktivitelerin nasıl kontrol edildiğini ve bunların metabolik olaylardaki önemini belirtmek.

3 Hedefler Enzimlerin yapısal özelliklerini, Enzimatik reaksiyonların isimlendirilmesi, Enzimatik reaksiyonların işleyişini, Enzimatik reaksiyonlara etki eden faktörleri, Enzimlerin reaksiyonları nasıl kontrol ettiğini, öğrenmek

4 İçerik Enzim nedir? Enzimlerin genel özellikleri Enzimlerin sınıflandırılması Aktivasyon enerjisi Enzim aktivitesini etkileyen faktörler Enzim Kinetiği Enzim aktivitesinin inhibisyonu Regülatör enzimler Zimojenler, İzoenzimler, Ribozimler, Abzimler

5 Enzimin tanımı Enzim nedir?

6 Katalizör Kimyasal katalizörler reaksiyona girer, reaksiyonu hızlandırır reaksiyonun sonunda değişme uğramaz. Reaktant X + Y C Z X + Y Z X + C XC + Y Z + C Y + C YC + X Z + C

7 Enzim Biyolojik Katalizör Protein yapısında olup biyolojik sistemlerde kimyasal reaksiyonları hızlandıran spesifik katalizörlerdir. Bir reaksiyonun hızı enzim varlığında kat artar.

8 Enzimler Reaksiyon dengesini bozmazlar, ancak Dengeye varış süresini kısaltırlar ve reaksiyonun daha kısa sürede gerçekleşmesini sağlarlar. A + B Enzim C + D

9 Enzimlerin yapısı, enzim substrat ilişkisi, enzimlerin adlandırması Enzimlerin Genel Özellikleri

10 Enzim Yapısı Terim Apoenzim Substrat Ürün Aktif merkez Anlam Enzimin protein kısmı Enzim ile reaksiyona giren molekül Enzimatik reaksiyon sonucunda ortaya çıkan Substratın enzime bağlandığı bölge veya reaksiyonun meydana geldiği yer

11 Enzim Komponentleri

12 Enzim Yapısı Terim Apoenzim Substrat Ürün Aktif merkez Kofaktör Koenzim Prostetik Grup Holoenzim Anlam Enzimin protein kısmı Enzim ile reaksiyona giren molekül Enzimatik reaksiyon sonucunda ortaya çıkan Substratın enzime bağlandığı bölge veya reaksiyonun meydana geldiği yer Enzimin nonprotein, inorganik kısmı Enzimin nonprotein, organik kısmı Koenzim, enzim proteinine kovalent bir bağ ile bağlanmıştır Enzim + Kofaktör/Koenzim

13 Kofaktör Kofaktörler enzim aktivitesi için esansiyel olan nonprotein moleküllerdir. Biyolojik reaksiyonlarda pek çok inorganik molekül kofaktör olarak aktivite gösterir. Kofaktör Cu 2+ Fe 2+ veya Fe 3+ K + Mg 2+ Mn 2+ Zn 2+ Enzim Sitokrom oksidaz Sitokrom oksidaz, Katalaz, Peroksidaz Piruvat kinaz Hekzokinaz, Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz, Piruvat kinaz Arjinaz, Ribonükleotid redüktaz Karbonik anhidraz, Alkol dehidrogenaz, Karboksipeptidaz

14 Koenzimler Enzimle reversible olarak bağlanabilen ve enziminin fonksiyonu için gerekli olan organik moleküllerdir. Koenzim Enzim Grup transferi Tiamin pirofosfat Piruvat dehidrojenaz Aldehit Flavin adenin nükleotid Monoamin oksidaz elektron, proton Nikotinamid adenin dinükleotid Laktat dehidrojenaz elektron, proton Piridoksal fosfat Glikojen fosforilaz amino grubu Koenzim A (KoA) Asetil KoA karboksilaz Açil grubu Biyotin Piruvat karboksilaz CO 2 5-Deoksiadenozil kobalamin Metilmalonil mutaz alkil grubu Tetrahidrofolat Timidilat sentaz tek karbonlu gruplar

15 Enzimatik Reaksiyon Enzim + Substrat Enzim-Substrat kompleksi Enzim + Ürün Kısaca E + S ES E + P Substratın enzime bağlanmasında, enzimin birincil yapısı değişmez, üç boyutlu yapısı değişir. Buna konformasyonel değişiklik denir.

16

17 Enzim (sukraz) Aktif bölge Substrat (sukroz) Glucose 4 Ürün ortama bırakılır Fructose 1 Aktif bölgesi boş 3 Substrat ürüne dönüşür 2 Substrat enzime bağlanır

18 Enzim-Substrat Etkileşimi 1. Anahtar-Kilit Modeli (1890 yılında Emil Fischer) 2. Uyarılma sonucu uyum Modeli (Koshland modeli, Uyarılmış uygunluk modeli, Induced-fit model)

19 Enzim-Substrat Etkileşimi

20 Enzim-Substrat Etkileşimi Anahtar Kilit modeli Uyarılma sonucu uyum modeli

21

22 Enzim aktivitesi Eğer bir enzim; denatüre olursa, sub-ünitelerine ayrılırsa, amino asitlerine parçalanırsa bir şekilde aktif bölgesi kapanırsa (substrat bağlayamazsa) katalitik aktivitesini kaybeder. Protein yapılı enzimlerin primer, sekonder, tersiyer ve varsa kuaterner yapıları katalitik aktiviteleri için gereklidir.

