BÖLÜM 1. (fosforışı). Bundan yararlanılarak karanlıkta bazı mikro yapıların izlenmesi gerçekleştirilebilmektedir.

Transkript

1 SAĞLIK YÜKSEK OKULLARI İÇİN HİSTOLOJİ (DERS NOTLARI ) Prof. Dr. Mehmet ÇAKIR

2 BÖLÜM 1 (MİKROSKOP VE TEKNİĞİ) I. Mikroskop Mikroskop, çıplak gözle izlenemeyen cisimleri tanımak ve değerlendirmek amacıyla ışın ve optik ilkelerine dayanarak yapılmış bir görme ve büyütme cihazıdır. Işık ışını, yüksek derecede ısıtılan ( a k k o r l u k ) ya da çeşitli biçimlerde enerji ile uyarılan (gazışı) cisimlerin yaydığı, görme duygusuyla algılanan ve ışıma ile yayılan bir enerji şeklidir. Cisimlerin içinde ve boşlukta her yönde yayılır. Işık ışınları dalga uzunluklarıyla ifade edilirler ve dalga uzunluklarına göre üç kısma ayrılırlar. Bunlar gözle algılana bilen (dalga uzunlukları 0.42µ ile 0.75µ arasında değişen u l t r a v i y ol e ya da m o r ö t e s i (dalga uzunlukları 0.42µ dan daha kısa olan), i n f r a r u j ya da kı rmızı ötesi (dalga uzunluğu 0.74µ 'dan daha uzun olan) ışınlardır. Işık ışınları, kaynağın çevresine yayılarak cisimleri görünür hale getirirler. Herhangi bir yüzeye düşen ışınların bir kısmı emilir, diğer bir kısmı da çeşitli yönlerde yansır. Yansıyan ışınlara bağlı olarak da cisimlerin rengi belirir. Aldığı tüm ışınları yayan cisimler beyaz ya da yansıttığı ışının dalga uzunluğuna bağlı olarak kırmızı (0.603µ ), sarı (0.573µ ), yeşil (0.523µ), mavi (0.481µ) gibi renklerde izlenir. Tüm ışınları emen cisimler de vardır. Kuramsal olarak bunların hiç görülmemesi gerekir. Ancak, emilme hiç bir zaman tam olmadığı için, cisimler kendilerini çevreleyen renkli bölgelerden ayrılır ve bunlar siyah olarak görülür. Bazı maddeler gözle izlenemeyen ışınları (X ışınları v.b.) aldıkları zaman, ışık yayma özelliği kazanırlar ( f l o r ı ş ı). Cismin bu özelliği, uyarıcı ışınların yok olmasından sonra da sürebilir (fosforışı). Bundan yararlanılarak karanlıkta bazı mikro yapıların izlenmesi gerçekleştirilebilmektedir. Bir kısım cisimler ışınları emmeden ve yaymadan içinden geçirirler. Bunlar saydam cisimler olarak tanımlanır (cam, su v.b) ve ışınları saptırırlar. Bu da kırılma olayını doğurur. Mikroskop yapımı tekniği açısından ışığın mercek tarafından kırılmasında görülen iki sapma oldukça önemlidir kromatik ve küresel. Bunlardan k r o mat i k sapma, beyaz ışığı oluşturan farklı dalga uzunluğundaki her bir rengin mercekten geçerken farklı açıda kırılması ve başka başka odaklarda toplanmasından ileri gelir. Bunun sonucu, görüntü etrafında renkli bir halka oluşur. 2

3 Küresel sapma ise mercek kalınlığının uçlarda ve merkezde aynı olmamasından ileri gelir. Işınlar kalın ve ince yerlerden geçerken farklı kırılma özelliği gösterirler ve farklı odaklarda toplanırlar. Buna bağlı olarak görüntü alanı tümüyle netleştirilemez. Işık dalgaları mikroskopta incelenen bir cisimden geçerken cisim tarafından değiştirilebilir. Eğer cisim, ışık dalgalarının dalga boyundan daha küçükse, ışık dalgalarını etkilemez. Dolayısıyla cisim görülmez. Işık mikroskoplarında, ışığın 0.42µ ile 0.75µ arasında değişen dalga boyuna sahip ışınlarından yararlanılmaktadır. Bu ışınların kırılma gücüne bağlı olarak da cisimler ancak katı bir büyüklüğe ulaştırılabilmektedir. Atomun negatif (-) yüklü parçacıkları olan elektronların keşfinden (1897) sonra bunların da ışık gibi dalgalar halinde yayıldığı ve dalga boylarının çok daha küçük olduğu manyetik halkalarla çevrelendiklerinde odaklanabildikleri görülmüştür. Bu buluşlar sonucu mikroskop yapımında, elektronlardan ışık kaynağı olarak da yararlanılmağa başlanılmıştır (1931). Yukarıda özetlemeye çalıştığımız ışık-cisim ilişkilerine bağlı olarak günümüzde farklı mikroskoplar geliştirilmiştir. Bunların kullanılan aydınlatma kaynağına göre iki ana grubu vardır: Işık mikroskobu ve elektron mikroskobu. Her iki ana grup da günün gelişen teknolojisi ve gereksinimlerine göre özel tekniklerin uygulandığı çeşitli amaçlara yönelik mikroskop tiplerini kapsamaktadır. Ancak büyütme gücü ve görüntüleri önemli farklılıklar göstermektedir. IŞIK MİKROSKOBU Bir ışık mikroskobunda mekanik ve optik olmak üzere iki ana sistem bulunur MEKANİK SİSTEM Optik sistem dışındaki metal ya da sertleştirilmiş yapay maddelerden yapılmış tüm kısımları kapsar. Bu kısımlar aşağıdaki şekilde gruplanabilirler: Ayak (taban) : Ağır metalden yapılmış, yerle temas eden tek parçalı kısımdır. Dikdörtgen, poligonal, U ya da V harfi benzeri olabilir; üzerinde veya içinde bir aydınlatma kaynağını taşır. Gövde (sehpa): Optik sistem ve diğer mekanik kısımları taşıyan metalden yapılmış bölümdür. Ayak üzerine hareketli ya da hareketsiz bir eklemle bağlanmıştır. Tabla (cisim taşıyıcısı): İnceleme materyalinin konduğu kısımdır. Materyalin hareketini sağlayan bir ayar mekanizmasını (şaryo) da taşıyabilir. 3

