GASTROİNTESTİNAL STROMAL TÜMÖRLERDE HİSTOPATOLOJİK,TANISAL VE PROGNOSTİK BULGULARIN DEĞERLENDİRİLMESİ

Transkript

1 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PATOLOJİ ANABİLİM DALI GASTROİNTESTİNAL STROMAL TÜMÖRLERDE HİSTOPATOLOJİK,TANISAL VE PROGNOSTİK BULGULARIN DEĞERLENDİRİLMESİ DR. FİLİZ ÇEVLİK UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI PROF. DR. FİGEN DORAN ADANA- 2006

2 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ PATOLOJİ ANABİLİM DALI GASTROİNTESTİNAL STROMAL TÜMÖRLERDE HİSTOPATOLOJİK,TANISAL VE PROGNOSTİK BULGULARIN DEĞERLENDİRİLMESİ DR. FİLİZ ÇEVLİK UZMANLIK TEZİ TEZ DANIŞMANI PROF. DR. FİGEN DORAN ADANA Bu çalışma Çukurova Üniversitesi Araştırma Fonu Tarafından Desteklenmiştir. TP2004LTP25

3 TEŞEKKÜR Patoloji eğitimim sırasında bilgi ve deneyimlerini benimle paylaşan, yetişmem ve uzmanlık tezimin hazırlanmasında büyük emeği geçen Tez Danışmanım Patoloji Anabilimdalı Öğretim Üyesi Sayın Prof. Dr. Figen Doran a, istatistik aşamasındaki emeği için Doç. Dr. Gülşah Şeydaoğlu na, titiz ve özverili çalışmaları için teknisyen Gülafer Korkut a teşekkür ederim. Ayrıca uzmanlık eğitimim sırasında yetişmemde emeği geçen Patoloji Anabilimdalı Öğretim Üyesi hocalarıma çok teşekkür ederim.

4 İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER...I TABLO LİSTESİ...II ŞEKİL LİSTESİ...III KISALTMA LİSTESİ...V ÖZET VE ANAHTAR SÖZCÜKLER...VI ABSTRACT-KEYWORDS...VIII 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Gastrointestinal Sistemin Mezenkimal Tümörleri Gastrointestinal Stromal Tümörler GEREÇ VE YÖNTEM Strept avidin-biotin boyama yöntemi Değerlendirme BULGULAR TARTIŞMA SONUÇLAR KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ...71

5 TABLO LİSTESİ Tablo 1. C-kit pozitif tümörler...8 Tablo 2. Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüsü Gastrointestinal stromal tömör Workshop 2001: Agresif davranış riskini tanımlamak için önerilen yaklaşım...10 Tablo 3. GIS in iğsi hücreli tümörlerinin ayırıcı tanısı için İHK sal şema...13 Tablo 4. İHK sal çalışmada kullanılan antikorların dilüsyon ve kaynakları...19 Tablo 5. Çalışmaya dahil edilen olguların listesi...23 Tablo 6. GİST lerde histolojik risk gruplarında klinikopatolojik ve immünhistokimyasal bulguların karşılaştırması...25 Tablo 7. C-kit boyanmasının tüm parametrelerle ilişkisi...33 Tablo 8. CD34 ile tüm parametrelerin ilişkisi...35 Tablo 9. SMA ile tüm parametrelerin ilişkisi...36 Tablo 10. S100 ile tüm parametrelerin ilişkisi...38 Tablo 11. Desmin ile tüm parametrelerin ilişkisi...39 Tablo 12. PDGFRα boyanmasının tüm parametrelerle ilişkisi...41 Tablo 13. Ki67 boyanmasının tüm parametrelerle ilişkisi...43 Tablo 14. P53 boyanmasının tüm parametrelerle ilişkisi...44 Tablo 15. Bcl-2 boyanmasının tüm parametrelerle ilişkisi...46 Tablo 16. Bax boyanmasının tüm parametrelerle ilişkisi...47 Tablo 17. Cox boyanmasının tüm parametrelerle ilişkisi...49

6 ŞEKİL LİSTESİ Şekil 1. Midede, kanama ve kistik dejenerasyon içeren GİST...26 Şekil 2. İnce barsak orijinli GİST...26 Şekil 3. GİST, iğsi hücreli tip (HEx100)...27 Şekil 4. GİST, epiteloid tip (HEx200)...27 Şekil 5. GİST, mikst hücreli tip (HEx200)...27 Şekil 6. Migzoid alanlar içeren GİST (HEx200)...28 Şekil 7. Belirgin perinükleer vakualizasyon (HEx400)...28 Şekil 8. Nükleer palizadlanma, (HEx100)...28 Şekil 9. Hafif atipi (HEx400)...29 Şekil 10. Belirgin atipi (HEx400)...29 Şekil 11. Hemoraji (HEx200)...30 Şekil 12. Mukozal invazyon (HEx200)...30 Şekil 13. C-kit negatif GİST olgusu, mast hücreleri pozitif (c-kitx400)...31 Şekil 14. GİST, c-kit 1+ (C-kitx400)...31 Şekil 15. GİST, c-kit 2+ (C-kitx400)...32 Şekil 16. GİST, c-kit 3+ (C-kitx400)...32 Şekil 17. %10-50 yaygınlıkta CD34 pozitifliği...34 Şekil 18. SMA ile yaygın boyanma (SMAx100)...36 Şekil 19. %10-50 yaygınlıkta S100 pozitifliği (S100x400)...37 Şekil 20. Desmin negatifliği, damar duvarları internal kontrol olarak pozitif (Desminx400)...39 Şekil 21. Fokal desmin pozitifliği (Desminx400)...39 Şekil 22. Pleksuslarda PDGFRα pozitifliği (PDGFRαx400)...40 Şekil 23. PDGFRα ile 1+ boyanma (PDGFRαx400)...40 Şekil 24. PDGFRα ile 3+ boyanma (PDGFRαx400)...40 Şekil 25. Ki67 ile >%10 boyanma (Ki-67x400)...42 Şekil 26. Ki67 ile <%10 boyanma (Ki-67x400)...42 Şekil 27. P53 ile pozitif boyanma (P53x400)...44 Şekil 28. P53 ile negatif boyanma (P53x400)...44 Şekil 29. Bcl-2 ile (-) boyanma, lenfositlerde Bcl-2 ile boyanma mevcut (Bcl-2x400)...45 Şekil 30. Bcl-2 ile 1+ boyanma (Bcl-2x400)...45 Şekil 31. Bcl-2 ile 3+ boyanma (Bcl-2x400)...45

7 Şekil 32. Bax ile 1+ boyanma (Bax x400)...47 Şekil 33. Bax ile 3+ boyanma (Bax x400)...47 Şekil 34. Cox-2 ile ganglion hücrelerinde boyanma (Cox-2x200)...48 Şekil 35. Cox-2 ile 1+ boyanma (Cox-2x400)...48 Şekil 36. Cox-2 ile 3+ boyanma (Cox-2x400)...48

8 KISALTMA LİSTESİ GİST ICC GİS IHK GANT SCF AFIP HE BBA MA Gastrointestinal Stromal Tümör Interstitial cells of Cajal ( Cajal ın interstisyel hücreleri) Gastro intestinal sistem Immünhistokimya Gastrointestinal otonomik sinir tümörleri Stem cell factor Armed Forces Institute of Pathology Hemotoksilen Eozin Büyük büyütme alanı Molekül ağarlığı

