TC BAŞKENT ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ. ORTOPEDİ ve TRAVMATOLOJİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 TC BAŞKENT ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ORTOPEDİ ve TRAVMATOLOJİ ANABİLİM DALI TURNİKE UYGULANAN ORTOPEDİ HASTALARINDA İSKEMİ-REPERFÜZYON HASARI SONUCU OLUŞAN OKSİDATİF HASARA KARŞI C VE E VİTAMİNİNİN KORUYUCU ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI UZMANLIK TEZİ Dr. Mehmet KIRAL ANKARA / 2012

2 TC BAŞKENT ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ ORTOPEDİ ve TRAVMATOLOJİ ANABİLİM DALI TURNİKE UYGULANAN ORTOPEDİ HASTALARINDA İSKEMİ-REPERFÜZYON HASARI SONUCU OLUŞAN OKSİDATİF HASARA KARŞI C VE E VİTAMİNİNİN KORUYUCU ETKİNLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI UZMANLIK TEZİ Dr. Mehmet KIRAL Danışman Prof. Dr. İlhami KURU ANKARA / 2012

3 İnsanın içine bir istek verildiğinde ; Onu elde etmesi için gerekenler de beraberinde verilir, Ama başarması için çok çalışması gerekebilir... Mavitüy den

4 Asistanlığım boyunca yalnız bıraktığım biricik oğlum Onur Alp e ve sevgili eşim Funda ya...

5 ÖZET Bu çalışmanın amacı: uzun süreli turnike uygulamasını gerektiren cerrahi işlemlerden önce hastalara alfa D tokoferol (E vitamini) ve C vitamini uygulaması yaparak bu vitaminlerin bilinen antioksidan etkilerinin yararlılık düzeyini istatistiki olarak ortaya koymak ve anlamlı bulunursa operasyon öncesi kullanımını önermektir. Çalışmaya, Başkent Üniversitesi Tıp fakültesi hastanesi, Ortopedi ve Travmatoloji Anabilim Dalına başvuran diz artroplastisi planlanan hastalar dahil edildi ve her grupta oniki hasta olacak şekilde, üç grup oluşturuldu. Kontrol grubundaki hastalara vitamin uygulaması yapılmazken diğer gruplara sırasıyla, C vitamini, E vitamini verildi. Vitamin C uygulaması, (C-plan 500 mg tb) hastalara ameliyattan bir önceki gün iki doz halinde oral olarak, Vitamin E uygulaması (Evicap 400 mg cap) ise ameliyattan önceki bir hafta boyunca günde iki doz halinde oral olarak uygulandı. Bu hastalardan, operasyon başlangıcında turnike öncesi ve turnike çözülmesinden sonra meydana gelen reperfüzyon sonrası (15.dakikada), venöz kanlar alınarak plazmaları ayrıldı. Tüm hastalardan alınan plazma örneklerinde lipid peroksidasyonunun göstergesi olan malondialdehit düzeyleri spektrofotometrik yöntemle ölçüldü. Deneylerin sonunda analiz sonuçlarına göre kontrol grubunda ve Vitamin C uygulanan grupta turnike sonrası plazma malondialdehit değerleri istatistiksel olarak incelendiğinde öncesi değerlere göre anlamlı olarak yüksek bulundu (p<0.01, p<0.05). Plazma MDA düzeylerinde Vitamin E uygulanan grupta ise turnike sonrası istatistiksel olarak incelendiğinde öncesi değerlere göre anlamlı bir fark bulunmadı (p>0.05). Sonuç olarak, çalısmada turnike uygulanarak alt ekstremite operasyonu geçiren hastalarda iskemi-reperfüzyonun neden olabileceği düşünülen oksidatif hasar tespit edildi. Vitamin E uygulamasının MDA oluşumunu baskıladığı, antioksidan kapasiteyi arttırdığı ve doku hasarında anlamlı düşme meydana getirdiği ortaya konmuş olup bu bulguların yapılan çalışmalar ile uyumlu olduğu görüldü. Böylece reperfüzyonun neden olduğu lokal ve sistemik komplikasyonları sınırlandırarak ekstremite dokusunda fonksiyonel iyileşmeyi hızlandırabileceği sonucuna varıldı. ANAHTAR KELİMELER: Artroplasti, Turnike, İskemi-reperfüzyon, Vitamin E, Vitamin C, Malondialdehit.

6 ABSTRACT Objective of this study is; to statistically present the effectiveness level of the known antioxidant effects of Vitamin E and Vitamin C vitamins by giving them to the patients before the surgical procedures necessitating long-term tourniquet application and if their effectiveness levels are found significant, to recommend their preoperative use. Patients who applied to the Orthopedics and Traumatology Department of Başkent University, Research and Application Hospital, by treatment of knee arthroplasty or knee arthroscophy are included in the study and three groups are formed by twelve patients in each group. As no vitamin application is performed on the patients in the control group, Vitamin C and Vitamin E is given respectively to other groups. Vitamin C application (C-plan 500 mg tb) is performed on the patients one day before the operation orally in 2 doses and Vitamin E application (Evicap 400 mg cap) is performed on the patients for one week before the operation orally in 2 doses a day. Venous bloods are taken from these patients at the beginning of the operation before the tourniquet and after the reperfusion following the resolve of the tourniquet (in minute 15) and their plasmas are seperated. In the plasma samples taken from all patients, malondialdehyde levels indicating lipide peroxidation are measured by the spectrophotometric method. As a result of the experiments; the malondialdehyde values after the tourniquet are found significantly higher in the control group and in the group on which Vitamin C is applied, in comparison to the previous values (p<0.01, p<0.05). On the other hand, in plasma MDA levels, there has been no significant difference found (p>0.05) between before and after application of Vitamin E. As a result of the study, oxidative damage thought to be resulting from ischemia-reperfusion is detected in patients undergoing lower extremity operations by the application of tourniquet. It is presented that application of Vitamin E represses MDA formation, increases antioxydant capacity and significant reduction in tissue damage and it is seen that these findings are compatible with the studies conducted. Thus it is concluded that can accelerate functional amelioration in the extremity tissue limiting local and systemic complications caused by the reperfusion. KEY WORDS: Arthroplasty, Tourniquet, Ischemia-reperfusion, Vitamin E, Vitamin C, Malondialdehyde

7 İÇİNDEKİLER Sayfa no Özet... I İngilizce özet... II İçindekiler... III Önsöz... IV Teşekkür... V Simge ve Kısaltmalar... VI Şekiller Dizini... VII Tablolar Dizini... VIII 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER MATERYAL VE YÖNTEM BULGULAR TARTIŞMA KAYNAKLAR... 38

8 ÖNSÖZ Tarih boyunca Ortopedi ve Travmatoloji müdahalelerinde kansız bir cerrahi saha her zaman ideal olmuştur.1904 yılında Harvey Cushing in tanımladığı ve 1960 lı yıllarda Klenerman ın ekstremite cerrahisinde kullanıma uygun hale getirdiği turnike, bizi cerrahi kansız saha idealine ulaştırmıştır. Beraberinde bir takım komplikasyonlarla... Ekstremite cerrahisinde turnike uygulaması iyatrojenik olarak oluşturulan bir iskemik ve perfüzyon sürecidir.cerrahi uygulamalarda turnikenin açılmasıyla birlikte iskemik kalmış olan dokunun reperfüze edilmesiyle iskemik ve perfüzyon hasarı kaçınılmaz hale gelmektedir. Bu hasarı minimalize etmek için bir takım arayışlar sürmektedir. En başta turnikenin kısa süreli uygulanması bir çözüm olmakla beraber turnikenin sağladığı avantajları da kısıtlamaktadır. İskemik ve perfüzyon hasarına sekonder oluşan oksijen radikal türevleri; zar lipleri, proteinler, nükleik asitler ve en önemlisi de deoksiribonükleik asit gibi hücresel yapılar üzerinde çoğu zaman geri dönüşümsüz hasarlara neden olmaktadır. Ve bu hasarlar malingnite gibi hayatı tehdit edebilecek boyutlara ulaşabilmektedir.temiz bir cerrahi saha için turnike uygulama isteği, aynı zamanda turnikeye sekonder yan etkilerin ortadan kaldırılma ihtiyacı, bir takım araştırmaları yönlendirmiştir. Okuyacağınız çalışma suda ve yağda eriyen antioksidan özellikleri bilinen iki vitaminin ( E ve D vitaminleri ) iskemik reperfüzyon hasarı üzerinde profilaktik etkilerinin insan üzerinde araştırılmasına yönelik bir çalışmadır. Bu çalışmanın iskemik reperfüzyon hasarına karşı dikkate değer katkı sağlayacağı inancındayım.