4 Tüp: Mikroskobun optik kısımlarını taşır. Metalden olup tabla tarafında üzerine objektiflerin yerleştirildiği değişmez bir eksen çevresinde dönebilen bir disk bulunur. Fokus gereçleri: Tüplerin ya da tablanın dikey doğrultuda az (mikro) yada çok (makro) hareketlerele kaymasını sağlayarak fokus yapımına hizmet eden bölümlerdir. OPTİK SİSTEM Tüm mikroskoplarda (iletimli) aynı yapı prensibi uygulanır ve optik sistem 5 ana kısımdan oluşur: Aydınlatma kaynağı veya Ayna, Kondansatör, Objektif, Projektif veya Oküler, Görüntü alıcı. Aydınlatma Kaynağı veya Ayna: Aydınlatma kaynağı olarak doğal ya da yapay ışıklar kullanılabilir. Yapay ışık olarak tungusten, karbon elektrotlu ve cıvalı ampullerden yararlanılır. Karbon elektrotlu ve cıvalı ampuller floresan mikroskopta kullanılır. Güneş ya da lambadan gelen ışınlar, optik eksen doğrultusunda mikroskop içine bir ayna ile yansıtılır. Güneş ışınlarından veya mikroskop dışı ışık kaynaklarından yararlanılan mikroskoplarda bulunan aynanın bir yüzü düz, diğer yüzü konkavdır. Gelen ışık yeter derecede kuvvetli ise aynanın düz yüzü, zayıf ise konkav yüzü kullanılır. Kondansatör: Cisim taşıyıcı altında, aynı eksen üzerinde dikey olarak hareket ettirilebilen, birkaç mercekten ve alt yüzüne yerleştirilmiş bir diyaframdan (apertür, kondansatör diyaframı) yapılmıştır. Diyafram, aynadan yansıyan dağınık kenar ışınlarını tutarak silindir şeklinde bir ışık demetinin kondansatöre gitmesini sağlar. Kullanılan objektifin büyütme gücü ile orantılı olarak, ışığın azaltılıp çoğaltılmasına yardımcı olur. Bu işleme bazı mikroskoplarda ışık diyaframı da eklenir. Küçük büyütmelerde diyafram fazla kısılır; büyük büyütmelerde ise açılır. Kondansatör aynadan gelen ışınları kırarak cisim üzerinde toplar. Kondansatörün cisme uzaklığı ışınların odak noktası cisim üzerinde olacak şekilde ayarlanır. Objektif: Metal bir tüp içine uygun biçimde yerleştirilmiş birkaç mercekten oluşan ve cisimin ilk büyütülmüş görüntüsü nü veren optik kısımdır. Oluşturdukları görüntüdeki ışık kusurlarının (küresel sapma, kromatik sapma) azlığı veya çokluğuna göre ayrı ayrı nitelendirilirler. Kromatik sapmanın kısmen yada tam düzetilmiş olmasına göre akromatik semiapokromatik yada apokromaitk objektifler olarak isimlendirilirler. Küresel sapma bakımından düzeltilmiş olanlar planobjektifler diye tanımlanırlar. Objektiflerde düzeltilme durumu belli simgelerle işaretlenir. Örneğin, pl.=plan, Apo.=apokromatik, Achr.=akromatik gibi. Objektifler üzerine kullanılacağı mikroskobun tüp uzunluğu (objektifin tüp üzerine vidalandığı düzlem ile okülerin üst yüzü arasındaki mesafe), preparat kapatmada kullanılacak lamellerin kalınlığı, objektifin büyütme gücü ve nümerik apertürü yazılmıştır. Tüp uzunluğu ve lamel 4

5 kalınlığını belirten rakamlar genellikle aynı sırada ve küçük puntolarla mm olarak yazılır. Örneğin 160/0, /0.17, 170/- gibi. İlk yazılan tüp uzunluğudur. Objektifler genellikle 160 mm uzunluktaki tüplerde kullanılmak üzere yapılmışlardır. Ayrıca çeşitli uzunluktaki tüpler için hazırlanmış olanları da vardır. Bu tip objektiflerin tüp uzunluğu işaretlenmemiştir. Lamel kalınlığı genellikle 0.17 mm'dir ile işaretlenmiş objektiflerde incelenecek preparatların 0.17 mm kalınlığında lamelle kapatılmış olması arzulanır. Lamelle kapatılmamış preparatların incelenmesinde kullanılan objektifler de hazırlanmıştır. Bunlar 0 ile işaretlenirler. Ayrıca değişik kalınlıkta lamel taşıyan ve lamel taşımayan preparatların incelenmesinde ortak kullanılan objektifler de vardır. Bu tür objektifler ise (-) ile işaretlenirler. Objektifin büyütme gücü ve nümerik apartürü de objektif üzerine iri puntolarla ve yan yana yazılırlar. Yazılan rakamlardan ilki objektifin kaç defa büyüttüğünü, ikincisi nümerik apertürü gösterir. Nümerik apertürü büyük olan objektifler özellikle büyük büyütmeler için daha uygundur. Çünkü hem daha fazla ayrım gücüne sahip hemde daha fazla ışık geçirirler. Objektifler kullanışlarına göre kuru sistemli yada immersiyon objektifleri olmak üzere ikiye ayrılırlar. İmmersiyon objektiflerin özelliğine göre bir sıvı (su gliserin sedir yağı) konur. Kuru sistemli objektiflerde ise preparat ve objektif arasında hava bulunur. İmmerisiyon obejktiflerin alt ucunda halka tarzında siyah bir çizgi vardır. Ayrıca bu tür objektiflerin üzerine hangi tür sıvı ile kullanılabileceği de yazılmış olabilir. Projektif veya Oküler Objektifin şekillendirdiği ilk görüntüyü tekrar büyüten ve objektifin ışık kusurlarını düzelten birkaç mercekten oluşmuş optik kısımdır.objektiflerde olduğu gibi her okülerin büyütme gücü üzerine yazılıdır. Mikroskop da iyi ve ayrıntılı bir görüntü elde edebilmek için objektife uygun büyütmeli oküler kullanmak gereklidir. Hangi objektifle hangi okülerlerin kombinasyonu gerektiği ise şu formülle bulunur. Nümerik apertürx500 En az büyütmeli oküler = Objektif büyütme gücü En fazla büyütmeli oküler =Nümerik apertürx1000 Objektif büyütme gücü Belirlenen bu iki değer arasında kalan büyütmelere sahip okülerler ayrıntılı görüntü elde etmek için idealdir. Uygulamada büyük görüntü elde etmek amacıyla yanlış olarak daha fazla büyüten oküler kullanılır. Bu yolla sadece objektifin gösterdiği ayrıntılar gereğinden fazla büyütülür ve görüntü netliğini kaybeder. Detaylı gerçek büyütmeler için büyük büyütmeli objektiflerle küçük 5

6 büyütmeli okülerler, küçük büyütmeli objektiflerle büyük büyütmeli okülerler kombine edilmelidir. Görüntü alıcı: Bu görüntüyü izleyen bir göz, fotoğraf filmi ya da flüoresan ekran olabilir. Işık Ayarı Mikroskop altında iyi bir değerlendirmenin yapılabilmesi için optik kalitenin yanı sıra iyi bir ışık ayarı da gerekir. Mikroskopta ışık ayarı için kullanılan kısım kondansatördür. Bu nedenle kondansatör ayarı ile ışık ayarı aynı anlamda kullanılmaktadır. Amaç prepatı (inceleme materyali) yeteri kadar aydınlatabilmektedir. Bunun için iki yol izlenir. Bunlardan basit olanı, her objektif değiştirmede kondansatörün pozisyonunun aşağı yukarı hareketlerle değiştirilerek prepat üzerinde yeteri kadar ışığın toplanmasının sağlanmasıdır. Küçük büyütmeli objektiflerle çalışırken kondansatör biraz aşağıya indirilir, büyük büyütmelerde yukarıya kaldırılır. Işık ayarında izlenen diğer bir yol da araştırma mikroskoplarında kullanılanıdır. Araştırma mikroskoplarının ışık ayarında kondansatör bir kez ayarlanır. Objektif değiştirmelerinde ayar yenilenmez (Köhler sistemi). Bu tür ayarlamada sırasıyla şu işlemler yapılır: -Kondansatör diyaframı iyice kısılır, -Saha diyaframı tamamen açılır, -Işık kaynağı (lamba) ile kondansatör arasında buzlu cam varsa çekilir, -Işık kaynağı ileri-geri ve gerekli yönlerde hareket ettirilerek lamba flamanının görüntüsü, kondansatör diyaframının alt yüzünde ortada olacak şekilde netleştirilir, -Saha diyaframı kısılır, -10 ya da 15 büyütmeli objektif kullanılarak preparatın net görüntüsü elde edilir, -Kısık haldeki saha diyaframının dar açıklığı görüntü alanında keskin sınırları belirinceye kadar, kondansatör aşağı yukarıya hareket ettirilir; diyafram açıklığı tam netleştiği zaman, kenarlarda mavi-yeşil bir halka görülebilir, -Preparat görüntü alanından alındığında, görüntüde diyafram açıklığı biri belirgin diğeri iz olarak çift gözlenirse, kondansatör özel mekanizması ile görüntü tek olacak şekilde sağ ve sola hareket ettirilir, sonra diyafram açıklığının netliği tekrar gözden geçirilir; gerekiyorsa ışık yolu üzerine ışığı homojen hale getirmek için buzlu cam konur, -Saha diyaframı, tüm görüntü alanı aydınlanacak düzeyde açılır. Kondansatör diyaframı sonuna kadar açılır, -Okülerden birisi çıkarılarak tüp içerisine çıplak gözle bakılır; tam aydınlık yuvarlak bir saha görülür, -Dairenin çapı 1/3'e ininceye kadar kondansöter diyaframı kısılır ve oküler yerine takılır. 6