9 ÖZET Gastrointesitinal Stromal Tümörlerde Histopatolojik, Tanısal ve Prognostik Bulguların Değerlendirilmesi Gastrointestinal stromal tümörler (GİST) gastrointestinal traktın en sık görülen mezenkimal tümörleridir. GİST ler benignden maligne kadar geniş bir davranış spektrumuna sahiptir. Literatürde GİST lerin kötü gidişini tahmin etmede risk gradelemesinin tümör boyutu ve mitotik oran baz alınarak yapılması gerektiği önerilmiştir. Bu çalışmanın amacı tümör boyutu, mitotik oran gibi konvansiyonel fakörlere ek olarak klinikopatololojik parametreler, risk gradei ve c-kit, CD34, S100, SMA, desmin, Ki-67, p53, bcl-2, bax, cox-2, PDGFRα nın prognostik değerini araştırmaktır. Bu çalışmada yılları arasında rezeke edilmiş GİST ler ve gastrointestinal sistemin diğer mezenkimal tümörlerine (leiomiyom, leiomyosarkom vb.) immünhistokimyasal yöntemle c-kit, CD34, SMA, S100 ve desmin uygulanmıştır. Bu olgulardan GİST tanısı alanlara prognostik değerlendirme amaçlı ki-67, p53, bcl-2, bax, cox-2, PDGFRα çalışılmıştır. Yirmiyedi olguda tümör ince barsakta, 20 olguda midede, 6 olguda omentumda, 4 olguda kalın barsakta, 2 olguda özefagusta lokalizeydi. Makroskopik olarak tümör boyutu mm arasındaydı (ortalama: 104mm). C-kit pozitif 60 olgu ve c-kit negatif 1 olgu, 12 olgu düşük risk gradeli, 8 olgu orta risk gradeli, 35 olgu yüksek risk gradeli olmak üzere risk gruplarına klasifiye edildi. Çok düşük risk grubuna giren olgu yoktu. 6 olgu tümör çapının bilinmemesi nedeniyle gradelenemedi. Risk gradei metastaz/rekürrens varlığıyla istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı. Mikroskopik olarak tümör, iğsi hücrelerden (40 olgu), epiteloid hücrelerden (7 olgu) ve mikst hücrelerden (14 olgu) oluşmaktaydı. Fokal hemoraji ve nekroz görüldü. Altmışbir GİST olgusundan, 43 ü (70,5%) CD34, 34 ü (55,7%) SMA, 40 ı (65,6%) S100, 9 u (14,8%) desmin, 44 ü (72,1%) ki67, 17 si (29,3%) p53, 48 i (%82,8) bcl-2, 19 u (32,8%) bax, 56 sı (96,6%) cox-2 ve 48 i (78%) PDGFRα ile pozitifti. Ki-67 ekspresyonu risk gradei ve mitozla koraleydi. Tümör nekrozu da risk gradei ile koraleydi. Bu çalışma GİST lerin malign potansiyelinin yaş, cinsiyet, tümör lokalizasyonu, büyüme paterni, ülserasyon, hücre tipi, nükleer atipi, sellülarite, kanama ve c-kit, CD34, SMA, S100, desmin, p53, bcl-2, bax, cox-2, PDGFRα ekspresyonu ile ilgili olmadığını göstermiştir.

10 Ki-67 labeling index ve tümör nekrozu malign potansiyeli tahmin etmede ve cerrahi tedavi şeklini belirleme, takip ve adjuvan terapi gerekliliğine karar vermede yardımcı olabilir. Anahtar sözcükler: Gastrointestinal Stromal Tümör, c-kit, CD34, S100, SMA, Desmin, Ki-67, P53, Bcl-2, Bax, COX-2, PDGFRα.

11 ABSTRACT The Evaluation of Histopathological, Diagnostic and Prognostic Features of Gastrointestinal Stromal Tumors Gastrointestinal stromal tumors (GISTs) are the most common mesenchymal tumors of the gastrointestinal tract. GISTs have a wide spectrum of biologic behavior ranging from benign to malignant. Risk grading based on tumor size and mitotic counts has been proposed in an effort to predict the adverse outcome of GIST in the literature so far. The aim of this study was to elucidate the prognostic values of clinicopathological parameters, risk grade and C-kit, CD34, S100, SMA, Desmin, Ki-67, P53, Bcl-2, Bax, COX-2, PDGFRα, in addition to the conventional factors including tumor size, mitotic counts. In this study diagnostic immunohistochemical staining with C-kit, CD34, SMA, S-100 and desmin were performed in patients with previously diagnosed GIST and other mesenchymal tumors (leiomyoma, leiomyosarcoma etc.) of gastrointestinal tract who underwent resection from 1995 to Ki-67, P53, Bcl-2, Bax, COX-2, PDGFRα staining were performed on tumors rediagnosed as gastrointestinal stromal tumor for the prognostic evaluation. There were 27 tumors located in the small intestine, 20 in the stomach, 6 omentum, 4 large intestine, 2 esophagus. Grossly, the tumor size was between 20 and 250mm (mean: 104mm). 60 cases of c-kit positive and one c-kit negatif GISTs were classified into, 12 cases of low-risk grade, 8 cases of intermediate-risk grade, and 35 cases of high-risk grade. There was no case of very low-risk grade. Six cases were excluded from the histopathological grading because of unknown tumor size. The risk grade was not significantly associated with the presence of metastases and/or recurrence. Microscopically, the tumor was composed of spindle cells (40 cases), epithelioid cells (7 cases) and mixed cells (14). Focal hemorrhage, necrosis could be seen. Among the 61 cases of GIST, 43 (70,5%) were positive for CD34, 34 (55,7%) for SMA, 40 (65,6%) for S100, 9 (14,8%) for desmin, 44 (72,1%) for Ki67, 17 (29,3%) for p53, 48 (%82,8) for bcl-2, 19 (32,8%) for bax, 56 (96,6%) for cox-2 and 48 (78%) for PDGFRα. Ki-67 expression was correlated with risk grade and mitosis. The tumor necrosis was also correlated with risk grade. The study also indicated that the malignant potential of GIST is not correlated with the age, sex, tumor location, growth pattern, ulceration, cell type,

12 nuclear atypia, high cellularity, tumor hemorrhage, expression of c-kit, CD34, SMA, S100, desmin, p53, bcl-2, bax, cox-2, PDGFRα. Ki-67 labeling index and tumor necrosis may be useful in predicting malignant potential, and therefore help to determine the surgical treatment, follow-up manner, and the necessity of adjuvant therapy. Key words: Gastrointestinal Stromal Tumor, c-kit, CD34, S100, SMA, Desmin, Ki- 67, P53, Bcl-2, Bax, COX-2, PDGFRα.

13 1.GİRİŞ Gastrointestinal stromal tümörler (GİST), mezenkimal tümörlerin en sık görülen tipidir. 1 GİST ler tüm sarkomların %5-10 unu kapsar ve tüm GİST lerin yaklaşık %25 i maligndir. En sık yaşlarında görülen bu tümörler tüm gastrointestinal sistemin her bölgesinde yeralabilir ayrıca omentum, periton ve retroperiton ve safra kesesinde de tariflenmiştir. 2,3 GİST lerin malignite kriterleri tümör boyutu, sellülarite, ve mitotik oran gibi parametrelerdir. Bu parametreler tümör ancak rezeke edildikten sonra değerlendirilebilir. Oysaki preoperatif biyopsi spesmenlerinin immünhistokimyasal profilinden malign potansiyeli tahmin edebilmek cerrahi ve adjuvan kemoterapinin planlanmasında faydalı olabilir. 4 Az diferansiye görünümde olan tümörlerin her zaman malign davranış göstermemesi, ayrıca küçük ve mitotik aktiviteleri düşük olan bazı olguların bile uzun bir periyottan (20-30 yıl) sonra rekürrens gösterebilmeleri nedeniyle bu tümörleri bening ve malign olarak sınıflandırmak zordur. Bu nedenle bütün GİST lerin malignite potansiyeline sahip olduğu ve uzun dönem takiplerinin gerektiği kabul edilmektedir. 5,6 C-kit protoonkogen tarafından kodlanan bir tirozin kinaz reseptörüdür. Bu reseptör hücre proliferasyonunu, differensiasyon ve adaptasyonu kontrol eder. C-kit, normal Cajal ın intertisyal hücrelerinde (ICC), mast hücrelerinde, melanositlerde, ve bazı epitel hücrelerinde ( meme, tükrük bezi, ter bezi, nefron), fetal endotelyal hücrelerde ve CD34 pozitif hemopoetik hücrelerin bir kısmında eksprese edilir. C-kit pozitifliği GİST tanısı için altın standart kabul edilmektedir çünkü bening ve malign GİST lerin % ünde c-kit pozitiftir. 1,7,8 GİST lerin yaklaşık %4 ü c-kit negatiftir ve bu grupta c-kit ile aynı tirozin kinaz ailesinden olan PDGFRα mutasyonu saptanmıştır. 9 C-kit negatif olguların PDGFRα ile pozitifliği immünhistokimyasal yöntemle net olarak izlenmiş 10, böylece c-kit negatif GİST lerin nihai tanısının mutant KIT veya PDGFRα varlığının gösterilmesiyle konabileceğinin altı çizilmiştir. 11 1