23 Enzimlerin Spesifikliğinin Nedenleri Mutlak özgüllük Grup spesifikliği Reaksiyon ve bağ spesifikliği Stereokimyasal spesifiklik

24 Mutlak Spesifiklik: Sadece tek bir substratla ilgili reaksiyonu katalizliyorsa L-Laktat dehidrojenaz O C C O O NADH + H + NAD + Laktat dehidrojenaz HO O C O CH CH 3 CH 3 Piruvat Laktat OH HO P O CH 2 Glukoz-6-fosfataz O O OH Glukoz-6-fosfataz HO CH 2 O OH HO OH HO OH OH Glukoz-6-fosfat H 2 O P i OH Glukoz

25 Grup Spesifikliği: Bazı özel fonksiyonel gruplara ilgi göstermesi Piruvat karboksilaz O O C C CH 3 Piruvat O CO 2 ATP Piruvat karboksilaz Biotin ADP + P i H 2 O C C O Okzaloasetat O C C O O

26 Reaksiyon ve bağ spesifikliği: Belli tipteki reaksiyonları katalizliyorsa Adenozin deaminaz N HO C H2 NH 2 N N O N H 2 O Adenozin deaminaz NH 4 + OH O NH N C H2 N O N HO Adenozin OH OH OH İnozin

27 Stereokimyasal spesifiklik: Belirli sterik veya optik izomeri etkileyen enzimler L-Laktat dehidrojenaz O C C CH 3 O O NADH + H + NAD + L-Laktat dehidrojenaz HO O C O CH L-Piruvat CH 3 L-Laktat

28 Enzimlerin Adlandırılması Her enzime iki isim verilmiştir. 1. Geleneksel adlandırma: A. Önceleri, enzimler için genel bir tanıma uymayan, pityalin, zimaz gibi karışık bir isimlendirme kullanılmıştır. B. Daha sonra enzimler etkili oldukları substratın sonuna az eki getirilerek (üreaz, amilaz) veya katalizledikleri tepkimeyi tanımlayan (laktat dehidrojenaz, adenilat siklaz) isimler kullanılmıştır. S1 + S2 Enzim (-az) P1 + P2

29 2. Sistematik adlandırma: Uluslararası Biyokimya ve Moleküler Biyoloji Birliği ne (IUBMB) göre enzim adlandırmaları, enzimin etkilediği tepkimenin türüne ve mekanizmasına göre yapılmakta ve buna göre uygun geliştirilen bir numara sisteminden oluşur. Buna göre: (IUBMB: International Union of Biochemistry and Molecular Biology, 1955)

30 Enzimlerin IUBMB Adlandırılması Tepkimenin Tipi Temel enzim sınıfı Vericinin Etkilediği grup E.C. X.Y.Z.Q Alıcı Olarak Yararlanılan Grup Enzim E.C. : Enzim Komisyonu

31 Enzimlerin IUBMB Adlandırılması Tepkimenin Tipi Vericinin Etkilediği grup Alıcı Olarak Yararlanılan Grup Enzim ATP-D-Heksoz-6- fosfotransferaz Transferaz Fosfat Transferi Alıcı Grup Olarak Alkol Hekzokinaz

32 Enzimlerin sınıflandırılması

33 Enzimlerin Sınıflandırılması EC 1. Oksidoredüktaz lar EC 2. Transferaz lar EC 3. Hidrolaz lar EC 4. Liaz lar EC 5. İzomeraz lar EC 6. Ligaz lar (Sentetaz)

34 Enzimlerin Sınıflandırılması EC 1. Oksidoredüktaz lar Bu enzimler oksido-redüksiyon tepkimelerini kataliz etmektedirler. 1.1 CH-OH bağı üzerine 1.2 C=O bağı üzerine Örneğin: EC , Alkol-NAD + oksidoredüktaz, Alkol dehidrojenaz R CH 2 OH + NAD + R CHO + NADH + H + Alkol Aldehit

35 Enzimlerin Sınıflandırılması EC 2. Transferaz lar Bu gruptaki enzimler bir fonksiyonel grubu bir molekülden diğerine aktarmaktadırlar. 2.1 bir karbonlu grup transferi 2.2 Aldehit veya keton grubu transferi 2.3 Açil grubu transferi Örneğin: EC , ATP:piruvat 2-O-fosfotransferaz, (Piruvat Kinaz) ADP ATP Fosfoenol piruvat Piruvat

36 Enzimlerin Sınıflandırılması EC 3. Hidrolaz lar Bu enzimler su katılması ile bağların parçalandığı hidroliz tepkimelerini katalizlemektedir. 3.1 Ester bağı hidrolizi 3.2 Glikozidik bağı hidrolizi 3.3 Eter bağı hidrolizi Örneğin: EC , L-arjinin amidinohidrolaz, (Arjinaz) H 2 O Üre Arjinin Ornitin

37 Enzimlerin Sınıflandırılması EC 4. Liyaz lar Bu gruptaki enzimler, oksidasyon veya hidrolizden başka mekanizmalarla bağlarının parçalanması veya oluşması tepkimelerinde görev yapmaktadırlar. 4.1 karboksi liyazlar 4.2 C-O bağının koparılması veya yapılması Örneğin: EC , 2-okso-asit karboksi-liyaz, (Piruvat dekarboksilaz) CO 2 O C O C O HC O CH 3 Piruvat CH 3 Asetaldehit