7 Bu ayarlamadan sonra objektif değiştirmelerinde son dört işlem tekrar gözden geçirilir. Klasik Işık Mikroskobu Canlı hücre ve dokunun içerdiği elemanların büyük çoğunluğu, görülen ışığı geçirerek absorbe etmez, hafif olarak kırar. Bu nedenle hafif bir faz değişimi açığa çıkar. Bu değişimlerin göz tarafından fark edilememesi sonucu cisim ayrıntılı olarak görülemez. Klasik ışık mikroskobuyla incelemede bulunabilmek için, cisimlerin ışığı emerek genlik değişimi yapabilen cisimler haline dönüştürülmesi gereklidir. Bunun için inceleme materyallerinin özel histolojik teknikler uygulanarak boyanması zorunludur. Boyanmış preparatlarda farklı bölgelerin değişik renk ve tonda olması ışınların farklı emilmesini ve buna bağlı olarak beliren kontraslar da ayrıntıların ortaya çıkmasını sağlar. Faz-Kontrast Mikroskobu Faz-kontrast mikroskobu inceleme materyallerinin canlı ve hareketli olarak izlenebilmeleri için geliştirilmiştir. Mikroskobun ana prensibi, direkt ışın ile cisimden gözle izlenemeyecek derecede hafif kırılarak geçen ışınlar arasındaki dalga uzunluğu farkını arttırmaktır. Faz-kontrast mikroskobunda kondansatör diyaframı, a n n u l u s adı verilen, açıklığı halka şeklinde özel bir diyaframdır. Objektif içerisine yine halka şeklinde bir alana sahip özel bir faz plağı yerleştirilmiştir. Diyaframdan geçen ışınlar, içi boş bir koni oluşturarak cisim üzerine giderler. Cismi geçerken ışınların bir kısmı kırılarak zayıflar. Zayıflayan bu ışınlar faz halkasından geçerken ikinci kez zayıflarlar. Annulusdan geçen ve cisim tarafından kırılmayan ışınlar ise faz plağının halkasından geçerken kuvvetlenirler. Faz plağının yapıldığı madde bu direkt ışınları daha ileri götürecek özelliktedir Böylece gözle izlenemeyecek kadar hafif kırılan ışınlarla direkt ışınlar arasındaki dalga uzunluğu farkı arttırılmış olur ve cisim kendisini çevreleyen ortamla yeterli kontrasta görülür. İnterferenz Mikroskop İnterferenz mikroskop faz-kontrast mikroskoplardan daha belirgin olarak kolaylıkla izlenemeyecek derecedeki küçük faz değişimlerine sebebiyet veren cisimlerin yapılarının incelendiği bir mikroskop çeşididir. Bu mikroskop ile dalga boyunun 1/300 ü kadar küçük cisimlerin şekillendirdiği faz değişimleri değerlendirilebilmektedir. Canlı boyanmış ve ince kesitlerin incelenmesinde iyi sonuçlar verir. Daha çok sitoloji, hidrobiyoloji ve bakteriyoloji alanlarında kullanılır. İnterferenz mikroskobun ana prensibi, polarize ışık ve bir analizör yardımıyla iki ışın arasındaki 7

8 faz ilişkisini incelemek ve ölçmektir. Karanlık Saha Mikroskobu Örneğin planktonlar gibi tamamen polarize ışık ve bir analizör saydam olan mikroorganizmaların görülmeleri güçtür. Bunların incelenmelerinde karanlık saha mikroskoplarından yararlanılır. Bu mikroskop karanlık bir odaya giren ışık demetinin sağladığı görüntüye benzer bir şekilde çalışır. Kondansatörden gelen ışınlar saptırılır ve objektife gelmesi önlenir. İncelenen cisimler, karanlık odadaki güneş ışığı demetlerinin içerisindeki tozlar gibi, kendilerinden geçen ışınların bir kısmını çevresine saçarlar. Saçılan bu ışınlar objektife gelir ve görüntü şekillenir. Ultraviyole Mikroskobu Bazı hücre elemanları (örneğin nükleik asitler) ultraviyole ışınlarını absorbe ederler. Bu olay ultraviyole mikroskobuyla izlenebilir. Bu tür mikroskoplarda ışık kaynağı olarak ultraviyole lambaları (ark, civa buharlı, ksenon) kullanılır. Işınlar, ultraviyole için özel olan bir optik sistemini geçtikten sonra, floresan bir ekran üzerinde görüntü oluştururlar. Ultraviyole ışınları görülmeyen ışınlar (dalga boyu 0.27 µ) oldukları için doğrudan izlenemezler. Florasan bir ekrandan yararlanma zorunluluğu vardır. Gereğinde görüntü duyarlı bir plak üzerine alınarak mikro fotoğraflarıyla karşılaştırılabilir. Florasan Mikroskobu Bu mikroskop dalga boyları kısa fakat yeterli derecede enerji sağlayabilen ışınlarla aydınlatılan bazı maddelerin daha büyük dalga uzunluğunda görülebilen ışın salma özelliklerinden yararlanılarak geliştirilmiştir. Floresan özellikle ya biyolojik yapının kendisinden ya da yapının florsan yapıcı boyalarla muamelesi sonu kazandırılır. Floresan mikroskoplarda kullanılan ışık kaynakları görünen dalga boylarının en kısalarından (0.42 µ ) ya da görünmeyen, ultraviyole ve yakın ( µ) mavi ışınlardan zengindir. Bu amaçla ark lambaları, civa buharlı lambalar v.b. kullanılabilir. Işık kaynağı önüne, floresan için gerekli ışınlar dışındaki ışınların görüntü alanına girmesini önlemek amacıyla uygun filtreler konur. Ayrıca izleyicinin gözünü ultraviyolenin etkisinden korumak için okülere ultrayiyoleyi tutan filtreler takılır. Polarizasyon Mikroskobu Biyolojide polarizasyon mikroskobu, ışığı çift kıran (anizotrop) maddelerin incelenmesinde 8

9 kullanılır. Polarizasyon mikroskobunda biri kondansatör altındaki filtre taşıyıcısına (polarizör), diğeri objektif ile oküler arasına (a n a l i z ör) yerleştirilmiş iki ayrı polaroid vardır (çift Nicol prizmaları). Polarizörden geçerek tek düzlemde yayılan ışık (polarize ışık) cismi geçip analizöre geldiği zaman, analizörün ışığı geçirme düzlemi polarizörünkine paralel ise analizörü geçebilir. Bu durumda mikroskop alanı aydınlık olarak izlenir. Polarizör ve analizör eksenleri birbirine dik olacak şekilde ayarlanırsa, hiç bir ışık analizörü geçemeyeceğinden mikroskop alanı karanlık olarak izlenir. Ancak incelenen cisim içerisinde ışığı çift kıran madde varsa, bunun özel düzenlenmiş molekülleri, ışığı birbirine dik iki ayrı düzlemde yayacaktır. İkiye ayrılan bu ışınlardan birisi analizörün polarizasyon düzlemine paralel gelerek geçer ve karanlık mikroskop alanında anizoptrop maddenin parlak görüntüsü olarak belirir. İnvert Mıkroskoplar Özellikle kesit alınmadan incelenecek örnekler için kullanılır. Optik sistemi terstir. Işık, merceklerden geçerek örnek üzerine gelir, örnek tarafından yansıtılır ve tekrar mikroskobun objektifine girer. Metal mikroskobisinde çok kullanılır. Elektron Mikroskobu Dalga uzunlukları çok küçük olan elektronlardan yararlanılarak geliştirilmiş, ayırım gücü birkaç Angström'e kadar inebilen komplike mikroskoplardır. Cisimleri aydınlatmak ve görüntüsünü elde etmek için vakumda hızlandırılmış elektron demetleri kullanılır. Elektron kaynağı, genel olarak tungsten bir flamandır. Bu flamandan çıkan elektronlar bir elektrod tarafından hızlandırılır, diyaframı geçerek cisim üzerinde demet halinde toplanır. Mercek olarak kullanılan elektrostatik ve elektromanyetik alanların oluşturduğu manyetik mercekler (objektif, kırılma merceği ve projektif) cismin büyütülmüş görüntüsünü floresan bir ekran üzerine düşürür. Bu görüntüler fotoğraf plağı ya da filmi üzerine (elektron mikrografi) de alınabilir. Elektron mikroskobunda görüntü, elektronların dağılması, yani sapmasına bağlı olarak elde edilir. Sapan elektronlar optik sistemden geçmez. Görüntüde elektronları saptıran maddeler saptırma durumuna göre griden siyaha kadar farklı tonlarda, elektronları geçiren maddeler ise beyaz olarak izlenir. Elektron mikroskobunda hücre içi gelişim ve değişimler ayrıntılı olarak incelenebileceği gibi (iletimli transmisyon elektron mikroskobu, TEM) hücre dışı ayrıntıların da izlenmesi mümkündür (taramalı scanning elektron mikroskobu SEM). TEM, içinden geçen bir elektron demeti yardımıyla hücre içindeki gelişim değişimleri ayrıntılı olarak gösterir. Hücre dışı ayrıntıları göstermez. Sem ise cismin binlerce kere büyütülmüş dış görünümü olduğu gibi bir televizyon ekranına 9