14 Bir yüzey glikoproteini olan CD34 vasküler endotelde, bazı mezenkimal hücrelerde ve vasküler neoplazilerde saptanmıştır. 12 GİST lerin %60-70 inde CD34 pozitiftir. 5,8,13 Çeşitli çalışmalarda Ki-67 nin GİST lerin malignite potansiyelini tahmin etmede yardımcı olduğu belirtilmektedir. 4,14 Bazı yazarlar mitotik indeksin, mitozun sadece M evresini yansıttığı buna karşın Ki-67 nin, prolife olan hücrelerin G1, S, G2, fazlarını da tanımlayabildiğinden GİST lerin malignitesini değerlendirmede objektif bir kriter olarak kullanılmalarının daha uygun olduğu görüşündedir. 15 Son zamanlarda Ki-67 labeling indeksinin %10 un üzerinde olduğunda anlamlı olarak kötü prognostik değer olduğu rapor edilmektedir. 15,16,17 P53, 17p13.1 kromozomda lokalize tümör supresör gendir. İnsan kanserlerinin yarısından fazlasında bu genin mutasyonu mevcuttur. Bazı yazarlar GİST lerde P53 ün artmış ekspresyonunu bildirmişken 18, bazı yazarlar buna katılmamaktadır. 4,19 Bcl-2, mitokondrial membran proteinidir. Proliferasyonu etkilemeden apopitozu inhibe ederek hücre yaşam süresini uzatır. 20 Bcl-2 overekspresyonu malign potansiyelin artışında önemli bir rol oynayabilir. 4,19 T(14;18) translokasyonuna bağlı Bcl-2 ekspresyonunda artış bazı GİST vakalarında rapor edilmiştir. 21 Bax apopitozu indükleyerek tümör büyümesini suprese eder. Yapılan bir çalışmada GİST lerde Bax ile malign potansiyel arasında anlamlı bir korelasyon saptanmamıştır. 4 Başka bir çalışmada ise histolojik grade ile ilişkili bulunmuştur. 22 Siklooksijenaz izoenzimleri, Cox-1 ve Cox-2, araşidonik asidin prostaglandinler, prostosiklin ve tromboksanlara oksidasyonunun ilk evresini katalize eder. 23 Cox-2 nin kanser patogenezinde rol aldığı ve yaşam süresini anlamlı olarak kötü etkilediği bilinmektedir. Bir çalışmada malign GİST lerde eksprese edildiği gösterilmiştir. 24 Bu çalışmada tanı koymada ve prognozu tahmin etmede yararlı olabileceğini düşündüğümüz c-kit, CD34, SMA, S100, desmin, Ki67, p53, bcl-2, bax, cox-2 ve PDGFRα nın GİST lerdeki boyanma özelliklerini değerlendirmeyi böylece tümörün evolüsyon ve biyolojik davranışı ile bu immünohistokimyasal boyama bulgularının ilişkisini araştırmayı amaçladık. 2

15 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Gastrointestinal Sistemin Mezenkimal Tümörleri Epitelyal neoplazilerden daha az görülmekle beraber gastrointestinal traktın mezenkimal tümörleri nadir değildir ve iki ana gruba ayrılır. Bir grup, gastrointestinal mezenkimal tümörlerin küçük bir kısmını oluşturur ve yumuşak dokudaki karşılıklarıyla özdeştir (örn: lipom, leiomyom, hemanjiom) ve bunlar yumuşak dokudan gelişenlerle aynı kriterlere göre tanı alır. Gastrointestinal mezenkimal tümörlerin daha büyük olan grubu gastrointestinal stromal tümörler olarak bahsedilen bir grup heterojen tümördür. 25 Gastrointestinal sistemin mezenkimal tümörleri: Gastrointestinal stromal tümörler Düz kas tümörleri Nöral tümörler Schwannom Granüler cell tümör Gangliositik paraganglioma Ganglionöroma Lipomatöz tümörler Lipom Liposarkom Vasküler tümörler Glomus tümör Hemanjiom Anjiosarkom 3

16 2.2. Gastrointestinal Stromal Tümörler Gastrointestinal stromal tümörler gastrointestinal traktta, bazen de gastrointestinal sistem (GİS) bağlantısı olmaksızın abdomende gelişen mezenkimal tümörlerdir. Gastrointestinal mezenkimal tümörlerin en sık görülen tipidir. 1 GİST ler tüm sarkomların %5-10 unu kapsar. Bu tümörlerin çoğu tamamen veya kısmen iğsi hücrelerden oluşur ve ışık mikroskopik olarak düz kas veya sinir kılıfı tümörü görünümündedir. 26 Bu nedenle uzunca bir süredir GİS den köken alan mezenkimal tümörler, düz kas tümörleri (leiomyoma ve leiomyosarkoma) ve nöral tümörler (schwannoma) olarak sınıflandırılmışlardır lerde Mazur et al. bu tümörleri, düz kas ve nöronal differensiasyonun immünfenotipik bulgularını taşımamaları nedeniyle stromal tümörler olarak adlandırmışlardır lı yıllarda bu lezyonların önemli bir kısmının CD34 immünpozitivitesi gösterdiği saptanmıştır. 13 Ancak takip eden yıllarda bu pozitiflik oranının %70 in üstüne çıkmadığı anlaşılmıştır. Ayrıca schwann hücre neoplazileri ve gerçek düz kas tümörlerinin bir kısmı da CD 34 pozitifliği göstermektedir de Kindblom et al. GİST lerin, orjinlerinin Cajal ın interstisyel hücrelerine differansiye olan kök hücreler olduğunu destekler şekilde Kit tirozin kinaz reseptörünü eksprese ettiklerini rapor etmiştir. 8 GİST ler en sık yaşlarında görülür. Tran et al. ın 1458 olguluk epidemiyoloji çalışmasında tanı anındaki en küçük yaş 20, en büyük yaş 98 (ortalama yaş 63) bulunmuştur. Hastaların %44 ü erkek, %46 sı kadındır. GİST lerin %1 i özefagusta, %51 i midede, %36 sı ince barsakta, ve %7 si kolonda lokalizedir. 27 Son zamanlarda GİST tipi tümörler omentum, periton ve retroperiton ve safra kesesinde de tariflenmiştir. 3,28 GİST ler primer kitle, ağrı, kanama, veya metastaz bulgularıyla saptanabilir ve tespit edildiği anda olguların 2/3 ü 5cm nin üzerindedir. Mide ve ince barsaktakiler sıklıkla kanamaya neden olurken, özefagus ve rektumdakiler obtrüksiyon, disfaji veya barsak alışkanlıklarında değişiklik tablosuna yol açar. Nörofibromatozis-1 li hastaların ince barsaklarında çok odaklı GİST insidansında artış vardır. Bu olasılıkla NF-1 gen ürünü ile c-kit arasındaki etkileşim ile ilişkilidir. 2 Bazı hastalarda ikincil kanserler (renal kanser, safra kesesi kanseri, mide kanseri ve lenfoması) olgu bazında rapor edilmiştir. 29 4

17 ve bazı epiteloid GİST ler Carney triadında paraganglioma ve pulmoner kondroma ile ilişkili bulunmuştur. 2 Son zamanlarda GİST lerin Cajal ın intertisyel hücrelerinden köken aldığı hipotezi ortaya konmuştur. Bunun için çeşitli nedenler vardır; a) Hem ICC ler hem de GİST ler c-kit ve CD34 pozitiftir. 1,8,30 b) ICC ve GİST lerde tümör hücreleri benzer ultrastrüktürel bulgular gösterir. 8 c) c-kit genindeki germline mutasyonlarda multiple GİST lerin geliştiği diffüz ICC hiperplazisi görülür. 30,31 d)hem GİST lerin hem de ICC lerin düz kas myozin ağır zincirinin embriyonik izoformunu eksprese ettikleri rapor edilmiştir. 32 ICC gutun otonomik innervasyonu ile düz kas hücreleri arasındaki bağlantıyı sağlayarak pacemaker aktivitesi ile GI motiliteyi düzenler. İnce uzun, oval nükleuslu, dar sitoplazmalı hücrelerdir. En sık midede, ince barsak ve kolonda Auerbach myenterik pleksusunda lokalizedirler. Lokalizasyon, ultrastrüktür ve diğer hücrelerle ilişkisine göre en az dört tipe ayrılır. Çeşitli differansiasyon yeteneği olan mezenkimal prekürsörlerden köken alma olasılıkları vardır. 2 Bu varsayımdan hareketle Torihashi et al. enterik pleksustaki proto-hücrelerin Stem Cell Factor stimulasyonu altında Cajal hücrelerine dönüştüğü, stimulus yokluğunda ise düz kas hücrelerine dönüştüğü hipotezini öne sürmüştür. 33 Bir başka çalışmada Cajal hücrelerinin nöral krestten köken almadığı düz kas hücrelerinin özel differansiye bir tipi olduğu gösterilmiştir. 34 Ayrıca Hirschsprung hastalığında aganglionik barsakta bu hücrelerin varlığı gösterilmiştir. 35 Embriyonik gutta, düz kas hücreleri c-kit protein eksprese eder fakat fötal gelişim sırasında bu kaybolur. Myenterik ganglia etrafında yerleşen Cajal hücrelerinde ise c-kit ekspresyonu devam eder. 33 ICC lerin immünhistokimyasal ve ultrastrüktürel olarak, hem nöral hemde myoid differansiasyonun inkomplet bulgularına sahip olduğu gösterilmiştir. Aynı hücrelerin immünhistokimya (IHK), insitu hibridizasyon ve polimeraz zincir reaksiyonu ile c-kit ve küçük bir subpopilasyonda CD34 eksprese ettikleri gösterilmiştir. Guttaki diğer hiçbir hücre CD34\c-kit\vimentin immünfenotipine sahip değildir. 36 ICC lerin dağılımı gastrointestinal trakt boyunca farklı bölgelerdeki GİST görülme insidansı ile korale olarak değişir. Gastrik fundusta dağınık ve en çok sirküler kas tabakasındadırlar. Gövde ve antrumda pleksus ve sirküler kas tabakasındadırlar. İnce barsaklarda en çok Auerbach pleksusları ve sirküler kastadırlar. Kalın barsakta en 5