9 TEŞEKKÜR Hayatımızda bize destek olmuş insanlar, o desteklerini vermemiş olsalardı şu an olduğumuz yerde olamazdık şüphesiz. Çok daha fazlasını hak edenlere küçük bir teşekkürün zamanıdır. Onlardan birkaçı; Cerrahi başarıda dokuya saygının önemini öğreten Bölüm Başkanımız Prof.Dr. İsmail Cengiz TUNCAY a Travma cerrahisinin aslında ne kadar keyifli olduğunu gösteren Prof.Dr.Hüseyin DEMİRÖRS e Detaylara dikkatin cerrahi başarıdaki yerini vurgulayan Prof.Dr. İlhami KURU ya Cerrahi başarıda hasta ile iletişimin önemini gösteren Doç. Dr. Rahmi Can AKGÜN e Bulunduğu ortama kattığı pozitif enerji ile Uzm. Dr. Orçun ŞAHİN e Konya Hastanemizdeki hocalarımızdan, eğitimime büyük katkıda bulunan Doç. Dr. Salim ERSÖZLÜ ye, YRD. Doç. Dr. A.Fevzi ÖZGÜR e, YRD. Doç. Dr. Mehmet TÜKENMEZ e Her zaman çalışmaktan keyif aldığım asistan arkadaşlarıma, Ve tabiki ; En başta varlık sebebim anneme, babama... Ve yine ; Hayatıma girdiği ilk günden beri desteği ve güleryüzü eksilmeyen sevgili eşime, Sonsuz teşekkürlerimle

10 SİMGE VE KISALTMALAR İ/R: MDA: ROS: SOR: KDH: KO: NO: O -. 2 : OH. : H 2 O 2 : LOOH : TBA: SPSS: İskemi-reperfüzyon Malondialdehit Reaktif oksijen türleri Serbest oksijen radikali Ksantin dehidrogenaz Ksantin oksidaz Nitrik oksit Süperoksit radikali Hidroksil radikali Hidrojen peroksit Lipit hidroperoksit Tiyobarbütirik asit Sosyal bilimler için istatistiki paket

11 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa no Şekil 2.1. Süperoksit radikali oluşumu... 6 Şekil 2.2.Serbest oksijen radikallerinin kaynakları... 9 Şekil 2.3. Serbest oksijen radikallerinin lipitlere etkileri Şekil 2.4. Oksidatif stresle ilişkili klinik durumlar Şekil 2.5. Lipid peroksidasyonunun oluşum şeması Şekil 2.6. Malondialdehit Şekil 2.7. Reaktif oksijen ürünleri metabolizması Şekil 2.8. Antioksidan-serbest radikal dengesi Şekil 2.9. Serbest radikallerin oluşumu ve enzimatik detoksifikasyonu Şekil E vitamininin formları Şekil Antioksidan mekanizmada vitamin E ve vitamin C arasındaki ilişki Şekil Askorbik asit in kimyasal yapısı Şekil 4.1. Ameliyat öncesi ve sonrası kontrol gruplarının plazma MDA düzeyi Şekil 4.2. Ameliyat öncesi ve sonrası vitamin C gruplarının plazma MDA düzeyi Şekil 4.3. Ameliyat öncesi ve sonrası vitamin E gruplarının plazma MDA düzeyi... 33

12 TABLOLAR DİZİNİ Sayfa no Tablo 2.1. Önemli bazı serbest radikal çeşitleri, simgeleri ve özellikleri... 8 Tablo 2.2. Önemli bazı antioksidanlar, reaksiyonları ve özelikleri Tablo 2.3. Ameliyat öncesi ve sonrası Paired Samples T Testi ile kontrol vitamin C ve vitamin E gruplarının plazma MDA düzeyi ortalamaları ve standart hata değerleri

13 1. GİRİŞ Ekstremite ameliyatlarının birçoğunda ameliyat esnasındaki görüş kalitesini artırmak ve kan kaybını azaltmak amacıyla turnike kullanılmaktadır. Günümüzde turnike kullanımının yararı ve gerekliliği ile ilgili bir şüphe bulunmamakla birlikte, bu ameliyatlarda turnikenin gevşetilme zamanı ile ilgili değişik uygulamalar sürmektedir. Bazı cerrahlar cerrahi işlemin bitiminde turnikeyi gevşeterek kanarna kontrolü yapmakta, bunu takiben yarayı kapatarak kompresif bandaj uygulamaktadır. Bir diğer grup cerrah ise öncelikle yarayı kapamakta, kompresif bandaj uygulamasını yapmakta ve turnikeyi daha sonra gevşetmektedir Birinci grup; yani yarayı kapamadan turnikeyi açan ve kanama kontrolü yapanlar böylelikle ameliyat sonrası dönemdeki kanama miktarının dolayısıyla da hematoma, sekonder yara enfeksiyonu ve cilt problemleri risklerinin azalacağını savunmaktadırlar. Bu grup, turnikenin açılmasının postoperatif ödem oluşumuna önemli bir katkısı olmadığını savunmaktadır. Diğer grup, yani turnikeyi açmadan yarayı kapayarak kompresif bandaj uygulayan ve daha sonra turnikeyi gevşetenler, böylelikle hemostazla uğraşarak ameliyat süresini gereksiz yere uzatmadıklarını ve ayrıca kompresif bir bandaj uygulaması yapılmadan önce turnikenin açılmasıyla ortaya çıkabilecek olan ödem oluşumunun da önüne geçtiklerini savunmaktadırlar. Vasküler, ortopedik ve rekonstrüktif cerrahide intraoperatif kanamayı azaltması ve cerrahi işlemi kolaylaştırması nedeniyle yaygın olarak kullanılan turnike uygulaması aynı zamanda istemli oluşturulan bir İ/R modelidir. Açığa çıkan toksik oksidanlar hem turnike uygulanan organlarda hem de dolaşıma geçerek uzak organlarda hasara yol açmaktadır. Yapılan literatür taramalarında C ve E vitamininin turnike uygulamalarında operasyon öncesi kullanımına dair insanlar üzerinde yapılmış bir çalışmaya rastlanmamıştır. Bu çalışmadaki amaç uzun süreli turnike uygulamasını gerektiren cerrahi işlemlerden önce hastalara alfa D tokoferol (E vitamini) ve C vitamini uygulaması yaparak bu vitaminlerin bilinen antioksidan etkilerinin yararlılık düzeyini istatistiki olarak ortaya koymak ve anlamlı bulunursa operasyon öncesi kullanımını önermektir 1