38 Enzimlerin Sınıflandırılması EC 5. İzomeraz lar Optik veya geometrik izomerlerin rasemizasyonu tepkimelerini katalizleyen enzim grubudur. 5.1 Rasemizasyon veya epimerizasyon 5.2 Cis-trans izomerizasyonu Örneğin: EC , Alanin rasemaz O C O O C O + H 3 N CH HC NH 3 + CH 3 L-Alanin CH 3 D-Alanin

39 Enzimlerin Sınıflandırılması EC 6. Ligaz lar C ve O, S, N arasında yeni bağ oluşumunu katalizleyen enzimlerdir. Bu tepkimelerde gerekli enerji, yüksek enerjili bir fosfat bileşiğinin hidrolizi ile sağlanmaktadır. 6.1 C-O bağı oluşumu 6.2 C-S bağı oluşumu 6.3 C-N bağı oluşumu Örneğin: EC , Süksinat KoA ligaz (Süksinat tiyokinaz) H 2 C H 2 C O C C S O O K o A G D P + P i K o A -S H G TP C H 2 H 2 C C C O O O O S ü k s in il K o A S ü k s in a t

40 Reaksiyonların yürütücü gücü Aktivasyon enerjisi

41 Enzim Enzimler reaksiyon hızını nasıl arttırırlar? E A bariyer A maddesi A maddesi 1 P maddesi 2 P maddesi

42 A maddesi P maddesine dönüşürken geçmesi gereken bariyerin tepe noktasına Transisyon durumu veya geçiş noktası denir. Geçiş durumu stabil olmayan bir ara basamaktır. Bu tepe noktasından sonra A maddesi hızla P maddesine dönüşür.

43 Aktivasyon enerjisi Bir sistemin geçiş durumuna ulaşabilmesi için ihtiyaç duyduğu enerji miktarı. Reaksiyon hızı, aktivasyon enerjisi tarafından belirlenir. Aktivasyon enerjisi düşük ise reaksiyon hızı daha büyük olur, ürün artar.

44 Enzimler reaksiyonun aktivasyon enerjisini düşürürler Enzimler reaksiyonun ΔG değerini değiştirmez.

45 Enzim aktivitesini etkileyen faktörler

46 Enzim Aktivitesini Etkiliyen Faktörler ph Sıcaklık Zaman Enzim miktarı Substrat miktarı Işık ve diğer fiziksel faktörler

47 ph Enzimler amfoterik moleküllerdir. Aktif kısımlarında ve yüzeylerinde çok sayıda asidik yada bazik grup taşırlar. Bu grupların yükleri, ortamın ph sının etkisiyle değişebilir.

48 ph nın Etkisi Bu iyonik gruplar, reaksiyonu katalizleyebilmek, substratı bağlayabilmek ve aktif merkezin konformasyonunu koruyabilmek için uygun iyonik formda bulunmalıdır. ph değişimi, enzimin net yükünü, dolayısıyla aktiviteyi, yapısal stabiliteyi ve enzimin çözünürlüğünü etkiler. Substrat iyonize olabilen gruplar içerebilir (!) Substratın sadece bir iyonik formu enzime bağlanabilir ya da katalize olabilir.

49 ph nın Etkisi Buna Göre: Enzimin reaksiyon hızı, ortamın ph sına bağlıdır. Belirli bir ph aralığında enzimin etkisi daha fazladır. Bir enzimin reaksiyonu en fazla hızlandırdığı ph'ya enzimin optimum ph sı denir. Optimum ph'nın aşağısında ve yukarısında reaksiyon hızı azdır.

50 Reaksiyonun hızı ph nın Etkisi Optimum ph

51 ph nın Etkisi Belirli ph da enzim tamamen etkisiz kalır ve çok defa tahrip olur. Enzimlerin çoğunun optimum ph sı 4-11 arasında olmakla beraber, istisnalar da mevcuttur.

52 ph nın Etkisi PEPSİN AMİLAZ TRİPSİN Örneğin ph yaklaşık 1-2 arasında en kuvvetli etki gösteren pepsin nötral ve alkali ortamda hiç etkili değildir. Optimum ph sı 9 olan tripsin ise asidik ph da etkili değildir. Optimum ph sı 7 olan amilaz nötral ph da etkilidir. Alkalen fosfataz ph 10'da en aktiftir.

53 ph nın Etkisi Optimum Aktivite için ph Enzim Optimum ph Lipaz (pankreas) 8.0 Lipaz (mide) Pepsin Tripsin Üreaz 7.0 Maltaz Amilaz (pankreas) Amilaz (malt) Katalaz 7.0

54 ph nın Etkisi Enzimin ph stabilitesi birçok faktöre bağlıdır. Sıcaklık İyonik güçler Tamponun kimyasal doğası Koruyucuların konsantrasyonu (gliserol, sülfidril bileşikleri) Metal iyonlarının konsantrasyonu Substrat ya da kofaktörlerin konsantrasyonu Enzim konsantrasyonu

55 Sıcaklık Isının başlangıçta her 10 C artışı enzim aktivitesinin %100 artmasına neden olur. Her 10 C'lık ısı artışı için reaksiyon hızında meydana gelen artışa reaksiyonun ısı katsayısı" denir ve Q10 ile gösterilir.