18 sık transvers kolonda bulunurlar. 2 Ayrıca Auerbach pleksusları GİST e komşu alanlarda hipertrofik hatta displastik olabilirler. 37 ICC lerin varlığının bilinmediği gastrointestinal sistem dışı alanlarda benzer neoplazilerin görülmesi açıklanamamıştır. Bazı yazarlar c-kit pozitif ICC lerle CD34 pozitif fibroblastların iki komşu fakat örtüşmeyen hücre tipi olduğu dolayısıyla GİST lerin orjininin ICC ler olduğu hipotezinin desteklenmediği görüşündedir. 38 GİST lerin orjini konusunda diğer bir olasılık da kökenlerinin pacemaker hücreler veya düz kas yönünde differansiasyon gösterebilen kök hücreler olduğudur. 8,39,40 Morfoloji: GİST ler iyi differansiyeden (myoid: leiomyoma,leiomyosarkoma; nöral: schwannoma) inkomplet differansiyasyona kadar geniş bir differansiasyon spektrumu sergilerler. Küçük bir grup undifferansiye olarak değerlendirilir. Gastrointestinal otonomik sinir tümörleri (GANT) gastrointestinal otonomik pleksusa benzer ultrastrüktürel bulgular sergileyen GİST in spesifik bir formu için kullanılmıştır fakat şimdi c-kit ve CD34 pozitifliği nedeni ile benzer immünhistokimyasal bulgular göstermesinden dolayı GİST ile aynı tümör olarak kabul edilmektedir. 30,41 Differansiasyon tipi ve derecesi ultrastrüktürel ve/veya immünhistokimyasal analiz ile belirlenir. 42 Makroskopik bulgular: Tümör çapı 1cm den 20cm ye kadar değişebilir. Submukozal, intramuskular, veya subserozal yerleşebilirler. Büyük tümörler kistik dejenerasyon, hemoraji, nekroz içerebilir. Tümörler sıklıkla iyi sınırlıdır ve kapsülsüzdür. Bazen psödokapsül görülebilir. Mukozal ülserasyon ve kavitasyona yol açabilirler. 2 Mikroskopik bulgular: Tümör, iğsi hücreli tip (%70), epiteloid tip (%20) veya mikst tip olabilir. Lezyonların %5 i belirgin miksoid stroma gösterebilir, bazı vakalar paraganglioma veya karsinoid benzeri büyüme paterni sergilerler. Vakaların sadece küçük bir kısmında (%2-3) belirgin sitolojik pleomorfizm görülebilir. 5 İğsi hücreli tip kısa fasiküller ve girdaplar oluşturan uniform eozinofilik hücrelerden oluşur. Tümör hücreleri düz kas hücre neoplazilerinden daha soluk sitoplazmalı, sıklıkla fibriler, sinsityal görünümdedir. Nükleuslar uniform görünümde, düz kas tümörü çekirdeklerinden daha ovoid, kısadır ve sıklıkla veziküle kromatinlidir. Perinükleer sitoplazmik vakuoller vakaların yaklaşık %5 inde tarif edilmiştir. Nükleer palizadlanma, stromal lenfositler, mikrokistik stromal dejenerasyon sıklıkla görülür. 6

19 Stromal kollajen çoğu vakada minimaldir, narin ince duvarlı damarlar belirgin olabilir ve stromal hemoraji bu tümörlerin sık bir bulgusu olarak karşımıza çıkar. 5 Epiteloid hücrelerin baskın olduğu GİST lerde tümör hücreleri daha bol, eozinofilik veya şeffaf sitoplazmalı yuvarlak hücrelerdir. Epiteloid hücreler, iğsi hücreler gibi uniform, yuvarlak-ovoid nükleuslu, veziküle kromatinlidir. İğsi hücreli vakalardan daha fazla yuvamsı yapı gösterir bu nedenle epitelyal veya melanositik lezyonlarla karışma riski daha fazladır. Şeffaf sitoplazmanın belirgin olduğu vakalarda sitoplazma hücre nükleusu çevresinde inklüzyonları taklit eder şekilde retrakte olarak izlenebilir. Mikst hücreli tipte iğsi ve epiteloid alanlar arasında ani bir geçiş görülebilir. 5 Tüm vakaların yaklaşık %10-20 lik kısmı stromal skenoid fibriller içerir. Bunlar hyalin veya fibriler parlak eozinofilik yapılardır. Pas pozitif globüler şeklinde veya daha elonge görünümdedirler. Bunların nöral differansiasyonla korale olduğuna inanılmakla birlikte şimdilik tam olarak anlamlandırılamamışlardır. 5 Bu tümörlerde berrak hücreli, yüzük hücreli, onkositik ve plazmositoid varyant görülebilir, multinükleer hücreler nadirdir. 2 C-kit: C-kit protoonkogen tarafından kodlanan bir tirozin kinaz reseptörüdür. Bu reseptör hücre proliferasyonunu, differensiasyon ve adaptasyonu kontrol eder. Ekstrasellüler ve intrasellüler olmak üzere iki kısımdan oluşur. Bu yapıdan dolayı makrofaj koloni stimüle edici faktör reseptörü ve platelet derive growth faktör reseptörü ile aynı alt grupta yer alır. Kit ligandı stem cell faktördür (SCF). Normalde iki SCF molekülünün bağlanmasıyla iki kit molekülü dimer oluşturur ve bu intrasellüler tirozin kinaz aktivasyonuna yol açar. Aktivasyon hücre proliferasyonu ve differansiasyonuna neden olur. 43 C-kit geninde mutasyon olduğu zaman bazı vakalarda tirozin kinaz aktivitesi kaybolur bazı vakalarda da SCF bağlanmaksızın aktivasyon olur. 30 Çeşitli mutasyonlar ekstrasellüler, jukstomembran, ve tirozin kinaz kısmında görülebilir. Soliter GİST lerde somatik mutasyonların, familyal ve multiple GİST lerde de germline mutasyonların görülmesinden dolayı c-kit mutasyonlarının GİST gelişimine neden olabileceği düşünülmektedir. 30 C-kit, normal ICC lerde, mast hücrelerinde, melanositlerde, ve bazı epitel hücrelerinde (meme, tükrük bezi, ter bezi, nefron), fetal endotelyal hücrelerde ve CD34 pozitif hemopoetik hücrelerin bir kısmında eksprese edilir. Boyanma genellikle sitoplazmiktir fakat mast hücreleri, melanositler ve germ hücrelerinde membranöz 7