14 2. GENEL BİLGİLER 2.1.Turnike Turnike günümüzde ortopedik cerrahide sık kullanılan bir yöntemdir. Turnike 1904 yılında Harvey Cushing tarafından tanımlanmıştır. Ekstremite cerrahisinde yaygın kullanımı ise Klenerman ın 1960 lı yıllardaki çalışmalarıyla olmuştur(1,2,3,4) Turnike uygulaması ile oluşan hemodinamik ve metabolik değişiklikler; turnike fazına (inflasyon-deflasyon), turnike inflasyon süresine, iskemik alanın büyüklüğüne, anestezi yöntemine ve hastanın kardiyovasküler durumuna göre değişir (5). Hemodinamik değişiklikler sağlıklı kişilerde minimal olmakla birlikte, zayıf kardiyak rezervi olan hastalar turnike inflasyonu veya deflasyonunu tolere edemeyebilirler (6). İnflasyondan sonra periferik vasküler rezistans ve venöz kan volümü artışına bağlı olarak sistemik arter basıncı ve kardiyak debi hafif yükselir. Santral venöz basınç ve sistolik kan basıncındaki bu geçici artış yavaş yavaş turnike öncesi düzeye geri döner. Ancak, zayıf ventriküler kompliyansı veya yaygın variköz venleri olan hastalarda pulmoner arter basıncında önemli artış izlenebilir. Uyluğa bilateral turnike uygulanan hastalarda, dolaşım yüklenmesi ve kardiyak arrest bildirilmiştir (5,6,7). Deflasyon ile iskemik ekstremitenin reperfüzyonu başlar. Postiskemik reaktif hiperemi ile birlikte periferik vasküler rezistansın azalması ve ekstremitenin reperfüzyonu sonucu büyük volümde kanın ekstremiteye geri dönmesi, pulmoner 2

15 vasküler rezistans, santral venöz basınç ve arteriyel kan basıncında azalmaya neden olur (5,6,7). Turnike deflasyonu ile iskemik alandan hiperkapnik venöz kanın sistemik dolaşıma geçmesi ve kardiyak debinin artması end tidal karbondioksit (ETCO 2 ) de geçici artışa neden olur. Bu artış alt ekstremite turnike deflasyonlarından sonra daha fazla görülmektedir (5). Turnikeden sonra ekstremitenin reperfüzyonu, pulmoner mikrovasküler zedelenmeye neden olur; pulmoner kapiller membran permeabilitesi artar ve ödem oluşur. Akciğerlerde nötrofil sekestrasyon artışı da gösterilmiştir (8). Turnikenin oluşturduğu metabolik değişiklikler, basınçtan çok turnike süresinin uzunluğu ile ilişkilidir (5). Bir, iki saatlik iskemiden sonra turnike deflasyonu ile arteriyel plazma K+ ve laktat konsantrasyonlarında orta dereceli bir artış izlenir. Laktat anaerobik metabolizma son ürünüdür. Doku hipoksisi, hematolojik, solunumsal ve hücresel disfonksiyon laktat üretimini arttırır (5,6). Deflasyonun 2. dk sinde oksijen tüketimi, CO 2 üretimi artar. Sekiz dk içinde deflasyon öncesi değerine döner. Karbondioksit üretimindeki artış, O 2 tüketiminin 3 katıdır. İskemik ekstremitede laktat ve CO 2 artışı, maksimum 4. dk de olmak üzere arteriyel ph de geçici azalmaya neden olur. Tüm bu metabolik değişiklikler dk de normale döner. Venöz O 2 saturasyonu %20 oranında düşerken, pulmoner şant oluşmadıkça arteriyel O 2 saturasyonunda azalma nadir görülür (5,6,7,9). İskemi sırasında oluşan süperoksit radikallerin endotelyal zedelenmeye neden olması ve kompresyonun oluşturduğu direkt mikrovasküler zedelenme, turnike deflasyonunun ardından mikrovasküler permeabilite artışına yol açar. İskemi, ödem ve mikrovasküler konjesyonun oluşturduğu etkiler post-turnike sendromu olarak 3

16 adlandırılır. Bu sendrom, ekstremitede paralizi olmaksızın katılık, solukluk, güçsüzlük ve hissizlik ile karakterlidir (6) Turnikenin uygulanışı Turnikeye bağlı komplikasyonların önlenmesi için operasyon esnasında bazı kurallara uyulması gerekmektedir. Örneğin manşonun ciltle temasını önlemek için en az 2 kat yumuşak pamuk sarılır. Şişman hastalarda kaymayı önlemek icin cilt ve cilt altı dokusu olabildiğince distale çekilip, sonra turnike manşonu şişirilmelidir (10). Her kullanımdan önce basınç ölçen kısmı, mutlaka kontrol edilmelidir. Manşon sarıldıktan sonra pamuklu bir elastik bandajla parmak uçlarından bağlanıp, turnike seviyesine kadar tüm kan, ekstremiteden boşaltılır. Enfeksiyon veya tümör cerrahisinde mutlaka turnike kullanılmak isteniyorsa bu tür bir boşaltma yerine, ekstremite 5 dakika yükseltilerek turnike şişirilir (10,11). Turnike basıncının ne olması gerektiği halen tartışmalıdır. Elde edilen bulgular, bugüne kadar gerekenden daha büyük basınçlar kullanıldığı yolundadır. Doğru basınç hastanın yaşı, kan basıncı ve ekstremitenin boyutuyla ilgilidir (12) Klenerman alt ekstremitede, koldan ölçülen sistolik basıncın iki katını kullanmayı önermektedir (13). Turnikenin şişirildiği saat mutlaka not edilmelidir. Basınç göstergesi anestezistin görebileceği bir yere konmalı ve en küçük basınç oynamaları, cerraha iletilmelidir. Elli yaşın altındaki sağlıklı yetişkinlerde tercih edilen turnike süresi kolda maksimum 1 saat, uylukta ise 1,5 saat olmalıdır. Eğer daha fazla süre gerekliyse 10 dakikalık reperfüzyondan sonra operasyona devam etmelidir. Ancak toplam sure kesinlikle 2 saati gecirilmemelidir. Ancak bazı ciddi komplikasyonlarda 2 saatlik limit aşılabilmektedir (11,14,15). 4

17 2.2. İskemi ve Reperfüzyon Hasarı İskemi, organ veya doku kan akımındaki yetersizliğe bağlı olarak gelişen geriye dönüşümlü veya dönüşümsüz hücre/doku zedelenmesine neden olmaktadır. Geri dönüşsüz hücre hasarını önleyebilmek için organ veya dokuya yeniden kan akımının sağlanması gerekmektedir. Ancak reperfüzyonun gerçekleşmesi, iskemik dokularda iskeminin organ veya dokuda oluşturduğu hasardan daha fazla hasara yol açabilmektedir. Buna reperfüzyon hasarı denir (16). Arteriyel ya da venöz kan akımı azalmasına bağlı organ ve dokunun yetersiz perfüzyonu sonucu bu doku veya organların oksijenden yoksun kalması şeklinde tanımlanan iskemi, hücresel enerji depolarının boşalması ve toksik metabolitlerin birikmesi sonucunda hücre ölümüne yol açmaktadır. İskemik dokuya hem hücrenin rejenerasyonu, hem de toksik metabolitlerin temizlenmesi için yeniden kan akımı gerekir. Ancak, iskemik dokunun reperfüzyonu dokuda paradoksal olarak sadece iskemi ile oluşan hasara göre çok daha ciddi bir hasara yol açar(17). Reperfüzyon döneminde gözlenen hasarda, hücre içine moleküler oksijen girişi ile hızla oluşan serbest oksijen radikal (SOR) türevleri başta olmak üzere birçok mekanizma rol oynamaktadır. Reperfüzyon hasarına en fazla duyarlı olan hücresel yapılar, zar lipitleri, proteinler, nükleik asitler ve deoksiribonükleik asit molekülleridir.(18). İskemik dönemde hücrede metabolik ve yapısal değişiklikler meydana gelir. Dokuya gelen kan akımının kesilmesi ile hücresel oksidatif fosforilasyon azalır ve adenozin 5 -trifosfat ve fosfokreatin gibi yüksek enerjili fosfat sentezi azalır(19). Hücrede enerji depolarının boşalması ile hücre zarında bulunan Na +,K + -ATP az pompası inhibe olur. Sonuçta hücre içinde Na + ve Ca +2 iyon konsantrasyonları artar(20). 5