56 Sıcaklık Fakat belirli bir sıcaklık aşıldıktan sonra enzimler de diğer proteinler gibi denatüre olurlar ve etkilerini kaybederler.

57 Sıcaklık Her enzim için birim zamanda substratını en fazla değişikliğe uğrattığı belirli bir ısı vardır. Bu ısıya o enzimin optimum ısısı denir.

58 Sıcaklık AKTİVASYON İNAKTİVASYON OPTİMUM Hayvansal enzimlerin çoğunun optimum ısısı C arasındadır.

59 Sıcaklık Termofilik bakterilerin enzimleri daha yüksek sıcaklığa dayanıklıdır, optimum ısıları C arasındadır.

60 Zaman Bir enzim tarafından katalize edilen bir reaksiyon sürerken reaksiyonun hızı giderek düşer. Bunun nedeni; reaksiyon devam ederken oluşan ürünlerin aralarında birleşerek aksi yönde bir reaksiyon oluşturmaları, enzimin zamanla inaktive olması, reaksiyonu önleyen maddelerin teşekkül etmesi ve substratın tükenmesi gibi faktörlerdir.

61 Işık ve Diğer Fiziksel Etkenlerin Etkileri Enzimlerin etkileri ışıkla artırılabilir veya azaltılabilir. Örneğin kırmızı ve mavi ışık tükürük amilazının etkisini arttırır. UV ışık ise ters etki gösterir. Enzim çözeltisinin kuvvetlice çalkalanması da enzimi denatüre edebilir.

62 Enzim Konsantrasyonu Substrat konsantrasyonu sabit Enzim Konsantrasyonu birim Gerekli inkübasyon süresinden sonra reaksiyon hızı ölçülür

63 Enzim Konsantrasyonu Substrat konsantrasyonu sabit Reaksiyon hızı Enzim konsantrasyonu Enzim reaksiyonunun hızı enzimin substrata doygun olduğu koşullarda enzim konsantrasyonuna bağlı olarak doğrusal olarak artmaktadır. Ortamda ne kadar çok enzim molekülü varsa ve çalışıyorsa, yeterli substrat olduğu sürece reaksiyon da hızla sürecektir.

64 Substrat Konsantrasyonu Enzim konsantrasyonu sabit Substrat Konsantrasyonu birim Gerekli inkübasyon süresinden sonra reaksiyon hızı ölçülür

65 Substrat Konsantrasyonu Enzim konsantrasyonu sabit Reaksiyon hızı Vmax Substrat konsantrasyonu Enzim konsantrasyonu sabit tutularak artan substrat konsantrasyonuna bağlı olarak ulaşılan maksimum hız noktası Vmax adını alır.

66 Substrat Konsantrasyonu Enzim konsantrasyonu sabit Reaksiyon hızı ½ Vmax Vmax Km Substrat konsantrasyonu Reaksiyon hızının Vmax ın yarısındadaki (1/2 Vmax) substrat değerine de Michaelis sabiti denir ve Km ile gösterilir.

67 Enzim Kinetiği

68 Leonor Michaelis ve Maud Menten (1913) Leonor Michaelis ( ) Maud Menten ( )

69 Kinetik nedir? Kinetik; hareket olaylarını inceleyen bilim dalıdır. Hareketi ona neden olan ve o hareketten doğan kuvvetleri de göz önüne alarak inceler. Kimyasal Kinetik; kimyasal tepkimelerin hızlarını inceleyen bilim dalıdır.

70 Kinetik nedir? Termodinamik ile kimyasal bir tepkimenin yönü ve denge konumu hakkında bilgi edinmek mümkün olsa bile, hızı hakkında bilgi edinilemez. Bu nedenle; Başlangıcından son buluncaya kadar bir kimyasal tepkimenin hızı ve bu hızın hangi şartlara ya da niceliklere bağlı olduğunun incelenmesi ve tepkime mekanizmasının irdelenmesine Kimyasal Kinetik adı verilir.

71 Enzim Kinetiğinin Kullanılabildiği Alanlar Enzim-İzoenzimlerin tayininde, Enzimler yardımıyla kimyasal metabolitlerin ölçüm tekniğinde, Bazı maddelerin miktar tayininde (glukoz oksidaz ile glukoz ölçümü gibi), Hastalıkların tanı, ayırıcı tanı ve izlenmesine yardımcı olarak, Tedavi amacı ile farmakolojik ajanlar, Gıda teknolojisinde.

72 Kimyasal Hız Bir enzimatik reaksiyonda belirli bir zaman aralığında kaybolan substrat veya oluşan ürün o reaksiyonun hızını V verir. S k P k k E + S ES E + P İlk Hız (V o ): Bir reaksiyonun ters yönde gerçekleşmesi için yeterli ürün miktarı oluşmadan önceki hızdır.