20 olabilir. 44 C-kit pozitifliği GİST tanısı için altın standart kabul edilmektedir. 7,45 Benign ve malign GİST lerin %94 ünde c-kit pozitiftir. Epiteloid tipte boyanma yoğunluğu daha az olmakla birlikte her iki tipte de pozitif boyanma mevcuttur. 1 C-kit düz kas tümörleri ve schwannomlarda negatiftir. Dermatofibrosarkom protuberens, hemanjioperistom, sklerozan liposarkom, anjiosarkom ve kaposi sarkomunda bazen fokal pozitiflik saptanabilir. Ayrıca melanoma, şeffaf hücreli sarkom, küçük hücreli akciğer kanseri, Ewing sarkomu, anaplastik büyük hücreli lenfoma, Hodgkin lenfoma (Reed-Sternberg hücreleri), AML, seminoma, glioma, ve endometrial karsinomalarda c-kit ile fokal pozitif boyanma bildirilmiştir. 2,46 Ancak pek çoğu GİS dışında yer alan bu tümörler nadiren ayırıcı tanıda karşımıza çıkar. (Tablo 1) Tablo1. C-kit pozitif tümörler Gastroitestinal stromal tümör Melanoma Şeffaf hücreli sarkom Endometrial karsinom Akciğerin anaplastik küçük hücreli karsinomu Ewing sarkom Anaplastik büyük hücreli lenfoma Hodgkin lenfomada Reed Sternberg hücreleri Mastositozis AML Glioma Germinom Sircar et al. malign olgularda c-kit ekspresyonunda kayıp olduğunu bildirmiştir. 36 GİST lerin yaklaşık %4 ü tipik klinikopatolojik ve sitogenetik bulgular taşımalarına rağmen c-kit negatiftir. Kit pozitif tümörlerle karşılaştırıldığında bu tümörler daha epiteloid hücre morfolojisine sahiptir. Bu tümörler genellikle PDGFRα onkojenik mutasyonları içerirler ve omentum/peritoneal yüzeyde görülürler. 9 CD34: Bir yüzey glikoproteini olan CD34 vasküler endotelde, bazı mezenkimal hücrelerde ve vasküler neoplazilerde saptanmıştır. 12 Dermatofibrosarkom protuberens, soliter fibröz tümör, GİST, adipöz doku tümörlerinin iğsi hücreli komponenti, benign 8

21 polipler ve periferik sinir kılıfı tümörleri gibi çeşitli yumuşak doku neoplazilerinde pozitif bulunmuştur. 47 GİST lerin %60-99 inde CD34 pozitiftir ve ekspresyonu tümör lokalizasyonuna göre değişir. 5,8,13,48,49 Miettinen et al. 292 vakalık GİST serilerinde c- kit ile özefagusta %100, midede %90, ince barsakta %47, kolonda %65, rektumda %96, barsak dışı lokalizasyonda %64 oranında pozitiflik saptamıştır. 50 Bir çalışmada malign olgularda CD34 ekspresyonunda kayıp olduğu bildirilmektedir. 36 SMA: Hücre motilitesinden sorumlu olan bir kontraktil proteindir. Düz kas ve myofibroblastik hücrelerin tanımlanmasında yararlı bir markerdır. Düz kasa ve çizgili kasa spesifik çeşitli izoformları vardır. Çizgili kasa spesifik olanlar rabdomyosarkom tanısında kullanılır. 47 GİST lerin %19-57 sinde izlenen düz kas differansiasyonuna bağlı olarak SMA pozitifliği gösterilmiştir. 46,48,49 En sık ince barsak tümörlerinde görülür. 50 Bir çalışmada GİST lerde SMA ile CD34 ekspresyonu arasında ters ilişki saptanmıştır. 51 S100: Asidik, dimerik kalsiyum bağlayıcı protein ailesi (MA 21,000) alfa ve beta subunitlerin çeşitli kombinasyonlarından oluşur ve ilk kez santral sinir sisteminde izole edilmiştir. Glial hücreler, şıvan hücreleri, melanositler, kondrositler, adipositler, myoepitelyal hücreler ve bunlarda köken alan hücrelerin nükleus ve sitoplazmasında bulunurlar. Bu antijenin çok çeşitli hücreler tarafından ekspresyonu tanısal değerini büyük ölçüde azaltmıştır. Yaygın kullanım alanı periferik sinir kılıfı ve melanositik tümörlerdir. 47 GİST lerin %6-28 i pozitiftir. 48,49 İnce barsakta yerleşim gösteren GİST lerde diğer bölgelerdeki GİST lere oranla daha yüksek S-100 ekspresyonu saptanmıştır. 51 Desmin: Bu kas tipi intermediate filament (MA 55,000) düz kas ve çizgili kas hücrelerinde daha az olarakta myofibroblastlarda bulunur. Primer olarak düz kas ve iskelet kası tümörlerini tanımlamak için kullanılmıştır. 47 Gerçek Kit pozitif vakalarda desmin pozitifliğini izlemek oldukça nadir (%1-2) bir bulgudur, eğer pozitiflik saptanırsa boyanmanın küçük bir grup tümör hücresinde fokal olduğu izlenir. 50,51 Davranış: Tran et al. değişik evre ve lokalizasyonlardaki 1430 GİST vakasının sağ kalım analizinde 1 yıllık sağkalımı %80, 5 yıllık sağkalımı %45 olarak rapor etmiştir. 27 DeMatteo et al yılında yaptıkları bir çalışmada 200 vakalık olgu grubunda yer alan GİST lerin yaklaşık %50 sinin tanı aldığı anda metastazlarının da saptandığını bildirmişlerdir. 52 Malign GİST ler lokal rekkürrens gösterir ve komşu 9

22 organlara, omentum/ mezentere, retroperitona, karaciğere ve daha az oranda lenf noduna, akciğere nadiren de kemiğe metastaz yaparlar. 2 Az diferansiye olan tümörler her zaman malign davranış göstermediği gibi küçük, mitotik aktiviteleri düşük olan bazı olguların da uzun bir periyottan (20-30 yıl) sonra rekkürrens gösterebilmeleri nedeniyle bu tümörleri benign ve malign olarak sınıflandırmak zordur. 51 Genel olarak bütün GİST lerin malignite potansiyeline sahip olduğu ve uzun dönem takiplerinin gerektiği kabul edilmektedir. 5,6 Çeşitli çalışmalarda tümör boyutunun metastaz riskini tahmin etmede bağımsız bir belirleyici olduğu sonucuna varılmıştır. 48,53 Bazı çalışmalarda kötü prognozlu olgularda mitozun >5/50 HPF olduğu belirtilmektedir. 53 Bu nedenle 50 HPF deki mitoz sayısı ve tümör boyutu esas alınarak GİST ler dört gruba ayrılmıştır. Bu yaklaşım Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüsü nce de kabul edilmiştir (Tablo 2). Mitotik aktivitenin yoğunluğu ve tümör boyutu maligniteyle ilişkilidir. 5,40,50,54,55,56,57,58 Tablo 2. Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüsü Gastrointestinal stromal tömör Workshop 2001: Agresif davranış riskini tanımlamak için önerilen yaklaşım Risk Boyut Mitotik oran (50 HPF) Çok düşük risk <2cm <5 Düşük risk 2-5cm <5 Orta risk <5cm 5-10cm 6-10 <5 Yüksek risk >5cm >10cm Herhangi bir boyut >5 Herhangi bir mitotik oran >10 Mitoz sayımı mitotik aktivitenin en yüksek olduğu alanda yapılmalıdır. Mitozların çoğu düzenlidir atipik mitozlar leiomyosarkom va andifferansiye non-gist sarkomlardakinin aksine oldukça nadirdir. 6 Bazı çalışmalarda tümör boyutu mitotik aktivite oranı ile korale bulunmuştur. 45 Diğer prognostik faktörler; mukoza ve muskularis propria invazyonu, DNA ploidi, proliferasyon markerları (PCNA, Ki-67), nekroz, sellularite, pleomorfizm, immünfenotip, telomeraz aktivitesidir. 2,14,59 10

