Çocukluk Çağı Akut Lenfoblastik Lösemisinde. Minimal Rezidüel Hastalığın Araştırılması ve Relaps ile İlişkisinin Gösterilmesi

Transkript

1 Çocukluk Çağı Akut Lenfoblastik Lösemisinde Minimal Rezidüel Hastalığın Araştırılması ve Relaps ile İlişkisinin Gösterilmesi Serap KARAMAN * Çocukluk Çağı Akut Lenfoblastik Lösemisinde Minimal Rezidüel Hastalığın Araştırılması ve Relaps ile İlişkisinin Gösterilmesi Günümüzde, akut lenfoblastik lösemide sağkalım oranı % lere ulaşmasına rağmen, relapslerin görülmesi, hala ciddi ve çözülmesi gereken bir problemdir. Klinik ve sitokimyasal yöntemlerle tam remisyonda kabul edilen bazı olgularda relapsların görülmesi, kemik iliğinde tedavi ile yok edilmemiş belli miktarda lösemik hücrenin kaldığını göstermektedir. Minimal rezidüel hastalık (MRH), morfolojik olarak saptanamayacak kadar düşük sayıda ve hastalığın tekrarlamasına neden olan lösemik hücrelerin gösterilmesidir. Tespitinde, çeşitli yöntemler kulanılmaktadır. Bunlar sırası ile 10-4 ve 10-5 hassasiyete kadar blastların varlığını gösterebilen akım sitometrisi ve moleküler biyolojik yöntemlerdir. Tek bir ölçümde MRH nin pozitif olması relapsın habercisi olabilirse de ardışık ölçümlerde MRH varlığı çok daha iyi bir göstergedir. Birçok çalışmada MRH tespiti için farklı günler önerilmekle birlikte, indüksiyon tedavisinin sonunda bakılan MRH ölçümünün tedavi etkinliğinin değerlendirilmesinde ve relaps açısından yüksek riskli grupların belirlenmesinde önemli bir gösterge olduğu ön görülmektedir. Anahtar kelimeler: Lösemi, minimal rezidüel hastalık Investigation of Minimal Residual Disease in Pediatric Acute Lymphoblastic Leukemia and Demonstration of its Relation with Relapse Although the survival rate of ALL reaches % recently, relapses are serious problem that should be resolved. Seeing relapses in some of the patients who are thought to be in remission according to clinical and cytochemical methods show that certain amount of leukemic cells remained in the bone marrow which could not be destroyed by treatment. Minimal residual disease means showing leucemic cells which are so low in number that they could not be demonstrated morphologically but cause relapse. Several methods are used for this. These are flow cytometry and molecular biological methods that show the presence of blasts with a sensivity of 10-4 and Minimal residual disease in a single measurement could show relapse but the presence of minimal residual disease in serial measurements is a better indicator of relapse. Although different times are proposed for establishment of minimal residual disease in different studies, measurement of minimal residual disease at the end of induction therapy is thought to be more valuable for evaluation of effectiveness of the treatment and also for determination of high risk groups for relapse. Key words: Leukemia, minimal residüel disease Lösemide tanı ve tedavi yöntemlerindeki son gelişmeler, destekleyici bakımdaki ilerlemelerle günümüzde sağkalım oranı % 70 lere ulaşmaktadır (1). Ancak tüm bu gelişmelere rağmen, relapsların görülmesi, hala ciddi bir problem olarak karşımıza çıkmaktadır. Nitekim, klinik ve sitokimyasal yöntemlerle tam remisyonda kabul edilen bazı olgularda relapsların görülmesi, kemik iliğinde tedavi ile yok edilmemiş belli miktarda lösemik hücrenin kaldığını göstermektedir. Sitolojik ve morfolojik tekniklerle ancak % 1-5 oranında blastik hücre gösterilebilmekte, dolayısıyla bu yöntemler, hastaya uygulanan tedavi yöntemlerinin etkinliğinin gösterilmesinde bazen yetersiz kalmaktadır. Tanı