10 yansıtır. SEM de elektron demetleri manyetik merceklerden geçtikten sonra eğilerek cismin yüzeyini tararlar. Bu tarama sonucu cisim yüzeyinde ikincil elektronlar oluşur. Bu ikincil elektronlar bir elektron toplayıcısında birikir ve yükseltgenerek bir katod ışınları tüpüne yollanır. Tüp içine gelen ışınlar burada tekrar ayrıştırılır ve televizyon ekranında cismin çok büyümüş, üç boyutlu bir görüntüsü şeklinde belirir. Elektron mikroskobunun keşfinden ve biyoloji alanına girişinden sonra, ışık mikroskobu ile seçilemeyen çeşitli hücre organellerinin ince yapıları (ultrastruktürleri) hakkında ayrıntılı bilgiler elde edilip, yapı-fonksiyon ilişkileri daha güçlü olarak açıklanabilmiştir. Bu gelişim zaman zaman eski klasik bilgilerin değişimine de sebep olmuştur. Günümüzde elektron mikroskobu yalnız biyoloji ve tıb alanında kullanılmamaktadır. Mineraloji, metalurji, jeoloji, kolloid kimyası, ilaç, fotoğraf, elektronik, uzay sanayi gibi teknik alanlara da yayılmış ve bu alanlardaki araştırmalarda ve rutin çalışmalarda çok önemli görevler üstlenmiş bulunmaktadır. Buna bağlı olarak mikroskop yapım sanayinde de çok büyük aşamalar kaydedilmektedir. Teknoloji ilerledikçe yeni yeni analiz yöntemlerini uygulamaya elverişli mikroskoplar geliştirilmektedir. Ancak, mikroskop için gerekli temel optik prensipler aynı kalmakta, spektromtre, mikroanaliz ve fizik test uygulama cihazları ile bilgisayar gibi çağın getirdiği yeni teknik uygulamalar mikroskoplara adapte edilmektedir. Böylece fiziksel ve kimyasal olaylar gözle izlenirken kesin nicel değerlendirmelerinin yapımı da gerçekleştirilebilmektedir. Bu gelişme hem ışık hem de elektron mikroskobu teknolojisinde izlenmektedir. II. Mikroskobik Teknik Organizmadan alınan doku ve organ parçalarının mikroskop altında görülebilir duruma getirilmesi bir seri uygulamaları gerektirir. Bu uygulamaların tümü m i k r o s k o b i k t e k n i k adı altında toplanır. Histolojik incelemeler canlı ya da cansız doku üzerinde gerçekleştirilir. Canlı Doku İncelemeleri (Vital İnceleme) Bu tür incelemeler daha çok, hücreleri normalde bir sıvı içerisinde birbirinden ayrı olarak bulunan kan, lenf, sperma gibi yapılara uygulanır. Materyal doğrudan faz, kontrast mikroskop ta ya da vital boya uygulamasından sonra klasik ışık mikroskoplarında incelenebilir. İncelemede kullanılan materyalin özelliğine bağlı olarak uygulamalar farklılık gösterir. Organizmanın hücre taşıyan sıvıları (kan, lenf, cerebrospinal sıvı gibi) temiz bir lam üzerine bir damla damlatıldıktan sonra, basınç uygulanmadan lamelle kapatılarak mikroskop altında süratle 10

11 incelenir. Gerekirse kurumayı önlemek için lamelin kenarları vazelin ya da benzeri bir madde ile kapatılabilir. Canlı yumuşak dokular (derialtı bağdokusu, mezenteriyum, epitel kazıntıları, kas ve sinir telleri, kültürler v.b.) çok küçük parçalar halinde lam üzerine alınır. Mikrodisseksiyon iğneleriyle tiftiklenerek, üzerine basınç uygulanmadan bir lamel kapatılır ve hızla mikroskop altında incelenir. Çalışmanın uzaması halinde dokunun kurumasını önlemek için organizmadaki doğal sıvılardan (lenf, kan serumu, amnion sıvısı, göz sıvısı v.b) ya da özel hazırlanan yapay sıvılarıdan (Ringer solüsyonu, seru fizyolojik v.b.) yararlanılabilir. Bu eriyiklerden biri lam üzerine lamel kapatıldığında lamel dışına taşmayacak kadar damlatılır. Sonra incelenecek materyal lam üzerindeki sıvı içerisine alınır, tiftiklenir, üzerine lamel kapatılır (basınç uygulanmaz) ve mikroskopta incelenir. Vital boyalar kullanılarak yapılacak incelemeler için, hafif dozlarda serum fizyolojik içerisinde eritilen boyalar ya organizmanın iç ortamına (in vivo) injekte edilirler ya da organizmadan alınan canlı doku ve hücreler veya doku kültürleri üzerine dışardan (in vitro) uygulanırlar. Vital boyalar az toksikdir ve hücreyi öldürmezler. Özellikle ilgi duydukları yapılarda yerleşirler. Çini mürekkebi, tripan mavisi, lityum karmen gibi boyalar in vivo olarak verildiğinde özellikle fagozitoz gücüne sahip hücrelerin görülmesinde yardımcı olurlar. Bazik karakterde ve in vitro olarak kullanılan nötral red ve krezil viyole vakuol sisteminin, Dahlia viyole nukleusun, Janus yeşili mitokondrinin, in vivo ve in vitro kullanılabilen metilen mavisi ve toluidin mavisi sinir hücrelerinin tanınmasında yardımcı olurlar. Cansız Doku İncelemeleri Bu tür incelemelerde doku ve organlardan alınan materyaller, çeşitli mekanik ve kimyasal işlemler sonucu daimi preparatlar haline dönüştürülür ve mikroskop altında incelenirler. Işık Mikroskobu Tekniği Daimi preparat hazırlama tekniği bir seri aşamalar gerektirir. Bunlar tesbit, su giderme (dehidrasyon), parlatma. bloka geçiş (impregnasyon) ye bloklama, kesit alma, boyamadır. Tespit: Histolojik incelemeler için hazırlanacak preparatlarda, doku ya da organı oluşturan yapı birimlerinin canlı yapıdaki doğal şekillerini ve yerlerini az çok korumaları istenir. Yaşamını sürdüren hücre içerisinde bir takım eritici enzimler vardır. Bu enzimler hücrenin ölümü ile birlikte sitoplazmada serbest kalırlar. Serbest kalan bu enzimler hücre proteinlerini sindirerek parçalarlar (o t o l i z). İşte bu tür değişimlere fırsat vermeden, doku ve organı oluşturan elemanları canlı organizmadakine yakın bir durumda ve hareketsiz halde tutma işlemine tesbit denir. Tesbit sonucu otoliz önlenir. Bu nedenle materyaller organizmadan ayrıldıktan sonra ne kadar süratli tesbit edilirse ölüm sonu (post mortal) değişimler o derece az olur ve yapı o derce 11