23 Bazı çalışmalarda düşük sellülaritenin iyi prognostik bulgu olduğu saptanmıştır. 53 Bazı yazarlara göre nükleer atipi genellikle GİST lerde baskın değildir ve önemi açık değildir. 6 Diğerleri ise belirgin pleomorfizmin kötü prognazla ilişkili olduğunu belirtmiştir. 53,60 Epiteloid ve mikst tümörlerin iğsi hücreli tümörlere göre daha kötü prognozlu olduğu belirtilmiştir. 61 Mukozal invazyon nadirdir fakat bulunursa bazı GİST ler için ayırt edici özellik olarak kabul edilir. Glandüler elemanlar arasında diffüz lenfoma benzeri büyüme paterni şeklinde görülür. Genel olarak mukozal invazyonun kötü prognostik bulgu olduğu kabul edilmektedir 6,53,62,63 Mukozal ülserasyon gastrik ve intestinal GİST lerin sık görülen bir bulgusudur. Tümöre bağlı kanama ile ilişkilidir ve hem benign hem malign GİST lerde görülebilir.bazı çalışmalarda kötü prognostik bulgu olduğu belirtilirken 62 bazılarında prognostik anlamı olmadığı düşünülmektedir. 6,53,63,64 Nekrozun da maligniteyle ilişkili olduğu rapor edilmiştir vakalık AFIP serisi lokalizasyonun, boyutun, mitotik aktivitenin, ve yaşın bağımsız prognostik değişkenler olduğunu göstermiştir. Özefagus orjinli tümörlerin iyi prognozlu, ince barsak orjinli tümörlerin daha kötü prognozlu olduğu belirtilmektedir. 55,61 Nakamura et al. ise farklı lokalizasyonlardaki GİST ler arasında anlamlı prognostik fark saptamamıştır. 65 Ayrıca 1458 vakalık gastrointestinal stromal tümörler çalışmasında farklı anatomik alanlarda yerleşen tümörler araştırılmış tümörün yerleşim yeri ile prognoz arasında anlamlı bir ilişki saptanmamıştır. 27 Benign ve düşük gradeli tümörler genellikle diploid ve çoğu malign tümör anoploddir fakat bu fark tanı için yeterli değildir. 2 Çeşitli çalışmalarda c-kit mutasyolarının GİST lerin malign potansiyeli ile korele olduğu bildirilmektedir. 1,7,8,66-69 Bazı çalışmalarda ise böyle bir korelasyona rastlanmamıştır. 61,70,71 İnsidantal olarak saptanan <1 cm GİST lerle yapılan bir çalışmada metastatik GİST lerle yaklaşık aynı oranda c-kit mutasyonuna rastlanmış (%85 / %86) bu nedenle de c-kit mutasyonunun progostik değeri olmadığı belirtilmiştir. 72 GİST teki mutasyonların çoğu jukstamembran kısmını kodlayan exon 11 de görülür. 7 Exon 9,13,17,14,15 mutasyonları da bildirilmiştir. 70,73,74 GİST lerin %85 inden fazlası aktive edici mutasyona sahiptir. 75 Yapılan bir çalışmada c-kit mutasyon negatif GİST vakalarının %35 inde PDGFRα kinaz aktivasyonuna neden olan 11

24 PDGFRα mutasyonu saptanmıştır. 76 Epiteloid ve mikst tip GİST lerde PDGFRα mutasyonlarının sıklığı daha fazladır. 77 Mikroskopik ayırıcı tanı: 1. Düz kas tümörleri: Leiomyomlar özefagus duvarında, kolon ve rektum submukozasında görülürler. Gerçek mural leiomyomlar oldukça nadirdir. Gerçek leiomyosarkomlar mide de hemen hiç görülmez, ince barsak, kolon ve rektum da bulunabilirler. İntestinal ve retroperitoneal leiomyosarkomlarda çok nadiren c-kit pozitif hücreler bulunabilir İnflamatuar myofibroblastik tümör: Gençleri sıklıkla pediatrik yaş grubunu etkiler, ekstramuraldir fakat barsak duvarına doğru gelişebilir. Belirgin plazma hücre infiltrasyonu sergileyen fasiit benzeri, fasiküler ve sklerozan paterne sahiptir. Hücreler myofibroblastik, GİST hücrelerinden daha uzun ve konik şekillidirler. SMA, desmin ve CK pozitifliği gösterirler fakat c-kit ve CD34 negatiftirler. Bir kısmı ALK1 ile pozitiftir Schwannom: Genellikle midede nadiren de özefagus ve kolonda görülürler. Keskin sınırlı fakat kapsülsüzdürler. S100 pozitif, c-kit negatiftirler İnflamatuar fibröz polip: En sık olarak ince barsak ve midede, erişkin yaşta görülürler. Genellikle sesildirler. Ödemli, hyalinize eozinofil ve plazma hücrelerini içeren stroma içerisinde iğsi ve yıldız şekilli fibroblastlardan oluşur. Fibroblastlar CD34 pozitif fakat c-kit negatiftirler Glomus tümör: Mide ve bazen özefagusta görülür. Histolojik olarak cilt ve yumuşak dokudakilere benzerdir ve c-kit negatiftirler Fibromatozis: Mezenter, retroperiton veya barsak duvarında görülebilir. Genç yaşta görülme eğilimi vardır. Makroskopik olarak tümör sert ve homojendir. Birbirine paralel, eşit uzunlukta iğsi veya yıldızımsı bir kaç mitoz içeren myofibroblastlardan oluşur. C-kit pozitifliği rapor edilmiştir ancak CD34 daima negatiftir. SMA %75 pozitif, desmin, vakaların %50 sinde fokal pozitiftir. 2 β- kateninin fibromatozisde nükleer pozitif olması ayırıcı tanıda yardımcıdır Soliter Fibröz Tümör: Peritoneal kavitede görülebilir ve barsağa yapışabilir. Belirgin bir patern oluşturmayan iğsi hücrelerden oluşur. Vakaların tamamına yakını CD34 pozitif, c-kit negatiftir. 2 12

25 8. Dedifferansiye Liposarkom: Pleomorfik sarkomdur, c-kit negatiftir. Çoğunlukla ekstramuraldir ve iyi differansiye liposarkom alanları içerir. S-100 pozitiftir Anjiosarkomlar: C-kit ve CD34 pozitifliği göstermelerinden dolayı GİST ile karışabilir ancak bu tümörler aynı zamanda CD31 de pozitiftir. 78 GIS in iğsi hücreli tümörlerinin ayırıcı tanısı için immünhistokimyasal bulgular Tablo 3 de gösterilmiştir. Tablo 3. GIS in iğsi hücreli tümörlerinin ayırıcı tanısı için immünhistokimyasal şema Tümör C-kit CD34 SMA Desmin S-100 GİST + %60-70 %30-40 nadir %5 Düz kas tümörü - % nadir Şıvannom Fibromatozis -* nadir + nadir - * Yazarların hepsi olmamakla beraber çoğu fibromatozislerde C-kit in negatif olduğunu rapor etmişlerdir. Fletcher et al. dan modifiye edilmiştir. 5 Tedavi: Primer tedavi tümörün eksizyonudur. Malign GİST ler konvansiyonel sitotoksik tedavilere dirençlidir. Kanser terapisi olarak sinyal iletiminin inhibisyonu ilk kez imatinib mesylate ile başarıyla denenmiştir. Başlangıçta Bcr-Abl blokajını hedef alan ve kronik myelositik lösemi tedavisinde kullanılan tirozin kinaz inhibitörü (Gleevac, Glivec) son zamanlarda GİST lerde de denenmiş mutasyon varlığına ve tipine bağlı olarak sonuç alınmıştır. Sonradan ileri evre GİST li hastalarda çok merkezli klinik çalışmalar yapılarak imatinibin güvenlik, etki ve biyolojik aktivitesine bakılmıştır. Bu çalışmalar ileri evre olgularda imatinibin etkili yeni bir terapötik olduğunu göstermiştir