sırasındaki yaş, lökosit sayısı, kromozomal translokasyonların varlığı, in vivo ya da in vitro olarak kemoterapiye cevabın değerlendirilmesi, hangi olgularda relapsın daha sık görülebileceği ile ilgili olarak risk grupları oluşturmada bize yardımcı olmaktadır (1). Morfolojik olarak saptanamayacak kadar düşük sayıda ve relapslara neden olan lösemik hücrelerin varlığına, MRH adı verilir (2). Minimal rezidüel hastalık aranmasında çeşitli yöntemler kulanılmaktadır. Bunlar sırası ile 10-4 ve 10-5 hassasiyete kadar blastların varlığını gösterebilen akım sitometrisi ve moleküler biyolojik yöntemlerdir (Polimeraz Zincirleme Tepkimesi; Polymerase Chain * İstanbul Şişli Etfal Eğitim ve Araştırma Hastanesi, Çocuk Hematoloji Kliniği, Dr. 33

2 Reaction:PCR). Komplet remisyonda olan çocuklarda bile 1010 civarında lösemik hücre bulunabilir (3). Kemik iliğinde < % 5 blast görülmesi sitolojik remisyonu gösterirken, < % 0.01 blast bulunması immünolojik ve moleküler remisyonu göstermektedir (4). Lösemide uygulanan yoğun kemoterapi rejimleri ve radyoterapi tedavisinin yeterli etki gösteremediği ve bu yüzden hastalığın kısa süre içinde tekrarlamasına neden olan bir grup hücrenin varlığı, lösemi tedavisi sonrası relapsa yol açan en önemli neden olarak gösterilmektedir. Erkek cinsiyet, başlangıçtaki lökosit sayısının 50000/mm 3 ün üzerinde olması, 1 yaş altı ya da 10 yaş üzerinde olmak, Philadelphia kromozom pozitifliği, t(4;11) pozitifliği, hipodiploidi, T hücre immunfenotipi ve tedaviye geç yanıtın artmış relaps riski ile ilişkili olduğu düşünülmektedir (5,6). Minimal rezidüel hastalık bakılmasının tedavi yanıtının değerlendirilmesinde ve relaps açısından yüksek riskli ya da düşük riskli grupları saptamada daha güvenilir olduğu ve klinik sonuçlar açısından yaş, immunfenotip lökosit sayısı, cinsiyet gibi diğer prognostik göstergelerden daha iyi bir gösterge olduğu belirtilmiştir (7,8,9). Bu yüzden ALL tanısında MRH in önemli bir prognostik faktör olduğu düşünülmektedir (7,10,11,12). Bu çalışmaların sonucunda MRH bakılması, giderek rutin tedavi protokollerinde risk sınıflamasına dahil edilebileceği yönündedir (7,8,13,14). Böylece klinikte tedavi edilen hastanın tedaviye yanıtı, remisyonu ve minimal rezidüel hastalığı, moleküler olarak takip edilebilmektedir. Mimimal rezidüel hastalığın gösterilmesi için yararlanılan yöntemler aşağıda belirtilmiştir: 1) İmmunfenotipleme: Akım sitometrisi ile lösemik hücre yüzeyindeki aberan protein ekspresyonun gösterilmesidir. Yapılan çalışmalarda flow sitometrik MRH tayininin prognostik önemi olduğu, kolaylıkla uygulanabilirliği, duyarlı olduğu gösterilmiştir. 2) Karyotip analizi: Sitogenetik çalışma, fluoresan in situ hibridizasyon (FISH). 3) PCR yöntemi: Kromozomal aberasyonların ve klona özgü Ig ile TCR gen yeniden yapılanmalarının gösterilmesi amaçlanır. Polymerase Chain Reaction (PCR) ile, 10-5 ten daha düşük seviyedeki hücre sayımı yapılarak MRH gösterilebilmektedir (15). İndüksiyon tedavisi sonrasında bakılan klonal gen yeniden yapılanmasının 1/1000 oranından daha sık bulunmasının relaps açısından yüksek risk oluşturduğu bildirilmiştir. Günümüzde de MRH tespitinde, en duyarlı ve en özgül teknikler olan akım sitometrisi ile immunfenotipleme ve PCR tercih edilmektedir (3,16,17). Flow sitometri ve PCR ile MRH ölçümlerinin benzer sonuçlar gösterdiği bildirilmiştir (18). Çocuklarda ALL ile ilgili yapılan çalışmalar, MRH ın tespiti ve kantitatif değerinin prognostik önemini desteklemektedir. Çocukluk çağı ALL sinde MRH ölçümü, sitotoksik tedavinin etkinliğini