73 Kinetik ve Hız Reaksiyon hızı reaktant ve ürünlerin konsantrasyonundan bağımsızdır. Hız S k P v = d [P] dt = d [S] dt = k [S] Sıfırıncı dereceden reaksiyon

74 Kinetik ve Hız Reaksiyon hızı reaktant ve ürünlerin konsantrasyona bağımlıdır. Hız S k P v = d [P] dt = d [S] dt [S] Birinci dereceden reaksiyon

75 Enzimatik reaksiyon S k P Sıfırıncı dereceden reaksiyon Hız Birinci dereceden reaksiyon [S] k 1 k 2 E + S ES E + P k -1 k -2

76

77

78 Michaelis - Menten Teorisi 1913 yılında Leonard Michaelis ve Maud Menten bu hiperbolik şekilli eğrinin matematiksel olarak nasıl ifade edileceğini bir formüle bağlamışlardır. Onlar bir enzimatik reaksiyonda ES kompleksinin önemli bir ara bileşik olduğunu önermişlerdir. k 1 E + S ES E + P k -1 k 2 k -2

79

80 Başlangıç Hız Yaklaşımı 1) Ölçümler başlangıç hızını belirlemek için yapılır (v o ). 2) v o durumunda çok az ürün oluşur. Dolayısıyla, E + P bir araya gelip tekrar ES oluşması ihmal edilebilir ve k -2 sıfıra eşittir. Yani; yerine E + S ES E + P Aynı zamanda [S] >>>[E] olduğunda, [S] sabit olarak kabul edilir. k 1 k -1 k 1 k cat E + S ES E + P yazılır k -1 k -2 k cat

81 Steady State Durumu Steady State Durumu= [ES] sabitdir. ES oluşum hızı ile ES yıkım hızı birbirine eşittir. k 1 E + S ES E + P k -1 k cat ES oluşum hızı = k 1 [E][S] ES yıkım hızı = k -1 [ES] + k cat [ES] = [ES](k -1 + k cat ) ([ES] ortak parantez)

82 Buradan. ES oluşum hızı = ES yıkım hızı k 1 [E][S] = [ES](k -1 + k cat ) ( k 1 kcat) k 1 [ E][ S] [ ES] ( k 1 kcat) k 1 K M Michaelis sabiti [ E][ S] K M [ ES]

83 K M ne anlama geliyor? K M değeri her enzim için farklıdır. K M değeri izoenzimler arasındak farkı gösterir K M değeri, mevcut enzimin yarısını doyuran substrat miktarıdır. K M değerinin düşük olması; enzimin substrata olan ilgisinin yüksek olduğunu gösterir, yani ½V max hızına erişmek için düşük konsantrasyonda substrat yeterli olmaktadır. V max V V max/2 K M değerinin büyük olması; enzimin substrata olan ilgisinin düşük olduğunu gösterir, enzimi yarı yarıya doyurmak için yüksek K M1 K M2 [S] konsantrasyonda substrat gerekir. Düşük K M sıkı bağlanma; yüksek K M zayıf bağlanma demektir.

84 Glukoz + ATP Hekzokinaz/Glukokinaz Glukoz-6-fosfat + ADP Substrat Glukoz Fruktoz Hekzokinaz 0,1 mm 1 mm Glukokinaz 10 mm -

85 Denge durumunda: [ES] oluşum = [ES] yıkım ) ( )) ( ( )) ( ( ) ( ) ( ) ( ) ( k k k S S E k k S k S E k ES k k S k ES S E k ES k k S ES k E k ES k k S ES k S E k ES k k S ES E k t t t t t t E ES E t S ES E k S E k v t ) 1 ( 1

86 Ürün oluşum hızı (hız kanunu), v = k 2 [ES]. ES Et S S K m v k 2 S E t K S m E t = [E] + [ES] v Max = k 2 E t

87 Michaelis-Menten Eşitliği Birim zamanda oluşan ürün miktarı v v S max v S K M d[ P] dt K M k k k Enzim konsantrasyonunun artışıyla beraber V m da lineer olarak artar.

88 V max Teorik maksimal hız V max bir sabittir. V max reaksiyonun teorik maksimal hızıdır ancak gerçekte ASLA elde edilemez. V max a ulaşmak için TÜM enzim moleküllerinin substrat ile sıkıca bağlanmasını gerekir ([E T ] = [ES]) Substrat arttıkça V max a asimptotik olarak yaklaşılır. V max değeri, enzim konsantrasyonuna bağlıdır. Gerçek özelliği k cat verir.

89 Turnover sayısı (k cat ) Katalitik aktivitenin bir ölçümü k cat, turnover sayısı: Enzim, substrat ile doyurulduğunda birim zamanda enzim molekülü başına ürüne çevrilen substrat moleküllerinin sayısıdır. Tüm enzimatik reaksiyonun hız sabitidir. Moleküllerin çarpışma hızı difüzyonlarına bağlıdır.

90

91 Reaksiyon hızı difüzyon limitlerine bağlıdır. Difüzyon limiti bir çok çevresel faktöre bağlıdır Ortalama difüzyon limiti yaklaşık /M. s dir

92 Lineweaver Burk Grafiği Hiperbolik eğrinin yüksek substrat konsantrasyonlarında yukarı doğru hafif eğimi nedeniyle V max a ne zaman erişildiğini saptamak mümkün olmayabilir (asimptotik) Matematiksel olarak Michaelis-Menten eşitliğinin her iki tarafını bir e bölünmesi ile elde edilir. Eğer 1/V 0, 1/[S] ye karşı çizilecek olursa düz bir çizgi elde edilir.