26 PDGFR-α : Normal gastrointestinal traktta PDGFR-α myenterik ve submukozal pleksuslardaki ganglionlarda ve schwann hücrelerinde eksprese edilir. 10,80 Diğer tüm normal yapılar; düz kas, endotel, adipöz doku ve lenfoid elemanlarda boyanma görülmez. 10 Cajal hücrelerinde ekspresyon görülmemiştir. 99 Bir çalışmada c- kit pozitif olguların PDGFR-α ile negatif, c-kit negatif olguların pozitif sonuç verdiği rapor edilmiştir. Yine aynı çalışmada PDGFR-α nın kit negatif GİST leri desmoid hariç diğer mezenkimal lezyonlardan ayırmada yararlı olduğu belirtilmiştir. 10 PDGFR-α mutasyonu saptanan GİST ler genellikle epiteloid morfolojidedir ve multinükleer dev hücreler içerebilirler. 99 PDGFR-α nın GİST lerde eksprese edildiği halde Cajal hücrelerinde görülmeyişi çelişkili bulunmamıştır çünkü PDGFR-α nın çeşitli tümörlerde henüz bilinmeyen faktörlerle up-regüle olduğu bilinmektedir. 99 Ki-67: Ki-67 protein ekspresyonu hücre proliferasyonu ile ilişkilidir. İnterfaz boyunca antijen sadece nükleus içinde saptanır oysaki mitozda proteinlerin çoğu kromozomların yüzeyinde yer alırlar. Ki-67 proteini hücre siklusunun tüm aktif fazlarında (G 1, S, G 2 ve mitoz) vardır ancak istirahat fazındaki (G 0 ) hücrelerde ekprese edilmez. Ki-67 nin tüm prolifere olan hücrelerde (normal ve tümör hücreleri) mevcut olması, onu bir hücre populasyonunun büyüme oranını saptamada mükemmel bir belirleyici haline getirmiştir. Ki-67 pozitif hücrelerin oranı (Ki-67 labeling indeks) sıklıkla hastalığın klinik gidişiyle koreledir. 81 Birçok çalışmada Ki-67 nin GİST in malignite potansiyelini tahmin etmede yardımcı olduğu belirtilmektedir. 4,14,26,54,58-60 Son zamanlarda Ki-67 labeling indeksinin oranının %10 un üzerinde olduğunda anlamlı olarak kötü prognostik belirleyici olduğu rapor edilmiştir ,65,82 Mitotik indeks mitozun sadece M evresini yansıtır fakat ki-67 prolife olan hücreleri G1, S, G2, fazlarında da tanımlayabildiğinden GİST lerin malignitesini değerlendirmede objektif bir kriter olarak kullanılmaları daha uygun bulunmuştur. 15 P53: P53 17p13.1 kromozomda lokalize tümör supresör gendir. İnsan kanserlerinin yarısından fazlasında bu genin mutasyonu mevcuttur. Çoğu vakada inaktive edici mutasyonlar her iki alleli etkiler ve somatik hücrelerde edinseldirler. P53 proteini nükleusta lokalizedir, görevi çeşitli diğer genlerin transkripsiyonunu kontrol etmektir. Normal hücre siklusunda görev almaz, DNA hasarlandığında p53 ün iki büyük etkisi olan; 1.hücre siklusunun durmasına neden olur 2. apopitoza aracılık eden çeşitli genlerin transkripsiyonunu stimüle eder. 83 Bazı yayınlarda GİST lerde P53 14

27 overekspresyonu bildirilmişken, 7,18 bazı yazarlar buna katılmamaktadır. 4,19 Çeşitli çalışmalarda GİST lerde p53 ekspresyonunun yüksek grade, nükleer atipi, yüksek mitototik oran ile ilişkili olduğu belirtilmiştir. 17,84,85 Bunlara ek olarak p53 gen mutasyonu, büyük boyut, mukozal invazyon ve epiteloid morfolojiyle de ilişkili bulunmuş 86, p53 ekspresyonunun tümörün davranışıyla korele olduğu, bu nedenle tümör davranışını tahmin etmede yardımcı olabileceği belirtilmiştir. 58 Sabah et al. %43 oranında pozitiflik ve benign GİST lerle malign GİST ler arasında anlamlı fark olduğunu rapor etmiştir. 87 Bir başka çalışmada ise anlamlı fark bulunmamıştır. 49 Bcl-2: Bcl-2 proliferasyonu etkilemeksizin apopitozu bloke ederek hücre ömrünü uzatan bir mitokondrial membran proteinidir. 20 Büyüme faktörleri ve diğer yaşam sinyalleri Bcl-2 protein ailesinin anti-apopitotik elemanlarının yapımını sitümüle eder. Bu ailede 20 den fazla protein vardır, iki ana anti-apopitotik proteinler Bcl-2 ve Bcl-x dir. Bu proteinler normalde mitokondrial membranlarda ve sitoplazmada yer alırlar. Hücre, yaşam sinyallerinden yoksun kaldığında yada strese maruz kaldığında Bcl-2 ve/veya Bcl-x mitokondrial membrandan kaybolur ve yerini Bak, Bax ve Bim gibi ailenin pro-apopitotik elemanları alır. Bcl-2/ Bcl-x düzeyleri azaldığı zaman, mitokondrial membran geçirgenliği artar ve çeşitli proteinler caspase cascade ın dışarı sızmasını aktive ederek hücreyi apopitoza götürebilir. 83 İlk kez folliküler ve diffüz B hücreli lenfomalarda 14;18 translokasyonunda tanımlanmıştır. Bu translokasyonun sonucu olarak 18. kromozomdaki Bcl-2 geni, 14. kromozomdaki immünglobülin ağır zincir geni ile yan yana gelir ve Bcl-2 up regülasyonu olur. 83 Bcl-2 onkoprotein ekspresyonu t(14;18) a spesifik değildir ve normal B ve T hücrelerinde ve bu translokasyona sahip olmayan diğer lenfoproliferatif hastalıklarda da saptanabilir. 88 Bcl-2 ekspresyonunun mide, kolon, over,uterus gibi lenfoid olmayan proliferesyonların premalign glandüler lezyonlarında up regülasyonu; karsinomlarında ise down regülasyonu bildirilmiştir. 89 Suster et al. un çalışmasında yumuşak doku, serozal yüzeyler ve gastrointestinal traktın çeşitli iğsi hücreli tümörlerinde Bcl-2 ekspresyonu saptanmıştır. Bu çalışmada Bcl-2 ekspresyonu CD34 ile paralel bulunmuştur ve Bcl-2 nin bir immünhistokimya paneli ile birlikte kullanıldığında bu proteini yoğun eksprese eden monofazik sinovial sarkom, soliter fibröz tümör ve gastrointestinal stromal tümörler için tanıya yardımcı olabileceği belirtilmiştir yine aynı çalışmada malign olmayan GİST lerin %100 ünde, 15

28 malign olanların ise %50 sinde pozitiflik saptanmış bu bulgu malign transformasyonla tümörün antijenik ekspresyon kaybına bağlı olduğu şeklinde yorumlanmıştır. 21 Yine farklı bir çalışmada GİST lerde Bcl-2 pozitifliğine %77 oranında rastlanmıştır. Bu çalışmada Bcl-2 nin prognostik değeri bulunamamıştır. 86 Başka araştırmacılar ise Bcl- 2 over ekspresyonunun GİST lerde malign potansiyelin artışında önemli bir rol oynayabileceğini belirtmişlerdir. 4,19,90 Bax: Bcl-2 protein ailesinin proapopitotik bir üyesi olan Bax ın artmış ekspresyonu apopitozda artışa neden olur. Apopitoz çeşitli karsinomların grade i ile ilişkili bulunmuş olmakla birlikte mezenkimal tümörlerdeki durumu bilinmemektedir. 91 Bazı çalışmalarda prognostik değeri olmadığı rapor edilmiştir. 4,87 Bir çalışmada 52 GİST olgusunun 29 unda (%55) bax pozitif bulunmuş lokalizasyonla anlamlı ilişki bulunamamış ancak histolojik grade ile paralellik saptanmıştır. 22 COX-2: Siklooksijenaz izoenzimleri, Cox-1 ve Cox-2, araşidonik asidin prostaglandinler, prostosiklin ve tromboksanlara oksidasyonunun ilk evresinde rol alan hız kısıtlayıcı enzimlerdir. 23,92 Her ikisi de endoplazmik retikulumda ve nükleer zarın iç ve dış membranında yer alır. 93 COX-1 pek çok normal dokuda sürekli olarak eksprese edilirken Cox-2 sitokinler, mitojenik ajanlar ve büyüme faktörlerine cevap olarak salınır. 94,95 Cox-2 enziminin in vitro up regülasyonu çeşitli tümorojenik etkilere sahiptir; hücre siklus arrestinin indüklenmesi 92, apopitoza direnç 96, hücre büyümesinde artış 97, mitogenezin stimülasyonu 98 gibi. Cox-2 pek çok epitelyal malignitede eksprese edilmektedir. Son yıllarda Cox-2 nin artmış ekspresyonu GİS in epitelyal tümörlerinde iyi tanımlanmış ve kötü prognozla korelasyon bildirilmiştir. 99 Ancak mezenkimal tümörlerdeki Cox-2 ekspresyonu ile ilgili fazla çalışma yoktur. Bu konuda yapılan çalışmalardan birinde GİST lerde de bu enzimin lezyonların proliferasyonunda rol oynayabileceği ve tedavide non-steroid antiinflamatuar ilaçların potansiyel olarak kullanılabileceği belirtilmektedir. 24 Başka bir çalışmada ise GİST lerde %92 oranında değişen yoğunluklarda ekspresyon saptanmış, Cox-2 ekspresyon düzeyleri ile tümör lokalizasyonu ve boyutu arasında korelasyon bulunmamıştır