değerlendirmemizi sağlamaktadır (7,8,13,19). Bu amaçla tedavinin ilk ayında MRH ölçümleri yapılmış, indüksiyon tedavisi sonunda 10-2 resiüel hücre bulunmasının, relaps riskini yaklaşık 10 kat arttırdığı bulunmuştur. Tedavinin haftasından sonra yaklaşık olarak 10-3 rezidüel hücrenin tespit edilmesi ise, iyi ve kötü risk grubundaki hastaları belirlemede yararlı bulunmuştur (7,8,20). Böylece MRH pozitif saptanan olgularda, erken dönemde tedavi stratejileri değiştirilebilir ya da hasta erken dönemde kemik iliği nakli için yönlendirilebilmektedir. İyi bir moleküler cevap varlğında ise, hastaya daha hafif bir kemoterapi rejimi sunulacak, dolayısı ile geç dönem yan etki potansiyeli azalacaktır. Stadt ve ark. (15), ALL li olguları, tanı sırasında düşük ve yüksek riskli gruplara ayırarak, indüksiyon tedavisinin sonunda (36.gün) PCR ile MRH bakmışlardır. Oniki olguda MRH negatif iken, 16 olguda 10-4 (düşük düzeyde), 28 hastada yaklaşık 10-2 (orta düzeyde), 20 34

3 hastada 10-2 (yüksek düzeyde) ve daha yüksek değerler elde edilmiştir. Tanı sırasında yüksek risk grubuna girenlerde MRH yüksek saptanmış olup, T-ALL olgularının hepsinde de, moleküler seviyede MRH saptanmıştır. Bunların dokuzunda yüksek pozitiflik (10-2 ve üzerinde), 6 sında ise düşük pozitiflik (10-2 nin altında) saptanmış olup tüm relapslar da yüksek seviyedeki MRH olgularında saptanmıştır (Tanıdan sonraki 336, 456 ve 549. günler). Bu çalışmada yüksek MRH düzeyi olan 20 olgudan yalnızca 5 i relaps etmiş olup, indüksiyon tedavisi sonunda saptanan yüksek değerlerdeki MRH in, yüksek relaps olasılığı ile ilişkili olmayabileceği bildirilmektedir. Ancak bunun tersini savunan çalışmalar da mevcuttur. Örneğin, Cave ve arkadaşları (7), 133 ALL olgusuna indüksiyon tedavisi sonunda MRH bakmışlar, 15 inde yüksek düzeyde MRH pozitifliği saptamışlar ve bunların 11 inin relaps ettiğini göstermişlerdir. Van Dongen ve ark. (8), indüksiyon tedavisi sonrası 169 ALL olgusundan 27 sinde yüksek düzeyde MRH saptamışlar (10-2) ve olguların 20 sinde (% 74) relaps saptamışlardır. Bu çalışmalarda değişik sonuçlar bulunmuş olması, farklı çalışma gruplarına farklı indüksiyon tedavisi verilmesinden kaynaklanabilir. Berlin-Frankfurt-Münter (BFM) ve Fransız çalışma grubunda indüksiyon tedavisinde 1 haftalık prednizolon ve 1. gün intratekal metotreksat tedavisi sonrasında 4 lü ilaç kombinasyonundan (prednizolon, vincristin, danorubisin ve L-asparaginaz) oluşan bir tedavi verilmekte iken, COALL protokolünde (farklı sonuç bulan Sinopsis çalışmasındaki gibi), tek doz daunorubisin ve intratekal metotreksat tedavisini takiben 3 lü ilaç kombinasyonundan (prednizolon, vinkristin, daunorubisin) oluşan tedavi verilmekte, L-asparaginaz; indüksiyon tedavisini takibeden intensifikasyon fazında verilmektedir. Bu durum, çok az derecede de olsa diğer protokole göre nispeten daha hafif bir indüksiyon tedavisi verilmesi nedeni ile, 36. günde daha yüksek lösemik hücre yüküne sebep olmuş olabilir. Bu yüzden bu iki grup arasındaki farklı MRH düzeyleri, indüksiyon tedavisinde L-asparaginaz ın yer almamasından kaynaklanabilir. Gruhn ve arkadaşları (21), çalışmalarında aynı noktaya değinmektedir. Bu çalışmada kullanılan yoğun 6 lı kemoterapi rejimi sonrasında (43.gün), MRH negatifliğini % 73 bulmuşlar, indüksiyon tedavisinin, MRH seviyesinde rol oynayan lösemik hücrelerin eradikasyonunda çok etkili olduğunu ileri sürmüşlerdir. Her ne kadar, COALL protokolündeki indüksiyon tedavisi sonrasında MRH düzeyi, diğer protokole göre daha yüksek düzeyde çıksa da, protokoller arasındaki sağkalım oranlarında