93 Lineweaver Burk Grafiği 1 1 v K V M S S K V S V M max max max y= ax + b y=(k M /V max )x + 1/V max (1/v)=(K M /V max )(1/S) + 1/V max y=0 olduğunda x= -1/K M x=0 olduğunda y=1/v max

94 Eadie-Hofstee Grafiği Michaelis-Menten denkleminin her iki tarafı V m ile çarpılacak olursa Eddie-Hofstee eşitliği elde edilir: v V m K m v [S]

95 Birimler Enzim aktivitesi: 1 mmol (10-6 ) substratı bir dakikada 25 o C de optimal şartlarda dönüştüren enzim miktarına bir ünite enzim aktivitesi denilir. (U) Spesifik aktivite: 1 mg enzim proteinin gösterdiği aktivitedir. Spesifik aktivite, enzim preparatının saflık derecesi hakkında fikir verir Birimi Katal dır

96 Enzim Aktivitesinin İnhibisyonu

97 İnhibitörler Enzimatik bir tepkimenin hızını azaltan ya da tamamen durduran maddelerdir. İnhibitörler reversibl yada irreversibl olarak bağlanabilirler. Niçin inhibisyon? [S] veya [P] kontrol etmek için Reaksiyona girmeyen [S] artırmak Oluşan [P] azaltmak

98 Reversibl İnhibitörler 1. Kompetitif (yarışmalı) inhibitörler 2. Nonkompetitif inhibitörler 3. Ankompetitif inhibitörler

99 Kompetitif İnhibisyon En yaygın olarak görülen inhibisyondur İnhibitör enzimin aktif yeri için substrat ile yarışır (kompetisyon) Enzimin substrata olan ilgisini azaltır.

100 Kompetitif İnhibisyon

101 Reaksiyon Şeması

102 Kompetitif İnhibisyon I ve S, E için birbirleriyle yarışır [I] nın artması [EI] yı artırır Substrat bağlayan [E] oranını azaltır İnhibisyonu devam ettirmek için [I] oranı yüksek tutulmalıdır.

103 Kompetitif İnhibisyon V 0 V αk max M [S] [S]

104 Lineweaver-Burk grafiğinin eğimini artırır. Km artar V max değişmez 1 V αk V M 1 [S] 1 0 max Vmax

105

106 Kompetitif İnhibisyon O O C CH 2 CH 2 C O O Süksinat O O C CH 2 C O O Malonat O C O C O O Okzalat Süksinat dehidrogenaz süksinatın analogları olan malonat, okzalat ve okzalasetat ile inhibe olur. Süksinat dehidrogenaz Süksinat + FAD Fumarat + FADH 2

107 Kompetitif İnhibisyon Kofaktör olarak metal iyonu gerektiren bazı reaksiyonlar benzer metal iyonları ile inhibe olabilir. Örneğin piruvat kinaz K + ile aktive, Na + ve Li + ile inhibe olur. Fosfoenolpiruvat + ADP Piruvat kinaz + K + - Na + - Li + Piruvat + ATP

108 Kompetitif İnhibisyon CH 3 OH Alkol dehidrojenaz Formaldehit Aldehid dehidrojenaz Formik asit Metanol Endüstride yaygın olarak kullanılan metanol ve araba radyatörlerinde kullanılan antifiriz zehirlenmeleri etanol ile inhibe edilerek tedavi edilir. Etanol, alkol dehidrojenaz a bağlanmak için metanol ile yarışır. CH 3 CH 2 OH Alkol dehidrojenaz Asetaldehit Aldehid dehidrojenaz Asetik asit Etanol

109 Kompetitif İnhibisyon Substrat konsantrasyonunu artırarak yarışma substrat lehine çevrilebilir.

110 Nonkompetitif İnhibisyon (Miks İnhibisyon) İnhibitör enzimin aktif olmayan bir bölgesine geri dönüşümlü olarak bağlanarak enzimi inaktivite eder. Substrat bağlanmasını bloke etmez

111 Reaksiyon şeması

112 Nonkompetitif İnhibisyon

113 Nonkompetitif İnhibisyon

114 Nonkompetitif İnhibisyon Vmax azalır Km değeri değişmez

115 Nonkompetitif İnhibisyon

116

117 Nonkompetitif İnhibisyon Aktiviteleri için Mg 2+ ve Ca 2+ metallere ihtiyaç duyan enzimler EDTA ile inhibe edilebilir. -SH gruplarına sahip enzimler Ag, Pb ve Hg gibi ağır metal iyonları ile inhibe olabilirler.

118 Nonkompetitif İnhibisyon Glikoliz de enolazın katalizlediği basamak ortama florür iyonları eklendiğinde aktivitesi için gerekli olan Mg 2+ fosfofloridat iyonları ile bağlandığı için inhibe olur. Enolaz Glukoz 2 Fosfogliserat Fosfoenol piruvat Mg 2+ Florid Piruvat kinaz Fosfoenol piruvat Piruvat Alanin

119 Ankompetitif İnhibitör Nonkompetitif inhibitör gibi, enzim üzerinde substratın bağlandığı aktif yerden ayrı bir yere reversibl olarak bağlanır ES kompleksi oluştuktan sonra enzime bağlanır ES konsantrasyonunu azaltır.

120 Reaksiyon şeması

121 Ankompetitif İnhibisyon Km ve Vmax değerleri azalır, Km/Vmax oranı sabit kalır.

122 Ankompetitif İnhibisyon Unkompetitif inhibisyon doğada daha nadir görülür. Mania nın tedavisinde kullanılan Lityum, inozitol monofosfataz inhibitörü olup bu şekilde sinyal iletiminde inozitol dönüşümünü bloke eder.