12 doğala yakın izlenir. Tesbit, Fiziksel ve Kimyasal yöntemlerle yapılabilir. Fiziksel tekniklerin esasını ısıtma, kurutma ve dondurma oluşturur. Isı ile tesbit sonu bir çok yapay görüntüler oluşmaktadır. Bu nedenle günümüzde hemen hemen terkedilmiş bir yöntemdir. Laboratuvar ısısında kurutma ile tesbit, özellikle kan ve kemik iliği yayma preparatlarının (f r o t i) hazırlamasında kullanılmaktadır. Dondurma ile tesbit ise metabolizma ve enzimatik reaksiyonların durdurulması amacıyla yapılır. Bu tür tesbitte doku parçaları kesilebilir bir kıvama da ulaştıklarından, dondurma mikrotomlarıyla doğrudan kesilebilirler. Dondurma tesbiti ve kesitleri, ısıya dayanıklı olmayan maddelerde histokimyasal reaksiyonların oluşturulması, su giderme ve parlatma aşamalannda eriyerek yapıdan ayrılan lipidlerin izlenmesi için idealdir. Tesbit daha çok kimyasal maddelerle yapılır. Bunların başlıcaları arasında formaldehid, pikrik asid, asetik asid, cıva klorür, potasyum bikromat, ozmik asid, alkol ve aseton sayılabilir. Bu maddeler saf ya da sıvı bileşikler oluşturularak kullanılabilir. Materyaller sıvı içine daldırılarak ya da buharına tutularak tesbit edilirler. Su giderme(dehidrasyon):tespit olan doku yada organ parçaları ince dilimler halinde kesilebilecek bir kıvamda değildir. Bu kıvamın kazandırılması için bir takım aşamalardan daha geçirilmesi gerekmektedir. Bunlardan birisi daha fazla sertleşmeyi sağlamak için uygulanan su giderme işlemidir. Su gederici olarak başlıca şu maddeler kullanılır: Etonal, izopropil alkol, asteon, dioksan, tetrahidrofuron. Parlatma: Bu aşamada hem dokunun kısmen parlaması hem de bir sonraki aşamada kullanılacak maddenin bir önceki aşamada kullanılan madde kadar güçlü olarak doku içerisine işlemesi sağlanır. Bunun için ksilol, toluen, benzen, kloroform gibi ayıraçlardan yararlanılır. Dioksan ve tetrahidrofuron ile su gidermelrde ikinci bir parlatma ayıracına gerek yoktur. B l o k a g e ç i ş (impregnasyon) v e b l o k l a m a: Bloklama maddesi olarak parafin, plastoid, selloidin ya da jelâtin kullanılabilir. En yaygın olanı parafin ve türevleridir. Bloklama için parlatma ayıracının doku içerisinden tamamen çıkarılması gerekir. Bunun için, örneğin parafinde bloklama işleminde, doku sırasıyla ksilolparafin karışımı, yumuşak parafin ve sert parafin içerisinden (etüvde) geçirilir. Sonra bloklanarak kesite hazır duruma getirilir. Tüm aşamalarda zaman, kullanılan solüsyonların özellikleri ve doku parçacıklarının büyüklükleri göz önünde bulundurularak ayrı ayrı belirlenir K e s i t a l m a: Dokuların iç yapısının değerlendirilmesi için 5-30 µ incelikte kesitler gereklidir. Dokulardan bu derece ince kesitler m i k r o t o m adı verilen cihazlarla alınır. Uygun kıvamda bloklanan dokular rotatif ya da kızaklı mikrotomlarda genellikle 5-7 µ inceliğinde kesilirler. Yumuşak kıvamda bloklanan ya da dondurularak kesit alınması gereken materyaller de 12

13 basit dondurma mikrotomu ya da daha gelişmiş tipi olan kriostatda kesilir. Mikrotomla alınan kesitler daha sonra lam üzerine yapıştırılır. B oy a m a: Histolojik oyalar doğal ya da sentetik kaynaklı olabilirler. Doğal boyalardan bitkisel olanlara hematoksilen ve orsein, hayvansal olanlara karmen örnek gösterilebilir. Eozin asid, pikrik, asid fuksin, oranj gelb, kongo kırmızısı, eritrosin asid özellikli ve metilen mavisi toludin mavisi jansiyan viyole, bazik fuksin, azokarmen, safranin ise bazik özellikli sentetik boyalara örnek gösterilebilir. Bunlar boyamada, çeşitli doku ve hücre kısımları tarafından farklı biçimlerde tutulurlar. Bazik boyaları tutan kısımlar b a z o f i l i k, asid boyaları tutan kısımlar a s i d o f i l i k olarak tanımlanır. Örneğin nukleus kromatini ve nukleolus bazifolik,stoplazma yapıları ise genellikle asidofilikdir. Genel olarak bazik boyarlın asid reaksiyonlu kısımlar tarafından asid boyarlın ise bazik reaksiyonlu kısımlar tarafından tutulduğu kabul edilir. Boyalar ya tek tek ya da bir kaçı birlikte uygulanır. Birleşik boyama ile yapı içerisindeki farklı bölgelerin aynı preparat üzerinde farklı renklerde izlenmesi sağlanır. Bazik boyalar, yapı birimlerini kendi boya renklerinden farklı bir renge boyarlar. Bu olay metakromazi olarak tanımlanır ve böyle boyalara metakroatik boyalar (tiyonin, toluidin mavisi v.b) adı verilir. Boyanan kesitler üzerine bir damla Kanada balzamı ya da sentetik örtücülerden biri damlatılarak lamel kapatılır. Elektron Mikroskobu Tekniği İletimli elektron mikroskobu (TEM) değerlendirmeleri için A o incelikte kesitler gereklidir. Canlı doku parçaları bu derece inceltilemediğinden vital inceleme gerçekleştirilemez. Bu nedenle sadece cansız doku parçaları incelenebilir. Dokuda Angström kalınlığında kesitler alabilmek için çok sert bloklar hazırlanır. Bu amaçla polyesterler ve vezinler kullanılır. Bu bloklardan da ultramikrotom denen alet aracılığıyla kesitler alınır. Alınan bu kesitler doğrudan doğruya mikroskop altında incelenebilir. Görüntünün daha kontrast olması arzulanırsa kesitlere boya metodları uygulanır. Bunun için kesitler atom ağırlığı yüksek elementler içeren bileşiklerle muamele edilir. Uygulama sonu bazı doku kısımları duyarlı oldukları metal tuzlarıyla çökertilmiş olurlar. Doku içerisine çökertilen bu ağır atomlar elektronları az geçirdiklerinden görüntüde koyu siyah renkte, diğer bölgeler ise griden beyaza kadar değişen farklı renk tonlarında izlenirler Taramalı elektron mikroskobundaki (SEM) değerlendirmeler için cismin herhangi bir kalınlığa ya da şekle dönüştürülmesi gerekmez. Olduğu gibi incelenir. Ancak hayvansal ve bitkisel örneklerin elektron bombardımanlarından korunabilmeleri için bir metal tabakasıyla kaplanması gerekir. Bu iş için genellikle altın kullanılmaktadır. 13