18 Hücre içinde Ca +2 iyon konsantrasyonunun artışı hücre için sitotoksiktir(21). Nitekim yine bu dönemde hücrede iyon konsantrasyonunun değişimi ile proinflamatuar sitokinlerin lökosit adhezyon moleküllerinin yapımında artış, buna karşılık antioksidan enzimlerin oluşumunda azalma olur. Bu durum hücreyi reperfüzyon dönemindeki hasara karşı dayanıksız kılar. İskemi döneminde ATP üretimi durduğu halde kullanımı devam ettiği için ATP den AMP ve adenozin oluşur. Adenozin, hızla hücre dışına difüze olur ve inozin ve hipoksantine parçalanır. Dolayısıyla, iskemi sonucu yüksek enerjili fosfat bileşiklerinin (ATP) yıkımı, dokuda ksantin ve hipoksantin gibi pürin metabolitlerinin birikimine ve ksantin dehidrojenazın (KDH) ksantin oksidaza (KO) dönüşümüne yol açar. Normal şartlarda hipoksantin ürik asite metabolize olur ve bu reaksiyonda elektron alıcı NAD+ (nikotinamid adenin dinükleotidin okside formu) dir. Ancak hipoksi ya da iskemi nedeniyle KDH KO a dönüştüğünden hipoksantinin ürik asite dönüşümü KO tarafından gerçekleşir ve bu reaksiyonda ise elektron alıcı olarak moleküler oksijen kullanılır(22). Şekil 2.1. Süperoksit radikali oluşumu. İskemi-reperfüzyon (İ/R) hasarının fizyopatolojisi ile ilgili çeşitli faktörler ileri sürülmüştür. Bunlar birbiriyle ilişkileri karmaşık, hücresel ve humoral olaylar serisidir(24, 25). 6

19 Özellikle; 1-Serbest oksijen radikalleri 2-Polimorf nüveli lökositler (PMNL) 3-Kompleman sistemi 4-Endotel hücreleri olmak üzere başlıca dört faktör hasarın nedenleri arasında yer almaktadır Serbest Oksijen Radikalleri Serbest radikal, eşlenmemiş elektron içeren atom veya moleküldür. Genelde elektronlar atom veya molekülde eşlenik olarak bulunmaları nedeniyle molekül stabildir ve reaktif değildir. Ancak, moleküle bir elektron ilavesi ya da bir elektron kaybı onu reaktif hale getirir (26). Organizma sürekli olarak serbest radikal ataklarıyla karşı karşıyadır. Atmosferin % 21 ini teşkil eden oksijenin aerobik organizmanın yaşamı için gerekliliği kaçınılmazdır. Serbest radikaller fizyolojik şartlarda ve dış etkenlere karşı organizmanın savunmasında da belirli oranda oluşur ve içsel mekanizmalarla organizmaya olabilecek zararlı etkileri önlenir. Biyolojik sistemlerde oluşan serbest radikallerin endojen kaynakları oksijen, nitrik oksit (NO), uyarılmış nötrofil, mitokondriyel elektron transport sistemi, endoplazmik retikulum, peroksizom ve plazma membranı olarak sayılabilir. Solunan oksijenin % 95 inden fazlası mitokondrilerde ATP şeklinde enerji oluşumunda kullanılırken, yaklaşık % 5 i de son yörüngelerinde ortaklanmamış elektron içeren ve bu özellikleri nedeniyle de toksik serbest radikallere dönüşmektedir (Şekil 1). İnsanda her yıl 2 kg O 2 oluştuğu bildirilmiştir (27). 7

20 Süperoksit radikali, oksijen molekülüne bir elektron ilavesi ile oluşur ve serbest radikal hasarına karşı koruyucu antioksidan bir enzim olan ve oksidan hasar oluşumu ile birlikte artan süperoksit dismutaz (SOD) aracılığı ile hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) e indirgenir. Hidrojen peroksit eşlenmemiş elektron içermediği için tek başına radikal değildir ve katalaz ve glutatyon peroksidaz ile H 2 O ve O 2 ye indirgenir. Alternatif olarak Fenton Reaksiyonu ile hidroksil radikali (OH. ) üretilir. Hidroksil radikali oldukça reaktif ve toksik bir radikaldir; ilk karşılaştığı molekül ile 10-6 sn içinde, 14 A mesafesinde reaksiyona girer. Hidroksil radikali büyük molekül yapısı ve elektronegativitesi nedeni ile DNA, protein, karbonhidrat ve lipitler gibi makromoleküllerle reaksiyona girerek bu yapılarda oksidatif hasara neden olur (Şekil 1). Makromoleküller hücrelerde kısıtlı miktarlarda bulunduklarından bu yapılarda oluşan hasar oldukça önemlidir. İn vivo herhangi bir OH. radikal süpürücüsünün etkili olabilmesi için mevcut hedef moleküllerin önemli bir bölümünü kapsayacak kadar yüksek konsantrasyonda bulunması gerekir. Bu nedenle OH. radikalinin oluşumunun önlenmesi, bu radikalin süpürülmesinden daha etkilidir(28). Tablo 2.1. Önemli bazı serbest radikal çeşitleri, simgeleri ve özellikleri (28). Serbest radikaller Simge Özellikleri Alkoksil RO Organik peroksitlerin yıkımı sonucu üretilen oksijen metabolitidir Azot dioksit NO 2 Nitrit oksitin oksijen ile olan reaksiyonundan üretilir Hidrojen H Basit, bilinen radikaldir Hidrojenperoksit H 2 O 2 Reaktivitesi ve moleküler hasar düzeyi zayıftır Hidroksil OH En reaktif oksijen metabolitidir Hidroperoksil HO 2 Lipidlerde çözünür ve lipid peroksidasyonu artırır Hipoklorik asit HOCl Myeloperoksidaz reaksiyonu ile oluşan protein oksidasyon ürünüdür Nitrik oksit NO L-arginin amino asitinden in vivo olarak üretilir Nitröz oksit HNO 2 Nitrit oksitin reaksiyonundan üretilir Peroksil ROO Lipidlerde lokalize olur ve perhidroksile oranla zayıf etkilidir Peroksinitrit ONOO NO ile süperoksit hızlı bir reaksiyon sonucu üretilir Singlet oksijen O 2 Oksidatif oksijen formu güçlü, yarılanma ömrü kısadır Süperoksit O 2 Oksijen metabolizmasının ilk ara ürünü Tiyol radikal RS Sürfürlü ve çiftlenmemiş elektron içeren türlerdir Trikloro metil CCl 3 Karaciğerde üretilen CCl 4 ürünü metabolit 8

21 Serbest Oksijen Radikallerinin Kaynakları Organizmaya ani ve aşırı miktarda oksijen girişinin artması, epinefrin ve diğer katekolaminlerin artışı, laktik asit, laktat dehidrogenaz, kreatinin fosfokinaz gibi litik (eritici) enzim aktivitelerinin yükselmesi, egzersiz, gebelik, yaslılık gibi fizyolojik koşullar, kimyasal çevre kirliliğinin yoğun olduğu ortamlarda uzun süre yaşam, yoğun stres, sigara ve alkol kullanımı, diyette çoklu doymamıs yağ asitlerince zengin, yüksek kalorili beslenme ve az miktarda sebze meyve tüketimi, antioksidan savunma sistemi yetmezlikleri veya savunma duvarının aşılması gibi durumlarda hassas olan oksidanantioksidan denge, oksidanlar lehine bozulabilir ki, bu da oksidatif stres oluşumuna neden olur. Bu durum, serbest radikallerin oluşumunun artışından ya da antioksidan aktivitesinin yetersizliğinden ileri gelebilir(29,30, 31). Şekil 2.2.Serbest oksijen radikallerinin kaynakları 9