farklılık gösterilememiştir. Bu çalışmaya göre MRH ın daha sonraki bir zamanda bakılması daha aydınlatıcı ve prediktif olabilir. Ne zaman MRH bakılmalı sorusunun cevabı, diğer çalışmalarda bakılan MRH sonuçlarının değerlendirilmesi ve karşılaştırılmasından sonra belirlenebileceği ve daha geniş çaplı araştırmalar yapılması gerektiği vurgulanmaktadır. Zhou ve ark. (22) yaptıkları çalışmada, B-ALL tanılı 284 olguda 4 haftalık indüksiyon tedavisi sonunda (30. gün) PCR ile MRH bakmış ve ALL de MRH nin kantitatif ölçümünün, erken relapsları saptamada en önemli prognostik faktör olduğunu belirtmişlerdir. Yine bu çalışmada, indüksiyon tedavisi sonunda yüksek düzeyde (10-3 ve üzeri) MRH olan olgularda, düşük MRH düzeyindeki olgulara göre daha kısa sürede relaps oluştuğu ve relaps riskinin 10,5 kat arttığı bulunmuştur. Bazı çalışmalarda MRH negatif olgularda da relaps görüldüğü bildirilmiştir. Borowitz ve ark. (23), bu yanlış negatifliğin nedenini ortaya koymak için tanı ve relaps sırasıdaki antijen expresyonunda, yani fenotipte bir değişikliğin olup olmadığını araştırmışlar ve relapstaki lösemik blastlarda, fenotipik açıdan değişiklikler oluştuğunu göstermişlerdir. Gaipa ve ark. (24) yaptıkları çalışmada, antijen expresyonundaki fenotipik değişikliklerin indüksiyon tedavisinin 15. günü kadar bile erken olabildiğini ve bunun ilaç tedavisi ile ilişkili olduğunu ileri sürmüşlerdir. 35

4 Mopett ve ark. (2), 129 ALL tanılı olguda, tanıdan 1 ve 3 ay sonrasında MRH bakmışlar, değeri pozitif olanlarda relaps riskini yüksek bulmuşlardır. Nyvold ve ark. (19), indüksiyon bitiminde (29. gün) MRH bakmışlar ve MRH değeri 10-4 ün altında ve 10-4 ün üzerinde olanlarla karşılaştırdıklarında, 10-4 ten daha düşük değerlere sahip olan hiçbir olguda relaps olmadığını bildirmişlerdir. Smith ve ark. (12), yaptıkları çalışmada, 14. haftada bakılan MRH değerinin en fazla prediktif değer taşıdığını ileri sürmüşlerdir. Bu çalışmada 3. yılda RFS (relaps free survival), MRH negatif olan olgularda % 93.4 iken, MRH pozitif olgularda bu oran % 57.9 bulunmuştur. Dworzak ve ark. (25), 33. gün ve 12. hafta mutlak blast sayısını MRH ile tespit etmişler ve 33. gün mikrolitredeki blast sayısı 10 ve üzeri ise RFS yi % 0; 12. haftada mikrolitredeki blast sayısı 1 ve üzeri ise RFS yi % 94 bulmuşlardır. Cave ve ark. nın çalışmasında (7), ALL li 133 olgunun 15 inde (% 11), Van Dongen ve ark. (8), 169 hastanın 27 sinde (%16), MRH seviyesini yüksek bulmuşlar ( 10-2), bu seviyedeki MRH pozitifliği ile relaps hızı arasında bir ilişki olduğunu bildirmişlerdir (Her 2 çalışmada da MRH 5. hafta bakılmıştır). Kemik iliği transplantasyonu (KİT) öncesinde MRH ölçümlerinin prognostik önemini belirten çalışmalar mevcuttur (26,27,28). Kinechti ve ark. (26), yaptıkları çalışmada, transplantasyon öncesinde yüksek seviyede tespit edilen MRH ın relaps ile ilişkisinin olduğunu bildirmişleridir. Ancak buna zıt olarak, KİT öncesinde yüksek seviyede MRH düzeyi olanlarda, komplet klinik remisyon sağlandığı da bildirilmiştir (27,28). Smith ve ark. (29) yaptıkları çalışmada, 248 ALL li olguda, remisyon indüksiyonunun sonu (tanıdan 6 hafta sonra) ve devam tedavisinin 14., 32., ve 56. haftalarında MRH bakmışlardır. İndüksiyon tedavisinin sonunda bakılan dönemde MRH düzeyi % 25.5 iken, düzeyin 14., 32., ve 56. haftalarda giderek azaldığını bildirmişlerdir. Beş yıllık izlemde relaps oranı, indüksiyon tedavisi sonunda MRH (+) olanlarda, (-) olanlara göre belirgin artmış olup, tedavi devam ederken tespit edilebilen MRH ise lösemik relaps için güçlü bir gösterge