14 III. Özel Teknikler Hücre ve dokularda gerek kimyasal yapı gerekse metabolizma ve fonksiyonların daha ayrıntılı izlenebilmesi, klasik histolojik teknikler dışı özel metotlar gerektirmektedir. Bunların başlıcaları şunlardır. a. Transilluminasyon Anestezi altında bazı organlar vücut boşluğundan dışarıya alınarak saydam bir odacık içerisinde ve doğrudan mikroskop altında incelenebilir. Örneğin sıçanların oyaryumları (ovarium) ve tuba uterinaları (tuba uterina) vücut ile bağı kesilmeden bir perfüzyon odacığına alınarak ovulasyon ve oositin tuba uterinaya geçişi gözlenebilir. Benzer olarak, dışarıya alınmış bir böbreğin mikrodisseksiyon ile açığa çıkarılan nefron tubullerinde glomerular süzüntünün seyri izlenebilir. Bu yöntem organların t r a n s i l l u m i n a s y o n u ve e k s t e r i y o r i z a s y o n u olarak isimlendirilmektedir. B. Transparent Odacık Hücre ya da doku parçacıkları, organizmada doğal halde bulunan transparent odacıklar ya da organizmaya uygulanan cam odacık içine alınarak gelişmeleri izlenebilir. Bu uygulama t r a n s p a r e n t o d a c ı k metodu olarak isimlendirilir. Organizmada transparent odacık olarak gözün kamera okuli anteriyör (camera oculi anterior) bölümünden yararlanılır. Burası doğal incelemeler için çok uygun bir ortamdır. Kameraya transplante edilen dokular için gerekli kan dolaşımı kornea-iris açısındaki kapillarlar tarafından sağlanırken, kamera sıvısı (humor aqueous) fizyolojik bir sıvı, kornea camdan bir pencere görevi üstlenir. Korneadan bir mikroskop yardımı ile kamera içerisine alınan dokuların gelişmeleri izlenir. Yapay olarak, örneğin, tavşankulağına cam bir odacık yerleştirilerek içerisine transplante edilen doku parçacıkları pencere arkasından görülür gibi kolaylıkla izlenebilir. Doku parçacıkları için gerekli olan kan dolaşımı, odacığın uygulandığı kulak bölgesinin bağ dokusu tarafından sağlanmaktadır. Bu yöntemle kapillarlar, sinirlerin gelişimi, kan damarlarından lökositlerin göç edişi, yağ doku hücreleri gelişimi ve birçok histofizyolojik olaylar incelenebilmektedir. c. Mikromanipulasyon Sitofizyolojik çalışmalar için mikroşirurji metodları da geliştirilmiştir. Mikrodisseksiyon aletleri ile hücre içi yapılara kadar müdahale mümkündür. Örneğin, bir amibin nukleusu uzaklaştırıldığında amibde sentez faaliyetlerinin durduğu, yeni bir yaşama uyum sağlayamadığı izlenebilmektedir. Mikromanipulasyon çalışmaları için mikro ayırım cihazlarının tabla üzerine yerleştirildiği özel mikroskoplar ya da mikroskoplara bağlanan mikro ataşmanlar geliştirilmiştir. 14

15 d. Radyasyon Uygulması Proton mikroşuaları ve ultrayiyole ışınlarıyla hücrenin istenilen bölümleri ışınlanabilmektedir. Bunun için bir mikrodiyafram kullanılmakta ve protonların % 80'ninin 2.5 µ çapındaki bir alana düşmesi sağlanabilmektedir. Ultraviyole ışınları ile de yaklaşık bir mikron çapındaki alan etki altına alınabilmektedir. Bu uygulamayla ışınlamanın hücre üzerine etkisi incelenmektedir. Hücre organellerinden biri seçilerek ışınlanıp, normal hücre fonksiyonunda açığa çıkan değişimlerle ışınlanan organelin hücre içi görevi, önemi, gelişimi gibi özellikleri gözlenebilmektedir. Örneğin, kromozomların mitoz mekiğine bağlandığı yerler ışınlanarak kromozomun tüm hareket yeteneklerini kaybettiği, ışın etkisi altında kalan bölümlerin renksizleştiği gözlenmiştir. e. Hücre Yapı Birimlerinin Santrifüj Yoluyla Ayrımı Bu yöntemle nukleusu mitokondrileri, lizozomları, mikrozomları, ribozomları,pigment granüllerini ve farklı tip salgı granüllerini birbirinden ayırarak toplamak mümkündür. Santrifüj bu farklı yapıları birbirinden ayırmada yardımcı olmaktadır. Santrifüj için hücreler mekanik olarak bir homojenizörde parçalanır. Elde edilen hücre içi yapılardan zengin homojenat önce fizyolojik tuzlu su ya da şekerli su ile karıştırılır ve sonra santrifüje edilir. Santrifüj devri ve süresine bağlı olarak kademeli bir biçimde sırasıyla bağ doku kalıntıları, nukleus, mitokondria ve lizozomlar, serbest ribozom ve mikrozomlar, protein ve nukleik asidlerle diğer makromoleküller ayrılırlar. Bu yöntemden enzim araştırmaları ve kimyasal bileşimlerin açıklanmasına yönelik çalışmalarda yararlanılmaktadır. f. Ultra Viyole Mikrospektrofotometresi Bu yöntem ultraviyole ışınlarının absorbsiyonu esasına dayanır. Her maddenin özel bir absorbsiyon spektrumu vardır. Örneğin, nukleik asidler 0.26 µ dalga boyundaki ultraviyole ışınlarını absorbe eder. Bu dalga boyunda alınan doku parçalarının ya da hücrelerinin mikrofotografileri sonunda, nukleik asidlerin yerleştiği bölgeler koyu görülür. Bu yolla ultraviyole mikroskobu ile nukleik asid, protein ve lipid ayrımı yapılabilmektedir. g. Historadyografi Historadyografi, doku örneklerinde X ışınlarının absorbsiyonu esasına dayanır. İnce bir kemik kesiti incelemesinde kalsiyum için özel olan dalga boyuna sahip X ışınları kullanıldığında ışınlar kalsiyum tarafından absorbe edilir. Historadyogram sonunda kesit üzerinde kemik minerallerinin yayıldığı alanlar beyaz olarak görülür. Yoğunluk tesbiti ile kalsiyum kantitativ olarak da belirlenebilmektedir. h. Otoradyograf Otoradyograf, hücreler ve dokularda metabolik olayların yerleşimi ve vücuttaki özlerin tesbiti 15

16 için çok etkili bir yöntemdir.canlıya radyoaktiv madde taşıyan bir öz injekte edildikten sonra otoradyograf preparatları yapılırsa, dokuda bu bileşiklerin yerleştiği yerler tesbit edilebilir. Otoradyograf için radyoaktiv madde taşıyan histolojik kesitler karanlıkta fotoğraf emulsiyonu ile örtülür ve yine karanlıkta bir süre (gün ya da hafta) saklanır.radyoaktiv izotoplar emülsiyon üzerine etki eder. Emilsüyon maddesinin özelliğine göre yapılan banyo sonucu da röntgen filmi ya da fotograflardaki etki alanları izlenerek izotopların doku üzerinde tutulduğu yerler tesbit edilebilmektedir. i. Histokimya Histokimya, çeşitli organik ve inorganik maddelerin doku ve hücreler içindeki varlıklarını ve yerleşimlerini görüntüleyerek, doku, ve hücrelerin kimyasal yapısını ortaya koyar. Histokimyasal metod ya da reaksiyonda, aranan maddenin dokuda bulunduğu yere, bir sıra kimyasal olaylar sonucu renkli bir bileşiğin çöktürülmesi amaçlanır. Bu yolla çeşitli kimyasal maddeler (anyonlar, katyonlar, proteinler, lipidler, polisakkaritler, enzimler, pigmentler ve vitaminler gibi) histolojik kesitler üzerinde görülebilmektedir. Reaksiyon sonu beliren renkli çökeltinin durum ve şiddeti izlenerek maddenin miktarı hakkında bir değerlendirme yapılabilir. Bu değerlendirme gözle kaba bir biçimde gerçekleştirilebileceği gibi fotometrik metodlarla da daha kesin olarak yapılabilir. j. İmmunohistokimyasal Yöntem Bu yöntemin esası floresan antikor tekniğine dayanmaktadır. Bunun için doku içerisindeki yerleşimi gösterilmek istenen protein ya da polisakaritlerin antikoru hazırlanır. Antikorlar saflaştırılır ve floresan bir boya ile bağlanır. Lam üzerine yerleştirilmiş olan incelenecek doku kesitine bu boyalı antikor dökülür. Antikor, ilgili protein ya da polisakarit ile bağlanarak bir antijen-antikor kompleksi oluşturur. Antijen-antikor kompleksleri de karanlık alan içerisinde parlak, aydınlık cisimler olarak görülür. k. Doku Kültürü Doku kültürü, hücre ve dokuların organizma dışında (in vitro) yaşatılması ve çoğaltılmasını amaçlayan bir metoddur. Ana prensip, organizmadan alınan küçük doku parçasını (1-2 mm çapında) yaşamına uygun bir ortam (besin, ısı v.b.) içinde bırakmaktır. Doku kültürleri canlılıklarını yitirmeden doğrudan faz-kontrast mikroskobunda ya da vital boyalarla boyandıktan sonra klasik ışık mikroskobunda incelenebilir. İnceleme süresince hücrelerin normal yaşamlarını sürdürebilmeleri için ayrıca mikroskoplara özel ataşmanlar da bağlanmaktadır. 16