22 Serbest Oksijen Radikallerinin Etkileri Reaktif oksijen türlerinin (ROS) oluşumu enflamasyon, radyasyon, yaşlanma, normalden yüksek parsiyel oksijen basıncı (po 2 ), ozon (O 3 ) ve azot dioksit (NO. 2 ), kimyasal maddeler ve ilaçlar gibi bazı uyarıların etkisiyle artar. Serbest radikaller hücrelerin lipid, protein, DNA, karbonhidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşiklerine etki ederler (28,32,33). Süperoksit radikali (O -. 2 ) ve hidroksil radikali (OH. ) sitoplazma, mitokondri, nükleus ve endoplazmik retikulum membranlarında lipid peroksidasyonunu başlatır. Membranlarda lipid peroksidasyonu meydana gelmesi sonucu membran permeabilitesi artar. Serbest radikallerin etkisiyle proteinlerdeki sistein sülfhidril grupları ve diğer aminoasit kalıntıları okside olarak yıkılır, nükleer ve mitokondriyel DNA okside olur (33,34). Serbest oksijen radikallerinin tüm bu etkilerinin sonucunda hücre hasarı olur. Hücrede reaktif oksijen türlerinin ve serbest radikallerin artışı hücre hasarının önemli bir nedenidir. İskemi sonrasında reperfüzyon da reaktif oksijen türlerinin artışına bağlı olarak iskeminin oluşturduğu hücre hasarını artırır. 10

23 Şekil 2.3. Serbest oksijen radikallerinin etkileri Serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarının birçok kronik hastalığın komplikasyonlarına katkıda bulunduğu düşünülmektedir. Aterogenez, amfizem/bronşit, Parkinson hastalığı, Duchenne tipi musküler distrofi, gebelik preeklampsisi, serviks kanseri, alkolik karaciğer hastalığı, hemodiyaliz hastaları, diabetes mellitus, akut renal yetmezlik, Down sendromu, yaşlanma, retrolental fibroplazi, serebrovasküler bozukluklar, iskemi/reperfüzyon hasarı gibi durumlarda serbest oksijen radikallerinin neden olduğu hücre hasarı söz konusudur (28,35,36). 11

24 Şekil 2.4. Oksidatif stresle ilişkili klinik durumlar Serbest radikallerin lipidlere etkileri Lipidler serbest radikallerin etkilerine karşı en hassas olan biyomoleküllerdir. Hücre membranlarındaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış bağları, serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar (37). Lipid peroksidasyonu membran fosfolipidlerindeki doymamış yağ asitlerinin oksidasyonlarına neden olan böylece membran lipid yapısını değiştirerek hücre yapı ve fonksiyonlarını bozan bir olaydır (28). Hücre membranlarının oksijen radikallerine maruz kalması lipid peroksidasyon reaksiyonlarını uyarır. Doymamış yağ asitleri peroksidasyona özellikle hassastır. Lipid peroksidasyon organizmada oluşan kuvvetli bir radikal etkisiyle, doymamış yağ asidi 12

25 zincirindeki α-metilen karbonundan bir hidrojen atomunun uzaklaşması ile başlar. Hidrojenin molekülüne ayrılması, ayrıldığı yağ asidi zincirinin radikalleşmesine neden olur. Oluşan lipid radikali dayanıksız bir yapıya sahip olduğu için spontan değişikliğe uğramaktadır. Lipid radikallinin moleküler oksijen ile reaksiyona girmesi sonucu bir lipid peroksit radikali(loo) meydana gelir. Bu radikallerde membran yapısındaki diğer doymamış yağ asitlerini etkileyerek yeni lipid radikallerinin oluşmasına sebep olur ve açığa çıkan hidrojen atomlarını alarak lipid hidroperoksitlerinin aldehit(malondialdehit), aklenler, lipit epoksit ile etan ve pentan gibi uçucu gazlara dönüşmesi ile sona erer(28). Nonenzimatik lipid peroksidasyonu çok zararlı bir zincir reaksiyonudur. Direkt olarak membran yapısına ve ürettiği reaktif aldehitlerle indirekt olarak diğer hücre bileşenlerine zarar verir. Böylece doku hasarına ve birçok hastalığa neden olur (28). Şekil 2.5. Lipid peroksidasyonunun oluşum şeması 13

26 Aldehitler en toksik ürünlerdir. Malondialdehit(MDA) ve lipid peroksidasyonun diğer son ürünleri nisbeten stabil olmaları nedeniyle hücrelerin daha uzak bölümlerine ya da diğer hücrelere ulaşabilirler. Böylece lipid peroksidasyonu direkt olarak peroksidatif hasara maruz kalmayan dokulara da zarar verebilir (31). Üç veya daha fazla çift bağ içeren yağ asitlerinin peroksidasyonunda malondialdehit (MDA) meydana gelir (31). Şekil 2.6. Malondialdehit Malondialdehit (MDA) kanda ve idrarda ortaya çıkar, yağ asidi oksidasyonunun spesifik ya da kantitatif bir indikatörü olmamakla beraber lipid peroksidasyonunun derecesiyle iyi korelasyon gösterir. Bu nedenle biyolojik materyalde malondialdehit (MDA) ölçülmesi lipid peroksit seviyelerinin indikatörü olarak kullanılır (28,31,37,38) Serbest radikallerin proteinlere etkileri Proteinler serbest radikallere karşı poliansatüre yağ asitlerinden daha az hassastırlar. Proteinlerin serbest radikal harabiyetinden etkilenme derecesi amino asit kompozisyonlarına bağlıdır. Doymamış bağ ve kükürt içeren triptofan, tirozin, fenilalanin, histidin, metiyonin, sistein gibi amino asitlere sahip proteinler serbest radikallerden kolaylıkla etkilenirler. Bu etki sonucunda özellikle sülfür radikalleri ve karbon merkezli organik radikaller oluşur (35). 14

27 Serbest radikallerin etkileri sonunda, yapılarında fazla sayıda disülfit bağı bulunan immünoglobülin G (IgG) ve albümin gibi proteinlerin tersiyer yapıları bozulur, normal fonksiyonlarını yerine getiremezler. Prolin ve lizin reaktif oksijen türleri (ROS) üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona uğrayabilirler. Hemoglobin gibi hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar görürler. Özellikle oksihemoglobinin süperoksit radikali (O 2 ) veya hidrojen peroksitle (H 2 O 2 ) reaksiyonu methemoglobin oluşumuna neden olur (28,35) Serbest radikallerin nükleik asitler ve DNA'ya etkileri İyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA'yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Hidroksil radikali (OH ) deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer ve değişikliklere yol açar. Aktive olmuş nötrofillerden kaynaklanan hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) membranlardan kolayca geçerek ve hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta hücre ölümüne yol açabilir. Süperokside (O 2 ) maruz kalan DNA molekülleri hayvanlara enjekte edildiklerinde daha fazla antijenik özellik gösterirler ki bu oldukça önemli bir etkidir, çünkü otoimmün bir hastalık olan sistemik lupus eritematozusta (SLE) ve romatoit artritte (RA) dolaşımda anti-dna antikorlar bulunur (39). Şekil 2.7. Reaktif oksijen ürünleri metabolizması (40) 15

28 Serbest radikallerin karbonhidratlara etkileri Monosakkaritlerin otooksidasyonu sonucu peroksitler ve okzoaldehitler meydana gelir. Açığa çıkan okzoaldehitler proteinlere bağlanabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etki göstererek etki ederler. Bu olaylar kanser ve yaşlanmaya neden olabilir (41) Antioksidanlar Organizmanın pro-oksidan/antioksidan dengesi sağlıklı bir yaşam sürdürebilmek için çok önemlidir. SOR ların oluşumunu ve meydana getirdikleri hasarları önlemek ve detoksifikasyonu sağlamak üzere organizmayı koruyan antioksidan savunma sistemi dört yolla etki göstermektedir: 1. Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma, yok etme, süpürücü etki. Antioksidan enzimler, küçük moleküller bu yolla etki gösterirler (42,43). 2. Serbest oksijen radikalleriyle etkileşip onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini azaltma veya inaktif şekle dönüştürücü etki. Vitaminler, flavanoidler bu tarz bir etkiye sahiptirler (44). 3. Serbest oksijen radikallerini bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etki zincir kırıcı etkidir. Hemoglobin, seruloplazmin ve mineraller zincir kırıcı etki gösterirler(45). 16