olduğu ifade edilmiştir. Özellikle remisyon indüksiyonu sonunda ve 14. haftada bakılan MRH düzeyi %1 ise bu durum, artmış relaps riski ile ilişkili bulunmuştur. Hem indüksiyon sonu hem de 14. haftada MRH pozitif olgularda 4 yıllık izlemde relaps oranı % 68±16 iken, 14. haftada MRH negatif olanlarda relaps oranı sadece % 7±7 saptanmıştır. Özellikle 14. haftada alınan örneklerdeki lösemik hücre oranı yüksek ( % 0.1) olanlarda, prognoz kötü olup, bu pozitiflik infantlarda ve 10 yaş ve üzeri çocuklarda, ara yaştaki çocuklara göre daha sık saptanmıştır. Grumayer ve ark. (30), yaptıkları çalışmada yüksek MRH değerlerinin, yüksek relaps riski ile ilişkili olduğunu göstermişlerdir. Bu çalışmada 68 ALL olgusunda tedaviye cevap, PCR ile 15. günde değerlendirilmiştir. Remisyon indüksiyonundan sonra rezidüel hastalığın saptanmaması, iyi prognozla ilişkili gösterilmiştir. Dongen ve ark. nın çalışmasında (8), olgular BFM protokolüne göre risk gruplarına ayrılmıştır (SRG=düşük risk grubu, MRG= orta risk grubu, HRG=yüksek risk grubu) ve protokole uygun olarak kemik iliği örnekleri alınmıştır (Tanı sırasında, 5. hafta, 12. hafta, 22. hafta (SRG ve MRG), 25. hafta (HRG), 28. hafta (SRG ve MRG), 33. hafta (HRG), 70 ve 80. haftalar olmak üzere 9 kez örnek alınmıştır). Rezidüel hastalık, PCR ile bakılmış, ilk iki örnekte alınan MRH negatifliğinde relaps oranı, MRH pozitifliğine göre anlamlı derecede düşük saptanmıştır. Tedavi sonunda düşük derecede bile olsa MRH pozitifliğinin gösterilmesinin, relaps riskini çok artırdığı bulunmuştur (Tanı 36

5 anından itibaren ilk 5 örnekte (60 ay) bakılan MRH negatif olanlarda relaps % 9, pozitif olanlarda % 86 bulunmuştur). Tedavi bitiminde MRH pozitif olan 6 hastadan 5 inde relaps saptanırken, MRH negatif olan 148 hastadan sadece 9 unda relaps gözlenmiştir. Bu çalışmada planlanan ilk 5 örnekte bakılan MRH değeri bağımsız prognostik faktör olarak bulunmuştur (özellikle indüksiyon sonrası bakılan ve konsolidasyon öncesi bakılan 2 örnek çok anlamlı bulunmuştur). Rezidüel hastalık derecesi açısından, risk grupları arasında farklılık saptanmamış, 1. ve 2. örnekte bakılan MRH negatif ise, relaps hızı daha da düşük bulunmuştur. Yüksek ve orta derecede MRH değerine sahip olanlarda relaps oranı, düşük olanlara göre daha yüksek bulunmuştur. Tedavi sırasında ve sonrasında bakılan MRH negatifliğinde 3 yıllık relaps oranı % 3-15 iken, pozitif olgularda bu oran % olup, MRH pozitifliğinin derecesinin de prognostik değer taşıdığı ifade edilmiştir. Yine aynı çalışmada, tek bir MRH değeri ölçümünün, iyi ya da kötü pronozlu olguları belirlemede yeterli olmayabileceği de bildirilmiştir. Ancak tekrarlayan kemik iliği örneklerine çok da gerek olmadığını, bunun çocuklar için çok uygun olmadığı ileri sürülmektedir. Kemik iliği örnekleme sayısının azaltılması görüşü savunulmakta ve tedavinin ilk yılında 3 ya da 4 kez yapılması yeterli olabilir, denilmektedir. Bu sayı protokollere göre belirlenmeli ve protokollerin de, tedavi stratejilerini belirlemek için MRH tayinleri baz alınarak düzenlenmesi gerektiği savunulmaktadır. Bu çalışmaya zıt olarak Roberts ve ark. çalışmasında (31), tedavi sonrasında alınan en az bir ya da daha fazla örnekte MRH pozitifliği saptadıkları 17 hastanın 15 inde sürekli tam remisyon sağladıklarını bildirmişlerdi. Bunun için de ileri sürülen şey, hastaların tamamına yakınında lösemik hücre yükünün düşük derecede olmasıydı. Lösemi tedavisinin 1. haftası sonunda dolaşımda lenfoblastların hala gösterilebilir olması ve remisyon indüksiyon tedavisi sırasında kemik iliğinde