29 3. GEREÇ VE YÖNTEM yılları arasındaki Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilimdalı nın gastrointestinal traktın tüm mezenkimal tümör tanısı (GİST, leiomyoma, leiomyosarkoma, malign fibröz histiyositoma) almış olgularına c-kit, CD34, SMA, S100, desmin uygulanarak pozitif olanlar çalışmaya dahil edildi. Tümörler çap, sellülarite, sitolojik atipi, ülser, nekroz, kanama, tümör büyüme paterni, mitoz açısından değerlendirildi. İmmünhistokimyasal çalışma için uygun bloklar seçildi. Amerikan Ulusal Sağlık Enstitüsü kritelerine göre risk grupları belirlendi. Nüks ve metastazlar dikkate alındı Strept avidin-biotin boyama yöntemi Dokuların hazırlanması İmmünhistokimyasal boyama için %10 luk formalinde tespit edilen dokular, doku takip işleminden sonra bloklanarak 5 mikron kalınlığında kesitler elde edildi. Kesitler 50 C lik sıcaklıktaki su banyosuna atılarak dokuların tam kat açıması beklendi vedokular özel polysineli lamlara alındı. Hazırlanan kesitler 60 C lik etüvde dk arası (parafin eriyene kadar) bekletildi. 60 C lik etüv içerisindeki sıcak ksilolde 10 dk tutuldu. Oda ısısındaki 3 ayrı ksilol şalelerinde, her birinde beşer dk tutularak daha sonra üç ayrı alkol şalelerinde beşer dk tutularak distile suda iyice yıkanıp, deparafinizasyon işlemi tamamlandı. Endojen peroksidaz aktivitesini bloke etmek için %3 H 2 O 2 (Hidrojen peroksid) in distile sudaki solüsyonunda beş dakika inkübe edildi. Sonra distile suda yıkandı. Ki-67, Bcl-2, CD34, S100, Desmin için ph 6.0 olan citrat bufer, P53 ve CD117 (C-kit) için ise ph 8.0 EDTA solüsyonu içerisine, (mikrodalgaya dayanıklı özel şalelerde) lamlar düzenli bir şekilde sıralanarak Beko marka 1550 model mikrodalga fırında medium konumda yedişer dakika iki kez çevrilerek inkübe edildi, daha sonra oda ısısında soğumaya bırakıldı (20-25 dk.). PDGFR α (c-20) için pepsin damlatılarak 30 dk oda ısısında bekletildi. 17

30 SMA, yukarıda belirtilen solüsyonlarla muamele edilmeden, tüm antikorlar için lamlar ph sı olan PBS (0-01M phosphote buffer saline) de 3-5 dk yıkanarak (3 ayrı şalede) daha sonra doku çevresi silinip dokular nemli bir ortamda ( yatay şalelerde, PBS ortamında) lamlar yatay bir şekilde konularak üzerine PAB damlatıldı. PBS de 3-5 dk yıkanarak doku çevresi silindi. Sekonder antibody (biotinli) damlatılarak 20 dk oda ısısında inkübe edildi. PBS de 3-5 dk yıkanarak doku çevresi silindi. HRP- Streptavidin damlatılarak 30 dk oda ısısında inkübe edildi. PBS de 3-5 dk yıkanarak doku çevresi silindi. AEC chyromogen damlatılıp 5-20 dk arası mikroskopta kontrol edilerek dokular distile suya alındı. Mayer hemotoksilende 1-3 dk tutulduktan sonra çeşme suyuna alınıp 3-5 dk yıkandı. Distile sudan geçirilerek su bazlı kapatma maddesiyle (Scytek Aqueous Mont Low viscsity) kapatıldı. Tüm aşamalar nemli bir ortamda yapılarak işlem esnasında dokuların kurumamasına önemle dikkat edildi. Antikorlar, dilüsyon ve kaynakları Tablo 4 de özetlenmiştir.. 18

31 Tablo 4. İmmünhistokimyasal çalışmada kullanılan antikorların dilüsyon ve kaynakları Antijen Klon Dilüsyon PAB süresi Polyclonal Rabbit Anti- ph 8.0 C-kit Oda ısısı Human EDTA 1:600 (CD117) 90dk A-4502 buffer SMA M0851-1:50 Oda ısısı 60dk S100 Z0311 ph 6.0 Oda ısısı 1:350 citrat buffer 60dk Desmin M0760 ph 6.0 Oda ısısı 1:80 citrat buffer 60dk Ki67 Monoclonal mause Anti- ph C 1 1:100 Human MIB-1 cod. M-7240 citrat buffer gece Bcl-2 Mouse monoclonal Batch: ph 6.0 Ready to +4 C citrat buffer use gece P53 ph 8.0 Monoclonal mause Anti- Ready to Oda ısısı EDTA Human D0-7 Ref N use 90dk buffer CD34 Monoclonal mause AntipH 6.0 Oda ısısı Human Class II QBEnd10 M- 1:50 citrat buffer 90dk 7165 Oda ısısı PDGFRα Rabbit polyclonal IgG Sc-338 pepsin 1:200 60dk ph 6.0 Oda ısısı Cox-2 Mouse (Cox 229) 1:100 citrat buffer 90dk Mouse (2D2) ph 6.0 Oda ısısı Bax 1: citrat buffer 90dk Kaynak DAKO DAKO DAKO DAKO DAKO Novacastra DAKO DAKO Santa Cruz Biotechology Zymed Zymed Universal kit Histostatin Plus Zymed 19

32 3.2. Değerlendirme Çukurova Üniversitesi Tıp Fakültesi Patoloji Anabilimdalı nda yılları arasında kabul edilerek incelenen GİST yada leiomyoma, leiomyosarkoma, malign fibröz histiyositoma tanısı alan tüm örnekler yeniden değerlendirildi. Çalışma kapsamına alınan örneklerin immünhistokimyasal çalışma için uygun blokları seçildi. Tüm kesitler ışık mikroskobunda iki araştırmacı tarafından ayrı ayrı ve daha sonra birlikte değerlendirildi. Mitoz 50 büyük büyütme alanında sayıldı. Tüm olgular mitoz ve tümör çapının esas alındığı Amerikan Sağlık Enstütüsü risk grade leme sistemine göre çok düşük, düşük, orta ve yüksek risk grubu olmak üzere sınıflandırıldı. C-kit için Cajal hücreleri ve mast hücreleri internal pozitif kontrol kabul edildi. Sitoplazmik ve membranöz boyanma dikkate alındı. Boyanma negatif/pozitif, pozitif olanlarda boyanma yaygınlığı <%10, %10-50, >%50, boyanma şiddeti 1+, 2+, 3+ olarak gruplandı. C-kit bir doku kesitinde negatif ise farklı doku kesitlerine uygulandı. CD34 için vasküler endotel internal pozitif kontrol olarak değerledirildi. Sitoplazmik boyanma pozitif kabul edildi. Boyanma negatif/pozitif, pozitif olanlarda boyanma yaygınlığı <%10, %10-50, >%50 olarak gruplandı. S100 için sinir pleksusları internal pozitif kontrol kabul edildi. Sitoplazmik ve nükleer boyanma dikkate alındı.boyanma negatif/pozitif, pozitif olanlarda boyanma yaygınlığı <%10, %10-50, >%50 olarak gruplandı. SMA ve Desmin için kas dokusu pozitif kontrol kabul edildi. Boyanma negatif/pozitif, pozitif olanlarda boyanma yaygınlığı <%10, %10-50, >%50 olarak gruplandı. Ki-67 için mukozal lenfoid doku pozitif kontrol olarak kullanıldı. Nükleer boyanma pozitif kabul edildi. Değerlendirme boyanmanın en fazla olduğu alanda yapıldı. Her kesitte 1000 hücre sayılarak pozitif boyananların oranı saptandı. Ayrıca %10 pozitiflik sınır kabul edilerek olgular, %10 un üzerinde pozitiflik ve %10 un altında pozitiflik gösterenler olarak gruplandırıldı. P53 ile her tümör için boyanan neoplastik nükleusların sayısı, toplam neoplastik hücrelerin sayısına bölünerek p53 skoru elde edildi. Yoğunluk 1 den 3 e kadar derecelendirildi. P53 skoru %10 ve yoğunluğu en az 2+ olanlar p53 için pozitif kabul edildi. Skor boyanmanın en çok olduğu alanda 1000 hücre sayılarak elde edildi. 20