29 4. Serbest radikallerin oluşturdukları hasarın onarılması şeklinde onarıcı etki gösterirler(46). Şekil 2.8. Antioksidan-serbest radikal dengesi Antioksidan savunma sisteminde görev yapan moleküller; yapı ve işleyiş mekanizmalarına göre enzimatik veya enzimatik olmayan antioksidanlar olarak gruplandırılabildiği gibi, görev aldıkları yapılara göre intrasellüler (SOD, CAT, GPx, sitokrom oksidaz gibi), ekstrasellüler (albümin, transferrin, serüloplazmin, laktoferrin gibi) ve membran (vitamin E, koenzim Q, β-karoten gibi) antioksidanları olarak da sınıflandırılabilmektedirler (Tablo 2) (35,37,38,47,48,49,50,51,52,53,54). 17

30 Tablo 2.2. Önemli bazı antioksidanlar, reaksiyonları ve özelikleri. Antioksidan İntraselüler Glutatyon (GSH) Glutatyon peroksidaz (GSH-Px) Glutatyon redüktaz (GSSG-R) Glutatyon S-transferaz (GST) Katalaz (CAT) Stokrom oksidaz Süperoksit dismutaz (SOD) Ekstraselüler Albumin Askorbat (Vit C) Bilirubin Ferritin Glikoz Haptoglobinler Hemopeksin Laktoferrin Mukus Serüloplazmin Sistein Transferrin Ürat Membran Koenzim Q10 α-tokoferol (Vit E) β-karoten (Vit A) Ubiquinol Reaksiyonu veya Özelliği GSH redoks substratı H 2 O 2 nin düşük konsantrasyonunun giderilmesinde katalizör Okside glutatyonun redükte glutatyona dönüşümünde katalizör Glutatyonun konjugasyonunu sağlayan katalizör H 2 O 2 nin yüksek konsantrasyonunun giderilmesinde katalizör O 2 nin indirgenme basamaklarında toksik madde oluşumu önleyicisi Süperoksidin giderilmesi reaksiyonunda katalizör HOCl radikal topalyıcısı, hem proteini ve bakır iyonları bağlayıcısı Hidroksil radikal giderici ve tokoferolü indirgeyici antioksidan Peroksil radikal toplayıcısı Doku demir bağlayıcısı Hidroksil radikallerini giderici antioksidan molekülü Hemoglobini bağlayarak hem in salınımını önler Serbest hem proteinlerini bağlayarak oksidasyonunu inhibe eder Düşük ph da demir iyonları bağlayıcısı Hidroksil radikal toplayıcısı Süperoksit radikalini nötralize eder ve bakır iyonları bağlayıcısı Organik bileşik indirgeyicisi Serbest demir iyonlarını fenton tepkimesi ile inhibe eder Metal bağlayıcısı ve değişik radikal toplayıcısı Enerji metabolizmasında antioksidan Lipidlerde çözünerek peroksidasyon zincir kırıcısı Singlet oksijen oluşumunu inhibe eder ve çeşitli radikal toplayıcısı Lipoproteinlerin otooksidasyon önleyicisi Enzimatik antioksidanlar Aerobik organizmalar oksijen toksisitesinden başlıca antioksidan enzimler yardımıyla korunurlar. Bunlar; süperoksit dismutaz, katalaz ve glutatyonla ilişkili glutatyon peroksidaz, glutatyon redüktaz ve glutatyon S-transferazdır (34,55). 18

31 Şekil 2.9. Serbest radikallerin oluşumu ve enzimatik detoksifikasyonu (36) Süperoksit dismutaz (SOD) Süperoksiti hidrojen peroksit ve moleküler oksijene çeviren reaksiyonu katalizleyen bir metalloenzimdir (34). 2O H+ H 2O 2 + O 2 Bu reaksiyon oksidatif strese karşı ilk savunma olarak da isimlendirilir. Çünkü, süperoksit zincirleme radikal reaksiyonlarının güçlü bir başlatıcısıdır. Bu sistem sayesinde hücresel kompartmanlardaki O2 - düzeyleri kontrol altında tutulur (56). 19

32 Katalaz (CAT) Katalaz, peroksizomlarda lokalize ve yapısında 4 hem grubu bulunan bir hemoproteindir. Karaciğer ve eritrositlerde en yüksek aktiviteye sahiptir. SOD aracılığı ile oluşan hidrojen peroksit bir radikal olmamasına karşın en reaktif tür olan HO. radikalinin öncüsü olması nedeniyle en fazla oksidatif hasara sebep olur (56). Katalaz hidrojen peroksiti su ve oksijene parçalar: 2H 2O 2 2H 2O + O Glutatyon peroksidaz (GSH-px) Glutatyon peroksidaz, hidrojen peroksit ve büyük moleküllü lipid hidroperoksitlerinin indirgenmesinden sorumludur(56). GPx, aşırı hidrojen peroksit varlığında glutatyonun (GSH) okside glutatyona (GSSG, glutatyon disülfür) oksidasyonunu katalize ederken, hidrojen peroksiti de suya dönüştürür (53,54,56). H 2 O 2 + 2GSH GSSG + 2H 2 O Glutatyon redüktaz (GR) GPx tarafından H 2 O 2 ve diğer lipid peroksitlerin indirgenmesi esnasında glutatyon okside glutatyona dönüşmektedir. Bu okside halin tekrar redükte GSH a dönüştürülmesi gereklidir. Çünkü organizmanın glutatyon deposu sınırlıdır (43,53,54). GR, NADPH varlığında glutatyon disülfiti (GSSG) tekrar redükte glutatyona (GSH) çevirir: GSSG + NADPH + H + 2GSH + NADP + 20

33 Glutatyon-S-transferaz (GST) Lipid hidroperoksitlere (ROOH) karşı GST lar Se-bağımsız glutatyon peroksidaz aktivitesi gösterirler (28): ROOH + 2GSH GSSG + ROH + H 2 O Enzimatik olmayan antioksidanlar Enzimatik olmayan antioksidanlardan glutatyon dışında farklı mekanizmalarla oksidatif hasarı önleyen α-lipoik asit, bakır, çinko, selenyum gibi elementler ile folik asit, ürik asit, albumin gibi kofaktörler ve E, A, C, B 1, B 2, B 6, B 12 gibi vitaminler yanında melatonin, albümin, sistein, bilirubin, seruloplazmin, ferritin, transfferin, laktoferrin, haptoglobülin, hemopeksin, mannitol, oksipurinol, probukol, deferoksamin, flavonoitler, fitoaleksinler ve araştırma aşamasında olan birçok madde vardır (28,32,36,49,54,57). Çalışmanın değerlendirilmesi dikkate alındığından bu bölümde sadece vitamin E ve vitamin C hakkında aşağıda bilgi sunulmuş, diğer enzimatik olmayan antioksidanlar hakkında ise yukarıda belirtildiği gibi grup içindeki yeri belirtilerek sadece isim olarak verilmiştir (Tablo 2) E vitamini 1922 yılında Evans ve Bishop tarafından keşfedilen bu maddeye 1924 yılında Sure tarafından E vitamini ismi verilmiştir (58). E vitamini terimi, yapısal olarak birbiriyle bağlantılı bir grup bileşiği kapsar. Bunlar temelde 2-metil-6-kroman çekirdeği içerirler ve 2. karbona bağlı 16 karbonlu fitil yan zincir kapsarlar. Vitamin E benzeri 21