17 BÖLÜM 2 (SİTOLOJİ) CANLILARIN YAPISI Hücre : Canlı maddenin fonksiyonel birimi hücredir. Hücre canlıların en küçük yapı taşını oluşturur. Hücrenin ilk tanımı 1665 yılında Robert Hooke tarafından yapılmıştır. Bu araştırıcı şişe mantarlarından elde ettiği ince kesitlerde gördüğü boşlukları, bal peteğine benzeterek ilk olarak Cellula (Selula-oda) sözcüğünü kullanmıştır. Hücre denince canlılığını bağımsız sürdürebilen protoplazma birimi anlaşılır. En ilkel hücrelerde nüve (nucleus) bir zarla çevrili değildir. Bu tip hücrelere Prokaryotik tip adı verilir kalıtsal materyali içeren Desksiribonucleik asit (DNA) hücre içinde yaygındır. Bu tip hücrelere örnek bakteri hücresidir. Gelişmiş hücrelerde çekirden bir zarla çevrilmiştir. Bu tip hücrelere Ökaryotik hücreler denir. Bitkisel ve hayvansal hücreler bu tip hücrelere örnektir. Hücre morfolojisi : Hücrelerin şekli, yapısı ve büyüklüğü fonksiyonlarına bağlı olarak değişir. Hücre şekilleri yassı (özellikle gaz alışverişi ve diffuzyona hizmet eder), mekik, iplik (kas hücreleri), kübik, silindirik, prizmatik (çoğunlukla emilim ve salgılama görevi yapan organlarda), yuvarlak, oval (endokrin organlar v.b.), yıldız, uzantılı (mezenşimal hücreler), çokgen epidermis de olabilir. Hücrenin fonksiyonundaki değişmelere paralel olarak, şeklinde de değişim izlenir. Bu olay hücrenin iç yapısında da görülür. Hücrenin yapısındaki değişimler farklı aktivite dönemlerinde ortaya çıkar. Yüksek salgı aktivitesine sahip olan hücre, genel olarak büyük bir Golgi aygıtına sahiptir. Özellikle protein sentezi yapan hücrelerde granüllü endoplazmik retikulum iyi gelişmiştir. Metabolik aktivitedeki artış ya da azalış hem nukleus hem de çekirdekçiğin büyüklükçe artışına ya da azalışına, aynı zamanda sitoplazmik organellerin bazılarının sayısı ve büyüklükçe değişimlerine neden olabilmektedir. Hücredeki canlılık belirtileri, fiziko kimyasal özelliklere sahip kolloidal (pelte kıvamında) bir kitlede açığa çıkmaktadır. Bu ortam hücrenin esasını oluşturur ve protoplazma olarak tanımlanır. Genel olarak, normal bir hücre iki ana kısımdan yapılmıştır. Bu kısımlara sitoplazma ve nukleus (çekirdek) adı verilir. A) Sitoplazma : Sitoplazma, hücrenin çekirdek dışındaki kalan kısmına verilen isimdir. Metabolik olayların büyük bölümü burada oluşur. Kapsamına giren yapılar dört grupta toplanır. Bunlar, hiyaloplazma (temel plazma), organeller, metaplazmik oluşumlar (metaplazma) ve paraplazmik oluşumlar (paraplazma) olarak isimlendirilir. Hiyaloplazma (temel plazma): Optik araçlarla izlenemeyen bir yapıya sahiptir. Kısmen homojen ve pelte kıvamında bir eriyiktir. Hiyaloplazma sitoplazmadaki şekilli unsurların aralarını doldurarak onlara 17

18 yataklık yapar. Ayrıca mikroskobik düzeydeki yeni şekilli unsurların yapımına katılır. İpliksi polipeptit zincirleri belli yönde yanyana ve ard arda dizilerek mikroflamanları, mikro tüpcükleri yapar. HÜCRE ORGANELLERİ : Organeller hücre metabolizmasında özel görev üstlenen yapılardır. Bunlar; Plazmalemma (hücre zarı), endoplazmik retikulum, Ribozomlar, Golgi aygıtı, Lizozomlar, Mitokondri, Sentrioller, Vakuol, bitki hücrelerinde Plastidler (Kloroplast, Kromoplast, Leukoplast) bu grupta yer alır. Plazmalemma (Hücre Zarı) : Sitoplazmayı en dıştan kuşatan çok ince bir zardır. Bu zar başlıca protein ve lipidlerden yapılmıştır. Az miktarda karbonhidrat ve enzim taşır. Hücre zarının moleküler yapısıyla ilgilil araştırmalarda çeşitli modeller üzerinde durulmaktadır. İlk görüşler protein ve lipidlerin tabakalar oluştaracak tarzda üst üste dizilmesi yönünde gelişmiştir. Bu görüşe göre hücre zarı ortada iki tabakalı lipid molekülleri ile bunu içten ve dıştan kuşatan protein moleküllerinden oluşmaktadır. Son yıllarda, zar proteinlerinin kesintisiz bir örgü şekillendirmeden lipid tabakaları arasına mozayik biçiminde yerleştiği görüşü önem kazanmıştır. Günümüzde varılan sonuçlara göre biyolojik zarların yarı sıvı bir yapıda oldukları (sıvı mozaik), çeşitli hücresel zarlarda görülen yapı ve görev ayrılıklarının zar proteinlerinin çeşikliliğine, yerlerine, yerleşim ve dağılışlarına bağlı oluğu düşünülmektedir. Plazmalemma nın (Hücre Zarı) Görevleri : Hücre zarı hücrenin çevre ortamdan ayrılmasında, madde ve iyon alış verişinde, uyarı iletiminde ve hücre metabolizmasında görev üstlenir. Endoplazmik reticulum (ER) : Endoplazmik reticulum, sitoplazmanın ışık mikroskobik düzeyde ayrıntıları izlenemeyen bazofilik kısımdır. Elektron mikroskobunda dallanan, ağızlaşan, yer yer genişlemeler gösteren kanalcıkların oluşturduğu bir ağ sistemi halinde görülür. Endoplazmik retikulum ya doğrudan hiyaloplazmadan ya da nukleus un dış zarından gelişir. Çekirdek zarıyla bağlantısı çok fazla olup, çok az hücre türünde, örneğin kasda, hücre zarı ile bağlantısı görülür. Bu organel olgun alyuvarlar ve trombositler dışındaki tüm hayvansal hücrelerle bitki hücrelerinde vardır. Endoplazmik vetikulum un iki tipi vardır. a )Granüllü endoplazmik retikulum; kuvvetli protein biyosentezi yapan hücrelerde daha boldur. Örneğin pankreasını salgı yapan hücreleri ve sinir hücrelerinde olduğu gibi. Granülü endoplazmik retikulumun dış yüzeyi üzerinde düzenli aralıklarla dizilmiş küçük tanecikler bulunur, bunlara Ribozom adı verilir. Ribozomların birleşmesiyle polizom adı verilen daha iritaneler oluşur. Ribozomlar nukleoproteinden yapılmıştır. Ribozomların yüzeyinde protein biyosentezi yapılır. Demek ki, protein sentezleyen hücrelerde granüllü endoplazmik reticulum çok fazla gelişmiştir. b) Granülsüz Endoplazmik Retikulum: Işık mikroskobunda görülmeyebilir. Elektron mikroskobunda ribozomsuz üç yönlü dizilim gösteren ağlaşmış kanallar olarak izlenir. Her hücrede bulunmayabilir. En iyi geliştiği hücreler karaciğer epitel hücreleri, bazı endokrin bezlerin epitel hücreleri ve kas hücreleri söylenebilir. Endoplazmik Retikulum un Görevleri : a) İster granüllü isterse granülsüz olsun, üzerinde kimyasal reaksiyon ve sentezlemelerin yapılmasını, (Protein sentezi, Glikojen biyosentezi ve Enzim üretimi). b) Bazı iç salgı bezlerinin (adren, leydig hücreleri v.b.) steroli hormon üretiminde, 18