blast saptanması, relaps için yüksek risk taşımaktadır (12,32,33). Yetişkinlerde lösemi tedavisine cevabın, çocuklardaki kadar hızlı olmadığı gösterilmiştir (9,34). Çocuklarda tedavi cevabı daha erken alınırken, erişkinlerde MRH pozitifliği, sıklıkla tedavi başlangıcından 2 ay sonrasına kadar devam edebildiği belirtilmiştir. Yetişkinlerde B-ALL ile ilgili olarak yapılan bir diğer çalışmada, flow sitometri tekniği ile 64 lösemik örnek incelenmiş ve bunların % 95,3 ünde en az bir tane lösemik fenotip bulunmuştur (% 57,3 ünde 2 ya da daha fazla). Metod, normal hücredeki 1 tane lösemik hücrenin tayininde yeteri kadar sensitif bulunmuştur (35). Bir diğer çalışmada tedavinin ilk 24 ayı içinde 4 kez MRH bakılmış ve özellikle indüksiyon sonrasında bakılan MRH, relaps riski açısından en anlamlı bulunmuştur (9). Ancak yetişkinlerde MRH tayininin, çocuklara göre daha az anlamlı olduğunu bildiren çalışmalar da mevcuttur (34,36,37). Sonuç olarak, lösemide tedavi yanıtının değerlendirilmesinde MRH tayini oldukça hassas bir gösterge olup, prognostik bir önem taşımaktadır (38,39,40,41). Giderek artan çalışmalarda, MRH bakılması rutin tedavi protokollerinde risk sınıflamasına dahil edilmektedir (42,43). Zamanlamada en fazla MRH bakılması önerilen günler, 33. ve 78. günler olup, tekrarlayan örneklerde hala (+) olarak bulunması çok kötü bir prognostik kriterdir. Minimal rezidüel hastalığın henüz bakılamadığı merkezlerde, düşük, orta ve yüksek risk gruplarını belirleyen steroid tedavisine iyi yanıt, lökosit sayısının 20000/mm 3 den az olması, T hücre immunolojisinin negatifliği, 15. gün kemik iliğinde remisyon olması gibi durumların MRH 37

6 bulguları ile iyi örtüştüğünü gösteren çalışmalar vardır (43,44). KAYNAKLAR 1. Lanskovsky P. Leukemias. In: P. Lanskovsky (ed). Manual of Pediatric Hematol and Oncol, 4th ed. Churcill Livinstone, New York, 2005; 14: Mopett J, Burke A A G, Steward CG, et al. The clinical relevance of detection of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. J Clin Pathol 2003; 56: Coustan Smith E, Ribeiro RC, Stow P, et al. A simplified flow cytometric assay identifies children with acute lymphoblastic leukemia who have a superior clinical outcome. Blood 2006; 108: Pui CH. Acute lymphoblastic leukemia in children. Current Opinion in Oncology 2000; 12: Eden OB, Harrison G, Richards S, et al. Long-term follow-up of the United Kingdom Medcal Research Council protocols for childhood acute lymphobastic leukemia, Medical Research Council childhood leukemia working party. Leukemia 2000; 14: Gaynon PS, Trigg ME, Heerema NA, et al. Children s cancer group trials in childhood acute lymphoblastic leukemia: Leukemia 2000; 14: Cave H, Bosch J, Suciu S, et al. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. European Organization for Research and Treatment of Cancer- Childhood Leukemia Cooperative Group. New Engl J Med 1998; 339: Van Dongen JJ, Seriu T, Panzer-Grumayer Er, et al. Prognostic value of minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia in childhood. Lancet 1998; 352: Mortuza YF, Papaioannou M, Moreira MI, et al. Minimal residual disease tests provide an independent predictor of clinical outcome in adult acute lymphoblastic leukemia. J Clin Oncol 2002; 20: Biondi A, Valsecchi MG, Seriu T, et al. Molecular detection of minimal residual disease is a strong predictive factor of relapse in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia with medium risk features. A case control study of the International BFM study group. Leukemia 2000; 14: Bjorklund E, Mazur