34 bileşikler iki grupta toplanırlar. Birinci grup tokoferoller, ikinci grup tokotrienoller olarak adlandırılır. Tokoferollerdeki yan zincir doymuş, tokotrienollerdeki ise doymamıştır (59). (Şekil 10). Şekil E vitamininin formları Tokoferoller hepsi aynı biyolojik aktivite ve aynı antioksidan etkide olmakla birlikte, tesir kuvveti bakımından birbirinden farklıdır; mesela biyolojik aktivite yönünden α > β > γ > δ sırasında olmaktayken antioksidan etki yönünden δ < γ < β < α sırasını takip eder (59). E-vitamini bağırsaklardan önce lenf sistemine sonra da kan yoluyla karaciğere gelir. Kullanılmayan miktarın fazlası genellikle dışkı ile atılır. Depo edilebilen kısmın çoğu yağ dokusu ve karaciğerdedir. Daha az miktarda da kalp, kas dokusu, testis, rahim, böbrek üstü bezi, beyin ve kanda depo edilir. Ayrıca deriden de emilebilme özelliği vardır (60). E vitaminin biyolojik aktif formuna tokoferol denir. Doğal olarak mevcut olan 8 tane tokoferol vardır ve bunlardan en aktif olanı α-tokoferoldür. α-tokoferol plazmadaki E vitamininin % ını oluşturmaktadır ve dokudaki major E vitamini formudur. Bunun sebebi α-tokoferolün LDL içinde öncelikle reinkorporasyonuna tokoferol 22

35 bağlayıcı protein (TBP) yoluyla ve γ-tokoferolün karaciğerde çabuk yıkılmasına bağlıdır. Bu yüzden α-tokoferol üstüne daha çok odaklanılmıştır ve E vitamini suplemantasyonun major formudur. α-tokoferol kanda γ-tokoferolden 4-10 kat fazladır (59). Yağda çözünen bir vitamin olan tokoferolün dokularda iki farklı etkisi vardır (58): 1. Antioksidan özelliği sayesinde hücrelerin radikallerden korunması 2. Vitamin özelliği nedeniyle vücuttaki fizyolojik etkileri E vitamininin antioksidan özelliği E vitamininin önemli bir özelliği; antioksidan etkinliğinin olması nedeniyle peroksitleri ve oksijen radikallerini nötralize etmesidir (61). Yani oksijeni bağlayarak, oksijen etkisi ile oluşabilecek istenmeyen etkilerin önüne geçer. Hücrelerde doymamış yağ asitleri (linoleik asit ve araşidonik asit gibi) kendiliğinden veya oksidan metabolitlerin etkisi sonucu kolayca oksitlenebilirler. Böylece lipit peroksidasyonuna veya protein ve yağlara kovalent bağlanarak membran hasarına neden olurlar (61,62). Serbest oksijen radikalleri oluşmasının eşlik ettiği bu olay zincirini membranda önleyen ve oluştuğunda nötralize eden en güçlü antioksidan E vitaminidir. Diğer antioksidan sistemleri (C vitamini, glutatyon, peroksidaz ve beta karoten gibi) E vitamini kadar etkili değildir. Bütün hücre membranlarının lipitleri serbest radikaller tarafından oksidasyona maruz kalarak yıkılırlar. Alfa tokoferol bu yıkım reaksiyon zincirini engeller ve serbest radikalleri durdurur. E vitamini, hücre ve organellerin membran lipitleri üzerindeki bu etkisi nedeniyle membranları oksidatif zedelenmeye karşı korur. Böylece genel olarak membran stabilitesini sağlar. E vitamini lipit peroksil 23

36 radikallerini etkisiz hale getirmek için, kendisinin bir fenolik hidrojen atomunu peroksil radikaline (ROO*) transfer etmek suretiyle aşağıdaki şekilde, gerçekleştirir (62). ROO* + Vitamin E ROOH + vitamin E* E vitamini radikali nispeten stabil: reaktivitesi az olan bir radikaldir. Serbest radikallerle birleşen tokoferol kinona dönüşen α-tokoferol bu şekilde radikal temizleyici işlevini gerçekleştirmektedir (58). C vitamini (askorbik asit); sıvı fazdaki tüm peroksil radikallerini plazma lipitlerine difüze olmadan tutar. Membranda oluşan tokoferoksil radikali askorbik asitle reaksiyonlaşarak tokoferol ve semidehidroaskorbil radikali meydana gelir. Siklüs semidehidroaskorbil radikalinin redüktaz enzimi ile indirgenmesi ile tamamlanır. Amaç tokoferolü rejenere ederek radikal tutma potansiyelini artırmak ve membranları peroksidasyondan korumaktır (58). Şekil Antioksidan mekanizmada vitamin E ve vitamin C arasındaki ilişki. E vitamininin bir diğer işlevi de A vitamininin barsaktan absorbsiyonunu ve dokulardaki düzeyini arttırmasıdır. Bu durum büyük bir olasılıkla, A vitamininin oksidasyonla kaybının azalmasına bağlıdır (59,63). 24

37 C vitamini Vitamin C (L-askorbik asit) 1921 yılında izole edilmiş, 1933 yılında da tanımlanmış ve sentez edilmiştir. Vitamin C nin araştırılmaya başlamasına skorbüt hastalığı önderlik etmiştir. Kobaylarında insanlar gibi skorbüte hassasiyetlerinin olduğu ve hastalığın deneysel olarak oluşturulabileceği gösterilmiştir (64). Askorbik asit (L-askorbik asit, L-ksilo askorbik asit, L-treo-heks-2-enoik asit- - lakton) vitamin C nin biyokimyasal isimlendirilmesidir (Sekil 3). L-askorbik asit bitkilerde ve hayvanlarda geniş dağılım göstermektedir (65). Şekil Askorbik asit in kimyasal yapısı İnsanların karaciğerinde askorbik asit sentezinde kullanılan L-gulono- -lakton oksidaz enzimi yoktur ve bu nedenle C vitamini sentezleyemezler (59,66). 25

38 L-askorbik asitin en önemli kimyasal özelliği dehidro-l-askorbik asite oksitlenmesidir. L-askorbik asit ısığa karsı hassastır. Oksijen ve ısı varlığında sıcaklık artışı ile orantılı olarak okside olur. Dehidro-L-askorbik asit, 2,3-diokso-L-gulonik aside hidrolize olur ve sonra okzalik asite ve L-treonik asite dönüsür (67, 68). Askorbik asit metabolizması, alım yoluna, alınan miktara ve beslenme gibi çeşitli faktörlere bağlıdır. İnsanda askorbik asit gastrointestinal sistemde enerji gerektiren sodyum bağımlı aktif transport mekanizması ile absorbe edilir. Aktif transport sistemi doygunluğa ulasabilir ve alımı arttıkça absorbsiyon azalabilir. İnsanlarda bu transport sisteminin aktivitesi en yüksek jejenumdadır. Ayrıca ince bagırsak duodenal ve proksimal duvarı da kobaylarda absorbsiyon bölgesi olarak bildirilmistir (59,63). Askorbat iyonu küçüktür ve renal glomerular filtrelerin porlarından rahatlıkla geçer. Serum konsantrasyonu 1.6 mg/dl ye ulaşınca tubuler reabsorbsiyon doyuma ulaşır ve bu değer bireysel farklılıklar göstermekle birlikte 2.5 mg/dl ye ulastığında askorbik asit idrarla atılmaya baslar. Lökosit ve dokulardaki vitamin C konsantrasyonu serum konsantrasyonuna bağlı olarak artıs gösterir (68) C vitamininin antioksidan özelliği Askorbik asit kuvvetli bir indirgeyici ajandır; 280 mv'lik düşük bir redoks potansiyeline sahip olması onun hemen tüm diğer okside olan serbest radikallerle reaksiyona girme termodinamik potansiyelinin varolduğu anlamına gelir (66). Bazı biyolojik sistemlerde lipozomal metillinoat misellerinin oksidasyonunu baskılayan antioksidan aktivitenin de vitamin C'den oluştuğu söylenmektedir (57). 26