123 İnhibisyon Çeşitleri (Özet)

124 İrreversibl İnhibitörler Kovalent bağ ile enzime bağlanırlar ya da Enzim aktivitesi için gerekli olan fonksiyonel grubu yok ederler.

125

126 Aktivitesi kontrol edilen enzimler Regülatör enzimler

127 Regülatör Enzimler 1. Allosterik enzimler 2. Kovalent Modifikasyon ile regüle edilen enzimler

128 Allosterik ne demek? Allos diğer Stereos katı veya şekil diğer şekil veya farklı yapı

129 Allosterik Enzimler Eğer bir substrat molekülünün bağlanması ile boş bölgeler için yapısal veya elektronik değişimlerle birlikte afinite değişimleri söz konusu ise, hız eğrileri Michaelis-Menten kinetiğini izlemeyecek ve enzim bir allosterik enzim olarak sınıflandırılacaktır.

130 Allosterik Enzimler Enzim molekülünün aktif bir bölgesi dışında başka bir yerine nonkovalent olarak bir molekülün bağlanmasıyla kinetik özellikleri değişen enzimlerdir. Bağlanan moleküle Modulatör veya Effektör veya Regülatör molekül denilir. Modülatör molekülün bağlandığı bölgeye de regülatör bölge denilir.

131 Allosterik Enzimler

132 Allosterik Enzimler

133 Allosterik Enzimler Bir allosterik modülatör; Enzimin substratına olan afinitesini (ilgisini) değiştirebilir (K M ) Enzimin katalitik aktivitesini değiştirebilir (V M ) Hem afinitesini hemde aktivitesini değiştirebilir.

134 Allosterik Enzimler Modülatör molekül enzim üzerinde negatif veya pozitif bir etki gösterebilir. Pozitif modulatör veya pozitif effektör, Afinitesini ve/veya aktivitesini arttırabilir. Negatif Modülatör veya negatif effektör, Afinitesini ve/veya aktivitesini azaltabilir.

135 Allosterik Enzimler Allosterik enzime, bir modulatör molekül bağlanmasına sonucunda enzim, konformasyonel değişikliğe uğrar. Allosterik enzimler özellikleri nedeniyle oligomerik bir yapı gösterirler. Oligomerik yapının içinde katalitik bölge, regülatör bölge farklı yerlerde bulunur.

136 Allosterik Enzimler

137 Allosterik Enzimler

138 Allosterik Enzimler Enzimin kendi substratı effektör molekül rolündeyse Homotropik etki Farklı bir molekül effektör rolundaysa Heterotropik etkiden bahsedilir.

139 Allosterik Enzimler X A B C D E X A B C D E

140 Allosterik Enzimler X A B C D E X K L M N O

141 Hiperbolik ve Sigmoidal cevap Aynı konsantrasyondaki substrat miktarının, iki enzimin o andaki hızına olan etkisine dikkat! Aynı hızda sigmoidal cevap veren enzimin kullanmış olduğu substrat konsantrasyonuna dikkat! Michaelis-Menten, hiperbolik cevabını gösteren enzimin V max /2 hızındaki kullanmışolduğu substrat miktarı (Km) ile sigmoidal cevabı yansıtan enzimin kullandığı substrat konsantrasyonuna dikkat!

142 Allosterik Enzimler Enzim Allosterik Modülatör Aktivasyonun şekli Treonin deaminaz İzolösin - Piruvat karboksilaz Asetil CoA + Fosfofruktokinaz Fruktoz-6-fosfat + Aspartat transkarbomilaz CTP -

143 Kovalent Modifikasyon Kovalent Modifikasyon ile regüle edilen enzimler Enzime bir kovalent bağ ile bir grubun bağlanması sonucu regüle edilmesidir. Fosforilasyon Metilasyon Adenilasyon Üridilasyon Adenozin difosfat ribozilasyonu

144 Kovalent Modifikasyon Fosforilasyon En sık rastlanan modifikasyon şeklidir. Enzim proteininin bir serin, treonin veya tirozin grubunun fosforilasyonuyla veya fosforile grubunun defosforilasyonu ile enzim aktivitesi modüle edilir. Bazı enzimlerin fosfo formu aktif iken bazılarında da defosfo formu aktifdir.

145 Fosforilasyon Enzimlerin fosforilasyonu veya defosforilasyonu yine enzimlerle gerçekleşir. ATP ADP P İnaktif Enzim Kinaz Enzim Aktif Aktif ATP Fosforilaz ADP İnaktif Fosforilasyon enzimde konformasyonel değişime neden olur. Bu değişim ile birlikte substrat bağlama ve/veya enzimatik aktivitede artış veya azalış ile sonuçlanır.

146

147 Hücre içinde protein kinazların fosforilasyonu bir reaksiyon dizisini başlatır.

148 L L Adenilat siklaz a R a b g G protein Membran ATP camp R R C C Protein Kinaz A C C Fosforilasyon İnaktif Aktif

149 L L R Membran Protein kinaz 1 Protein kinaz 1 P Protein kinaz 2 Protein kinaz 2 P Protein kinaz 3 Protein kinaz 3 P Hücresel cevap

150 Kovalent Modifikasyonlar: ADP-Ribolizasyonu ADP-ribozil grubu bir koenzim olan NAD den gelir ve hedef proteine kovalent bağlarla bağlanır. Böylece proteinin inaktivasyonuna neden olur.