19 c) Karaciğerde kolesterol ve safra yapımı, glikojen ve lipid değişimi gibi metabolizma olaylarına katılma, d) Sentezlenen maddelerin, kanalcıkları ile hücrenin intra selüler olarak gereken yerlerine veya extraselüler olarak hücre dışına taşınmasını, e) Kaslarda kasılma ve gevşeme olayının gelişmesinde, f) Bu maddelerin gereğine göre küçük kesecikler içinde depo edilmesini ve olgunlaşmasını sağlar. Golgi Aygıtı : Elektron mikroskopta birbirine parelel yassı keseciklerin ve bunların şişkinleşen kenarlarının boğumlanarak ayrılmasından oluşan vakuollerin ve daha küçük yapılıştaki granülsüz endoplazmik retikulumdan kaynaklanan keseciklerin meydana getirdiği bir sistem olarak izlenir. Golgi aygıtı, monera dışında bütün insan, hayvan ve bitki hücrelerinde az çok değişik şekillerde bulunur. Golgi aygıtının şekli ve büyüklüğü hücreden hücreye ve aynı hücrenin fonksiyonel dönemleine bağlı olarak değişiklik gösterir. Golgi Aygıtının Görevleri : a) Golgi aygıtı hücrenin sekresyonla (salgı) ilgili organelidir. b) Granüllü endoplazmik retikulumda sentezlenen protein tabiatındaki salgı veya ön salgı maddeleri golgi keseciklerine geçer, burada yoğunlaştıktan, bazanda bazı değişiklere uğradıktan sonra hücre ışına çıkarılır. c) Polisakkaritlerin sentez yerinin Golgi Aygıtı olduğu söylenmektedir. d) Hücre zarının yapısına katılan makromolekülleri sentezlediği esas alınarak Golgi aygıtı hücre yüzü ile ilgili biyolojik olayları kontrol eden bir organel olarak da kabul edilir. e) Lizozomların oluşumunda da görev alır. Lizozom : Lizozomlar, ışık mikroskobuyla görülebilen tek zarla sınırlanmış keselerdir. Her hücrede bulunurlar. Büyüklükleri ve morfolojik yapıları gelişim evrelerine göre çeşitlilik gösterir. İçlerinde fosfataz (fosfat esterlerini parçalayan), esteraz (asetat esterlerini parçalayan), sulfataz (sülfat grubunu parçalayan), ketepsin (proteinleri parçalayan) ve proteinaz (geçirgenliği arttıran) gibi eritici (hidrolitik) enzimler taşır. Golgi keseciklerinden oluşur Lizozomların Görevleri: a) Lizozomların görevleri başında sitoplazmayı arıtma gelir. Hücreye dışarıdan örneğin fagositoz ve pinositoz ile alınan maddeleri ve yıpranan hücre organellerini parçalar ve sindirirler. b) Fazla salgı ürünlerini de parçalayarak hücre dışına boşaltılmalarını kolaylaştırırlar. Mitokondrium : Bütün hayvan ve bitki hücrelerinde bulunan mitokondriumar, ışık mikroskobunda çubuk yada küre şeklinde görülürler. Elektron mikroskobunda mitokondriler bir çift zarla çevrelenmiş olarak izlenir. Mitokondrium ların görevleri : a) Mitokondriler hücrenin çeşitli görevleri için enerji sağlayan, enerji üretici aerobik solunum merkezleridir. Hücrede kimyasal olayların oluşması, hücre şekli ve iç düzeninin sürdürülmesi enerji gerektirir. b) Mitokondriler protein sentezi ve lipi metabolizması için gerekli enzimleri yapar. 19

20 c) Mitokondrilerin aktif transport, impuls (uyarı) iletimi, çeşitli maddelerin biyosentesi, hareket, kontroksiyon gibi olaylarla yakın ilişkisi vardır. Vakuol (Koful) : Bir hücreli ve ilkel yapılı çok hücreli hayvanlar ile bitki hücrelerinin sitoplâzmasında tek zarla çevrilmiş olarak bulunur. Bitki hücrelerindeki vakuol hem büyük, hem de daha tipiktir ve içinde hücre öz suyu bulunur. Hayvan hücrelerinde ise iki çeşit vakuol vardır. a) Besin Vakuolü, b) Kontraktil Vakuol. Besin vakuolü bir hücreli hayvanların çoğunda ve sölenterelerin endoerm hücrelerinde görülür. En iyi şekilde protozoalardan amiplerde bulunur. Kontraktil vakuol ise yine bir hücreli hayvanlarda görülür. Kontraktil vakuol 2-3 saniyede bir kontraksiyon (kasılma) yaparak ozmoz ile hücre içine giren suyun fazlasını dışarı atmaya ve osmotik dengeyi sağlamaya yarar. Sentriol (Centriolus) : Bütün insan, hayvan hücrelerinde ve bazı yosun ve mantarlarda (protista) bulunur. Yüksek yapılı bitkilerde yoktur. Yapısı içi oyuk bir silindir görünümdedir. Sentriol, interfaz halindeki hücrelerde nukleus zarının hemen dışında yuvarlak ve açık renk bir bir sitoplazma alanının ortasında ve genel olarak çif olarak bulunur. Sentriol lerin görevi : a) Sentriol hücrede hareket organı olup, intraselüler (hücre içi) hareketin merkezidir. b) Hücre bölünmesinde önemli görev üstlenir. c) Silia ve flagellaların oluşumunda rol alırlar. Plastidler : Bitkisel hücrelerin sitoplazmasında oluşan sitoplazmik organeldir. Heterortrof bakteri ve funguslarda bulunmazlar. Hücredeki yerine ve fonksiyonuna göre bicim ve renk alırlar. Bu nedenle başlıca üç tipi gözlenir. a) Kloroplast lar, b) Kromoplast lar ve c) Leukoplast lar dır Metaplazmik Oluşumlar (Metaplazma) : Organeller dışında kalan mikroflamanlar ve mikrotubuller gibi sitoplazma yapıları metaplazmik oluşumlar olarak tanımlanır. Mikroflamanlar (mikrofibrillerin): görevi genel olarak hücrenin mekanik dayanıklılığını sağlamaktır. Mikrotubuller : Sitoplazmada dağınık olarak bulunan mikrotubuller adet spiral dizilmiş protofibril adı verilen flamanlardan oluşmuştur. Görevleri; Hücrenin mitotik (bölünme) fazında özemli görev üstlenirler. Ayrıca hücreye sağlamlık kazandırma, kasılma, hareket, madde iletimi ve hücre farklılaşması gibi olaylarda görev alır. Paraplazmik Oluşumlar (Paraplazma) : Paraplazmik oluşumlar, sitoplazmik inklizyonlar olarak da tanımlanır. Eksojen maddelerin yağılımı ya da hücrenin metabolizma ürünleridir. Bunlar organizma tarafından ihtiyaç duyulduğunda serbest bırakılan proteinler, yağlar, hormon ve enzimler, yumurta sarısı, karbonhidratlar, salgı granülleri ve pigmentlerden oluşur. Pigmentler genelde yoğunlaştığı dokulara özel renk kazandıran maddeler olarak da tanınır. Örneğin melanin, lipofuksin hemoziderin gibi. 20