39 Askorbik asit tipik peroksil radikallerle suda tepkimeye girer; daha aktif triklorometilperoksil radikaliyle 100 kat daha hızlı tepkimeye girer. Askorbat molü başına yakalanan peroksil radikallerinin sayısı, düşük askorbat yoğunluklarında 2'den, yüksek askorbat yoğunluklarında sıfıra kadar değişiklik gösterir. Bunun nedeni yüksek askorbat seviyelerinde radikal yakalamayla rekabet eden kendi kendini sonlandıran reaksiyonlardır. Çok güçlü bir indirgeyici ajan olan askorbik asit semidehidroaskorbat radikal ara ürünü üzerinden kolaylıkla dehidroaskorbik aside okside olur. Güçlü indirgeyici aktivitesinden dolayı aynı zamanda güçlü bir antioksidandır. Süperoksit ve hidroksil radikali ile kolayca reaksiyona girerek onları temizler (69). Semidehidroaskorbat da antioksidan etki gösterir. C vitamini ayrıca antiproteazların oksidan maddeler ile inaktive olmasını engeller, tokoferoksil radikalinin, a- tokoferole redüklenmesini sağlar. C vitamininin bitkisel ve hayvansal yağları, balık, margarin ve süt gibi yağ ihtiva eden yiyecekleri oksidatif bozulmaya karşı koruduğu bilinmektedir (28). C vitaminin diğer bir özelliği, antioksidan etkisi yanında oksidan etki de göstermesidir. Çünkü C vitamini, ferri demiri ferro demire indirgeyen, süperoksit radikali dışındaki tek sellüler ajandır (69). Bu yolla askorbat, proteine bağlı ferri demiri uzaklaştırarak ya da doğrudan ferri demiri indirgeyerek Fenton reaksiyonunda hidrojen peroksit ile etkileşmeye uygun olan ferrodemire dönüştürür. Yani süperoksid üretimine katkıda bulunur. Bu özelliğinden dolayı C vitamini, serbest radikal reaksiyonlarının önemli bir katalisti veya bir prooksidan olarak değerlendirilir (28). 27

40 2.5. Serbest Radikallerin Ölçümü Oksidatif stres çalışmalarında, organizmada serbest radikal üretimi artışının belirlenmesi için çeşitli biyolojik materyalde lipid peroksidasyonunun çeşitli ürünlerinin konsantrasyonları sıklıkla ölçülmektedir. Serbest oksijen radikallerin başlattığı lipid peroksidasyon zincir reaksiyonu sonucunda lipid hidroperoksitleri (LOOH) ve konjuge dienler oluşur. Lipid hidroperoksitleri (LOOH) ve konjuge dienler de daha sonra alkan aldehitler, alken aldehitler, hidroksialken aldehitler, malondialdehit (MDA) ve uçucu hidrokarbonlar oluşturmak üzere parçalanırlar (28, 70). Serbest radikal üretimi artışının belirlenmesi için lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) ölçümü, konjuge dienlerin ölçümü, MDA dışındaki aldehitlerin ölçümü, uçucu hidrokarbonların ölçümü, lipid peroksidasyonu fluoresan ürünlerinin ölçümü ve malondialdehit (MDA) ölçümü yapılabilir. Her bir tekniğin kendine göre zorlukları vardır ve hiçbir metodun lipid peroksidasyonunu tam bir doğrulukta ölçtüğü söylenemez. Ayrıca, oluşan ürünlerin miktarı çeşitli faktörlerden etkilenebildiğinden bir tek ürün yerine birden fazla ürünü ölçmek idealdir (28,70,71,72). Lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) ölçümü çeşitli tekniklerle plazmada yapılır. Bu tekniklerden biri, hassas olmakla birlikte pahalı bir teknik olan gaz kromatografisikütle spektrometrisi (GC-MS) tekniğidir. Plazma lipid hidroperoksitlerinin (LOOH) ölçümü ticari olarak mevcut kitlerle de yapılabilir. Ancak bu ölçümlerin sonuçları diğer metotların sonuçlarıyla iyi bir korelasyon göstermemektedir. Konjuge dienlerin ölçümü biyolojik materyallerde hem proteinleri gibi bazı maddelerin varlığından dolayı zordur. Ayrıca normalde insan plazmasında mevcut olan düşük düzeylerdeki konjuge dienler de ölçümü zorlaştırırlar. 28

41 MDA dışındaki aldehitlerin ölçümü genellikle zaman alıcı, pahalı ve rutin olarak kullanılmaya uygun olmayan metotları gerektirir. Uçucu hidrokarbonların ölçümü flame iyonizasyon dedektörlü gaz kromatografisi yöntemiyle, dışarı verilen solunum havasında yapılır. Yöntem oldukça hassastır ve olgulardan tekrar tekrar numune alınabilme avantajı vardır, fakat zaman alıcı ve pahalıdır. Ayrıca sigara dumanı ve egzoz gazı gibi eksojen kaynaklardan hidrokarbon kontaminasyonu riski vardır. Lipid peroksidasyonu fluoresan ürünlerinin ölçümü peroksidasyonun geç aşamasını yansıtır ve her laboratuvarda uygulanması zordur. Malondialdehit (MDA) ölçümü lipid peroksidasyonunun derecesinin belirlenmesi için en sık başvurulan testtir. MDA ölçümü en yaygın olarak tiyobarbitürik asit (TBA) yöntemiyle yapılır (73). Bazı deneysel sistemlerde TBA yönteminin esas olarak MDA'nın kendisini ölçtüğü gösterilmiştir. Ancak çoğu sistemde bu test MDA için spesifik olmadığından tiyobarbitürik asit ile reaksiyon veren maddelerin (TBARS) ölçümü şeklinde ifade edilir. Saf lipidlerle yapılan çalışmalar ve hayvanlar üzerinde yapılan denemeler, TBARS ölçümü ile lipid peroksidasyonunu ölçen diğer metotlar arasında iyi bir korelasyon olduğunu göstermiştir (28). Serbest MDA'nın direkt tayini en güvenilir şekilde yüksek performans likit kromatografisi (HPLC) yöntemiyle yapılır. HPLC çok hassas ve hızlı bir metottur ve az numune gerektirir. Fakat teknik çok dikkatli numune hazırlığı gerektirir (73). 29

42 3. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal Çalışmaya, Başkent Üniversitesi Araştırma ve Uygulama Hastanesi, Ortopedi ve Travmatoloji Anabilim Dalına başvuran diz artroplastisi ya da artroskopisi planlanan hastalar dahil edildi. Çalışmaya dahil edilen bu hastalarda, sistemik hastalıklarının olmaması ve son altı aylık dönemde herhangi bir ilaç tedavisi görmemiş olması, temel ölçüt olarak kabul edildi. Böylece ilaç etkileşimlerinin önüne geçilmesi ve sistemik hastalıkların çalışmaya etkisi önlenmeye çalışıldı. Periferik vasküler hastalığı olan bireyler ve vitamin alerjisi olanlar çalışmaya dahil edilmedi. Çalışmaya dahil edilen hastaların, demografik özellikleri kaydedildi. Çalışma, her grupta oniki hasta olacak şekilde, üç gruptan oluşturuldu. Grupları oluşturan hastalar, çalışma ölçütlerine uydukları takdirde, rastlantısal olarak gruplara yerleştirildi. Kontrol grubundaki hastalara vitamin uygulaması yapılmazken diğer gruplara sırasıyla, C vitamini, E vitamini verildi. Vitamin C uygulaması, (C-plan 500 mg tb) hastalara ameliyattan bir önceki gün iki doz halinde oral olarak, Vitamin E uygulaması (Evicap 400 mg cap) ise ameliyattan önceki bir hafta boyunca günde iki doz halinde oral olarak uygulandı. Bu hastalardan, operasyon başlangıcında turnike öncesi ve turnike çözülmesinden sonra meydana gelen reperfüzyon sonrası (15.dakikada), venöz kanlar alınarak plazmaları ayrıldı. Tüm hastalardan alınan plazma örneklerinde lipid peroksidasyonunun göstergesi olan malondialdehit düzeyleri spektrofotometrik yöntemle ölçüldü. Tüm çalışma grupları sadece spinal anestezi alan bireylerden oluşturuldu ve böylece, genel anestezinin olası antioksidan etkilerinden kaçınılmış oldu. Uygulama öncesi bireyler detaylı olarak bilgilendirildi ve bilgilendirilmiş onam formları alındı. 30