151 Kovalent Modifikasyonlar: ADP-Ribolizasyonu Hücrede sadece birkaç proteinde vardır. Difteri ve kolera toksinleri hücredeki anahtar enzimlerin ADP-ribolizasyonunu ve inhibisyonunu katalizlemektedir. Difteri toksini translasyonda görevli bir protein olan Elongation factor-2 nin inhibisyonuna neden olur. Kolera toksini ise G proteinine atak yapar.

152

153 Zimojenler, İzoenzimler, Ribozimler, Abzimler

154 Zimojen Proprotein olarak salgılanırlar. Protein eğer bir enzim ise Proenzim veya Zimojen denilir Proprotein Proteolitik etki Enzimatik yıkım Asidik yıkım Aktif parça Uzaklaştırılan kısım

155 Zimojen Pepsinojen-Pepsin Midede Pepsinojen Pepsin (40 kda) asidik (32,7 kda) 44 aminoasitlik birim uzaklaştırılmaktadır. Trp, Phe, Tyr, Met, Leu gibi aminoasitlerin karboksil ucundan hidrolizler X-Trp-Y-.

156 Zimojen Pankreas sindirim enzimleri de proenzim formunda salınırlar Tripsinojen-Tripsin Arg ve Lys karboksil terminalinden etki eder. Tripsinojen Enteropeptidaz Tripsin Kimotripsinojen-Kimotripsin Aromatik aminoasitlerin karboksil ucundan etki gösterir. Prokarboksipeptidaz-Karboksipeptidaz C terminalinde bulunan aminoasitleri amino ucundan hidrolizler Proelastaz-Elastaz Alifatik aminoasitlerin (Gly, Val, Ala, Ile) karboksil ucundan etkiler

157 Zimojen Enteropeptidaz Pankreas Tripsinojen Tripsin Kimotripsinojen x Proelastaz Kimotripsin x Elastaz Prokarboksipeptidaz x Karboksipeptidaz Prolipaz x Lipaz

158 Koagulasyon: Pıhtılaşma Mekanizması XI IX TF+VIIa X XIIa XIa Prekallikrein HMW Kininogen IXa Ca 2+ PL PL, Ca 2+ VIIIa Xa Protrombin PL, Ca 2+ Va Ortak Yol XIII İntrensek Yol Ekstrensek Yol Trombin Fibrinojen Fibrin Monomer XIIIa Fibrin Polimer

159 Zimojen Enzimin Zimojen formda olması diğer proteolitik enzimlere karşı korunma sağlamaktadır. Enzimatik aktivitelerin gerektiği zamanlarda devreye girmesini sağlar. Sistemin düzenli çalışmasını sağlar ve kontrol eder.

160 İzoenzimler Bir enzimin ayı reaksiyonunu katalizliyen fakat farklı fiziksel özelliklere sahip (doku dağılımı, ısı, inhibitör ve aktivatörlere yanıtı) farklı olan formlarına İzoenzim (izozim) denir.

161 İzoenzimler 1. Farklı organlarda farklı metabolik düzen. Glikojen fosforilaz glikojen yıkımı iskelet kası, karaciğer izozimleri 2. Aynı hücre içindeki izozimler için farklı yerleşimler ve farklı metabolik düzen. İzositrat dehidrojenaz sitosol ve mitokondri izozimleri 3. Embriyonik ve erişkin dokularda farklı gelişim dönemleri. LDH- fetal ve erişkin karaciğer izozimleri- malin kanserlerde fetal izozimi artar. 4. İzozimlerin allosterik modülatörlere farklı tepkileri. Karaciğer hekzokinaz ı ve doku glukokinaz ın Glukoz 6-fosfat la inhibisyona duyarlılığı farklı.

162 İzoenzimler Klinikte, total enzim aktivitesinin belirlenmesi ile karşılaştırıldığında izoenzim ölçümleri daha yararlıdır. Farklı dokulardan kaynaklanan ve hasara uğramış doku veya organı daha iyi belirleyebilen izoenzimler, özgünlüğü arttıran göstergelerdir. Bir enzimin farklı izozimlerinin dağılımı en azından dört unsuru yansıtır.

163 İzoenzimler Kreatin kinaz (CK), kreatin fosfokinaz (CPK); kreatin in fosforlanmasından sorumludur. 3 izoenzimi vardır: İzoenzim CK-1 (CK-BB) CK-2 (CK-MB) CK-3 (CK-MM) Özelliği Beyinde bulunur, serumda her zaman aktivite gösteremez. Kalp kasında bulunur; plazma düzeyi normalde total CK düzeyinin % 2 sinden azdır; miyokard enfaktüsten sonra plazma düzeyi artar. İskelet kasında bulunur, normalde plazma düzeyi total CK düzeyinin % 98 ini oluşturur.

164 İzoenzimler LDH, Laktat dehidrojenaz; Piruvat ın laktik asit e dönüşümünden sorumlu enzim. 5 tane izoenzimi vardır: LDH1, LDH2, LDH3, LDH 4, LDH5.

165 Ribozimler and Abzimler Oldukça yeni bulunmuşlardır Ribozimler Protein olmaksızın enzimatik aktivite gösteren RNA parçaları Örnek: RNaz P ve peptidil transferaz Abzimler İlgili bir reaksiyonu denge formunda tutan antikorlar (antibody, Ab) Science dergisinde, Vol. 269, sayfa (1995) bunlarla ilgili detay bilgi bulunabilir.

166

167 TEŞEKKÜRLER