J, Soderhall S, et al. Flow cytometric follow-up of minimal residual disease in bone marrow gives prognostic information in children with acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2003; 17: Coustan-Smith E, Sancho J, Hancock MI, et al. Clinical importance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2000; 96: Coustan-Smith E, Behm FG, Sanchez J, et al. Immunological detection of minimal residual disease in children with acute lymphoblastic leukemia. Lancet 1998; 351: Jacquy C, Delepaut B, van Daele S, et al. A prospective study of minimal residual disease in childhood B-lineage acute lymphoblastic leukemia: MRD level at the end of induction is a strong predictive factor of relapse. Br J Haematol 1997; 98: Stadt ZU, Harms DO,Schlüter S, et al. MRH at the end of induction therapy in childhood acute lymphoblastic leukemia:outcome prediction strongly depends on the theraopeutic regimen. Leukemia 2001; 15: Campana D, Pui CH. Detection of minimal rezidüel disease in acute leukemia: Methodological advances and clinical significance. Blood 1995; 85: Van Dongen JJ, Macintyre EA, Gabert JA, et al. Standardized RT-PCR analysis of fusion gene transcripts from chromosome abberations in acute leukemia for detection of minimal residual disease: report of the BIOMED-1 Concerted Action:investigation of minimal residual disease in acute leukemia. Leukemia 1999; 13: Neale GA, Coustan-Smith E, Pan Q, et al. Tandem application of flow cytometry and polymerase chain reaction for comprehensive detection of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 1999; 13: Nyvold C, Madsen HO, Ryder LP, et al. Precise quantification of minimal residual disease at day 29 allows identification of children with acute lymphoblastic leukemia and an excellent outcome. Blood 2002; 99: Brisco MJ, Condon J, Hughes E, et al. Outcome prediction in childhood acute lymphoblastic leukemia by molecular quantification of residual disease at the end of the induction. Lancet 1994; 343: Gruhn B, Hongeng S, Yi H, et al. Minimal residual disease after intensive induction therapy in childhood acute lymphoblastic leukemia predicts outcome. Leukemia 1998; 12: Zhou J, Goldwasser A, Li A, et al. Quantitative analysis of minimal residual disease predicts relaps in children with B-lineage acute lymphoblastic leukemia in DFCI ALL Consortium Protocol Blood 2007; 110: Borowitz M, Pullen JD, Winick N, et al. Comparison of Diagnostic and relapse flow cytometry phenotypes in childhood acute lymphoblastic leukemia:implications for residual disease detection: a report from the children s oncology group. Clinical cytometry 2005; 68B: Gaipe G, Basso G, Maglia O, et al. Drug-induced immunphenotypic modulation in childhood ALL:implications for minimal residual disease detection. Leukemia 2005; 19: Dworzak MN, Froschl G, Printz D, et al. Prognostic significance and modalities of flow-cytometry minimal residual disease detection in childhood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002; 99: Knechtli CJ, Goulden NJ, Hancock JP, et al. Minimal residual disease status before allogeneic bone marow transplantation is an important determinant of successful outcome for children and adolescents with acute lymphoblastic leukemia. Blood 1998; 92: Uzunel M, Mattsson J, Jaksch M, et al. The significance of graft-versus-host disease and pretransplantation minimal residual disease status to outcome after allogeneic stem cell transplantation in patients with acute lymphoblastic leukemia. Blood 2001; 98: Bader P, Hancock J, Kreyenberg H, et al. Minimal residual disease status prior to allogeneic stem cell transplantation is a powerful prediction for transplant outcome in children with ALL. Leukemia 2002; 16:

7 29. Coustan-Smith E, Sancho J, Behm FG, et al. Prognostic importance of measuring early clearance of leukemic cells by flow cytometry in childood acute lymphoblastic leukemia. Blood 2002; 100: Panzer-Grumayer ER, Schneider M, Panzer S, et al. Rapid molecular predicts a good outcome in childhood acute lympholastic leukemia. Blood 2000; 95: Roberts WM, Estrov Z, Ouspenskaia MV, et al. Measurement of residual leukemia during remission in childhood acue lymphoblastic leukemia. N Engl J Med 1997; 336: Dördelmann M, Reiter A, Borkhardt A, et al. Prednisone response is the strongest predictor of treatment outcome in infant acute lymphoblastic leukemia. Blood 1999; 94: Steinherz PG, Gaynon PS, Breneman JC, et al. Cytoreduction and prognosis in acute lymphoblastic leukemiathe importance of eary marrow response:report from the Childrens Cancer Group. J Clin Oncol 1996; 14: Brisco MJ, Hughes E, Neoh SH, et al. Relationship between minimal residual disease and outcome in adult acute lymphoblastic leukemia. Blood 1996;87: Krampera M, Perbellini O, Vincenzi C, et al. Methodological approach to minimal residual disease detection by flow cytometry in adult B-lineage acute lymphoblastic leukemia. Haematologica/the hematology Journal 2006; 91: Foroni L, Harrison CJ, Hoffbrand AV, et al. Investigation of minimal residual disease in childhood and adult lymphoblastic leukemia by molecular analysis. Br J Haematol 1999; 105: Foroni L, Coyle LA, Papaioannou M, et al. Molekular detection of minimal residual disease in adult and childhood acute lymphoblastic leukemia reveals differences in treatment response. Leukemia 1997; 11: Borowitz MJ, Devidas M, Hunger SP, et al. Clinical significance of minimal residual disease in childhood acute lymphoblastic leukemia and its relationship to other prognostic factors: a Children s Oncology Group study. Blood ; 12: Flohr T, Schrauder A, Cazzaniga G, et al. Minimal residual disease-directed risk stratification using real- time quantitative PCR analysis of immunoglobulin and T-cell receptor gene rearrangements in the international multicenter trial AIEOP-BFM ALL 2000 for childhood acute lymphoblastic leukemia. Leukemia 2008; 22: Mussolin L, Pillon M, Conter V, et al. Prognostic role of minimal residual disease in mature B-cell acute lymphoblastic leukemia of childhood. J Clin Oncol 2007; 33: Fronkova e, Meistrikova E, Aviqad S, et al. Minimal residual disease (MRD) analysis in the non-mrd-based ALL IC-BFM 2002 protocol for childhood ALL: is it possible to aviod MRD testing? Leukemia 2008; 22: Attarbaschi A, Mann G, Panzer-Grmayer R, et al. Minimal residual disease values discriminate between low and high relapse risk in children with B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia and an intrachromosomal amplification of chromosome 21: the Austrian and German acute lymphoblastic leukemia Berlin-Frankfurt- Munster (ALL-BFM) trials. J Clin Oncol 2008; 20: Van der Velden VH, Corral L, Valsecchi MG, et al. Prognostic significance of minimal residual disease in infants with acute lymphoblastic leukemia treated within the Interfant-99 protocol. Leukemia 2009 Feb 12. Epub ahead of print. 44. Van der Velden VH, Panzer Gümayer ER, Cazzaniqa G, et al. Optimization of PCR-based minimal residual disease diagnostics for childhood acute lymphoblastic leukemia in a multi-center setting. Leukemia 2007; 21: